מאמר שיטה

ניסוח מינוני מעקב ויטמין A למתן לנבדקים אנושיים באמצעות טכניקת דילול איזוטופים רטינול

186 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69240

⸱

31 במרץ 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

במאמר זה

סיכום

הכנת ויטמין A המסומן באיזוטופים יציבים, הנחוץ לטכניקת דילול איזוטופ רטינול, חייבת לעמוד בתקני בטיחות מזון. הפרוטוקול מציג הכנת מינון בשמן צמחי בריכוזים המתאימים למערכת האספקה הנבחרת ולפלטפורמה האנליטית המיושמת.

תקציר

טכניקת דילול האיזוטופים של רטינול (RID) מתבססת על מתן מעקבי ויטמין A המסומנים איזוטופי לנבדקים אנושיים. כאן אנו מציגים שיטה להנחות צוותי מחקר כיצד להכין מעקבי איזוטופ יציבים של ויטמין A הן למחקרים והן לסקרי אוכלוסייה. המאמר מספק סקירה של ההכנה, השגת החומרים, הציוד הנדרש ונהלים כדי להבטיח שהמעקבים בטוחים לצריכה אנושית. ניתן להשיג מעקבי איזוטופ יציבים של ויטמין A באופן מסחרי ובדרך כלל מסומנים בדויטריום [2H] או פחמן-13 [13C] עם >95% טוהר איזומרי כל-טרנס והעשרה איזוטופית של >99%. הכנת האיזוטופים היציבים של ויטמין A כוללת המסה בשמן צמחי אכיל באמצעות סוניקציה וחום. יש להכין מעקבים בריכוז שנמצא היטב בגבולות הנפח של מערכת המשלוח. לבסוף, המעקב מוזרם לבקבוקי זכוכית ענבר סטריליים, וריכוזי העוקב מאושרים ספקטרופוטומטרית.

מבוא

כדי לאפשר ניטור יעיל של תוכניות התערבות שמטרתן להפחית מחסור בוויטמין A, שיטת דילול איזוטופים של רטינול (RID) יושמה בהצלחה כדי לספק מידע על מאגרי ויטמין A הכוללים (TBS) בגוף בקבוצות אוכלוסייה שונות 1,2,3,4. בעוד שרטינולסרום 5, חלבון קישור רטינול סרום (RBP)6,7,8 ובדיקות תגובה יחסית מותאמת (MRDR) משמשים לעיתים קרובות לאישור חוסר בוויטמין A, RID היא השיטה היחידה שמכמת במדויק את מאגרי ויטמין A הכולל בגוף בכל הספקטרום – מחסר תת-קליני ועד רעילות 3,10. על ידי מתן מינון ידוע של ויטמין A מסומן ומדידת דילול בפלזמה לאחר שיווי משקל, שיטת RID מספקת הערכות מדויקות של מאגרי TBS וכבדויטמין A 11,12. חשוב לציין ששיטת RID נשארת אמינה גם באוכלוסיות עם דלקת, מה שהופך אותה לחיונית להערכת יעילות ההתערבות ולהערכת סיכוני רעילות בתוכניות חופפות של תוספים וחיזוק13,14.

כדי לבצע את שיטת RID, ויטמין A המסומן איזוטופי צריך להינתן כמנה דרך הפה של רטיניל אסטר, שלרוב הוא רטיניל אצטט מומס בשמן צמחי מאכל. רוב המעבדות יקבלו ויטמין A מסומן באיזוטופים מספקים מסחריים 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. כמעט כל מעקבי איזוטופ ויטמין A הזמינים מסחרית מתויגים באמצעות איזוטופים יציבים של פחמן-13 [13C] או דויטריום [2H] (טבלה 1). בחירת מינון האיזוטופ המיושם תלויה במכשיר האנליטי שבו משתמשים לקביעת ריכוז הסרום או הפלזמה של רטינול המסומן במסה. בעוד שכרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה (GC-MS) וכרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) יכולות לנתח גם את [13C] וגם את [2H]22,23,24,25,26,27, ספקטרומטריית מסה בכרומטוגרפיית גז-בעירה-איזוטופ (GC-C-IRMS) יכולה לנתח רק [13C] מעקבי רטינול מסומנים 4,25,28. גבולות הגילוי של המכשיר האנליטי הנבחר, קבוצת היעד (ילדים או מבוגרים), ואורך המחקר יקבעו את גודל המינון שיש להחיל 3,25,29. עד כה, מינוני האיזוטופים נעו בין 0.3 ל-4.3 מ״ג רטינול שקול (RE; שווה ערך ל-1 - 15 מיקרומול) בילדיםבגילאי 3,4,30 ומ-0.6 עד 10.0 מ״ג RE (שווה ערך ל-2 - 35 מיקרומול) במבוגרים 2,3,31, כאשר מחקרים עדכניים יותר השתמשו במינונים נמוכים שנעו בין 0.3 ל-0.6 מ״ג RE (1 - 3 מיקרומול) לילדים ו-0.6 - 2.0 מ״ג RE (2 - 7 מיקרומול) במבוגרים. למרות שהועלו חששות כי מסה גבוהה של ויטמין A במינון עלולה להפריע לקינטיקה הבסיסית של ויטמין A, ניתוח עדכני שהשתמש במודלים אזוריים אישר כי מינוני איזוטופים של 7 מיקרומול RE לילדים או 14 מיקרומול RE למבוגרים לא אמורים להשפיע על דיוק תחזיות TBS29. כאן נדגים כיצד להכין מעקב מסומן איזוטופ ליישום אוראלי בשיטת RID, תוך התחשבות בחששות לבטיחות מזון וקבלת ריכוזי מינון מדויקים. הכנת מינון האיזוטופים חיונית לשיטת RID.

פרוטוקול

מחקר 1 אושר על ידי שירות האתיקה הלאומי למחקר, ועדת צפון-מזרח סנדרלנד (REC 09/H0904/20) לפני רישום ברשת המחקר הקליני הבריטית (UKCRN: 7413). מחקר 2 אושר על ידי מועצת האתיקה המחקרית של אוניברסיטת הפיליפינים, מנילה (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), ועדת הביקורת המוסדית באוניברסיטת קליפורניה, דייוויס (IRB ID: 903681-2), ונרשם ב-ClinicalTrials.gov (מזהה: NCT03030339). מחקר 2 היה חלק מפרויקט GloVitAS שמומן על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס (OPP1115464: הערכת הסיכון לרעילות ויטמין A הנגרם מהעשרת מזון בקנה מידה גדול והתערבויות נוספות). גאורג ליץ היה החוקר הראשי של פרויקט GloVitAS ופיקח על יישום מחקר השטח. סקירה של פרוטוקול המחקר ניתנת באיור 1.

1. קריטריוני הכללה והחרגה

  1. למחקר 1, הקריטריונים שניתנו היו: קריטריוני הכללה: כוללים מתנדבים בריאים גברים ונשים בגילאי 18-45. קריטריונים להחריג: יש להחריג מתנדבים עם הריון, עישון, לחץ דם גבוה, סוכרת, BMI >30, מחלות כבד/כליות/מערכת העיכול, הפרעות מטבוליות של שומנים וצריכת מולטי ויטמינים (המכילים ויטמינים A, C, E) או תוספי β-קרוטן 3 חודשים לפני תחילת המחקר.
  2. למחקר 2, הקריטריונים שניתנו היו: קריטריוני הכללה: כוללים ילדים בגילאי 12-18 חודשים שנשארו באזור המחקר לאורך כל תקופת המחקר. קריטריונים להחריג: להחריג אם ילדים לא קיבלו תוספי ויטמין A במינון גבוה וחיו באזורים שלא נחשפו למזונות מועשרים בוויטמין A בשווקים המקומיים.

2. קביעת כמות האיזוטופ היציבה הכוללת עבור RID

  1. קבע את כמות מעקב האיזוטופים היציב שכל נבדק צריך לקבל תוך התחשבות בטוהר האיזומרי. מומלץ להשתמש באיזוטופים יציבים של ויטמין A עם טוהר טרנס מלא של >95%, שכן פעילות ביולוגית ומסלולי מטבוליה משתנים באופן משמעותי בין איזומרים גאומטריים. חשב את רמת המינון בהתבסס על מקבילי רטינול (RE). דוגמה לאופן חישוב זה ניתנת בטבלה 2.
  2. הכפל את רמת המינון במספר הנבדקים הכולל. מספר הנבדקים הכולל המבוסס על חישובי הספק עבור גודל המדגם הנדרש אך עולה בהתאם לנטייה הצפויה (ראו טבלה 2 לדוגמה). הגדלת כמות הטרייסר הכוללת הנדרשת על ידי התחשבות באובדני פיפטציה של עד 20%.
    הערה: ככלל, הכנת האיזוטופים צריכה לכלול עודף, שכן לא ניתן לשחזר את כל החומר מהבקבוקון. אובדן נוסף יתרחש בשל צמיגות השמן שנותר על קצה הפיפטה. כדי לקבל נפחים מדויקים של המינון במהלך המסירה, יש לנקות את עודפי השמן על קצה הפיפטה. מפעילים יכולים למזער את אובדן הפיפט אם קצה הפיפטה לא טובל עמוק מדי בשמן.

3. קביעת כמות השמן הצמחי הנדרשת להמסה של האיזוטופ היציב

  1. החליטו איזה שמן צמחי להשתמש ונפח המינון לכל נבדק (טבלה 2). קבעו את כמות השמן המוסף על ידי מערכת האספקה במהלך מינון הנבדקים.
    הערה: אנו משתמשים בשמן חמניות בשל תכולת ויטמין E הגבוהה, המסייעת ליציבות תכשיר ויטמין A32,33. עם זאת, שמנים צמחיים אחרים שימשו קבוצות אחרות כדי לעמוד בסטנדרטים התזונתיים המקומיים. מכיוון שה-RID מסתמך על אספקה מדויקת של מעקבים יציבים עם סימון איזוטופים, מומלץ להשתמש בפיפטה בעלת הזזה חיובית ליישום מינון המוכן בשמן אכיל. רוב המחקרים האחרונים השתמשו בנפחים של עד 250 מיקרוליטר, במיוחד אם המינון ניתן לילדים 1,7,23.
  2. חשב את ריכוז המינון של מעקב האיזוטופ היציב בשמן צמחי [mg/mL]. קבעו את הנפח הכולל של שמן צמחי נדרש. חשב את משקל השמן הנדרש, בהתבסס על הנפח המחושב והצפיפות היחסית של שמן הצמח (ראו טבלה 2 לדוגמה).
    הערה: למען דיוק, מומלץ לשקול את השמן להכנת איזוטופ יציב. לאחר חישוב הנפח הכולל של השמן הנדרש, ניתן להזמין את המעקב המסומן באיזוטופ יציב. חשוב לבקש לשלוח את מעקב האיזוטופ בבקבוק בנפח מספיק שיאפשר לצוות המחקר לשקול את שמן הצמח ישירות לבקבוק המכיל את המעקב המסומן באיזוטופ.

4. הכנת מעקב יציב מסומן באיזוטופים באזורים ייעודיים להכנת מזון

  1. פתח בזהירות את מכסה הבקבוק הענבר המכיל את הכמות הכוללת שנקבעה מראש של האיזוטופ היציב ומניח אותו על איזון אנליטי, אשר לאחר מכן מעובד לאפס.
  2. הוסיפו את השמן בטיפה עד להשגת המשקל הרצוי (בדיוק של ± 0.1 גרם) באמצעות מזרק סטרילי בנפח 10 מ"ל.
    הערה: מכיוון שחלק מהגבישים של רטיניל-אצטט עלולים להילכד בתוך פקק הבקבוק הענברי, יש לפתוח את הבקבוק בזהירות רבה. לאחר הוספת שמן צמחי לבקבוק הענבר, הפקק מונח בזהירות חזרה על הבקבוק, ואז מנענע ביד בזהירות כדי להחזיר את גבישי רטיניל אצטט שנותרו בתוך המכסה.
  3. הניחו את הבקבוק באמבט מים סוניקי עם עוצמה אולטרסונית: 14 W/L ותדר פעולה: 44 kHz. מלא במים מעל רמת השמן בבקבוק, אך מתחת לגובה המכסה, כדי למנוע כניסה של מים בטעות למכין.
  4. סוניקציה של הבקבוק ל-15 דקות לפני ערבוב ידני זהיר, ואז סוניקציה נוספת 15 דקות. יש להיזהר שטמפרטורת אמבט המים הסוניקטיבית לא תעלה על 50 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשימוש בשמן חמניות להכנה, מצאנו כי איזומריזציה לרטינואידים ציסג'נדריים אינה מתרחשת כאשר המינון נחשף ל-50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (ראו איור 2). עם זאת, יש לנתח את ההכנות על ידי HPLC כדי להעריך את היקף האיזומריזציה התרמית.
  5. הניחו את הבקבוק באמבט מים מחומם בטמפרטורה של 50°C למשך 30 דקות כדי להמיס לחלוטין את המיקרוקריסטלים.
  6. קחו דגימת שמן של 20 מיקרוליטר כדי לבדוק נוכחות מיקרו-גבישים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 200 במעבדה. אם קיימים מיקרו-גבילים, חזור על תהליך הקול והחימום.
  7. לאחר השגת המסה מלאה, מחלקים את כל הכנת השמן לבקבוקי זכוכית ענבר סטריליים בנפח 2 - 4 מ"ל. השתמשו בפיפטות עם תזוזה חיובית להליך זה כדי למנוע זיהום צולב.
    הערה: נפח מעקב האיזוטופים היציב שנוסף לבקבוקי הזכוכית הענברי ניתן להונחה על ידי קצב הגיוס היומי, לדוגמה, אם מגויסים 5 נבדקים ביום ונפח המינון הוא 150 מיקרוליטר, הבקבוקון צריך להכיל מספיק נפח כדי לפצות על 5 מנות בתוספת הפסדי פיפטינג: 5 x 150 מיקרוליטר x 1.2 = 900 מיקרוליטר.
  8. קבעו ריכוז איזוטופ יציב בשלושה עותקים. שמרו 200 מיקרוליטר שמן צמחי טהור (המשמש להכנת ריק ספקטרופוטומטרי) ו-200 - 350 מיקרוליטר של מינון איזוטופ יציב בבקבוקי ענבר נפרדים בנפח 2 מ"ל במהלך הכנת האיזוטופ היציב המסומן בעקבות.
    1. אם ריכוז המינון הוא ≤ 0.5 מ"ג RE, שמור 350 מיקרוליטר מהאיזוטופ היציב בבקבוקון ענבר נפרד בנפח 2 מ"ל. לריכוזי מינון > 0.5 מ"ג RE, שמרו 200 מיקרו-ליטר מהאיזוטופ היציב בבקבוקון ענבר נפרד בנפח 2 מ"ל.
  9. כיסו את הבקבוקונים בגז אינרטי (Ar) כדי לעכב את החמצון הפוטנציאלי של המעקב המסומן באיזוטופים, סגרו היטב ואחסנו בקופסת קריוקופסה המסומנת בריכוז איזוטופים, נפח מינון (שנקבע לאחר מכן), תאריך ההכנה ושם הפרויקט. אחסן את תיבת הקריובוקס במקפיא מזון בטמפרטורה של מינוס 20°C עד למשלוח. בתנאים אלו, מינון המעקב יציב לפחות לשנתיים.

5. קביעת ריכוז יציב של מעקב איזוטופים במעבדה

  1. מדלל את האיזוטופ היציב בשלושה בקבוקים נפחיים עם n-הקסאן. מלאו בקבוקים נפחיים ב-n-הקסן עד 1 ס״מ מתחת לקו הכיול לפני הוספת מינון העוקב.
    1. קבעו את הדילול של האיזוטופ היציב על ידי ריכוז המינון של העוקב. אם ריכוז המינון של מעקב האיזוטופ היציב הוא ≤ 0.5 מ"ג RE, יש לדלל 100 מיקרוליטר מהמינון היציב של האיזוטופ בבקבוק נפחי של 50 מ"ל עם n-הקסאן. אם ריכוז המינון נע בין 0.5 ל-2 מ"ג RE, אז 50 מיקרוליטר של מינון איזוטופ יציב בבקבוק נפחי של 50 מ"ל עם n-הקסאן. אם ריכוז המינון הוא >2 מ"ג RE, אז 50 מיקרוליטר של מינון איזוטופ יציב בבקבוק נפחי של 100 מ"ל עם n-הקסאן.
    2. יש לשחרר ישירות 50 או 100 מיקרו ליטר שמן אל ההקסאן ולבקבוק בנפח של 50 או 100 מ"ל עם הקסאן נוסף באמצעות פיפטת זכוכית של פסטר. הפוך את הבקבוקון 10 פעמים כדי לערבב את השמן עם ההקסאן.
      אזהרה: יש לטפל בהקסאן בארון עשן, וללבוש ציוד מגן מתאים. פסולת הקסן נאספת במיכל ייעודי להטמנה מיוחדת על ידי קבלן מאושר.
  2. הכינו את הבקבוק הריק הספקטרופוטומטרי על ידי פיפסת אותו נפח שמן צמחי כמו מעקב האיזוטופ היציב (50 או 100 מיקרוליטר) והזרקתו להקסאן. ודאו שהדילול המופעל (50 או 100 מ"ל) זהה לזה של האיזוטופ היציב. הפוך את הבקבוקון 10 פעמים כדי לערבב את השמן עם ההקסאן.
    הערה: לפיפטינג של איזוטופ יציב או שמן טהור, נעשה שימוש בפיפטה בעלת תזוזה חיובית בנפח 100 מיקרוליטר. כדי להבטיח שנפחים מדויקים יפיפטו, חשוב מאוד לנגב את הקצה כלפי מטה באמצעות נייר נטול סיבים כדי להסיר שאריות מעקב/שמן מהחלק החיצוני של הקצה. יש להיזהר בעת ניגוב קצה הפיפטה ההחלפה הישירה כדי שהנייר לא ייגע בפתח הקצה, שכן שמן יישאב מתוך הקצה.
  3. מדדו את ריכוזי האיזוטופים היציבים בקובטה קוורץ באמצעות ספקטרופוטומטר שמוגדר לאורך גל של 325 ננומטר, תוך שימוש בשמן הצמחי בהקסן כבסיס ספקטרופוטומטרי (ראו טבלה 3 לדוגמה).
    1. התחל במדידות עם שמן צמחי בהקסן כמכשיר הספקטרופוטומטרי. נקה את הקובט UV של הקוורץ בין כל מדידה על ידי שטיפה 3 פעמים עם n-הקסאן. לאחר שכל הדגימות, נקה בזהירות את הקווטה באמצעות n-הקסן טהור.
  4. קבעו את ריכוז מעקב האיזוטופ היציב באמצעות קריאות ממוצעות של AU והחלו את מקדם ההכחדה המולרית הספציפי לאיזוטופים באמצעות חוק ביר-למברט. מכך, יש לחשב את נפח האיזוטופ היציב המוכן הנדרש לכל מנה (ראו דוגמה בתוצאות מייצגות למטה ובטבלה 3).

תוצאות

חישוב גודל המינון הכולל של מעקב איזוטופים
למחקר בגודל מדגם של 100 נבדקים, חושבה כמות ה-[13C10] רטיניל אצטט הכוללת כדי לזהות את כמות [13C10] רטיניל אצטט שצריך לסנתז (טבלה 2). הכמות מבוססת על חישובי הספק עבור גודל המדגם הנדרש (n = 100), שחיקה צפויה (n=15; שחיקה של 15%), אובדן פיפטינג (20%) וריכוז רטיניל אצטט [13C10] למנה (0.4 מ"ג RE; בהתבסס על רגישות ספקטרומטר המסה שהוחל, אורך הניסוי וקבוצת הגיל של הנבדקים). הכמות הכוללת של RE הנדרשת (55.2 מ"ג RE) מומרת למשקל הנדרש עבור [13C10] רטיניל אצטט (63 מ"ג).

כדי לחשב את נפח שמן החמניות הנדרש להמיס [13C10] רטיניל אצטט בריכוז הרצוי, נקבע תחילה את נפח מתן המנה ל-150 מיקרוליטר/מנה (0.15 מ"ל/מנה). לאחר מכן מחושב ריכוז [13C10] רטיניל אצטט ב-1 מ"ל שמן חמניות (טבלה 2). חלוקת המשקל הנדרש ל-[13C10] רטיניל אצטט (63 מ"ג) בריכוז המינון הנדרש נותנת את הנפח הכולל של שמן החמנייה הנדרש. לבסוף, משקל שמן החמנייה נקבע באמצעות צפיפות יחסית של שמן החמניות.

ריכוז המינון המדויק של [13C10] רטיניל אצטט בשמן אושר על ידי מדידת ריכוזי האיזוטופים היציבים באמצעות ספקטרופוטומטר המבוסס על חוק ביר-למברט (טבלה 3). התחשבות בדילול האיזוטופ היציב במהלך המדידה (פקטור דילול של 500) נותנת ריכוז של 2.58 מיקרומול/μL [13C10] רטיניל אצטט בשמן. הנפח הסופי של מעקב האיזוטופ היציב המוכן הנדרש למינון של 0.4 מ"ג RE נקבע כ-155 מיקרוליטר (טבלה 3).

בדיקת איזומריזציה פוטנציאלית של מינון העוקב
טוהר האיזומרי של מינון המעקב שהושג נקבע על ידי בדיקת איזומריזציה של סיס באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC; איור 2). לצורך ביצוע זה, דגימה מתמיסת המעקב המדוללת משלב 5.1.2 יובשה תחת גז חנקן והשאריות הומסו מחדש לאתנול 100% להזרקה. ניתוח HPLC של 3 דגימות חוזרות בוצע בשיטת ליו ואח' 34 כדי לבדוק איזומריזציה ציס-(ראו איור 2). יש לעקוב אחר טוהר מינון המעקב לאורך כל המחקר כדי לוודא שהמינון אינו מתדרדר.

השפעת ריכוזי מינון המעקב על חלק מהמינון לאורך זמן
יישום של רמות מינון שונות יוביל לשינוי בחלק מהמינון שנצרך לאורך זמן, מה שעשוי להשפיע על יכולת הפלטפורמה האנליטית לזהות רטינול [13C10] בכל הנבדקים בנקודות הזמן הנדרשות. יישום מינון של 1 מ"ג או 0.4 מ"ג של [13C10] רטיניל אצטט בשמן במבוגרים (איור 3A) או ילדים (איור 3B) הצביע על שיעור גבוה יותר במינון לאחר מתן 1 מ"ג לעומת 0.4 מ"ג של [13C10] רטיניל אצטט, ואישר את יכולת ה-LC-MS/MS המופעל לזהות [13C10רטינול בנבדקים עד 28 ימים לאחר המינון. דבר זה מאשר שהמידע על שבר המינון בנקודות זמן משתנות הוא קריטי להחלטה אם רמת המינון המופעלת גבוהה מספיק כדי לקבל אות מעל רמת הגילוי בפלטפורמת הניתוח המופעלת, וכי יש לקבל מידע זה באופן אידיאלי במהלך מחקר פיילוט עם דגימות מייצגות.

figure-results-1
איור 1: תרשים זרימה להכנת מנות מעקב ויטמין A. שלבים מרכזיים להכנת מינון איזוטופים יציבים כוללים קביעת הכמויות הנדרשות, ריכוז מינון המעקב שהושג ואישור טוהר המינון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: כרומטוגרמה HPLC של מינון המעקב לחקירת איזומריזציה של רטיניל אצטט. האיזומריזציה הפוטנציאלית של [13C10] רטיניל אצטט לאחר (A) סוניקציה ו-(B) חימום ל-50°C למשך 30 דקות כל אחד הוערכה באמצעות ניתוח HPLC של מינון האיזוטופ לאחר כל שלב. הניתוח בוצע על HPLC עם זיהוי מערך דיודות בשיטת Liu ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: ממוצעים נצפו של חלק המינון של רטינול בפלזמה לאורך זמן לאחר צריכת [13C10]רטיניל אצטט. חלק מהמינון מ-(A) 45 מבוגרים בבריטניה16 ו-(B) 112 ילדים פיליפינים1 שקיבלו מינון של 1 מ"ג או 0.4 מ"ג [13C10]רטיניל אצטט, בהתאמה. שבר המינון = {פלזמה [13מעלות צלזיוס]ריכוז רטינול (μmol/L) X נפח פלזמה מוערך (L) / [13C]מינון (μmol). הנתונים מוצגים כממוצע גיאומטרי ± SEM. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איזוטופ יציבספק/יצרן
[D4]-רטיניל אצטטBuchem BV/ReseaChem GmbH/ מעבדת איזוטופים קיימברידג'
[D6]-רטיניל אצטטBuchem BV/ReseaChem GmbH/ מעבדת איזוטופים קיימברידג'
[D8]-רטיניל אצטטBuchem BV/ReseaChem GmbH/ מעבדת איזוטופים קיימברידג'
[13C3]-רטיניל אצטטBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-רטיניל אצטטBuchem BV/ReseaChem GmbH/ מעבדת איזוטופים קיימברידג'
[13C8]-רטיניל אצטטBuchem BV/ReseaChem GmbH/ מעבדת איזוטופים קיימברידג'
[13C10]-רטיניל אצטטBuchem BV/ReseaChem GmbH/ מעבדת איזוטופים קיימברידג'

טבלה 1: מעקבי איזוטופים יציבים של ויטמין A זמינים מסחרית. רשימת מעקבי רטיניל אצטט מסומנים 13C ו-2Hמספקים שונים.

פרמטרים
גודל מדגם [n]:100
שחיקה [n] (%):15 (15%)
הפסדי פיפטינג:20%
MW [13C10]רטיניל אצטט:338.5 μg/μmol
MW [13C10] רטינול:296.46 מיקרוגרם/מיקרומול
גודל המינון:0.4 מ"ג RE של [13C10] רטיניל אצטט לכל מתנדב
חישוב
הסכום הכולל של RE הנדרש:= גודל מינון ב-mg RE x גודל דגימה x שחיקה x אובדני פיפטינג
= 0.4 מ"ג RE x 100 x 1.15 x 1.2
= 55.2 מ"ג RE
כמות כוללת של [13C10] רטיניל אצטט נדרש:= מ"ג RE x MW [13C10]רטיניל אצטט / MW [13C10]רטינול
= 55.2 מ"ג RE x 338.5 מיקרוגרם/מיקרומול / 296.46 מיקרוגרם/מיקרומול
= 63.0 מ"ג [13C10] רטיניל אצטט
ריכוז המינון של [13C10] רטיניל אצטט בשמן:[13C10] רטיניל אצטט [mg/ml] =
(מ"ג RE x MW [13C10]רטיניל אצטט / MW [13C10]רטינול) / 0.15 מ"ל
= (0.4 מ"ג RE x 338.5 מיקרוגרם/מיקרומול / 296.46 מיקרוגרם/מיקרומול) / 0.15 מ"ל
= 3.04 מ"ג/מ"ל
הכמות הכוללת של שמן חמניות נדרש:= משקל / מינון ריכוז רטיניל אצטט [13C10] בשמן
= 63.0 מ"ג / 3.04 מ"ג/מ"ל
= 20.7 מ"ל שמן
משקל שמן החמנייה הנדרש:= נפח כולל של שמן חמניות x צפיפות יחסית שמן חמניות
= 20.7 מ"ל x 0.92 גרם למ"ל
= 19.0 גרם שמן חמניות

טבלה 2: דוגמה לחישובי גודל מינון יציב של מעקב איזוטופים. סימון פרמטרים וחישובים לקביעת מינון המעקב וכמויות שמן צמחי.

פרמטרים
מקדם הכחדת טוחנות (E1%1 ס"מ) של [13C10] רטיניל אצטט בהקסאן:52718 L mol-1 ס"מ-1 x 1 ס"מ
גורם דילול:500 (100 מיקרוליטר של הכנת שמן ב-50 מ"ל הקסאן)
ספיגה ממוצעת מדודה:0.917
MW [13C10] רטינול:296.46 מיקרוגרם/מיקרומול
חישוב
ריכוז (mol/L) של [13C10] רטיניל אצטט בהקסאן:ריכוז (mol/L) = ספיגה / E1%1 ס"מ x אורך הקובטה (1 ס"מ)
= 0.917 / 52718 L mol-1 ס"מ-1 x 1 ס"מ = 1.739 x 10-5 mol/L
המרת ריכוז למיקרומול/μL:ריכוז (mol/L) = ריכוז (μmol/μL)
1.739 x 10-5 mol/L שווה ערך ל-1.739 x 10-5 מיקרומול/μL
תיקון לדילול:1.739 x 10-5 מיקרומול/מיקרוליטר x 500 = 8.697 x 10-3 מיקרומול/מיקרוליטר בשמן
משקל למיקרוליטר (μg/μL):= [13C10] רטיניל אצטט μmol/μL בשמן x MW [13C10]רטינול
= 8.697 x 10-3 מיקרומול/מיקרוליטר x 296.45 מיקרוגרם/מיקרומול = 2.58 מיקרוגרם/ליטר
נפח למנה:= נפח (μL/ מינון 400 מיקרוגרם) = 400 מיקרוגרם / 2.58 מיקרוגרם/μL = 155 מיקרו-ליטר

טבלה 3: קביעת ריכוז מינון יציב של מעקב איזוטופים. נדרשו פרמטרים וחישובים לקביעת ריכוזי מינון המעקב והנפחים הנדרשים למינון אוראלי.

דיון

מעקבי איזוטופים יציבים המשמשים במחקרים אנושיים נחשבים בדרך כלל לבטוחים, ללא השפעות ביולוגיות או פיזיולוגיות שליליות מדווחות בריכוזים25,35. עם זאת, מאחר שמעקב האיזוטופ היציב צריך להיות מונח דרך הפה, חשוב שהמינון של המעקב יעמוד בסטנדרטים של בטיחות מזון. ניתן להשיג זאת על ידי דרישה מהספקים והיצרנים של ויטמין A המסומן באיזוטופים יציבים לבצע בדיקות בטיחות מזון על האיזוטופים 7,20,24 המסופקים. כמו כן, חשוב שהכנת ואחסון האיזוטופים יתבצעו רק באזורים ייעודיים להכנת מזון. יתרה מזאת, כל הציוד המשמש להכנת איזוטופים יציבים חייב להיות מוקדש רק להכנת איזוטופים ולשמור באזורים להכנת מזון.

איזוטופים המסומנים באצטט רטיניל הומסו בעבר באמצעות אתנול, יובשו תחת גז חנקן לפני שהומסו לשמן צמחי36. כאן אנו מציגים שיטה שמאפשרת להמיס את העוקב המסומן באיזוטופ לשמן צמחי באמצעות שילוב של סוניקציה וחום. למרות ששיטה זו קלה יותר לביצוע באזור הכנת מזון, יש להיזהר בעת חימום להמיס את המעקב בשמן צמחי. כל הטרנס-רטינול עובר איזומריזציה ל-13-ציס-רטינול במהלך טיפול חום, שמאיץ עם טמפרטורות גבוהותיותר 37. איזומריזציה של רטינול עולה עוד יותר בעקבות חשיפה לאור32. יתרה מזאת, היציבות של רטינול מושפעת מתכונת החמצון השומנית של שמן צמחי32,38. מכיוון שתכולת α טוקופרולים בשמן צמחי משפיעה לטובה על שימור ויטמין A32, ושמן חמניות מכיל אחד התכולים הגבוהים ביותר של α-טוקופרול33, בחרנו להשתמש בשמן חמניות להכנת מנות המעקב. ההחלטה להחיל חום עד 50°C להמסה של הטרייסר התבססה על יישום חום להפשרת גבישי רטינול במוצרי קוסמטיקה ללא אובדן משמעותי39. למרות שלא ראינו פירוק משמעותי של רטיניל אצטט לפי הפרוטוקול המתואר, חשוב לבדוק איזומריזציה ציס של מינון המעקב מיד לאחר הטיפול בחום (איור 2). אנו ממליצים בנוסף לעקוב אחר יציבות מינון המעקב לאורך כל המחקר כדי לאשר את ריכוז מינון המעקב.

המעקב חייב להיות מוכן בריכוז גבוה בטווח הנפח של מערכת האספקה המשמשת למתן המנה הנדרשת. מכיוון ש-RID מסתמך על אספקה מדויקת של מעקבים יציבים עם סימון איזוטופים, מומלץ להשתמש בפיפטה בעלת הזזה חיובית ליישום מינון. למרות שגדלי מינון של עד 1 מ"ל הוחלו בעבר על מבוגרים 16,20,40, קל יותר להחיל נפחים בין 100 ל-250 מיקרוליטר, שכן נפחים אלו הוכחו כנסבלים היטב על ידי תינוקות וילדים 1. לחילופין, ניתן גם לתת מנות בצורת קפסולה17, אך חשוב לבחור קפסולות שמיועדות במיוחד למניעת דליפת שמן ולהבטיח קבלה בקרב אוכלוסיית המחקר. לבסוף, רמות המינון המיושמות תלויות בקבוצת הגיל של אוכלוסיית היעד29, ביכולת של הפלטפורמה האנליטית לזהות רמות נמוכות3 ובמאגרי הגוף הכוללים של אוכלוסיית היעד, עם שיעור פלזמה נמוך יותר במינון במאגרי גוף כולליםגבוהים יותר 1.

כפי שצוין בדוגמה לעיל, [13C10] רטיניל אצטט בריכוז של 2.58 מיקרוגרם/מיקרוליטר בשמן חמניות יספק מינון של 0.4 מ"ג טרייסר RE ב-155 מיקרוליטר שמן חמניות, שניתן לספק בדיוק באמצעות פיפט חיובי של 250 מיקרוליטר. כדי להשיג ריכוזים שנמצאים בגבולות הנפח של מערכת המשלוח, חשוב מאוד ששמן הצמחי שנבחר להמיס את המעקב יישקל במדויק באמצעות איזון אנליטי (מדויק עד 0.1 גרם) לתוך הבקבוק המכיל את האיזוטופ היציב. לדוגמה, אם יש להכין בסך הכל 63 מ"ג [13מ"ג10] רטיניל אצטט בריכוז של 3.04 מ"ג/מ"ל בשמן חמניות, והמשקל הסגולי של שמן החמניות הוא 0.92 גרם למ"ל בטמפרטורה של 25 ◦ צלזיוס, אז יש לשקול 19.0 גרם (20.7 מ"ל x 0.92 גרם למ"ל) של שמן לתוך הבקבוק המכיל את המעקב. למרות שהריכוז הסופי של מעקב האיזוטופ היציב יאושר באמצעות קריאת ספקטרופוטומטר, שקילה מדויקת של מעקב האיזוטופ והשמן המוחל תבטיח שהריכוזים המתקבלים קרובים לנפח המסירה שנבחר לכל מנה.

מומלץ להפריד את תכשילי השמן לפי הדרישה היומית הצפויה כדי להבטיח שכל המנות בבקבוקון ישמשו תוך שבועיים מפתיחת הבקבוקון. מומלץ לשמור את חומרי השמן על שקיות קרח בשדה במהלך השימוש ולהקפיא אותם מחדש בהקדם האפשרי לאחר סיום המינון. למרות שההכנות בשמן אינן מושפעות ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים, יש להגן עליהן תמיד מהאור ולהקפיא אותן כשאינן בשימוש.

לסיכום, פרוטוקול זה מפרט את ההכנה המדויקת ובקרת האיכות של מנות המעקב לשיטת RID, ומבטיח מינון מדויק, יציבות ובטיחות. השיטה מחשבת את דרישות המעקב, אופטימיזציה של מסיסות בשמן צמחי, ומאמתת טוהר וריכוז באמצעות ספקטרופוטומטריה ו-HPLC. הנחיות טיפול ואחסון קפדניות מבטיחות שלמות מעקב אמינה להערכות מדויקות מבוססות איזוטופים.

גילויים

למחברים אין מה להצהיר.

תודות

תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי קרן ביל & מלינדה גייטס (מספר פרויקט: OPP1115464) והסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית (IAEA) בווינה (פרויקט מספר E4.30.30).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקי זכוכית ענבר בגודל 2 מ"ל לציון מינוניםפישר11573690בהתאם לגודל המדגם של המחקר ולכמות המתנדבים שמקבלים מינון יומי, ייתכן שיהיה יעיל יותר להשתמש בבקבוקים ענבר גדולים יותר, למשל 4 מ"ל
בקבוקי נפח של 100 מ"לפישר11323644בקבוק זכוכית בורוסיליקט מסוג Pyrex Class A מוסמך לבקבוק נפחי מוסמך
בקבוקי נפח של 50 מ"לפישר11313644בקבוק זכוכית בורוסיליקט מסוג Pyrex Class A מוסמך לבקבוק נפחי מוסמך
משקלים אנליטיים פישר13592970
בוכנות קפילריות (קצות פיפטה) CP100 10x96 TIPACKגילסוןFD148314
בוכנות קפילריות CP1000ST 2x91גילסוןF148180
בוכנות קפילריות CP250ST 6x96גילסוןF148714
קרקופסת קרטוןסטארלאבA9623-8181
קוורץ UV של Hellma cuvetteSLSCEL1600
הקסן 95% n-הקסן עבור HPLC מאושרפישרH/0406/17
מכסים לבקבוקי זכוכית ענבר בצבע 2 מ"לפישר11573542
מיקרומן E M1000E פיפט (הדחפה חיובית)גילסוןFD10006
Microman E M100E פיפט (תזוזה חיובית)גילסוןFD10004
Microman E M250E Pipette (תזוזה חיובית)גילסוןFD10005
מיקרוסקופניקוןאקליפס E400
שקופיות זכוכית מיקרוסקופיות סיגמא41122601
אמבט מים סוניקיVWRUSC100T
ספקטרופוטומטרתרמו פישר סיינטיפיקA51119600C
איזוטופ יציב מסומן בעקבות רטיניל אצטטבוכם BVלא זמיןניתן להשתמש במגוון איזוטופים יציבים עבור שיטת RID. רשימה של איזוטופים מסחריים שונים מוצגת בטבלה 1. 
אמבט מים ללא ערבובSLSSLS1176
שמן צמחיכל סופרמרקטלא זמיןחשוב להשתמש בשמן צמחי טרי עם חיי מדף מספקים להכנת מינוני איזוטופים.
פיפטת פסטור זכוכית מנותקת וולאק 150 מ"מSLSPIP4150

מקורות

  1. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  2. Haskell, M. J., Jamil, K. M., Peerson, J. M., Wahed, M. A., Brown, K. H. The paired deuterated retinol dilution technique can be used to estimate the daily vitamin A intake required to maintain a targeted whole body vitamin A pool size in men. J Nutr. 141 (3), 428-432 (2011).
  3. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  4. Pinkaew, S., et al. Triple-Fortified Rice Containing Vitamin A Reduced Marginal Vitamin A Deficiency and Increased Vitamin A Liver Stores in School-Aged Thai Children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  5. VMNIS: Serum retinol concentrations for determining the prevalence of vitamin A deficiency in populations. , World Health Organisation. https://www.who.int/publications/i/item/WHO-NMH-NHD-MNM-11.3 (2011).
  6. Engle-Stone, R., et al. Plasma retinol-binding protein predicts plasma retinol concentration in both infected and uninfected Cameroonian women and children. J Nutr. 141 (12), 2233-2241 (2011).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Larson, L. M., et al. Approaches to Assess Vitamin A Status in Settings of Inflammation: Biomarkers Reflecting Inflammation and Nutritional Determinants of Anemia (BRINDA) Project. Nutrients. 10 (8), (2018).
  9. Sheftel, J., Tanumihardjo, S. A. Systematic Review and Meta-Analysis of the Relative Dose-Response Tests to Assess Vitamin A Status. Adv Nutr. 12 (3), 904-941 (2021).
  10. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  11. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  12. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  13. Green, M. H., Ford, J. L., Green, J. B. Development of a Compartmental Model to Investigate the Influence of Inflammation on Predictions of Vitamin A Total Body Stores by Retinol Isotope Dilution in Theoretical Humans. J Nutr. 151 (3), 731-741 (2021).
  14. Suri, D. J., et al. Association between Biomarkers of Inflammation and Total Liver Vitamin A Reserves Estimated by (13)C-Retinol Isotope Dilution among Preschool Children in 5 African Countries. J Nutr. 153 (13), 622-635 (2023).
  15. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  16. Green, M. H., et al. A Retinol Isotope Dilution Equation Predicts Both Group and Individual Total Body Vitamin A Stores in Adults Based on Data from an Early Postdosing Blood Sample. J Nutr. 146 (10), 2137-2142 (2016).
  17. Green, M. H., et al. Use of Population-Based Compartmental Modeling and Retinol Isotope Dilution to Study Vitamin A Kinetics and Total Body Stores among Ghanaian Women of Reproductive Age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  18. Haskell, M. J., et al. Population-based plasma kinetics of an oral dose of [2H4]retinyl acetate among preschool-aged, Peruvian children. Am J Clin Nutr. 77 (3), 681-686 (2003).
  19. Lopez-Teros, V., et al. Use of a "Super-child'' Approach to Assess the Vitamin A Equivalence of Moringa oleifera Leaves, Develop a Compartmental Model for Vitamin A Kinetics, and Estimate Vitamin A Total Body Stores in Young Mexican Children. J Nutr. 147 (12), 2356-2363 (2017).
  20. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  21. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Quantitative assessment of total body stores of vitamin A in adults with the use of a 3-d deuterated-retinol-dilution procedure. Am J Clin Nutr. 77 (3), 694-699 (2003).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  23. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  24. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Methods Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  25. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  26. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  27. Wang, J., et al. Vitamin A equivalence of spirulina beta-carotene in Chinese adults as assessed by using a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 87 (6), 1730-1737 (2008).
  28. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  29. Green, M. H., Lopez-Teros, V., Green, J. B. Does the Amount of Stable Isotope Dose Influence Retinol Kinetic Responses and Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method in Theoretical Children and Adults. J Nutr. 152 (1), 86-93 (2022).
  30. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Bioconversion of plant carotenoids to vitamin A in Filipino school-age children varies inversely with vitamin A status. Faseb J. 14 (4), A486-A486 (2000).
  31. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  32. Hemery, Y. M., et al. Influence of light exposure and oxidative status on the stability of vitamins A and D3 during the storage of fortified soybean oil. Food Chem. 184, 90-98 (2015).
  33. Shahidi, F., de Camargo, A. C. Tocopherols and Tocotrienols in Common and Emerging Dietary Sources: Occurrence, Applications, and Health Benefits. Int J Mol Sci. 17 (10), (2016).
  34. Liu, Z., Lee, H. J., Garofalo, F., Jenkins, D. J. A., El-Sohemy, A. Simultaneous Measurement of Three Tocopherols, All-trans-retinol, and Eight Carotenoids in Human Plasma by Isocratic Liquid Chromatography. J Chromatograph Sci. 49 (3), 221-227 (2011).
  35. Davies, P. S. W. Stable isotopes: their use and safety in human nutrition studies. Eur J Clin Nutr. 74 (3), 362-365 (2020).
  36. Haskell, M. J., Ribaya-Mercado, J. D. Handbook on Vitamin A Tracer Dilution Methods to Assess Status and Evaluate Intervention Programs. , Harvest Plus Technical Monographs. (2005).
  37. Han, S. H., et al. Quantitative characterization of degradation behaviors of antioxidants stabilized in lipid particles. Talanta. 71 (5), 2129-2133 (2007).
  38. Park, H., Mun, S., Kim, Y. R. UV and storage stability of retinol contained in oil-in-water nanoemulsions. Food Chem. 272, 404-410 (2019).
  39. Retinol 50C, 15D and 10S. , BASF. https://www.skinident.world/fileadmin/img/spanish-pictures/pdf/BASF_Vitamin_A.pdf (2005).
  40. Green, M. H., et al. Plasma Retinol Kinetics and beta-Carotene Bioefficacy Are Quantified by Model-Based Compartmental Analysis in Healthy Young Adults with Low Vitamin A Stores. J Nutr. 146 (10), 2129-2136 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

13
ניסוח מינוני מעקב ויטמין A למתן לנבדקים אנושיים באמצעות טכניקת דילול איזוטופים רטינול
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.