הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אורגנואידים במעי אדם בעלי זרע תא יחיד למחקר אורגנואידים

743 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69265

⸱

6 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Graduate School of Medical Science, Brain Korea 21 Project, Yonsei University College of Medicine, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, NYU Grossman School of Medicine, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Department of Pathobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Veterinary Medicine

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעי שמקורם במטופלים בעלי זרע תא יחיד, ומספק תרביות סטנדרטיות שמפחיתות הטרוגניות ומשפרות את השחזוריות לבדיקות במסגרת המשך ויישומים ברפואה מדויקת.

תקציר

התפתחויות אחרונות בטכנולוגיית אורגנואידים אפשרו יצירת אורגנואידים מעיים שמקורם בחולה (PDIOs) המשקפים את התכונות המבניות, הפונקציונליות, הגנטיות והאפיגנטיות של הרקמות המקוריות שלהם. עם זאת, אורגנואידים שמקורם במעבר קונבנציונליים מניבים בהכרח אוכלוסיות הטרוגניות בגודל ובמספר, מה שמוביל לתוצאות לא עקביות גם בתנאים זהים. כדי להתמודד עם זה, הוקמה גישה סטנדרטית, המכונה כאן "PDIOs עם זרע תא יחיד". בשיטה זו, PDIOs בוגרים פורקו אנזימטית לתאים בודדים וזרעו במספר מוגדר לבארות בודדות של לוח של 96 בארות. זריעה מבוקרת זו נרמלה את גודל ומספר ה-PDIOs. בהשוואה לאורגנואידים שמקורם במעבר, PDIOs עם זרע תא יחיד הראו שונות מופחתת בין בארות במספר האורגנידים ובשונות בתוך באר בגדלי אורגנואידים, מה שמאפשר קביעת יעילות הייצור ומשפר את השחזוריות של מבחני הכדאיות. יתרה מזאת, פלטפורמה זו תואמת לניתוח במורד הזרם, כולל ניתוח טרנסקריפטומי ופרופיל ביטוי חלבונים. ביחד, גישה זו עשויה לשפר את עקביות הניסוי ולספק בסיס מעשי למחקרים מבוססי PDIO הניתנים לשחזור.

מבוא

המעי האנושי הוא מערכת אקולוגית מורכבת מאוד, המוגדרת על ידי אינטראקציות מדויקות בין מיקרוביוטה במעיים, אפיתל המעי ומערכת החיסון1. רכיבים אלו שומרים על הומאוסטזיס במעי באמצעות רשתות איתות מפוקחות בקפידה. לדוגמה, המיקרוביום של המעי, הכולל מעל עשרה טריליון אורגניזמים מיקרוביאליים, מתקשר עם תאי מערכת החיסון כדי לווסת את פעילות מערכת החיסון ושומר על סביבה מעיים מאוזנת2. האפיתל המעי הוא גורם מרכזי בתיווך המיקרוביוטה-מערכת החיסוניתהזו 3,4. תאי גזע במעי (ISCs), המניע המרכזי להתחדשות האפיתל, מתחדשים ומתמיינים באופן מתמיד לסוגי תאים מיוחדים, כולל שושלות תאי הפרשה (תאי פנת', תאי גביע, תאי אנטרואנדוקריניים ותאי טאפט), אנטרוציטים סופגים ותאי מיקרופולד 5,6. יחד, תאים אלו יוצרים מחסום פיזי חיוני וממשק פונקציונלי שמגן על המארח מפני גירויים דלקתיים.

בשנים האחרונות, PDIOs הפכו לפלטפורמה עוצמתית במחקר תרגומי7. תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) אלו נוצרות מ-ISCs המבודדים מרקמות המטופל ונשמרות במטריצה חוץ-תאית כמו מטריצה חוץ-תאית (ECM), יחד עם גורמי גדילה מוגדרים שמסכמים את נישת ISC 8,9. ראוי לציין כי PDIOs שומרים על התכונות הגנטיות והאפיגנטיות של רקמת התורם, ומאפשרים התרחבות מתמשכת וניסויים שחוזרים. מאז שסאטו ועמיתיו פיתחו לראשונה PDIOs מקולטן 5+ (Lgr5⁺) ISCs10 המכיל עשיר בלוצין ומכיל חזרה עם חלבון G, מחקרים מאוחרים יותר זיהו גורמי גדילה חיוניים ליצירה והבחנה של PDIOs, מה שהוביל לפרוטוקולים שאומצו באופן נרחב במעבדות 11,12,13. עם זאת, הסביבות הניסיוניות לטיפול ב-PDIO עם תרופות מועמדות משתנות במידה ניכרת בין המחקרים ולעיתים קרובות אינן מתוארות כראוי 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45, 46, 47. יתרה מזאת, PDIOs עוברים בדרך כלל באמצעות הפרעה מכנית, מה שמוביל להטרוגניות בגודל האורגני, במורפולוגיה ובסידור המרחבי. שונות זו מסבכת את ההערכה המדויקת של תגובתיות התרופות והמנגנונים המולקולריים הבסיסיים. כדי להתמודד עם מגבלה זו, מחקרים עדכניים פיתחו PDIOs שמקורם בתאים בודדים או בתאים בודדיםממוינים 45,48,49,50,51,52,53,54.

במאמר זה, כאחת השיטות המשלימות והמעשיות, מוצגים "PDIOs עם זרע תא יחיד" ליצירת PDIO סטנדרטיים מתליית תא יחיד באמצעות ECM ומדיה קונבנציונליים, מה שמאפשר בדיקות מדויקות וניתנות לשחזור. בקצרה, תאים בודדים שבודדו מה-PDIO הבוגרים הוטמעו ב-ECM בצפיפויות תא מוגדרות, והתרביות שהתקבלו נבדקו במשך שבועיים בזמן שמספר, גודל ומורפולוגיה נמדדו. מכיוון שכל כיפה של ECM מוטמעת בקלט תא ידוע, ספירת האורגנידים לבאר עקבית, מה שמאפשר חישוב יעילות הייצור כקריאה לקיבולת רגנרטיבית בכל קו אורגנואידי49,54. למרות שהמטריג'ל בצורת כיפה מייצר הטרוגניות בגודל בשל הגרדיאנט המרחבי של ריכוז Wnt3a הנובע מחוסר היציבות הטבועה בו ומהדיפוזיה המוגבלת55, שונות בגודל בין בארות ב-PDIO חד-תאית נמוכה משמעותית מאשר באורגנידים שמקורם במעבר 49,54. עם זאת, לגישה זו עדיין יש מגבלות מעשיות. ללא מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה, ייתכן שחלק מהאורגנידים נוצרים מדאבלטים או טריפלטים, מה שמוביל להטרוגניות ביולוגית פנימית בתוך PDIOs. כמו כן, יש לקבוע אמפירית את מספר התאים הבודדים האופטימלי עבור כל קו אורגנואידי בשל יעילות ייצור משתנה. לבסוף, PDIOs חד-זרעי תא ממוינים במלואם עברו ניתוחים במורד הזרם כולל PCR שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR), ווסטרן בלוט ואימונוהיסטוכימיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל החומרים והתגובות הנדרשים לניסוי מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים וחומרים

  1. חממו מראש את צלחת תרבית האורגנידים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך יותר מ-90 דקות.
    הערה: חימום מוקדם של לוח התרבות יעזור להצקות את ה-ECM ולשמור על צורת הכיפה. 90 דקות הוא הזמן המינימלי הנדרש לפולימריזציה של ECM. מומלץ מאוד לחמם את הצלחת מראש ליותר מ-12 שעות.
  2. השתמש במדיום גדילה אורגנואידי (EXP) בתוספת 0.5% פניצילין-סטרפטומיצין (PS) כמדיום תרבית אורגנואידים.
  3. לצורך התמיינות של PDIO עם זרעים חד-תאיים, יש להשתמש במדיום התמיינות (DIF) המורכב ממדיום בסיסי המשולב עם גורמי גדילה (טבלה 1). התווך הבסיסי מורכב מ-DMEM/F12 מתקדם בתוספת 0.5% PS, 0.25% גנטמצין סולפט ו-1% גלוטמין, יחד עם גורמי גדילה הבאים: Noggin (100 ng/mL), R-Spondin-1 (1 מיקרוגרם/מ"L), Wnt3a (100 ng/mL), גורם גדילה אפידרמלי (EGF; 50 ng/mL), N-אצטיל-L-ציסטאין (1 mM), [Leu15]-גסטרין I אנושי (10 ננומטר), A 83-01 (500 ננומטר), גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-I; 200 ng/mL), פקטור גדילה של פיברובלסטים (FGF; 100 ng/mL), ותוסף B-27 (1x) (טבלה 1).
    הערה: PS וגנטמצין הם ביו-מסוכנים ויש לטפל בהם עם כפפות והגנה על העיניים.
  4. הכינו מחדש את תמיסת התאים (CRS), בופר שטיפה (DMEM גבוה גלוקוז עם 1% BSA), 1 mM Y-27632, EXP ו-DIF, ושמור על הקרח עד השימוש.
    הערה: אפשר ל-EXP ול-DIF להתאזן לטמפרטורת החדר לפחות 20 דקות לפני הוספה לצלחות התרבית המחוממות מראש.
  5. הפשיר את ה-ECM על הקרח וודא שהוא תמיד קר.
    הערה: ECM דורש הפשרה על קרח ויש לשמור אותו תמיד קר כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת.
  6. לאזן את תגובת הדיסוציאציה האנזימטית לטמפרטורת החדר. חממו מראש את המגיב באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני היישום.
    הערה: תגובת ניתוק אנזימטי היא מגרה ויש לטפל בה עם ציוד מגן אישי מתאים.

2. הפשרה והתאוששות של PDIOs שמורים בקריופ

  1. שלפו את צינור הקריוביאלים המכיל אורגנואידים ממיכל החנקן הנוזלי. שחרר מעט את פקק הצינור והפשר באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60-90 שניות.
    הערה: העבר מיד את הצינור לקרח לאחר ההפשרה.
  2. הרטיב מראש קצה פיפטה רחב-קוטר עם בופר שטיפה והעבר את האורגנואידים מהצינור הקרייביאלי לצינור של 50 מ"ל.
  3. שטוף את הקריוביאל עם 1 מ"ל של בופר שטיפה והעבר את התכולה הנותרת לצינור של 50 מ"ל. חזור על שלב השטיפה הזה פעמיים.
  4. צנטריפוגה ב-290 × גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. ודא שנוצר כדור גלוי נראה בתחתית הצינור.
  5. שאפו את הסופרנטנט.
  6. תלייה מחדש ב-ECM באמצעות קצה פיפטה רטוב מראש רחב.
  7. הנח את ה-ECM על פלטת 24 בארות מחוממת מראש ודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: השתמש ב-30 מיקרו-ליטר ECM לכל באר.
  8. הוסיפו EXP ומקיפים את הבארות במי מלח סטריליים עם בופר פוספט (PBS) או מים מזוקקים.
    הערה: השתמש ב-500 מיקרו-ליטר של EXP לכל באר. התרבית ב-EXP הושלמה עם 10 מיקרומום Y-27632 במשך שלושת הימים הראשונים, ואז עברה ל-EXP ללא Y-27632.

3. העברת PDIOs

  1. שאפו את הניסיון שהוצא.
  2. הרטיב מראש קצה פיפטה רחב-קוטר עם בופר שטיפה, הוסף 1 מ"ל של תגובת פירוק תאים לניתוק ה-ECM, והעבר את התכולה לצינור של 15 מ"ל.
  3. דגרו את הצינור על נדנדה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. פנו את הסופרנטנט והוסיפו 1 מ"ל של בופר כביסה. השעתי 20 פעמים.
  6. הוסף עוד 1 מ"ל של בופר כביסה, תלה מחדש 20 פעמים, והעבר לצינור של 50 מ"ל.
  7. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. שאפו את הסופרנטנט.
  9. תלייה מחדש ב-ECM באמצעות קצה פיפטה רטוב מראש רחב.
  10. הנח את ה-ECM על פלטת 24 בארות מחוממת מראש ודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: השתמש ב-30 מיקרו-ליטר ECM לכל באר.
  11. הוסיפו EXP ומקיפים את הבארות במים סטריליים של 1x PBS או מים מזוקקים.
    הערה: השתמש ב-500 מיקרו-ליטר של EXP לכל באר. התרבית ב-EXP הושלמה עם 10 מיקרומום Y-27632 במשך שלושת הימים הראשונים, ואז עברה ל-EXP ללא Y-27632.

4. תרבית PDIO חד-תאית

  1. שאפו את הניסיון שהוצא.
    הערה: פסולת המכילה אנטיביוטיקה (למשל, מדיום עם PS או ג'נטמיצין) צריכה להיות מאוטוקלבת לפני ההשלכה.
  2. שטוף עם 1 מ"ל של PBS סטרילי 1x.
  3. הרטיב מראש קצה פיפטה רחב-קוטר עם בופר כביסה, מוסיפים 300 מיקרוליטר CRS לניתוק ECM, והעבירו את התכולה לצינור של 50 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 1A).
  5. שואף את הסופרנאנט, הוסף 3 מ"ל של בופר שטיפה, ותלווה מחדש 20 פעמים.
    הערה: שלב זה משבש מכנית את האורגנואידים.
  6. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 1B).
  7. שואף את הסופרנטנט והוסיף 5 מ"ל של תגובת דיסוציאציה אנזימטית מחוממת מראש המכילה 10 מיקרומום Y-27632. סובב 2-3 פעמים ודגר באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות, תוך ניעור הצינור כל 5 דקות.
    הערה: מצטברות פסולת מופיעות בדרך כלל תוך 10 דקות מהדגירה. הגבל את סך הטיפול במגיב הדיסוציאציה האנזימטי לפחות מ-20 דקות. אל תעלה על 25 דקות, שכן עיכול יתר פוגע משמעותית בתפוקה ובחיוניות של תאים בודדים.
  8. הוסף 10 מ"ל DMEM עם סוכר גבוה.
  9. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 1C).
  10. שאפו את הסופרנטנט והוסיפו 1 מ"ל של בופר שטיפה. השעתי 20 פעמים.
    הערה: פסולת המכילה תגובת דיסוציאציה אנזימטית צריכה להיאסף בנפרד ולהשבית עם אקונומיקה של 0.5-1% לפחות 30 דקות לפני ההשלכה, בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
  11. סינן דרך מסננת תא של 40 מיקרון לצינור חדש בנפח 50 מ"ל (איור 1D).
    הערה: שלב זה קריטי לבידוד תאים בודדים מהאורגנואידים הבוגרים. יש להשתמש במסננת תאים של 40 מיקרון לבידוד תאים בודדים.
  12. ספירת תאים באמצעות Trypan Blue. העבר את הנפח המחושב לצינור של 1.5 מ"ל.
    הערה: לוחות 3,000-4,000 תאים לכל באר בלוח 96 בארות מחומם מראש.
  13. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (איור 1E).
  14. הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה.
  15. החזירו את התאים ל-ECM (100-500 תאים/מיקרוליטר) באמצעות קצה פיפטה רטוב מראש רחב.
  16. הנקודה את ה-ECM לפלטת 96 בארות מחוממת מראש ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: השתמש ב-10 מיקרו-ליטר של ECM לכל באר.
  17. הוסיפו DIF לבארות. הקיפו את הבארות במים סטריליים של 1x PBS או מים מזוקקים.
    הערה: השתמש ב-150 מיקרוליטר DIF לכל באר. התרבית ב-DIF הושלמה עם 10 מיקרומום Y-27632 במשך 3 ימים, ואז הוחלפה ל-DIF ללא Y-27632. החלף בינוני כל 3 ימים ושמור על זה בסך הכל 10 ימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לצורך יצירת PDIO עם זרע תא יחיד, נאספו ביופסיות צביטה רירית של האילאום הסופי ושל המעי הגס העולה מנבדקים בריאים בהסכמה במהלך קולונוסקופיית ניטור באמצעות מלקחי ביופסיה סטנדרטיים בקוטר 2.8 מ"מ, תחת ועדת הסקירה המוסדית של בית הספר לרפואה גרוסמן של אוניברסיטת ניו יורק (פרופיל חיסוני רירי בחולים עם מחלת מעי דלקתית; S12-01137). לאחר מכן, נוצרו PDIOs עם זרעים תאיים בודדים על ידי פירוק 6,000 תאים שבודדו מ-PDIOs בוגרים לתוך ה-ECM, ואחריהם גידול ב-DIF. האורגנואידים נוצרו מתאים בודדים והחלו ליצור מב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

PDIOs מחזיקים בהבטחה עצומה למידול מחלות מדויק, סקר תרופות ורפואה רגנרטיבית, שכן הם שומרים בנאמנות על הנוף הגנטי והאפיגנטי של מטופלים בודדים. עם זאת, היישומים המעשיים שלהם לעיתים קרובות מוגבלים בשל קשיים בסטנדרטיזציה של יצירת אורגניים ואפיון. כדי להתגבר על אתגרים אלו, הוכנסה גישה המשתמשת ב-PDIOs שמקורם בהשעיית תא יחיד או תאים בודדים במחקרים אחרונים 45,48,49,50,51,52,53,54.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ג'ורדן א. אקסלרד קיבל מענקי מחקר מ-BioFire Diagnostics, Genentech, Janssen ו-Takeda; דמי ייעוץ, שכר או עמלות ועדת ייעוץ מ-AbbVie, Abivax, Adiso, Biomerieux, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Ferring, Fresenius, Janssen, Merck, Pfizer, Sanofi, Takeda ו-Vedanta. K.C. הוא ממציא בפטנט אמריקאי מספר 10,722,600 ובפטנטים זמניים 62/935,035 ו-63/157,225.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (RS-2025-0057588, RS-2024-00411768, RS-2025-18362970, ו-RS-2025-02214844, קיונג קו ג'אנג); מענק של פרויקט מחקר ופיתוח טכנולוגיית בריאות קוריאה דרך מכון פיתוח תעשיית הבריאות של קוריאה (KHIDI) במימון משרד הבריאות והרווחה של רפובליקת קוריאה (RS-2024-00406488, קיונג קו ג'אנג); DK093668 מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (קן קדוול); K23DK124570 (ג'ורדן אי. אקסלרד); קרן קרוהן ודלקת קוליטיס (ג'ורדן אי. אקסלרד). למממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[לו<מה נשמע>15]-גסטרין אני בן אדםסיגמא-אלדריץ'G91450-0.1 מ"ג
צינור קוני בקוטר 15 מ"לSPL50015
20X PBS, pH 7.4ביוססאנגP2007-7.4
צינור קוני בנפח 50 מ"לSPL50050
A 83-01טוקריס2939-10 מ"ג
DMEM/F-12 מתקדםגיבקו12634010
Axygen 1000 ומיקרו; קצות פיפט L, רחבי קינה, שקופים, לא סטרילייםאקסיגןT-1005-WB-C
Axygen 200 ומיקרו; קצות פיפט L, רחבי קינה, שקופים, לא סטרילייםאקסיגןT-205-WB-C
תוסף B-27 (50X) ללא סרוםגיבקו17504044
אלבומין סרום בקררוש10735078001
מיקרולוחות פוליסטירן שקופים עם 96 בארות קורנינגקורנינג3599
פתרון לשחזור תאי קורנינגקורנינג354253
מטריצת קורנינג ECM (קורנינג מטריג'ל) קורנינג356231
לוחות באר מרובים של בורות שקופים ב-Costar 24 בארות שטופלו ב-TCקורנינג3526
סוכר גבוה ב-DMEM עם גלוטמין יציב עם נתרן פירובטביוווסטL0103-500
גנטמיציןגיבקו15750060
תגובת דיסוציאציה עדינה של תאיםתאי גזע100-0485
חלבון רקומביננטי FGF-2/bFGF) אנושי (FGF-2/bFGF) (154 aa)גיבקו100-18B-100UG
IGF-I אנושי, חלבון רקומביננטי חופשי מבעלי חייםגיבקוAF-100-11-500UG
חלבון נוגין אנושיאקרוביוסיסטםללא H5219-1mg
חלבון R-Spondin 1 / RSPO1 (21-146) אנושיאקרוביוסיסטםRS6-H4220-1mg
מדיום גדילה אורגנואידי IntestiCult (אדם)תאי גזע6010
L-גלוטמין 100XביוווסטX0550-100
חלבון רקומביננטי EGF בעכברגיבקו315-09-100UG
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמא-אלדריץ'A9165-5 g
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100Xביוווסטl0022-100
אדם רקומביננטי של Wnt3a פונדקאיאקרוביוסיסטםWNE-W5253-50ug
TrypLE (תגובת דיסוציאציה אנזימטית) מבטא אנזים (1X), ללא פנול אדום גיבקו12604013
Y-27632 דיהידרוכלורידטוקריס1254-10MG

מקורות

  1. Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
  2. Zheng, D., Liwinski, T., Elinav, E. Interaction between microbiota and immunity in health and disease. Cell Res. 30 (6), 492-506 (2020).
  3. Liebing, E., Krug, S. M., Neurath, M. F., Siegmund, B., Becker, C. Wall of Resilience: How the Intestinal Epithelium Prevents Inflammatory Onslaught in the Gut. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 19 (2), 101423(2025).
  4. Soderholm, A. T., Pedicord, V. A. Intestinal epithelial cells: at the interface of the microbiota and mucosal immunity. Immunology. 158 (4), 267-280 (2019).
  5. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: Regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  6. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  7. Lucafò, M., et al. Patient-derived organoids for therapy personalization in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 28 (24), 2636-2653 (2022).
  8. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, (2022).
  9. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  12. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  13. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793.e6 (2018).
  14. An, S., Huh, H., Ko, J. S., Moon, J. S., Cho, K. Y. Establishment and characterization of patient-derived intestinal organoids from pediatric Crohn's disease patients. Pediatr Gastroenterol Hepatol Nutr. 27 (6), 355-363 (2024).
  15. d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Front Cell Dev Biol. 8, 363(2020).
  16. Arnauts, K., et al. Ex vivo mimicking of inflammation in organoids derived from patients with ulcerative colitis. Gastroenterology. 159 (4), 1564-1567 (2020).
  17. Deleu, S., et al. High acetate concentration protects intestinal barrier and exerts anti-inflammatory effects in organoid-derived epithelial monolayer cultures from patients with ulcerative colitis. Int J Mol Sci. 24 (1), (2023).
  18. Dennison, T. W., et al. Patient-derived organoid biobank identifies epigenetic dysregulation of intestinal epithelial MHC-I as a novel mechanism in severe Crohn's Disease. Gut. 73 (9), 1464-1477 (2024).
  19. Ding, W., Marx, O. M., Mankarious, M. M., Koltun, W. A., Yochum, G. S. Disease severity impairs generation of intestinal organoid cultures from inflammatory bowel disease patients. J Surg Res. 293, 187-195 (2024).
  20. Dotti, I., Mayorgas, A., Salas, A. Generation of human colon organoids from healthy and inflammatory bowel disease mucosa. PLoS One. 17 (10), e0276195(2022).
  21. Ferrer-Picón, E., et al. Intestinal inflammation modulates the epithelial response to butyrate in patients with inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 26 (1), 43-55 (2020).
  22. Gopalakrishnan, S., et al. Comprehensive protocols for culturing and molecular biological analysis of IBD patient-derived colon epithelial organoids. Front Immunol. 14, 1097383(2023).
  23. Hammoudi, N., et al. Autologous organoid co-culture model reveals T cell-driven epithelial cell death in Crohn's Disease. Front Immunol. 13, 1008456(2022).
  24. Jurickova, I., et al. Eicosatetraynoic acid and butyrate regulate human intestinal organoid mitochondrial and extracellular matrix pathways implicated in Crohn's disease strictures. Inflamm Bowel Dis. 28 (7), 988-1003 (2022).
  25. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., van Griensven, M., Giselbrecht, S. A Microwell-based intestinal organoid-macrophage co-culture system to study intestinal inflammation. Int J Mol Sci. 23 (23), (2022).
  26. Karakasheva, T. A., et al. Patient-derived colonoids from disease-spared tissue retain inflammatory bowel disease-specific transcriptomic signatures. Gastro Hep Adv. 2 (6), 830-842 (2023).
  27. Kawamoto, A., et al. Ubiquitin D is upregulated by synergy of notch signalling and TNF-α in the inflamed intestinal epithelia of IBD patients. J Crohns Colitis. 13 (4), 495-509 (2019).
  28. Kelsen, J. R., et al. Colonoids from patients with pediatric inflammatory bowel disease exhibit decreased growth associated with inflammation severity and durable upregulation of antigen presentation genes. Inflamm Bowel Dis. 27 (2), 256-267 (2021).
  29. Lee, C., et al. Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids. J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).
  30. Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to T-cell-mediated tissue injury. Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).
  31. Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. The γδ IEL effector API5 masks genetic susceptibility to Paneth cell death. Nature. 610 (7932), 547-554 (2022).
  32. Murthy, S., et al. Single-cell transcriptomics of rectal organoids from individuals with perianal fistulizing Crohn's disease reveals patient-specific signatures. Sci Rep. 14 (1), 26142(2024).
  33. Nanki, K., et al. Somatic inflammatory gene mutations in human ulcerative colitis epithelium. Nature. 577 (7789), 254-259 (2020).
  34. Niklinska-Schirtz, B. J., et al. Ileal derived organoids from Crohn's disease patients show unique transcriptomic and secretomic signatures. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 1267-1280 (2021).
  35. Nishimura, R., et al. Establishment of a system to evaluate the therapeutic effect and the dynamics of an investigational drug on ulcerative colitis using human colonic organoids. J Gastroenterol. 54 (7), 608-620 (2019).
  36. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. J Crohns Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  37. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nat Commun. 12 (1), 262(2021).
  38. Skovdahl, H. K., et al. Patient derived colonoids as drug testing platforms-critical importance of oxygen concentration. Front Pharmacol. 12, 679741(2021).
  39. Suzuki, K., et al. Single cell analysis of Crohn's disease patient-derived small intestinal organoids reveals disease activity-dependent modification of stem cell properties. J Gastroenterol. 53 (9), 1035-1047 (2018).
  40. Tindle, C., et al. A living organoid biobank of patients with Crohn's disease reveals molecular subtypes for personalized therapeutics. Cell Rep Med. 5 (10), 101748(2024).
  41. Tsuchiya, M., et al. Functional analysis of isoflavones using patient-derived human colonic organoids. Biochem Biophys Res Commun. 542, 40-47 (2021).
  42. Vanhove, W., et al. Biopsy-derived intestinal epithelial cell cultures for pathway-based stratification of patients with inflammatory bowel disease. J Crohns Colitis. 12 (2), 178-187 (2018).
  43. Xu, P., et al. Interleukin-28A induces epithelial barrier dysfunction in CD patient-derived intestinal organoids. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 320 (5), G689-G699 (2021).
  44. Ko, C. Y., et al. Alleviative Effect of alpha-lipoic acid on cognitive impairment in high-fat diet and streptozotocin-induced type 2 diabetic rats. Front Aging Neurosci. 13, 774477(2021).
  45. Jang, K. K., et al. Tofacitinib uptake by patient-derived intestinal organoids predicts individual clinical responsiveness. Gastroenterology. 167 (7), 1453-1456.e5 (2024).
  46. Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. Int J Mol Sci. 22 (11), (2021).
  47. Laudadio, I., et al. Characterization of patient-derived intestinal organoids for modelling fibrosis in Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Res. 73 (8), 1359-1370 (2024).
  48. Marinucci, M., et al. Standardizing patient-derived organoid generation workflow to avoid microbial contamination from colorectal cancer tissues. Front Oncol. 11, 781833(2021).
  49. Lin, X., et al. IL-17RA-signaling in Lgr5(+) intestinal stem cells induces expression of transcription factor ATOH1 to promote secretory cell lineage commitment. Immunity. 55 (2), 237-253.e8 (2022).
  50. Miller, D. S., Talbot, C. A., Simpson, W., Korey, A. A comparison of naproxen sodium, acetaminophen and placebo in the treatment of muscle contraction headache. Headache. 27 (7), 392-396 (1987).
  51. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  52. Abdulla, N., Aronson, R., Plessis, T. D., Bebington, B., Kaur, M. Protocol for the establishment and characterization of South African patient-derived intestinal organoids. STAR Protoc. 6 (3), 103970(2025).
  53. Kang, S., Lee, M. R., Choi, W., Kong, S. Y., Kim, Y. H. Protocol for generation and utilization of patient-derived organoids from multimodal specimen. STAR Protoc. 6 (3), 104039(2025).
  54. Zhou, C., et al. Epigenetic reprogramming alters intestinal stem cell fate in pouchitis. bioRxiv. , (2025).
  55. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  56. Jang, K. K., et al. Variable susceptibility of intestinal organoid-derived monolayers to SARS-CoV-2 infection. PLoS Biol. 20 (3), e3001592(2022).
  57. He, G. W., et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 29 (9), 1333-1345.e6 (2022).
  58. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  59. Sockell, A., et al. A microwell platform for high-throughput longitudinal phenotyping and selective retrieval of organoids. Cell Syst. 14 (9), 764-776.e6 (2023).
  60. Saito, T., Amako, J., Watanabe, T., Shiraki, N., Kume, S. Human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids for pharmacokinetic studies. Eur J Cell Biol. 104 (2), 151489(2025).
  61. Velasco, V., Shariati, S. A., Esfandyarpour, R. Microtechnology-based methods for organoid models. Microsyst Nanoeng. 6, 76(2020).
  62. Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Adv Biosyst. 4 (10), e2000126(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זריעת תא בודדאורגנואידים המופקים מחולהשונות של אורגנואידיםהדירות של אורגנואידיםבדיקת חיות של אורגנואידיםיעילות יצירת אורגנואידיםאנליזה טרנסקריפטומיתפרופיל ביטוי חלבונים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.