מאמר שיטה

בדיקה סרולוגית מולטיפלקס לאיתור תגובות נוגדנים לארבו-וירוסים

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69259

⸱

4 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Infectious Diseases Epidemiology and Analytics G5 Unit, Department of Global Health, Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM U1347, 2Laboratory for Urgent Response to Biological Threats (CIBU), Environment and Infectious Risks (ERI) Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 3Immunology of Infectious Diseases Unit, Institut Pasteur de Madagascar, 4MRC Centre for Infectious Disease Analysis and Modelling, School of Public Health, Imperial College London, 5Immunophysiopathology and Infectious Diseases Department, Institut Pasteur de Dakar, 6Pasteur Network, Institut Pasteur, 7Department of Immunology, Institut Pasteur

במאמר זה

סיכום

בדיקות אימונולוגיות פלואורסצנטיות מרובות הופכות להתייחסות לבדיקות סרולוגיות. היישום שלהם, לעומת זאת, מוגבל על ידי המורכבות ותהליכי הצימוד הגוזלים זמן. דוח זה מציג פרוטוקול צימוד חרוזים מיקרוספירה מרובה אוטומטי למחצה הניתן לשחזור הניתן לשחזור הניתן לשחזור הניתן להשוואה לשיטה הסטנדרטית תוך קיצור משמעותי של זמן התוצאות.

תקציר

נגיפים הנישאים על ידי פרוקי רגליים (arbovirus) הם קבוצה של פתוגנים הנישאים על ידי יתושים המופצים ברחבי העולם. מאז התפרצות נגיף הזיקה (ZIKV) באמריקה ב-2016 שהביאה את הזיהומים הללו למודעות הציבורית, ארבו-וירוסים ממשיכים להטיל נטל ניכר על בריאות הציבור. הופעתם באזורים שבעבר לא היו אנדמיים היא סיבה לדאגה לבריאות הציבור. המעקב והבקרה של זיהומים ארבו-ויראלים הם בראש סדר העדיפויות הנוכחי של ארגון הבריאות העולמי (WHO), שהשיק תוכנית אסטרטגית גלובלית למאבק במחלות ארבו-ויראליות בשנת 2024. טכנולוגיית המולטיפלקס® חוללה מהפכה בתחום המעקב הסרולוגי, ומאפשרת מדידה בו זמנית של מספר נוגדנים תוך דרישה לנפח דגימה מינימלי. בהתבסס על מומחיות בפיתוח בדיקות סרולוגיות מרובות, פותחה בדיקת מולטיפלקס מבוססת חרוזים לאיתור נוגדנים לאנטיגנים של ארבו-וירוס. הבדיקה כוללת מספר אנטיגנים ספציפיים לנגיפי ארבו-וירוסים נפוצים, כולל נגיפי דנגי (DENV), קדחת צהובה (YFV), זיקה וצ'יקונגוניה (CHIKV). נעשה שימוש בשיטה אוטומטית למחצה כדי לקשור קוולנטית אנטיגנים לחרוזי מיקרוספרה. פרוטוקול חדש זה יעיל ביותר, ומאפשר צימוד של עד 96 אנטיגנים בניסוי יחיד תוך הבטחת תוצאות הניתנות לשחזור. נתוני עוצמת הקרינה החציונית (MFI) נרכשו באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית ידידותית למשתמש. כאשר מיושמים על דגימות סרום אנושיות ממדינות אנדמיות, אנו צופים כי בדיקה זו תהווה כלי רב עוצמה למאמצי מעקב סרו.

מבוא

ארבו-וירוסים מהווים ביחד אלפי מקרי מוות מדי שנה. נגיפים אלה מועברים לבני אדם באמצעות פרוקי רגליים נגועים, בעיקר יתושים וקרציות. חומרת הזיהומים הארבו-ויראלים מגוונת ונעה בין זיהום א-סימפטומטי למחלה קשה שעלולה להוביל למוות. בשנת 2024, ארגון הבריאות העולמי (WHO) רשם למעלה מ-10,000 מקרי מוות שנגרמו מארבעת הסרוטיפים של נגיף הדנגי (DENV) בלבד1. באותה שנה, הנגיף הדביק למעלה מ-14 מיליון בני אדם, כולל 50,000 מקרים קשים1. בעוד ש-DENV הוא הארבו-וירוס הבולט ביותר, הקבוצה כוללת פתוגנים מסכני חיים אחרים שהיו אחראים להתפרצויות מרובות ברחבי העולם. סקירה מסכמת שנערכה לאחרונה על זיהומים ארבו-ויראלים באפריקה מצאה כי נגיפים אלה, כולל DENV, נגיף הקדחת הצהובה (YFV), נגיף הצ'יקונגוניה (CHIKV), נגיף קדחת קרים-קונגו (CCHFV), נגיף קדחת עמק השבר (RVFV), נגיף הנילוס המערבי (WNV) ונגיף הזיקה (ZIKV), גרמו לפחות ל-29 התפרצויות ברחבי היבשת בשנת 20232. בשנת 2022, דו"ח שפורסם על ידי המשרד האזורי של ארגון הבריאות העולמי לאפריקה הדגיש את המגבלות הנוכחיות במעקב אחר ארבו-וירוס ברחבי האזור, והדגיש את הצורך הדחוף בפיתוח שיטות למעקב ובקרה של ארבו-וירוס3.

אבחון קליני של זיהומים ארבו-ויראלים הוא מאתגר בשל הדמיון בתסמינים, כגון חום, דלקת מפרקים וחולשה כללית, המשותפים לפתוגנים אחרים הנמצאים באזורים אנדמיים4. בנוסף, בשל המחזור המשותף וההדבקה הפוטנציאלית של הנגיפים, קשה להבחין בין הפתוגן האטיולוגי5. אישור מעבדה הוא חיוני לאבחנה מבדלת. קיימות מספר שיטות לאיתור נגיפי ארבור בדגימות אנושיות. שיטות ישירות, כולל בדיקות אבחון מולקולריות, זיהוי אנטיגן ויראלי ובידוד נגיפי, מזהות את נוכחות הפתוגן, בעוד ששיטות עקיפות, כגון אבחון סרולוגי, מודדות את התגובה החיסונית לזיהום הנגיפי6.

פותחו שפע של שיטות לזיהוי תגובות נוגדנים לארבו-וירוסים. אלה כוללים מבחני אימונוסורבנט המקושרים לאנזים (ELISAs), קיבוע משלים, עיכוב המגלוטינציה ובדיקות אימונולוגיות מיקרוספרה 6,7. דוח זה מציג בדיקה חיסונית מבוססת מיקרוספרה פלואורסצנטית מרובה (FMIA) לזיהוי תגובות נוגדנים לאנטיגנים של ארבו-וירוס. מבחנים מבוססי מיקרוספרה8 נמצאים בשימוש נרחב בסרולוגיה ומציעים מספר יתרונות, החשוב ביותר, היכולת לזהות אנליטים מרובים בתגובה אחת עם נפח דגימה מינימלי. מיקרוספירות מקודדות אופטית (חרוזי פוליסטירן מגנטיים) המצופות באנטיגנים רקומביננטיים מעניינים משמשות בבדיקה חיסונית סרולוגית עקיפה. לאחר מכן מודגרים החרוזים המצומדים עם דגימות, ונוגדנים ספציפיים לאנטיגן מתגלים באמצעות נוגדן IgG משני אנטי-אנושי המצומד למדווח פלואורופור Phycoerythrin (PE). מספר אנלייזרים זמינים לזיהוי פלואורסצנטיות נפלטת, המדווחת כ-MFI.

עקרון הבדיקה מפורט ב- Angeloni et al.8. בקצרה, האנטיגנים המעניינים קשורים כימית למיקרוספירות מקודדות בצבע. לשם כך, החרוזים מטופלים בתחילה ב-1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] Carbodiimide (EDC) ו-N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), המפעילים את קבוצת הקרבוקסיל על פני החרוזים, ויוצרים תרכובת תגובתית-אמין. תרכובת ביניים יציבה למחצה זו מעורבבת לאחר מכן עם החלבון המבוקש, לפיו חלקיקי אמין של החלבון נקשרים קוולנטית לחרוזים, ויוצרים מיקרו-חרוזים יציבים המצופים בחלבון המעניין על פני השטח. החרוזים הקשורים לאנטיגן מודגרים בדגימות, מה שמאפשר לנוגדנים להיקשר לאנטיגנים ספציפיים. נוגדנים הקשורים לאנטיגן מתגלים באמצעות נוגדן משני אנטי-אימונוגלובולין המצומד לצבע פלואורסצנטי. אנו משתמשים בנוגדנים משניים עם תווית PE. MFI נמדדים באמצעות הדמיית אור (פרטי המכשיר מופיעים בטבלת החומרים). המכשיר משתמש בשתי נורות LED, נורית LED אדומה ונורית ירוקה, אשר מעוררות בנפרד את הצבעים הפנימיים של החרוזים ופלואורסצנטיות מדווח על פני החרוזים9. לאחר מכן משתמשים במסננים כדי לסווג חרוזים על סמך הצבע ולכמת את הקרינה הנפלטת מהאנליטים.

יישמנו בעבר את הטכנולוגיה לזיהוי תגובות נוגדנים ל-SARS-CoV-210 ולמחלות הניתנות למניעה באמצעות חיסון11 והראינו כי מבחני מולטיפלקס מהווים כלי רב ערך למחקרי שכיחות סרולוגית ומעקב. מטרת פרויקט זה היא להרחיב את השימוש ב-FMIA לזיהוי תגובות נוגדנים לאנטיגנים מרובים השייכים לארבו-וירוסים במטרה ליישם את הבדיקה לבדיקת דגימות מאזור אפריקה.

מבחני מולטיפלקס ארבו-וירוס באמצעות טכנולוגיית מולטיפלקס תוארו במקומות אחרים באמצעות מטרות אנטיגן שונות כגון חלבון לא מבני 1 (NS1)12,13 או תחום מעטפת III (EDIII)14. מוצגת בדיקת 50 פלקס, הכוללת 26 אנטיגנים של ארבו-וירוס (כולל NS1, EDIII, חלקיקים דמויי נגיף (VLPs), ומספר אנטיגנים אחרים לבדיקת פתוגנים המסתובבים במקביל באזור. הבדיקה תאפשר הערכה של עוצמת ההעברה של פתוגנים אלה. סיכום של אנטיגנים רקומביננטיים המשמשים לפיתוח הבדיקה מסופק בטבלה 1. הפרוטוקול המוצג בדוח זה פותח כהשלמה למחקר פיתוח שיטות נרחב המתמקד באופטימיזציה של זיהוי ארבו-וירוסים.

בדרך כלל, הצימוד (או הקיבוע) של אנטיגנים לחרוזי המיקרוספירה מתבצע בצינורות בודדים8 (צימוד ידני). תהליך זה גוזל זמן, מסורבל ונוטה לשגיאות שחזור. מאמר זה מדווח על פרוטוקול המשתמש במכשיר אוטומטי לביצוע השלבים העוקבים הכרוכים בקישור כימי של אנטיגנים לחרוזים. בכתב יד זה, אנו מדווחים על צעדים שננקטו לאימות הפרוטוקול החדש. האימות של הפרוטוקול החדש בוצע על ידי השוואת תגובות IgG שנמדדו עם FMIA של 50 plex באמצעות חרוזים מצומדים לאנטיגן שהוכנו בשיטה הידנית או בפרוטוקול האוטומטי. אימות נוסף של השיטה בוצע על ידי ניתוח דגימות סרום אנושיות מקבוצות אפריקאיות וצרפתיות.

פרוטוקול צימוד החרוזים האוטומטי מהיר, ומאפשר צימוד בו זמנית של עד 96 אנליטים בריצה אחת. חשוב מכך, התוצאות דומות לאלו המתקבלות באמצעות הפרוטוקול הידני שנקבע, עם שונות מופחתת בין אצווה לאצווה.

פרוטוקול

הושג אישור אתי מתאים לשימוש בדגימות אנושיות. הדגימות היו שאריות אנונימיות ממחקרים קודמים. הפרוטוקול לשימוש בדגימות ORPAL "סטנדרטיות" אושר על ידי מועצת האתיקה הלאומית של סורינאם (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), חוות דעת מספר VG 25-17). השימוש בדגימות ממדגסקר אושר כחלק מפרויקט PvSTATEM על ידי ועדת האתיקה של בית הספר להיגיינה ורפואה טרופית של לונדון (28541) והוועדה למחקר ביומדיקל של מדגסקר (135MSANP/SG/AMM/CERBM), בעוד שהשימוש בדגימות סנגליות אושר כחלק מפרויקט Dielmo ו-Ndiop המתמשך על ידי ועדת האתיקה הלאומית של מחקר הבריאות בסנגל (CNERS Sénégal). אישור למדוד נוגדנים למחלות NTD בדגימות אלה ניתן על ידי CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). דגימות צרפתיות לא אנדמיות הופקו מבדיקות רפואיות שגרתיות במעבדות בתי חולים צרפתיים ועובדו בהתאם לתקנות ולהנחיות הקיימות של הוועדה הצרפתית להגנה על נתונים (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertes). דגימות סרום אנושיות נלקחו מנבדקים מאזורים עם שכיחות גבוהה של ארבו-וירוסים ומאוכלוסייה צרפתית נאיבית. דגימות הסרום הושבתו בחום לפני השימוש על ידי דגירה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אם הדגימות אינן מושבתות, תפעל אותן מתחת לארון בטיחות. רוב האנטיגנים הרקומביננטיים הושגו באופן מסחרי למעט חלבונים רקומביננטיים EDIII, שסונתזו בבית. מכשיר מנתח מבוסס הדמיה9 שימש לרכישת נתונים. הריאגנטים והציוד המשמשים מסופקים בטבלת החומרים.

1. לקבוע ריכוזי אנטיגן אופטימליים לצימוד

הערה: כדי למנוע פוטוהלבנה, צמצם את החשיפה של חרוזי מיקרוספרה לאור לאורך כל ההליך. לפני צימוד בתפזורת, בצע אופטימיזציה של ריכוזי הצימוד עבור כל אנטיגן באמצעות פרוטוקול צימוד ידני. הפרוטוקול הותאם מ-Angeloni et al.8. מאגרים ופתרונות מפורטים בטבלה משלימה 1.

  1. בחר אזורי חרוזים לשימוש לצימוד. מערבולת יסודית במשך 20 שניות. סוניקציה של הצינור למשך 60 שניות לפחות.
  2. העבירו 200 מיקרוליטר (2.5 מ 'חרוזים) של חרוזים לצינור של 1.5 מ"ל.
  3. שוטפים את החרוזים עם 200 מיקרוליטר 100 מ"מ נתרן פוספט מונו-בסיסי/0.125x טריטון.
    1. הנח את הצינור על מפריד צינור מגנטי למשך 60 שניות. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי לגעת בחרוזים.
    2. הוסף מאגר נתרן פוספט מונו-בסיסי. השאירו על המדף המגנטי למשך 60 שניות. הסר את ה-supernatant.
  4. הפעל את החרוזים עם מאגר המכיל 80 מיקרוליטר של 100 מ"מ נתרן פוספט חד-בסיסי, 0.125x טריטון, 10 מיקרוליטר סולפו-NHS ו-10 מיקרוליטר EDC.
    1. הוסף נתרן פוספט מונו-בסיסי -sulfo-NHS -EDC לשפופרות. דגירה בחושך למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על גלגלת.
    2. שוטפים את החרוזים ב-250 מיקרוליטר PBS (1x) ו-0.125x טריטון. חזור על הכביסה שלוש פעמים.
  5. קושרים את האנטיגנים.
    1. הכן את הריכוזים השונים (דילולים סדרתיים) של אנטיגנים בנפח כולל של 1 מ"ל 1x PBS ו-0.125x טריטון. בדוק לפחות שני ריכוזים של אנטיגנים.
    2. הוסף פתרונות אנטיגן לחרוזים מופעלים. דגירה בחושך שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על רולר.
  6. שטפו חרוזים מצומדים ב-500 מיקרוליטר PBS-TBN ו-0.125x טריטון. חזור על הכביסה שלוש פעמים.
  7. השעו מחדש את החרוזים המצומדים ב-1 מ"ל של PBS-TBN ו-0.125x Triton.
    הערה: אחסן את החרוזים המצומדים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות לפני השימוש. חרוזים מצומדים הראו שונות ב-MFI כאשר נבדקו מיד לאחר הצימוד בהשוואה לבדיקה לאחר 24 שעות.
  8. בחר ריכוז אופטימלי לשימוש בצימוד בקנה מידה גדול שלאחר מכן. השתמש בחרוזים מצומדים שונים לבדיקה החיסונית בבריכה סטנדרטית. בחר את הריכוז הנמוך ביותר שבו התקבלה עקומה סטנדרטית ליניארית.
    הערה: דוגמה לליניאריות של תגובת נוגדנים למאגר סטנדרטי מסופקת בסעיף התוצאות, איור 1.

2. צימוד חרוזים אוטומטי בקנה מידה גדול

  1. הכן חרוזי COOH מגנטיים פרו.
    1. חשב חרוזים נדרשים: באמצעות 500 חרוזים/דגימה, 2.5 מיליון חרוזים מספיקים ל-5000 דגימות.
    2. הכן אזורי חרוזים לשימוש לצימוד כפי שתואר קודם לכן.
    3. העבירו את נפח החרוזים הרצוי לבארות שהוקצו. עבור 2.5 מיליון, נעשה שימוש ב-200 מיקרוליטר חרוזים (ריכוז לומינקס סטנדרטי הוא 1.25e7 חרוזים/מ"ל).
  2. הכן את האנטיגנים. זהו צעד קריטי להבטחת כמויות מדויקות של אנטיגנים.
    1. חישוב כמויות האנטיגן הנדרש, לאחר אופטימיזציה. הריכוזים המשמשים לכל אנטיגן מפורטים בטבלה 1.
    2. בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, מערבבים היטב נפח מספיק של אנטיגנים מעניינים עם 1x PBS / 0.125x Triton לסך של 1 מ"ל.
  3. הכן צלחות עם ריאגנטים. הכן צלחות באר בעומק 96 כדלקמן. הנפחים הם לבאר ומחושבים עבור 2.5 מיליון צימוד חרוזים.
    1. לוח 1 (מסרקי קצה): מסרקי קצה עומס.
    2. לוח 2 (חרוזים): הוסף 8 מיקרוליטר של 0.125x טריטון ו-200 מיקרוליטר מאזורי החרוזים המעניינים.
    3. צלחת 3 (Wash1): הוסף 200 מיקרוליטר של 100 מ"מ נתרן פוספט מונו-בסיסי / 0.125x טריטון.
    4. צלחת 4 (הפעלה): הוסף 80 מיקרוליטר של 100 מ"מ נתרן פוספט מונו-בסיסי / 0.125x טריטון + 10 מיקרוליטר סולפו-NHS + 10 מיקרוליטר EDC.
    5. לוח 5 (Wash2): הוסף 250 מיקרוליטר של 1x PBS / 0.125x Triton.
    6. לוח 6 (צימוד): העבר 1 מ"ל של תמיסת אנטיגן לבאר שהוקצתה.
    7. לוח 7 (Wash3): הוסף 500 מיקרוליטר PBS-TBN/0.125x Triton.
    8. לוח 8 (צלחת סופית, מכיל חרוזים מצומדים): הוסף 1 מ"ל של PBS-TBN + 0.125x Triton.
  4. הגדר את הפעלת מחזור הצימוד במעבד האוטומטי.
    1. פעל בהתאם להוראות היצרן כדי להפעיל את המכשיר ולהגדיר את הפרוטוקול. התוכנה הדרושה ניתנת להורדה במחשב האישי15. פרמטרים ספציפיים לריצה מפורטים בטבלה משלימה 2.
    2. טען את הלוחות לתוך החריץ שהוקצה במכונה. בחר את הפרוטוקול. התחל את המחזור. הזמן המשוער להשלמת התוכנית הוא 2:50 שעות.
  5. סוף המחזור
    1. פעל בהתאם להוראות היצרן כדי לכבות את המכשיר. פרוק צלחות לפי ההוראות. בדוק ויזואלית שצלחת 8 מכילה את החרוזים (גלולה חומה). בנוסף, דוח הפעלה מיוצא מהמכשירים.
    2. העבירו חרוזים מצומדים מלוח 8 לצינורות בודדים של 1.5 מ"ל לאחסון. אחסן חרוזים מצומדים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  6. ספרו את החרוזים.
    הערה: נעשה שימוש במונה סלולרי. לספירה ידנית באמצעות המציטומטר, עיין במדריך ספר הבישול של Luminex8.
    1. חרוזים מצומדים היטב למערבולת. העבר 10 מיקרוליטר לתא ספירת תאים. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לקרוא את ספירת החרוזים למ"ל.
    2. בדוק את הצבירה על-ידי הדמיית התמונה על מונה התאים. ראה איור משלים 1 לתמונה מייצגת של חרוזים לא מצטברים.
    3. אם קיימים אגרגטים, מערבולת וסוניקט היטב למשך 5 דקות לפחות. ספירה חוזרת
      הערה: לאחר ספירת החרוזים, יעילות הצימוד הוערכה על ידי ביצוע בדיקה חיסונית של חרוזים מצומדים על מאגר סטנדרטי כדי להעריך את הליניאריות של תגובת הנוגדנים.

טבלה 1: פאנל אנטיגנים הכלול ב-50-plex. הבדיקה כוללת אנטיגנים מרובים לאיתור זיהומים ארבו-ויראלים ופתוגנים במחזור הדם. כמויות אנטיגנים המשמשות לצימוד של 1.25 מיליון חרוזים מסופקות. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

3. בדיקה חיסונית מולטיפלקס

הערה: שלבים מפורטים של הפרוטוקול למדידת MFI מסופקים במדריך המתאים9. כדי למזער את חשיפת החרוזים לאור ואת הסיכון להלבנת אור, מכינים את כל התמיסות והדגימות לפני הוצאת החרוזים מהמקרר.

  1. הגדר את פריסת הצלחת. נעשה שימוש בלוחות של 96 בארות וכללו דילולים סדרתיים של בריכה סטנדרטית וכן ריק (חיץ בלבד) בשורה הראשונה.
  2. לדלל דגימות ותקן במאגר PBT בצלחת נפרדת שאינה מחייבת. דילול של 1:200 (ריכוז סופי של 1:400) שימש לדגימות. עבור העקומה הסטנדרטית, נעשה שימוש בדילול של 1:50 של מאגר הסרום הסטנדרטי (וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 1:100) ועשרה דילולים טוריים פי 2.
  3. קבע את כמות החרוזים המצומדים לשימוש בנפח כולל של 50 מיקרוליטר לבאר. נעשה שימוש ב-500 חרוזים מכל חרוז לבאר והותאמו לנפח עם מאגר PBT.
  4. מערבולת יסודית את תערובת החרוזים המשולבים למשך 30 שניות. סוניקט למשך 60 שניות לפחות.
  5. חשב את הנפח של כל חרוז מצומד כדי להוסיף לתערובת המולטיפלקס כדי להבטיח חרוזים שווים לכל אנליט. נפחי החרוזים חושבו באופן הבא: נפח חרוזים לבאר = מספר חרוזים לבאר / ספירת חרוזים.
    הערה: דוגמה לחישוב חרוזים ונפחי חיץ הדרושים לתערובת מומחשת בטבלה משלימה 3.
  6. העבירו נפחי אנטיגן חרוזים נאותים לצינור צנטריפוגה.
  7. כוונן את עוצמת הקול באמצעות PBT.
  8. מערבבים היטב את התערובת המוקדמת.
  9. פזרו 50 מיקרוליטר של הפרמיקס למיקרו-לוחית ההדמיה (למשל, ps, לוחות f-bottom).
  10. הוסף 50 מיקרוליטר מהדגימות המדוללות לחרוזים.
  11. מערבבים על שייקר צלחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, 700 סל"ד.
  12. שוטפים את הצלחות שלוש פעמים באופן הבא (שטיפה ידנית).
    1. הנח את הצלחת על מתלה מגנטי למשך 60 שניות בטמפרטורת החדר. החזק את הצלחת בחוזקה על המתלה והשליך את הסופרנטנט.
    2. הוסף מאגר PBT של 100 מיקרוליטר. השאירו על המדף המגנטי למשך 60 שניות. חזור על השטיפות
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במכונת כביסה16 . מכונת הכביסה נקבעה באופן הבא: מחזור השרייה אחד, ואחריו 3 מחזורים (שאיפה, חלוקה והשריה) ושאיבת מחזור אחרון.
  13. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 50 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל.
    1. עקוב אחר הוראות הספק להכנת תמיסת מלאי של הנוגדן המשני. נעשה שימוש בתמיסת דילול של 1/120 של נוגדן משני. נפחי הנוגדנים המשניים חושבו באופן הבא: נוגדן משני נפח = נפח כולל/גורם דילול.
    2. מערבבים את הנוגדן המשני עם נפח מספיק של מאגר PBT. מערבבים היטב. הוסף 50 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל לחרוזים השטופים.
  14. דגירה על שייקר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, 700 סל"ד.
  15. בצע שלוש כביסות כמתואר קודם לכן.
  16. השעו מחדש חרוזים במאגר PBT של 150 מיקרוליטר.
  17. דגירה על שייקר למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, 700 סל"ד. עקוב אחר הוראות היצרן כדי להגדיר את המכשירים9.
    הערה: נעשה שימוש בתוכנת xPONENT17 שסופקה עם מכשיר ההדמיה. ההגדרות לקריאת הקרינה נקבעו כדלקמן: נפח האיסוף הוגדר ל-50 מיקרוליטר, עם מידה מינימלית של 50 חרוזים, ללא מחמם XY, וסוג הניתוח כאין.

4. ניתוח נתונים

  1. הפעל אימות
    1. בדוק שהגעת לספירת החרוזים המינימלית. מומלץ לפחות 35 חרוזים לבאר כדי לקבל MFI8 תקף סטטיסטית.
    2. בדוק שערכי MFI של מדגם בקרה ריק ושלילי הם מינימליים.
    3. בדוק ערכי MFI עבור תקנים על ידי התוויית עקומה סטנדרטית. אלה גבוהים יותר מדגימת הבקרה הריקה ו/או השלילית.
  2. ניתוח נתונים לדוגמה
    1. ייצא את הנתונים כקבצי CSV ונתח חיצונית באמצעות תוכנת R.

תוצאות

כדי להמחיש את התהליך שבוצע לאימות הפרוטוקול, בחרנו שלושה אנטיגנים המייצגים שלוש משפחות של ארבו-וירוסים: Flaviviruses (חלבון DENV1 NS1), Alphaviruses (חלבון CHIKV VLP) ו-Bunyaviruses (RVFV NP). האנטיגנים נבדקו על מאגר סטנדרטי של אוכלוסייה שנחשפה מראש (ORPAL), ספרת אוכלוסייה צרפתית (לא חשופה) ושתי קבוצות מאפריקה (סנגל ומדגסקר).

ליניאריות דילול של תגובת הנוגדנים
ריכוז האנטיגנים לשימוש לצימוד חרוזים נקבע באמצעות דילולים סדרתיים של בריכת ה-ORPAL. הריכוז האופטימלי נבחר כריכוז הנמוך ביותר בו התקבלה עקומה סטנדרטית ליניארית (הנתונים לא הוצגו). איור 1 מציג את הליניאריות של אנטיגנים נבחרים של ארבו-וירוס בריכוז אופטימלי עבור כל אנטיגן. לבקרת איכות של צימוד, כל אצווה של חרוזים מצומדים נבדקה ליניאריות דילול במאגר הסטנדרטי של ORPAL באמצעות הריכוז שנבחר מראש.

השוואה לבדיקת הצימוד הידנית הסטנדרטית
כדי להעריך את יכולת ההשוואה של נתונים המתקבלים באמצעות הפרוטוקול האוטומטי החדש עם הצימוד הידני המבוסס היטב, השווינו עקומות סטנדרטיות שנוצרו מתוצאות שהתקבלו עם צימוד ידני לעומת אוטומטי. איור 2 מציג ליניאריות מקבילה עבור שתי הבדיקות. ערכי MFI משתנים בהתאם לאנטיגן.

וריאציה של אצווה צימוד חרוזים
וריאציה של אצווה צימוד, כפי שהוערכה יכולת השחזור של בדיקות מאותה אצווה צימוד, הוערכה באמצעות תרשים לוי-ג'נינגס18. נעשה שימוש באנטיגנים המייצגים ובחרוזי הבקרה המצומדים ל-BSA ונבדקו במאגר הסטנדרטי של ORPAL. איור 3 מציג MFI מ-19 לוחות שונים, שנבדקו בימים שונים עבור כל אנטיגן. ה-MFI המתקבלים נופלים בטווח הממוצע ± 3 SD עבור שלושת האנטיגנים והבקרה.

השפעת ריבוב על MFI
כדי להעריך עוד יותר את ביצועי הבדיקה, בדקנו אם ריבוב של מספר אנטיגנים השפיע על תגובת הנוגדנים הנמדדת. התגובה הושוותה לאנטיגן בודד (או חרוז יחיד) באמצעות מאגר תקן ORPAL. איור 4 מראה מתאם חזק (R = 0.99, p < 2.2e-16) בין התוצאות שהתקבלו כאשר MFI נמדדו על אנטיגנים בודדים או מתערובת מוקדמת המכילה 50 אנטיגנים.

תגובות נוגדנים מדגימות סרום אנושיות באוכלוסיות אפריקאיות
כדי להעריך את ישימות הבדיקה על דגימות מקבוצות מגוונות, השווינו את תגובות הנוגדנים בדגימות סרום אנושיות מאוכלוסיות אפריקאיות, שיש להן סבירות גבוהה לחשיפה לארבו-וירוסים, עם אלו מקבוצה צרפתית שככל הנראה יש לה חשיפה נמוכה יותר לנגיפים אלה. בסך הכל נבדקו 1,596 דגימות למדגסקר, 1,428 לסנגל ו-84 מהקבוצה הצרפתית. איור 5 מציג תרשימי צפיפות עבור הקבוצות השונות. עבור קבוצת סנגל, נצפתה התפלגות בימודאלית ברורה של נתונים עבור התגובות ל-CHIKV VLP, מה שמרמז על שתי תגובות שונות ל-CHIKV באוכלוסייה. זנב בימודאלי עדין נצפה גם עבור DENV1 NS1 ו-RVFV NP בקבוצת סנגל, בעוד שאין הבדל בין הקבוצה הצרפתית למדגסקר.

figure-results-1
איור 1: לינאריות תגובת הנוגדנים שנבדקה במאגר הסטנדרטי של ORPAL. אנטיגנים נבחרים של ארבו-וירוס מוצגים כדוגמה. עוצמות הקרינה החציונית (MFI) מוצגות על ציר ה-y (סולם לוג) ודילול סדרתי של המאגר הסטנדרטי על ציר ה-x. כל האנטיגנים בפאנל נבדקו מראש על המאגר הסטנדרטי לפני בדיקה בתפזורת על דגימות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ליניאריות מקבילה של תגובת נוגדנים בשיטות צימוד. יומן MFI (ציר y) של אנטיגנים מייצגים (facet) שנבדק על דילולים סדרתיים של מאגר תקן ORPAL (ציר x). הצבעים מייצגים שיטות צימוד שונות: אוטומציה (אדום, ירוק, כחול) וידנית (סגול). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: וריאציה של לוח-ללוח. חלקות Levey_Jennings עבור חרוז מצומד BSA (בקרה), DENV1 NS1, CHIKV VLP ו-RVFV מוצגות עבור מאגר סטנדרטי של ORPAL בריכוז של 1:400. התוצאות מייצגות 19 צלחות הפועלות בימים שונים. MFI מוצגים על ציר y, מספר הבדיקות הוא על ציר ה-x. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מתאם של תגובת נוגדנים לבדיקת מונו ומולטיפלקס. המאגר הסטנדרטי דולל בריכוז סופי של 1:400 ונבדק על תערובת מוקדמת המכילה את האנטיגנים של 50 פלקס במקביל לחרוזים מצופים אנטיגן בודדים. מתאם פירסון שימש לניתוח. שלושה אנטיגנים מייצגים מוצגים כדוגמה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: יישום הבדיקה על קבוצת הדגימות האנדמית והלא אנדמית. הבדיקה נבדקה על דגימות ממדגסקר (ירוק), סנגל (כחול) וצרפת (אדום). הדגימות דוללו בריכוז סופי של 1:400. ציר ה-X מייצג MFI מנורמל (nMFI), המחושב כיחס בין MFI מדגם ל-MFI מאגר סטנדרטי באותו ריכוז (1:400). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: דוגמה לתמונה מייצגת של צבירת חרוזים. לוח (A) מציג חרוזים לא מצטברים, ופאנל (B) מציג אגרגטים של חרוזים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 1: טבלת חוצצים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 2: הגדרות פרוטוקול צימוד חרוזי KingFisher Apex. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 3: דוגמה לחישוב נפחי חרוזים לתערובת מוקדמת. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

השימוש ב-FMIA שינה את נוף הבדיקות הסרולוגיות. חוזק הבדיקות טמון ביכולת להעריך את תגובות הנוגדנים לאנטיגנים מרובים בתגובה אחת, להפחית את הזמן לתוצאות ולהפחית את עלות הבדיקה. זה חשוב במיוחד במעקב סרולוגי. עם זאת, השימוש השגרתי במבחני FMIA מונע על ידי שלב צימוד החרוזים הידני עתיר העבודה וגוזל זמן, הדורש טיפול באנטיגנים בודדים לכל תגובה. דוח זה מציג שיטה אוטומטית לצימוד כימי של אנטיגנים לחרוזים. האוטומציה מאפשרת צימוד בו-זמני של עד 96 אנטיגנים בריצה אחת, מה שמפחית במידה ניכרת את הזמן הנדרש לצימוד אנטיגן בתפוקה גבוהה.

איור 1 מראה שהאנטיגנים נקשרו בהצלחה לחרוזים. התוצאות מראות גם הקבלה חזקה בין הפרוטוקול האוטומטי החדש לבין הפרוטוקול הידני המבוסס היטב (איור 2), מה שמעיד על דיוק לא נחות בזיהוי תגובות IgG לאנטיגנים המוערכים. תוצאות של וריאציה של אצווה של צלחת לצלחת (איור 3) ושונות אצווה של צימוד חרוזים (איור 2) מראות יכולת השוואה של נתונים בעת שימוש בשיטה האוטומטית לצימוד. מתאם גבוה בין MFI מולטיפלקס לסינגלפלקס (איור 4) מראה כי ריבוב מספר גבוה של אנטיגנים אינו משפיע על תגובת הנוגדנים לקבוצת האנטיגנים הבודדים המשמשים בבדיקה זו.

לצורך אימות הבדיקה, נבדקו דגימות מקבוצות אנדמיות ולא אנדמיות (איור 5). בעוד שמחקרי שכיחות סרולוגית של ארבו-וירוסים עדיין נדירים באפריקה, נתונים זמינים 19,20,21,22 מציעים תמונה ניואנסית עם שכיחות IgG משתנה בין ובתוך מדינות בודדות. יש לציין כי הנתונים הקיימים מצביעים על שכיחות גבוהה יותר של שלושת הנגיפים (צ'יקונגוניה, דנגי ועמק הבקעה) בסנגל בהשוואה למדגסקר, למשל19. שכיחות זו עולה בקנה אחד עם התצפית בדוח זה, שהראתה תגובה ברורה ומובחנת לאנטיגנים השונים בסנגל בהשוואה לקבוצות האחרות. זה תומך ביכולת של הבדיקה להבחין בפרופילי נוגדנים בהקשר של שכיחות סרולוגית גבוהה יחסית. ניתן להסביר את הנתונים שנצפו עבור קבוצת מדגסקר על ידי השכיחות הנמוכה המדווחת של הנגיפים באתר איסוף הדגימה22, בעוד שהשוואת הנתונים לעוקבה הלא אנדמית עשויה להיות מוסברת חלקית על ידי גודל המדגם הקטן של העוקבה הצרפתית. בנוסף, שונות מדווחת בין אזורים עשויה להסביר את ההבדלים שנצפו במערכי הנתונים. יש צורך במחקר מקיף להערכת השכיחות הסרולוגית של IgG; עם זאת, הנתונים המוצגים בדוח זה מראים כי הבדיקה שפותחה היא ספציפית לאיתור תגובות IgG לאנטיגנים המוערכים של ארבו-וירוס, תוך הבחנה בין נתונים מאזורים אנדמיים כמו גם תגובות מובחנות וניואנסים בתוך אותה אוכלוסייה.

האתגרים הטכניים העיקריים כללו השגת פתרונות אנטיגן הומוגניים למרות השימוש בהם בכמויות קטנות מאוד, הבטחת ייצוג שווה ערך של אזורי חרוזים בפרמיקס ומזעור צבירת חרוזים. כדי להתגבר על הקושי בהשגת תמיסה הומוגנית בצלחת 96 הבארות, יושם שלב שבו כל התמיסות האנטיגניות עורבבו היטב בצינור של 1.5 מ"ל לפני הפצתן לצלחת. בנוסף, נוסף שלב לספירת החרוזים המצומדים והתאמת הנפחים כדי להבטיח שמספר שווה של אזורי חרוזים יתווספו לתערובת המוקדמת. שלב סוניקציה נכלל גם כדי להקל על ערבוב חרוזים ולמזער את הצבירה בפרמיקס.

במחקר מוגבל זה, יציבות החרוזים המצומדים והשפעתם על ביצועי הבדיקה לא הוערכו, מכיוון שכל הדגימות נבדקו תוך חודש אחד מצימוד החרוזים. הערכה זו הייתה מחוץ לתחום דוח זה והיא תוערך במחקרים עתידיים. למרות מגבלות אלה, דוח זה מציג שיטה מהירה ואמינה לזיהוי תגובות נוגדנים למגוון פתוגנים, כולל ארבו-וירוסים. מעקב סרולוגי אחר זיהומים ארבו-ויראלים הוא חיוני לשליטה במחלות, והזמינות של שיטה מהירה וניתנת לשחזור לאיתור תגובות נוגדנים לנגיפים אלה מייצגת התקדמות משמעותית במאמצים הגלובליים להעריך הטרוגניות בהעברה ולהתערבויות ממוקדות כדי להפחית את הנטל של זיהומים אלה. בנוסף, למרות שדוח זה מתמקד בארבו-וירוסים, פרוטוקול זה ישים באופן נרחב למגוון רחב של אנטיגנים ומייצג התקדמות משמעותית בתחום.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

תודות

המחברים מודים מקרב לב למשתתפי המחקר ולעובדי בריאות הקהילה בכל אחד מאתרי המחקר. אנו גם מודים לכל צוות המעבדה והשטח על מאמציהם המסורים באיסוף דגימות, איסוף נתונים וניתוחי מעבדה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק שחזור עוצמת ההעברה של ארבו-וירוסים ברחבי אפריקה וההשפעה של התערבויות באקלים משתנה (xSTAR) מקרן וולקאם [228185/Z/23/Z]. לצורך גישה פתוחה, המחברים החילו רישיון זכויות יוצרים ציבורי של CC BY על כל גרסת כתב יד מקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו. אנו מודים גם לאנשים הבאים על הרשות להשתמש בדגימות: רוב ואן דר פלויים (אפידמיולוגיה וניתוח מחלות זיהומיות, מכון פסטר, פריז) ומייליס דואן ואליס סאנה (המרכז לחקר קליניק אנטילים-גיאן, המרכז ההוספיטלייה דה קאיין, קאיין).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל -דברים כלליים במעבדה
יחידות סינון 1000 מ"ל 0.2 אמ"מתרמופישר סיינטיפיק567-0020
מאגרי 25 מ"ל  תרמו-מדעי95128095
צינורות 50 מ"ל פאלקון-דברים כלליים במעבדה
96 לוחות באר עמוקים - KingFisher DWתרמו-מדעי10373480
שטיפת לוחות אוטומטית (אופציונלי)טקאןשטיפת מיקרופלט HydroFlex Plus
B שעלת FHAאנטיגן טבעי  BP-FHA-50
איזון-ציוד מעבדה כללי
צנטריפוגה ספסלית  - ציוד מעבדה כללי
BioPlex Pro חרוזי COOH מגנטיים  לומינקסMC10xxx  (x=אזור חרוזים)
אלבומין סרום בקר, BSAסיגמאA7906
ברנסון אולטרסוניקס ברנסוניק מנקה אולטרסוני דגם B200פישר סיינטי15-337-22
BSAסיגמא אולדריץ'A7906
גרנד פרי CCHFאנטיגן טבעיREC31639-100
מונה תאים/המציטומטרביורד/מרקTC20 /Z359629
CHIKV פרק 2אנטיגן טבעיREC31617-100
CHIKV VLPאנטיגן טבעיCHIKV-VLP-100
לוחות חיסון שקופים עם תחתית שטוחה ולא-סטריליים מסוג 96 בארותתרמו-מדעי3455
חלקיקי CMVאנטיגן טבעיCMV-HP-100
ספירת שקופיות, תא כפול למונה תאים ביוראדL003662 א
cp23אנטיגן טבעיפרודקשן פרודקשן
CT694אנטיגן טבעיפרודקשן פרודקשן
CtxB
DENV1 EDIII + SNAPהפקה פנימית-
DENV1 NS1אנטיגן טבעיDENV1-NS1-100
DENV1 VLPאנטיגן טבעיDENVX4-VLP-100
DENV2 EDIII + SNAPהפקה פנימית-
DENV2 NS1אנטיגן טבעיDENV2-NS1-100
DENV2 VLPאנטיגן טבעיDENVX4-VLP-100
DENV3 EDIII + SNAPהפקה פנימית-
DENV3 NS1אנטיגן טבעיDENV3-NS1-100
<שם="טווח! A33">DENV3 VLPאנטיגן טבעיDENVX4-VLP-100
DENV4 EDIII + סנאפהפקה פנימית-
DENV4 NS1אנטיגן טבעיDENV4-NS1-100
DENV4 VLPאנטיגן טבעיDENVX4-VLP-100
רעלת דיפטריהאנטיגן טבעי  DIP-TNL-100
EBV-GP125אנטיגן טבעיREC31601-100
EDC סיגמא03449
אתנול 100% -מעבדה כללית 
איטום סרט לאלומיניום לא סטרילי -כללי
מכשיר הדמיה פלואורסצנציונית - מערכת MAGPIXLuminex MAGPIX-XPON4.1-CEIVD
מגנט ידני לצלחות - מפריד מגנטי עם 96 בארותלומינקסCN-0269-01
hev-ORF2אנטיגן טבעי  REC31653-100
Inaba OSPBoston_MGH -
מסרק קצה קינגפישר דיפוול 96 בארותתרמו-מדעי17170069
לישמניה K28מדעי הקליניותMBS3040095
ערכת כיול Luminex MAGPIXלומינקסMPX-CAL-K25
ערכת אימות Luminex MAGPIXלומינקסMPX-PVER-K25
מפריד צינורות מגנטייםInvitrogenDynaMag
MAGPIX Drive Fluid Plusלומינקס40-50030
NP לחצבתאנטיגן טבעיREC31796
מנענע מיקרופלטה  רנדוקס
מיקרופלטה, באר 96, PS, תחתית F (באר הארובה)גריינר-ביו אחד655096
MiliQ H20 -מעבדה כללית 
פיפטות רב-ערוציות 10, 300סארטוריוס
NIEאנטיגן טבעיפרודקשן פרודקשן
אוגאווה OSPBoston_MGH -
ONNV E2מדעי הקליניותIT-022-006Ep
מכשיר מעבד חלקיקיםתרמו-מדעיתרמו-סיינטיפיק קינגפישר פלקס
PBS 10x PH~7.0EUROMEDEXET330
נוגדן משני IgG Fc אנטי-אנושי מצומד PEמחקר אימונו ג'קסון709-116-098
PfAMA1הפקה פנימית-
PfMSP1אנטיגן טבעיREC32013-100
PGP3אנטיגן טבעיפרודקשן פרודקשן
Pipette Tips (ספק) 10 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; L -דברים כלליים במעבדה
Pm MSP1מדעי הקליניותCUST-PRT-31102024-1B
Po MSP1מדעי הקליניותCUST-PRT-31102024-1A
PvMSP1אנטיגן טבעיREC31724-100
תוכנת R R4.4.1--
RVFV NPאנטיגן טבעיREC31640-100
פיפטות חד-ערוציות 10p, 20p, 200p, 1000pאפנדורף
סנאפהפקה פנימית-
S-NHS סיגמא56485
אזיד נתרןסיגמאS2002
תמיסת היפוכלוריט נתרן (אקונומיקה) -אקונומיקה כללית בבית
רעלן טטנוסאנטיגן טבעיREC31801-100
גרסת תוכנת Thermo Scientific BindIx גרסה 1.1תרמופישר סיינטיפיק-
טריטוןתרמו-סיינטיפיקA16046
גלגל צינורות  איקהרולר 6D -100219627
טווין-20סיגמאP7949
USUV EDIII + SNAPהפקה פנימית-
USUV NS1אנטיגן טבעיUSUV-NS1-100
Vortex  -ציוד מעבדה כללי
VSP3אנטיגן טבעיפרודקשן פרודקשן
VSP5אנטיגן טבעיפרודקשן פרודקשן
WNV EDIII + SNAPהפקה פנימית-
WNV NS1אנטיגן טבעיWNV-NS1-100
תוכנת xPONENTלומינקס89-30000-00-759 העת A במאי-19
YFV EDIII + SNAPהפקה פנימית-
YFV NS1אנטיגן טבעיYFV-NS1-100
ZIKV EDIII + SNAPהפקה פנימית-
ZIKV NS1אנטיגן טבעיZIKV-NS1-100
ZIKV VLPאנטיגן טבעיZIKV-VLP-100

מקורות

  1. Global dengue surveillance. , World Health Organization. https://worldhealthorg.shinyapps.io/dengue_global (2025).
  2. Bangoura, S. T., et al. Arbovirus epidemics as global health imperative, Africa, 2023. Emerg Infect Dis. 31 (2), e240754(2024).
  3. World Health Organization. Surveillance and control of arboviral diseases in the WHO African Region: assessment of country capacities. , WHO. (2022).
  4. Starolis, M. W., Perez, O., Powell, E. A. Clinical features and laboratory diagnosis of emerging arthropod-transmitted viruses. J Clin Virol. 132, 104651(2020).
  5. Alves, R. P. D. S., Amorim, J. H. Editorial: Arboviruses: Co-circulation, co-transmission, and co-infection. Front Microbiol. 14, 1321166(2023).
  6. Pan American Health Organization. Recommendations for laboratory detection and diagnosis of arbovirus infections in the region of the Americas. , PAHO. (2023).
  7. Fischer, C., et al. Challenges towards serologic diagnostics of emerging arboviruses. Clin Microbiol Infect. 27 (9), 1221-1229 (2021).
  8. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. xMAP cookbook: A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP technology. Luminex. , https://info.diasorin.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook (2025).
  9. Luminex MAGPIX user manual. , Luminex Corporation. (2023).
  10. Rosado, J., et al. Multiplex assays for the identification of serological signatures of SARS-CoV-2 infection: An antibody-based diagnostic and machine learning study. Lancet Microbe. 2 (2), e60-e69 (2021).
  11. Bloch, E., et al. Investigation of the sero-epidemiology of vaccine preventable diseases and common viral infections in French populations using a multiplex serological assay. medRXiv. , (2024).
  12. Venkateswaran, N., Sarwar, J., Nelson, W., Venkateswaran, K. Determination of IgG antibody profile to arboviruses using a multiplex serology panel. , (2024).
  13. Lawford, H. L. S., et al. Integrated serological surveillance for neglected tropical diseases, vaccine-preventable diseases, and arboviruses in Samoa, 2018. Sci Rep. 15 (1), 12667(2025).
  14. Bailly, S., et al. Spatial distribution and burden of emerging arboviruses in French Guiana. Viruses. 13 (7), 1299(2021).
  15. KingFisher Apex purification system: User guide. , Thermo Fisher Scientific Inc. https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0018970_kingfisher_apex_UG.pdf (2025).
  16. Instructions for use for HydroFlex Plus. , Tecan. (2025).
  17. XPONENT 4.3 installation instructions. , Luminex Corporation. https://us.diasorin.com/sites/default/files/products-documentation-tool/89-30000-00-759.pdf (2025).
  18. Van Den Hoogen, L. L., et al. Quality control of multiplex antibody detection in samples from large-scale surveys: the example of malaria in Haiti. Sci Rep. 10 (1), 1135(2020).
  19. Bangoura, S. T., et al. Seroprevalence of seven arboviruses of public health importance in sub-Saharan Africa: a systematic review and meta-analysis. BMJ Glob Health. 9 (10), e016589(2024).
  20. Awuah, A. A., et al. Seroprevalence of dengue in the Democratic Republic of Congo, Ghana and Senegal: results of the SERODEN study. Int J Infect Dis. 152, 107428(2025).
  21. Mhamadi, M., et al. Human and livestock surveillance revealed the circulation of Rift Valley Fever virus in Agnam, Northern Senegal, 2021. Trop Med Infect Dis. 8 (2), 87(2023).
  22. Broban, A., et al. Seroprevalence of IgG antibodies directed against dengue, chikungunya and West Nile viruses and associated risk factors in Madagascar, 2011 to 2013. Viruses. 15 (8), 1707(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים