שחזורי כלי דם אצל מושתלים, כולל הווריד הנבוב התחתון העל-הפטי (SHIVC), וריד פורטלי וריד נבוב תחתון אינפרה-כבדי (IHIVC), הם הליכי המפתח להשתלת כבד אורתוטופית מוצלחת בעכבר. אנו מספקים כאן טכניקות תפירה וטיפים לשחזור SHIVC ו-IHIVC במודל השתלת כבד עכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טכניקות תפרים לשחזור כלי דם בהשתלת כבד אורתוטופית בעכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקר תרגומי באמצעות מודלים של בעלי חיים חיוני לטיפול בבעיות הקליניות בהשתלות איברים. למרות שהשתלת כבד אורתוטופית של עכבר (LT) היא כלי שימושי לחקירת המנגנונים של התחדשות כבד, פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה ותגובות חיסוניות בעקבות LT, אתגרים טכניים בהליך זה מגבילים את היתכנותו. ההיבטים העיקריים ל-LT אורתוטופי מוצלח של עכבר הם שחזור כלי דם אצל מקבלים, כולל הווריד הנבוב התחתון העל-הפטי (SHIVC), וריד הפורטל (PV) והווריד הנבוב התחתון התת-הפטי (IHIVC). בנוסף לקשיים הטכניים בשחזור כלי דם אלה, מגבלת הזמן של השלב האנפטי לתוך 20 דקות הופכת את ההליך הזה למאתגר יותר. למרות שניתן להשתמש בטכניקת שרוול לשחזור PV, נדרשת טכניקת תפירה בטוחה ומהירה כדי לשחזר את ה-SHIVC במהלך השלב האנהפטי. עבור שחזור IHIVC, בעוד שטכניקות השרוול והתפרים ישימות כאחד, טכניקת התפר מובילה לזמן ניתוח קצר יותר בניתוח תורם והכנת שולחן אחורי ויכולה לשמור על לומן כלי דם גדול יותר מטכניקת השרוול. אנו מספקים כאן הנחיות לשחזור SHIVC ו-IHIVC באמצעות טכניקת תפר כדי להקל על LT אורתוטופי של עכבר.
מבוא
עם ההתקדמות בטכניקות כירורגיות, תרופות מדכאות חיסון ורפואה לטיפול נמרץ, השתלת איברים הוקמה כטיפול סטנדרטי למחלות איברים בשלב הסופי. השתלת כבד (LT) היא כיום הטיפול המרפא היחיד למחלת כבד סופנית ולממאירויות מסוימות בכבד. מחקר תרגומי באמצעות מודלים של בעלי חיים חיוני כדי לטפל בבעיות קליניות ב-LT. מכיוון שבעלי חיים מהונדסים גנטית שונים זמינים במודלים של עכברים, LT אורתוטופי של עכבר הוא כלי חשוב לחקור תובנות מכניסטיות לגבי התחדשות כבד, פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה ותגובות חיסוניות בעקבות LT1. עם זאת, מכיוון שהאתגרים הטכניים בהליך זה מגבילים את היתכנותו, קבוצות המחקר העובדות על מודל זה מוגבלות 2,3,4,5,6,7,8,9,10.
LT אורתוטופי של עכבר תואר לראשונה על ידי Qian et al. בשנת 19912. ההליך הכירורגי, שפותח על ידי יישום טכניקות LT אורתוטופיות בחולדות, כולל שלושה שלבים: ניתוח תורם, הכנת שתל הכבד בשולחן האחורי וניתוח נמען6. החלקים המאתגרים מבחינה טכנית של LT עכבר הם שחזור מרה וכלי דם אצל מקבלים, כולל הווריד הנבוב התחתון העל-הפטי (SHIVC), וריד הפורטל (PV) והווריד הנבוב התחתון התת-כבדי (IHIVC). בנוסף לטכניקות הניתוחיות, השלב האנהפטי מההידוק ועד לשחרור זרימת ה-PV צריך להיות תוך 20 דקות עבור אורתוטופ LT 2,6,11 מוצלח של עכבר. יתר על כן, מניסיוננו, זמן הזלוף הכולל מהידוק PV לשחרור IHIVC צריך להיות בתוך 30 דקות כדי להשיג הישרדות לטווח ארוך ב-LT של עכבר. זה עולה בקנה אחד עם הדוח הקודם עבור חולדה LT המתאר את הזמן המועדף של מצב המודינמי מערכתי לא יציב בתוך כ-30 דקות12. לפיכך, קשיים טכניים ומגבלות זמן ב-LT של עכבר הופכים את ההליך הזה למאתגר יותר.
למרות שניתן להשתמש בטכניקת השרוול לשחזור PV, נדרשת טכניקת תפר כדי לשחזר את ה-SHIVC בשלב האנהפטי. לכן, טכניקת תפירה בטוחה ומהירה חיונית לאנסטומוזיס SHIVC. בעוד שטכניקות השרוול והתפרים ישימות לשחזור IHIVC, רוב המחקרים הקודמים השתמשו בטכניקת שרוול 5,6,7,11,13. עם זאת, השימוש בטכניקת שרוול בשחזור IHIVC מוביל לזמן פעולה ארוך יותר בפעולות תורם ושולחן אחורי. בנוסף, החדרת שרוול עשויה להיות קשה יותר מתפירת שרוול למתחילים בגלל השוליים הקצרים של הווריד הנבוב התחתון (IVC)13.
אנו מספקים כאן הנחיות לשחזור מוצלח של SHIVC ו-IHIVC באמצעות טכניקת תפר ב-LT אורתוטופי של עכבר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קיוטו ובוצעו בהתאם להנחיות להגנת בעלי חיים של אוניברסיטת קיוטו. ניתוחי עכברים בוצעו בהרדמה כללית באמצעות אינהלציה איזופלורן. הוופורייזר הוגדר ל-3% איזופלורן עם 1 ליטר לדקה חמצן כדי לגרום להרדמה. לאחר לפרוטומיה, איזופלורן הופחת ל-1% כדי לשמור על הרדמה. הכלים המיקרו-כירורגיים המשמשים בפרוטוקול זה, כולל אלה המשמשים בפרוטוקול שחזור כלי הדם13 שפורסם בעבר, מפורטים בטבלת החומרים. נדרש מיקרוסקופ כדי לבצע אורתוטופ LT13 של עכבר. כרית חימום שימשה לשמירה על טמפרטורת גוף העכבר13.
1. בעלי חיים
- השתמש בעכבר במשקל 25-30 גרם.
הערה: למרות שניתן להשתמש בעכברים במשקל 20-35 גרם, כ-25 גרם עכברים מתאימים הן לתורמים והן למושתלים. מכיוון שגיל וסטיאטוזיס בכבד משפיעים על תוצאות LT, יש לבחור עכברים מתאימים לכל מטרה של הניסויים.
2. דיסקציה של IHIVC בכבד התורם
- בודד את ה-IHIVC מהרקמה שמסביב. אטום את הוורידים המותניים בעזרת צריבה חשמלית במידת הצורך.
- הסר את השומן מ-IHIVC כדי לחשוף את דופן הכלי.
- לנתח את ה-IHIVC מעל עורק הכליה והווריד הימני (איור 1).
הערה: אם טכניקת התפר משמשת לשחזור IHIVC, דיסקציה של וריד הכליה הימני באתר התורם אינה נחוצה. ניתוח תורם אורך בדרך כלל פחות מ-30 דקות כאשר מיישמים את טכניקת התפר לשחזור IHIVC.
3. דיסקציה של SHIVC בכבד התורם
- לאחר זלוף של תמיסת האחסון מה-PV, חתכו את הקירות הקדמיים והאחוריים של ה-SHIVC (איור 1).
הערה: בידוד הקיר האחורי של SHIVC מהסרעפת הוא חיוני להשגת מרווח מספיק לשחזור.
4. הכנת שתל הכבד בשולחן האחורי
- חבר שרוול ל-PV, כפי שתואר קודם לכן13.
- חבר clamp קליפ ל-IHIVC.
- הפוך את הכבד וחשוף את גדם SHIVC.
- הנח תפר שהייה עם ניילון 10-0 בשני קצוות ה-SHIVC והחזק אותם עם מהדקי בולדוג.
הערה: הכנת השולחן האחורי אורכת כ-10 דקות ללא חיבור שרוול ל-IHIVC.
5. שחזור ה-SHIVC אצל הנמען
- הקיפו את ה-SHIVC במשי 4-0 כדי להחזיר את הכבד כלפי מטה.
- הפחת את ריכוז האיזופלורן ל-0.3-0.5% לפני השלב האנהפטי.
- מהדק את ה-IHIVC מעל וריד הכליה הימני באמצעות מיקרוסרפין.
- מהדק את ה-PV באמצעות מלקחיים של אפונה13.
- מהדקים את ה-SHIVC עם הסרעפת באמצעות מהדק בולדוג תוך החזרת הכבד כלפי מטה.
- חותכים את הדופן הקדמית של SHIVC, ואז חותכים את הדופן האחורית (איור 1).
הערה: בידוד הדופן האחורית של SHIVC מהסרעפת אצל הנמען והתורמים הוא חיוני להשגת מרווח מספיק לשחזור. - אחרי ניתוח PV ו-IHIVC קרוב לכבד של המקבל, הסירו את הכבד מהנמען (איור 1).
- הכניסו את שתל הכבד המוכן לחלל הבטן של הנמען והניחו את הכבד כראוי.
- הניחו וקשרו תפר שהייה בקצה הימני של ה-SHIVC והחזיקו אותו עם מהדק בולדוג כדי למשוך את התפר לכיוון הצד הגחוני של הנמען (איור 2A).
הערה: הצד הימני של ה-SHIVC נמצא עמוק בחלל הבטן. משוך החוצה את הצד הימני של ה-SHIVC כך שהקיר האחורי יוצב מלפנים. - הנח וקשר תפר שהייה בקצה השמאלי של ה-SHIVC.
- התחל תפירה רציפה בשיטה תוך-לומינלית על הדופן האחורית של ה-SHIVC מצד שמאל (איור 2A).
- כאשר מגיעים לקצה הימני של הקיר האחורי של ה-SHIVC, סובבו את שולחן הניתוחים ב-90 מעלות נגד כיוון השעון.
הערה: סובב את שולחן הניתוחים 90° בכיוון השעון עבור מנתחים שמאליים. לחלופין, מנתחים יכולים לתפור את הדופן הקדמית מקדימה לכיוון הגב ללא סיבוב. - המשיכו את התפר עם תפר מעל ומעבר על הדופן הקדמית של SHIVC מצד ימין (איור 2A).
הערה: נדרשים כשישה עד שמונה תפרים לקיר האחורי ושמונה עד עשרה תפרים לקיר הקדמי. התפר בקצה השמאלי של הדופן הקדמית חשוב למניעת דימום. - לאחר שטיפת האוויר ב-SHIVC, קשרו את התפר הרציף עם תפר השהייה בצד שמאל של ה-SHIVC.
- סובב את שולחן הניתוחים 90° בכיוון השעון כדי להחזיר את מיקום הנמען למצב המקורי.
- לאחר השחזור והזלוף מחדש של ה-PV, שחרר את ה-SHIVC.
הערה: לוקח 10-15 דקות לשחזור SHIVC. מכיוון שזמן ההידוק של ה-PV יכול להשפיע על תוצאות LT, יש לתקן את זמן ההידוק (מ-PV clamping ועד ל-PV unclamping) עד 20 דקות על סמך מיומנות המנתח. לאחר PV reperfusion, איזופלורן מאופס ל-1% כדי לשמור על הרדמה.
6. שחזור ה-IHIVC אצל הנמען
- הנח וקשר תפרי שהייה עם ניילון 10-0 בשני קצוות ה-IHIVC.
- החזק את תפרי השהות עם מהדקי בולדוג כדי למשוך לכיוון שני הצדדים, כך שגדם ה-IHIVC יהפוך רחב וישר.
- התחל את התפירה הרציפה בשיטה תוך-לומינלית בצד שמאל של הדופן האחורית (איור 2B).
- לאחר שהגעתם לצד ימין, המשיכו לתפור שוב ושוב על הדופן הקדמית מצד ימין של הנמען (איור 2B).
הערה: סיבוב שולחן הניתוחים אינו נדרש לשחזור IHIVC. מספיקים כשישה עד שמונה תפרים לכל דופן אחורית וקדמית. - שטפו את האוויר ב-IHIVC.
- שחרר את מהדקי ה-IHIVC מצד השתל, ולאחר מכן מהצד המקבל.
הערה: קשירת התפר הרציף עם תפר השהייה בצד שמאל של ה-IHIVC מיותרת. זה לוקח 8-10 דקות לשחזור IHIVC. זמן הזלוף הכולל מהידוק PV לשחרור IHIVC צריך להיות בתוך 30 דקות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מושתל עכבר התאושש מהרדמה תוך 30 דקות כאשר שחזור כלי דם מוצלח בוצע באמצעות שתל כבד רגיל ללא זמן איסכמי קר ממושך. שיעור הצלחה של >90% יכול להיחשב מיומן להליך זה. בחנו את עקומות הלמידה אצל מנתח אחד עבור שיעורי התאוששות לאחר LT (התאוששות מהרדמה), זמן אנהפטיקה (מהידוק לשחרור זרימת ה-PV), וזמן הרפרפוזיה הכולל (מהידוק ה-PV לשחרור זרימת ה-IHIVC). למעלה מ-60 מקרים נדרשו כדי להשיג שיעורי החלמה משביעי רצון, ולמעלה מ-80 מקרים נדרשו כדי להשיג זמן אנהפטיה יציב תוך 20 דקות וזמן רפרפוזיה כולל של כ-30 דקות (איור 3...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה תיעד את הטכניקות המפורטות לשחזור SHIVC ו-IHIVC בטכניקת תפר ב-LT אורתוטופי של עכבר. שחזור כלי דם, במיוחד אנסטומוזיס SHIVC, הדורש טכניקת תפירה בשלב האנהפטי, הוא מיומנות חיונית ל-LT עכבר מוצלח. בנוסף לטכניקת התפירה הבטוחה והמאובטחת, יש צורך בתפירה מהירה כדי לשמור על השלב האנהפטי תוך 20 דקות לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור בעכבר LT 2,7,11.
יש צורך בסיבוב של שולחן הנית...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (מספר מענק: 24K19356).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10-0 תפר מיקרו | תאגיד AROSurgical Instruments | T4A10N07 | |
| 16 גרם קטטר תוך ורידי | טרומו | SR-FF2032 | שרוול IHIVC |
| 20 גרם קטטר תוך ורידי | טרומו | SR-FF1651 | שרוול PV |
| 8-0 משי צמה | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 משי |
| פתרון אחסון קר של Belzer UW | אסטלס | נוזל שימור איברים | |
| מהדק בולדוג | בי בראון | FB329R | מהדק בולדוג |
| מהדקי בולדוג | Natsume Seisakusho | C-42-S-2 | עבור SHIVC clamping |
| עכברי C57BL/6 | אוריינטל ביו סרוויס | ||
| מלקחיים | כלים מדעיים עדינים | 11231-30 | |
| תמיסת אינהלציה איזופלורן | ויאטריס | הרדמה | |
| קצוות מיקרו קהים 0.1 מ"מ x 0.06 מ"מ | כלים מדעיים עדינים | 11253-20 | מיקרו-מלקחיים ישרים |
| מספריים מיקרו | מורנאקה מכשירים רפואיים | 451-609-13 | |
| מיקרו סרפין | כלים מדעיים עדינים | 18055-03 | עבור הידוק IHIVC |
| מיקרו סרפין | כלים מדעיים עדינים | 18055-04 | ל-PV clamping |
| Micro Serrefine Clamp אפליקטור עם מנעול | כלים מדעיים עדינים | 18056-14 | מוליך קליפ כלי |
| מיקרו סרפינס | כלים מדעיים עדינים | 18055-4 | קליפ כלי |
| עוזרי תפרים זעירים | אסקולאפ | FD281R | |
| מוליך מהדק מיקרו-סרפיין | כלים מדעיים עדינים | 18056-14 | |
| מחזיק מחט | אסקולאפ | FD231R | |
| להבים רזרביים מס' 11 | סכין גילוח בטיחות FEATHER | 11 | להבים |
| מספריים עיניים, ידית עגולה | בי בראון | FD103R | מיקרו-מספריים |
| מיכל פלסטיק בצורת מלבני | פורטוגל | אורך 10 ס"מ, רוחב 15 ס"מ וגובה 6 ס"מ | |
| טיפים ל-SuperGrip | כלים מדעיים עדינים | 00649-11 | מיקרו-מלקחיים מעוקלים |
| SZX7 | אולימפוס | SZX7 | מיקרוסקופ |
| מספריים Vannas | מכשירי דיוק עולמיים | 501232 | |
| קליפ כלי דם | תאגיד BEAR Medic | TKF-1-30 | להידוק IHIVC על שתל הכבד |
מקורות
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Tian, Y., Rudiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Klein, I., Gassel, H. J., Thiede, A., Crispe, I. N., Steger, U. A microsurgical approach to hepatic and extrahepatic antigen presentation and its effects on the migration pattern of activated CD8(+) T cells. Microsurgery. 27 (4), 289-294 (2007).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Kojima, H., et al. T cell CEACAM1-TIM-3 crosstalk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248.e9 (2023).
- Tanaka, K., et al. Recipient toll-like receptor 4 determines the outcome of ischemia-reperfusion injury in steatotic liver transplantation in mice. Am J Transplant. 25 (6), 1168-1179 (2025).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Hori, T., et al. Comprehensive and innovative techniques for liver transplantation in rats: A surgical guide. World J Gastroenterol. 16 (25), 3120-3132 (2010).
- Tanaka, K., et al. Vascular reconstruction with the cuff technique in mouse orthotopic liver transplantation. J Vis Exp. (202), e66215(2023).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
