מאמר שיטה

הדמיית תאים חיים של הובלה אנדוציטית באמצעות ננו-גופים פונקציונליים בתאים מתורבתים

DOI:

10.3791/69284

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הובלה אנדוציטית ונסיגה של חלבונים מקרום הפלזמה לרשת הטרנס-גולגי חיונית לשמירה על הומאוסטזיס הממברנה ולוויסות האיתות. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה וכימות של הובלה אנדוציטית של חלבוני מטען טרנסממברניים על ידי מיקרוסקופ תאים חיים באמצעות ננו-גופים נגזרים נגד GFP בתאי HeLa.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנדוציטוזיס של קולטנים וחלבונים טרנסממברניים אחרים משטח התא לאנדוזומים ומעבר להם הוא קריטי להומאוסטזיס, פיזיולוגיה ותפקוד. כדי לחקור ספיגה אנדוציטית וסחר בחלבונים רטרוגרדיים, הקמנו ערכת כלים רב-תכליתית הכוללת ננו-גופים פונקציונליים לניטור הובלה מפני השטח של התא לרשת טרנס-גולגי (TGN) באמצעות הדמיית תאים קבועים וחיים, מיקרוסקופ אלקטרונים ואלקטרופורזה בג'ל בשילוב עם אוטורדיוגרפיה. פיתחנו ננו-גופים נגזרים המכוונים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או mCherry - קושרים חלבונים מונומריים, שאינם צולבים, בעלי זיקה גבוהה - שניתן להוסיף לקווי תאים המבטאים חלבוני ממברנה מעניינים הנושאים את תגי הקרינה החוץ-תאיים המתאימים. עם קשירה למדווחים טרנסממברניים מתויגים GFP או mCherry, הננו-גופים מופנמים באופן ספציפי ונסחרים במקביל למסלולי המיון האנדוגניים של המדווחים. ננו-גופים אלה פונקצונאליים עם פלואורופורים נבחרים כדי לעקוב אחר הובלה לאחור על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והדמיה חיה, עם אסקורבט פרוקסידאז 2 (APEX2) כדי לפתור לוקליזציה אולטרה-מבנית על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, ועם מוטיבים של טירוזין סולפטציה כדי להעריך כמותית את קינטיקה של הגעת TGN. במחקר מתודולוגי זה, אנו מפרטים את הפרוטוקול הכללי לביטוי חיידקים וטיהור של ננו-גופים פונקציונליים, כמו גם יצירת קווי תאים יציבים של GFP-reporter. אנו מדגימים את התועלת של גישה זו להדמיית תאים חיים על ידי שימוש בננו-גוף אנטי-GFP ששונה ב-mCherry (VHH-mCherry) כדי לנתח את הספיגה האנדוציטית של קולטן הטרנספרין (TfR) והקולטן התלוי בקטיון מאנוז-6-פוספט (CDMPR).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנדוציטוזיס של קולטנים וחלבונים טרנסממברניים אחרים (TM) מממברנת הפלזמה לתאים תוך-תאיים שונים חשובה לשמירה על הומאוסטזיס הממברנה 1,2. לאחר הפנמה על ידי אנדוציטוזיס תלוי קלתרין או בלתי תלוי, מטעני חלבון מאכלסים תחילה אנדוזומים מוקדמים משם הם ממוינים עוד יותר לאורך המערכת האנדו-ליזוזומלית, ממוחזרים לקרום הפלזמה, או נשלחים רטרוגרדית לרשת טרנס-גולגי (TGN)3,4,5. מיחזור מאנדוזומים ו/או משטח התא ל-TGN הוא חלק מהמחזור התפקודי של מספר קולטני מטען טרנסממברניים, כגון קולטני מנוז-6-פוספט תלויי קטיון ובלתי תלויים בקטיונים (CDMPR ו-CIMPR), המספקים הידרולזים ליזוזומליים מסונתזים חדשים מה-TGN לאנדוזומים וליזוזומים מאוחרים 6,7,8, Wntless (WLS) מעביר ליגנדים Wnt למשטח התא9, 10,11,12, או TGN46 המלווה חלבוני מטען מפרישים מסיסים, כולל גורם מווסת לבלב (PAUF) ומטען CARTS אחר, מ-TGN 13,14,15,16. בעוד שכל קולטני המטען הללו עוברים דרך ה-TGN לאיסוף חלבוני לקוח חדשים, קולטן הטרנספרין (TfR) שמפנים טרנספרין קשור לברזל אינו נכלל בהחזרת גולגי 17,18,19,20,21.

כדי לחקור תנועה אנדוציטית ונסיגה, הקמנו בעבר ערכת כלים מבוססת ננו-גוף שנועדה לתייג ולעקוב אחר חלבוני מטען מפני השטח של התא לתאים תוך-תאיים17. ננו-גופים מהווים סוג חדש של קושרים חלבונים שמקורם בנוגדנים הומודימריים בעלי שרשרת כבדה בלבד (hcAbs) המצויים באופן טבעי בגמלים ובדגי סחוס22,23. הם מייצגים את תחום השרשרת הכבדה המשתנה (VHH) של hcAbs ומציעים יתרונות רבים על פני נוגדנים קונבנציונליים (למשל, IgGs): הם מונומריים, קטנים (~15 kDa), מסיסים מאוד, חסרי קשרים דיסולפידים, יכולים להתבטא באופן חיידקי וניתנים לבחירה לקשירה בעלת זיקה גבוהה24. כדי לשפר את הרבגוניות והישימות הרחבה של ערכת כלים זו של ננו-גוף, השתמשנו בננו-גופים פונקציונליים נגד GFP כדי לתייג ולעקוב אחר חלבונים המתויגים בתגי GFP בתחומים החוץ-תאיים או הלומנליים שלהם. באמצעות צימוד רקומביננטי של ננו-גופים עם mCherry, ascorbate peroxidase 2 (APEX2), או רצפי טירוזין סולפטציה, ניתן לנתח את הסחר לאחור של חלבוני מטען טרנסממברניים בתום לב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי קבוע וחי, מיקרוסקופ אלקטרונים או בדיקות ביוכימיות באמצעות אוטורדיוגרפיה. בהתחשב בכך שסולפטציה של טירוזין, המזרזת על ידי טירוזיל חלבון סולפוטרנספראזות TPST1 ו-TPST2, היא שינוי פוסט-תרגומי המוגבל לטרנס-גולגי/TGN, אסטרטגיה זו מאפשרת הערכה ישירה של דינמיקת הובלה וקינטיקה משטח התא לתא גולגי 25,26,27. לאחרונה, הרחבנו את הרפרטואר הזה של קושרי חלבון פונקציונליים כדי לכלול ננו-גופנים נגזרים נגד mCherry . ריאגנטים אלה הוכיחו את עצמם כחיוניים בניתוח מסלולי הובלה תלויי מכונות של MPR, במיוחד של CDMPR17,28, ל-TGN באמצעות ניתוחים ביוכימיים.

בעוד שהמחקר הקודם התמקד בעיקר ביישום של ננו-גופים ששונו עם רצפי סולפטציה של טירוזין כדי להעריך ביוכימית את הגעת TGN על ידי אוטורדיוגרפיה19, מאמר שיטות זה מתאר את היצירה של ננו-גופים פונקציונליים (VHH-mCherry) וקווי תאים מדווחים להדמיית תאים חיים של סחר אנדוציטי. בשילוב עם חלבון מדווח פלואורסצנטי נוסף תושב גולגי, ניתן להתאים פרוטוקול זה עוד יותר כדי לשמש כזרימת עבודה חזקה לניתוח כמותי של הדמיית תאים חיים של הובלת אנדוזום ל-TGN של חלבוני מטען נבחרים.

לפני יישום פרוטוקול זה, על החוקרים לוודא כי חלבון המטרה מתבטא כמבנה היתוך מתויג GFP, שנוצר בדרך כלל על ידי גישות שיבוט מולקולאריות סטנדרטיות. ניתן לייצר בקלות ננו-גופים פונקציונליים בחיידקים בתפוקות המספיקות לניסויי תיוג פני השטח, כאשר ריכוזי עבודה בטווח הננו-מולרי הנמוך מתאימים לרוב בדיקות ההדמיה של תאים חיים. על המשתמשים גם לקחת בחשבון שקינטיקה של הובלה עשויה להשתנות בין חלבוני מטען, מה שדורש התאמה של משך התיוג או תדירות ההדמיה להדמיה אופטימלית של סחר אנדוציטי או אנדוזום ל-TGN.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טרנספורמציה חיידקית עם VHH-mCherry

הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לביטוי, טיהור וניתוח של ננו-גופים אנטי-GFP פונקציונליים כפי שתואר קודם לכן17. השלבים הבאים מותאמים ל-VHH-mCherry ועולים בקנה אחד עם הדוח המתודולוגי הקודם19.

  1. הפשירו חיידקים כימותרפיים (50-100 מיקרוליטר) המתאימים לביטוי חלבון (למשל, תאי Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3)) על ידי הנחתם על קרח.
    הערה: הכן תאי חיידקים כימותרפיים בהתאם לפרוטוקולי מעבדה סטנדרטיים. ניתן להשתמש בתאי BL21 (DE3) הזמינים מסחרית מבית NEB לשם כך.
  2. הוסף 50 ננוגרם של פלסמיד המקודד את מבנה ה-VHH-mCherry הפונקציונלי (Addgene #109421). כדי להבטיח ביוטינילציה יעילה ספציפית לאתר של מדווח הננו-גוף במהלך ביטוי חיידקים, טרנספורמציה משותפת עם עודף משולש (150 ננוגרם) של פלסמיד המקודד את הביוטין ליגאז החיידקי BirA (Addgene #109424). החלק בעדינות את הצינור 4x-5x כדי לערבב תאים ו-DNA פלסמיד.
    הערה: אין צורך בטרנספורמציה משותפת עם הפלסמיד המקודד BirA אם אין צורך בביוטינילציה על ידי פפטיד מקבל הביוטין (BAP).
  3. דוגרים את התערובת על קרח למשך 30 דקות. הימנע מתסיסה במהלך שלב זה.
  4. הלם חום תאי חיידקים על ידי הצבתם למשך 20 שניות בדיוק ב-42 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום.
  5. הוסף 1 מ"ל של מדיום מרק לוריא (LB) בטמפרטורת החדר (RT) ודגר את החיידקים שעברו טרנספורמציה בתרמושייקר (250-500 סל"ד) למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר ביטוי פנוטיפי של גנים עמידים לאנטיביוטיקה.
    הערה: להכנת 1 ליטר בינוני, מוסיפים 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם טריפטון, 10 גרם NaCl ומרכיבים את הנפח במים, ומעקרים על ידי חיטוי.
  6. גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-11,000 x גרם למשך דקה אחת והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מדיום LB טרי. מערבבים היטב על ידי פיפטינג.
  7. צלחו את החיידקים המרחפים על צלחות LB מחוממות מראש המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה (למשל, עם 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין; אם התמרה משותפת עם BirA, כלול גם 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין, ראה שלב 1.2).
  8. דגרו את לוחות ה-LB בתוספת אנטיביוטיקה הפוכים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 13-15 שעות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן צלחות עם מושבות מגודלות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולאטום בסרט חדיר למניעת ייבוש.

2. תרבית נוזל חיידקים ואינדוקציה של ביטוי VHH-mCherry

  1. בחר מושבת חיידקים בודדת מצלחת הטרנספורמציה וחסן אותה לבקבוק ארלנמאייר המכיל 20 מ"ל מדיום LB בתוספת אנטיביוטיקה. דגרו את התרבית באינקובטור רועד למשך 13-15 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ראה גם שלב 1.7 לגבי אנטיביוטיקה לבחירה).
  2. למחרת, יש לדלל את תרבית החיידקים של 20 מ"ל למשך הלילה לבקבוק טרי המכיל 1 ליטר של מדיום LB עם אנטיביוטיקת הבחירה המתאימה.
  3. המשך לדגור ב-37 מעלות צלזיוס עד שהתרבית מגיעה לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD600) של 0.6-0.7.
    הערה: הניחו לתרבית להתקרר ל-RT או ל-16 מעלות צלזיוס לפני השראת ביטוי החלבון.
  4. לגרום לביטוי של VHH-mCherry (ו-BirA, אם הוא מתבטא במשותף) על ידי הוספת 1 מ"ל של 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"מ של המשרה (דילול של 1:1000). אם בוצעה טרנספורמציה משותפת עם פלסמיד הביטוי BirA, השלם את התרבית גם ב-10 מ"ל של תמיסת מלאי D-biotin של 20 מ"מ, המניבה ריכוז סופי של 200 מיקרומטר D-ביוטין במדיום הגידול. זה מקל על ביוטינילציה in vivo של האפיטופ מקבל הביוטין (BAP) הקיים במבנה VHH-mCherry .
    הערה: הכן את מלאי ה-D-ביוטין ב-ddH2O והמיס אותו על ידי הוספה הדרגתית של 500 מ"מ NaH2PO4.
  5. דגרו על תרבית 1 ליטר המושרה על ידי IPTG למשך 13-15 שעות ב-16 מעלות צלזיוס כדי לקדם קיפול ותפוקה אופטימליים של חלבון.
    הערה: תנאי ביטוי עבור מבני ננו-גופים שתוכננו לאחרונה עם תגים פלואורסצנטיים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה אמפירית על ידי החוקר.
  6. העבירו את התרבית לבקבוק צנטריפוגה של 1 ליטר וקצרו תאים על ידי צנטריפוגה ב-5,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. השליכו את הסופרנטנט לפסולת הביולוגית הנוזלית המתאימה והמשיכו בשלבי הטיהור.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה על ידי אחסון גלולת החיידקים ב-80 מעלות צלזיוס. גלולת VHH-mCherry נראית בדרך כלל ורודה, מה שמעיד על קיפול נכון של חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי.

3. טיהור מבוסס IMAC של VHH-mCherry

  1. במידת הצורך, הפשירו את כדור החיידקים הקפוא על קרח (ראה גם שלב 2.6).
  2. הוסף 30 מ"ל של מאגר קשירה קר כקרח (20 מ"מ אימידזול ב-1x PBS) לכדור תא החיידק והשהה מחדש ביסודיות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. העבירו את המתלה לצינור צנטריפוגה מסומן של 50 מ"ל.
  3. השלם את התאים המרחפים עם 200 מיקרוגרם/מ"ל ליזוזים, 20 מיקרוגרם/מ"ל DNase I, 1 מ"מ MgCl2 ו-1 מ"מ פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF). דגרו את התערובת למשך 10 דקות ב-RT, ולאחר מכן שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס על מסובב מקצה לקצה.
    הערה: PMSF רעיל. להכין ולטפל בתמיסות מלאי במכסה אדים כימי עם כפפות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים; השלך פסולת המכילה PMSF במיכלי פסולת אורגנית הלוגנית. לניסויים נעשה שימוש בתמיסת מלאי של 0.1 M ודוללה עוד יותר.
  4. לשבש מכנית את תאי החיידקים באמצעות סוניקטור קצה המוחדר ישירות לתרחיף. הפעל שלושה פולסים קבועים של סוניקציה של דקה אחת, המאפשרים מרווח קירור של דקה אחת בין כל פולס עם הגדרות סוניקטור מוגדרות (גודל קצה בדיקה: 6 מ"מ, קצה מוצק; משרעת 40%; מחזור עבודה (מצב דופק): 1 שניות מופעל/1 שניות כבוי)
  5. הבהירו את הליזאט על ידי צנטריפוגה ב-15,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות כדי לגלול פסולת תאי חיידקים וחיידקים שלמים.
    הערה: ניתן להעביר את הליזאט לבקבוק צנטריפוגה או להכניס אותו לצינורות של 5 מ"ל לצנטריפוגה על ספסל.
  6. העבירו בזהירות את הסופרנטנט שנוצר לצינור חדש של 50 מ"ל והשליכו את הגלולה לפסולת הביולוגית המתאימה.
  7. שמור את הליזט הנקי על הקרח תוך הכנה לכרומטוגרפיה של זיקה מתכתית (IMAC). לבידוד של ננו-גופים מתויגים-היסטידין, השתמש בעמודות טיהור His-tag ארוזות מראש לשימוש חד-פעמי המותאמות לפעולת זרימת כוח הכבידה.
  8. אבטח את עמודי Ni-NTA (חומצה ניטרילוטריאצטית) על מעמד מתכת או מחזיק עמודים מתאים.
    1. רוקנו את מאגר האחסון מהעמודות ואזנו עם 10 מ"ל של מאגר כריכה (20 מ"מ אימידזול ב-1x PBS).
    2. אפשר למאגר לעבור דרך כוח הכבידה; השליכו את הזרימה כפסולת ביולוגית.
  9. מרחו בהדרגה את הליזט החיידקי שנוקה (~30 מ"ל) על העמודה. תן לו לזרום דרך כוח הכבידה והשליך את הזרימה.
  10. שטפו את העמודה בשני נפחים רצופים של 10 מ"ל של מאגר מחייב (20 מ"מ אימידזול ב-1x PBS).
  11. הוצא את הננו-גופים הקשורים עם 2 מ"ל של מאגר פליטה (500 מ"מ אימידזול ב-1x PBS) לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל.
  12. בצע החלפת מאגר.
    1. יש לאזן עמוד התפלה המונח במתאם צינור של 50 מ"ל על ידי שטיפה 5x עם 5 מ"ל של 1x PBS.
    2. אפשר למאגר להיכנס במלואו לשרף הארוז; השליכו את הזרימה. לאחר שטיפת ה- PBS הסופית, צנטריפוגה את העמוד ב -1,000 x גרם למשך 2 דקות.
    3. השלך את הזרימה. הנח את העמוד עם המתאם על צינור חדש של 50 מ"ל. טען 2 מ"ל של ננו-גוף פונקציונלי מנוקה (משלב 3.11) על עמוד ההתפלה המאוזן PBS וסובב ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות ואסוף את הפליטה.
      הערה: ניתן להשתמש בדיאליזה לחלופין להחלפת חוצץ.
  13. כמת את ריכוז חלבון ה-VHH-mCherry המטוהר באמצעות חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) או בדיקת ברדפורד בהתאם לפרוטוקולי היצרן.
    הערה: לספיגה יעילה של ננו-גופים ביישומי הדמיה של תאים חיים, מומלץ ריכוז מלאי סופי של 5-10 מ"ג/מ"ל.

4. אימות ביטוי וטוהר VHH-mCherry (צביעת Coomassie)

  1. הכן ג'ל 10% נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) על פי פרוטוקולי מעבדה שנקבעו.
    הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בג'לים שיפועים טרומיים זמינים מסחרית מבית Bio-Rad לנוחות ושחזור.
  2. יש ליטול 20 מיקרוגרם של VHH-mCherry מטוהר בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ולפרק על ידי רתיחה במאגר דגימה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. טען את דגימת הננו-גוף המפורקת על ג'ל SDS-polyacrylamide ובצע אלקטרופורזה בהתאם להליכי PAGE סטנדרטיים עד שצבע המעקב (למשל, ברומופנול כחול) מגיע לתחתית הג'ל המפרק.
  4. המשך עם צביעת Coomassie והימנעות מהג'ל.
    1. הסר בזהירות את הג'ל מהקסטה וטבל אותו בתמיסת צביעה של Coomassie (5% ממלאי Coomassie Brilliant Blue של 10 גרם/ליטר ב-10% חומצה אצטית ו-45% מתנול ב-ddH2O) למשך 20-30 דקות ב-RT על פלטפורמה רועדת בעדינות. ודא שהג'ל שקוע במלואו בתמיסת הצביעה.
    2. הימנעו מהג'ל באמצעות תמיסת עיכוב (7.5% חומצה אצטית ו-15% מתנול ב-ddH2O), ובצעו 2-3 שטיפות רצופות של שעה כל אחת ב-RT. להפחתת רקע אופטימלית, יש להשאיר את הג'ל למשך 13-15 שעות בתמיסת עיכוב טרייה.
      הערה: עודפי צבע יכולים להיספג ביעילות על ידי הנחת מגבות נייר ביתיות סביב הג'ל במהלך תהליך ההימנעות. תמיסות צביעה/עיכוב מכילות מתנול דליק וחומצה אצטית מגרה. השתמש במכסה אדים, ללבוש כפפות ומשקפי מגן, ואסוף תמיסות משומשות במיכלי פסולת דליקים ייעודיים.
  5. דמיין את הג'ל באמצעות מערכת תיעוד ג'ל או מצלמה לבחירתך.
    הערה: לאישור נוסף של ביטוי ננו-גופים, ניתן לבצע אימונובלוטינג באמצעות נוגדנים ספציפיים לאפיטופ (ראה גם איור 1C).

5. יצירת קווי תאי HeLa מדווחים מתויגים GFP באמצעות התמרה רטרו-ויראלית

הערה: כתבי GFP שונים HeLa α קווי תאים בקיוטו (כאן פשוט נקראים HeLa או HeLa α) נוצרו בעבר17. לצורך הדגמת בדיקת הדמיית התאים החיים, נעשה שימוש ב-CDMPR או TfR המתויגים ב-GFP, כחלבוני מטען מייצגים. בעוד שחלבוני TM עם טופולוגיה מסוג I מתויגים GFP בקצה ה-N הקיצוני, חלבוני TM עם טופולוגיה מסוג II דורשים היתוך GFP C-terminal.

  1. הגנים המקודדים ל-EGFP-CDMPR (Addgene #182642) או TfR-EGFP (#243763) שובטו בעבר לתוך הווקטור הרטרו-ויראלי pQCXIP באמצעות טכניקות שיבוט אנזימי הגבלה סטנדרטיות17. לאחר הטרנספורמציה ל-E. coli כימולוגי, הכינו DNA פלסמיד בטוהר גבוה באמצעות ערכות הכנה של מידי (למשל, מ-Macherey-Nagel).
    הערה: יש להכין תאי חיידקים כימותרפיים בהתאם לפרוטוקולי מעבדה סטנדרטיים. NEB 5-alpha Qualified E. coli מבית NEB יכול לשמש לשיבוט וטיהור פלסמיד.
  2. כדי ליצור קווי תאים יציבים של מדווח GFP, חלקיקים רטרו-ויראלים מיוצרים על ידי טרנספקציה של קו תאי האריזה אמפו פיניקס. כל עבודת תרבית התאים מתבצעת בתנאי זרימה למינרית BSL2.
    1. יום לפני הטרנספקציה, זרעו 2.0-3.0 x 106 תאי אמפו של פיניקס לתוך צלחת של 10 ס"מ ב-10 מ"ל של מדיום כדי להשיג מפגש של 60%-80% עד למחרת. אמפו פיניקס נשמר ב-DMEM GlutaMAX-I עתיר גלוקוז עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 יחידות/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין ו-1 מ"מ נתרן פירובט.
    2. ביום הטרנספקציה, החלף את המדיום ב -10 מ"ל של מדיום שלם טרי.
    3. בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, שלב 1 מ"ל של GlutaMAX-I ללא סרום ותוספי מזון עם 10 מיקרוגרם של pQCXIP-EGFP-CDMPR או pQCXIP-TfR-EGFP ו-30 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה FuGENE HD. מערבבים היטב על ידי פיפטינג.
    4. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של מגיב DNA.
    5. הוסף את כל תערובת הטרנספקציה טיפתית לתרבות האמפו של פיניקס. סובבו את הצלחת בעדינות כדי להפיץ את המתחמים באופן שווה.
    6. דגירה של תאי אמפו פניקס שעברו טרנספטציה למשך 13-15 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
      הערה: ניתן להשתמש בקווי תאי אריזה חלופיים, בתנאי שהם תואמים למערכת הווקטור Retro-X Q.
  3. למחרת, השליכו את מדיום הטרנספקציה והחליפו אותו ב-7 מ"ל של מדיום שלם טרי כדי לשפר את הייצור הנגיפי.
  4. לאחר 48 שעות ואופציונלי 72 שעות לאחר הטרנספקציה, אספו את התרבית העליונה (~7 מ"ל) המכילה חלקיקים נגיפיים באמצעות עזר פיפטה. עקוב אחר ביטוי GFP בתאי אמפו פניקס שעברו טרנספטציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מערכת הדמיה (למשל, Bio-Rad ZOE).
    הערה: שוב, מניפולציות רטרו-ויראליות דורשות הכלה של BSL-2. בצע את כל העבודות בארון בטיחות ביולוגית מוסמך, ללבוש כפפות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים, ולטהר משטחים עם 1% hexaquart ואחריו 70% אתנול לפני השלכת הפסולת באמצעות חיטוי.
  5. סנן את הסופרנטנט הנגיפי שנאסף דרך מסנן בגודל 0.45 מיקרומטר. ניתן להשתמש בסופרנטנט המסונן באופן מיידי (ראה שלב 5.7) או לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש לטווח קצר או בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. שימו לב שרמות הטיטר הנגיפי עשויות לרדת עם ההקפאה.
  6. כדי לבסס תאי HeLa מדווחים על GFP יציבים, המשך בהתמרה רטרו-ויראלית באמצעות הסופרנטנט הנגיפי המסונן. כל ההליכים חייבים להתבצע בתנאי BSL2.
    1. יום אחד לפני ההעברה, זרעו כ-2.0-3.0 x 106 תאי HeLa α בצלחת של 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום כדי להגיע למפגש של 60%-80% עד למחרת. תאי HeLa α תרבית ב-GlutaMAX-I עתיר גלוקוז DMEM בתוספת 10% FBS ו-100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. ערבבו סופרנטנט ויראלי מסונן עם 15 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן (הקסדימתרין ברומיד) כדי לשפר את יעילות הזיהום.
      הערה: פוליברן הוא חומר מגרה - במהלך הכנת המלאי, יש לטפל בכפפות והגנה על העיניים, להימנע מהיווצרות אירוסול ולהשליך תמיסות המכילות פוליברן כפסולת כימית מסוכנת.
    3. למחרת, החלף את מצע הגידול הסטנדרטי בסופרנטנט ויראלי לא מדולל המכיל פוליברן, וודא שכל שטח המנה מכוסה.
    4. דגירה של תאי HeLa α תחת התמרה למשך 13-15 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
      הערה: כדי לקבוע טיטר נגיפי, ניתן לבצע דילול סדרתי ובדיקות זיהום על תאי HeLa α. טיטרציה במקרה זה היא אופציונלית, מכיוון שרטרו-וירוסים מדביקים רק תאים מתחלקים.
  7. יום לאחר ההעברה, השליכו את המדיום הנגיפי לפסולת BSL2 והחליפו אותו ב-10 מ"ל של מדיום HeLa α שלם טרי. דגירה למשך 13-15 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  8. למחרת, התחל את הבחירה על ידי החלפת המדיום במדיום שלם המכיל 1.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.
  9. שמור על לחץ הבחירה למשך 2-3 שבועות, והעביר תאים לפי הצורך. לפני העברת תאים מהונדסים גנטית לסביבת BSL1, ודא שהם נקיים מחלקיקים נגיפיים בעלי יכולת שכפול.
  10. כדי להשיג אוכלוסייה הומוגנית, השתמש בבידוד משובט באמצעות טבעות שיבוט או גלילים, או מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS). ניתן לבצע FACS על תאי HeLa α מותמרים באמצעות FACSAria III או Fusion (BD Biosciences) כדי להעשיר לאוכלוסייה עם ביטוי GFP אחיד המבוסס על עוצמת הקרינה.
    הערה: ניתן לאמת את הביטוי של מדווח GFP בתאי HeLa α על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים קבועים או אימונובלוטינג עם נוגדנים נגד GFP (ראה גם איור 2C).

6. קליטת VHH-mCherry על ידי תאים מתורבתים להדמיית תאים חיים

הערה: כל הליכי תרבית התאים מתבצעים בתנאים סטריליים בתוך מכסה זרימה למינרי לפני מיקרוסקופיה של תאים חיים.

  1. 6.1תחת זרימה למינרית סטרילית, זרע כ-50,000 עד 110,000 תאי HeLa המבטאים ביציבות CDMPR או מדווח TfR מתויג GFP לתוך כל באר של שקופית תא ibiTreat עם μ שקופיות. השתמש ב-700 מיקרוליטר של תרבית מלאה המכילה אנטיביוטיקה (DMEM עם גלוקוז גבוה, פנול ללא אדום), בתוספת 10% FBS, 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-1.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.
  2. דגרו את התאים למשך 13-15 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2 כדי לאפשר הידבקות והתפשטות נאותים. התאים אמורים להגיע לכ-80% מפגש עד למחרת.
  3. ביום ההדמיה, ממש לפני הניסוי, החלף בעדינות את המדיום בכל באר ב-350 מיקרוליטר של מדיום שלם טרי ללא פנול ללא אדום.
  4. במקביל, הכינו תמיסת עבודה VHH-mCherry בריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל (כ-50 ננומטר) במדיום מחומם מראש, נטול פנול אדום. שמור על התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  5. לאחר אתחול מערכת ההדמיה האוטומטית של תאים חיים (למשל, FEI MORE או Nikon Ti2 X-Light V3), יש לחמם מראש את תא הדגירה של המיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 לפני העברת תא המיקרוסקופיה של איבידי למיקרוסקופ והגדרת הגדרות הרכישה באופן הבא.
    1. בחר את U PlanS Apo 100x NA 1.4 והוסף את תא המיקרוסקופיה של ibidi על שלב המיקרוסקופ.
    2. הגדר שני ערוצים עם אורך גל עירור מתאים ומסנני פליטת מעבר פס יחיד עבור EGFP (לדוגמה: 470/20 ננומטר, em: 517/20 ננומטר) ו-mCherry (לדוגמה: 550/15 ננומטר, em: 590/20 ננומטר).
    3. בחר זמן חשיפה קצר ועוצמת תאורה נמוכה כדי למנוע פוטוהלבנה (למשל, 50 אלפיות השנייה ו-5% הספק עבור EGFP, 160 אלפיות השנייה ו-25% עבור mCherry). חשוב שהערכים שנבחרו יישמרו קבועים עבור כל הניסויים.
    4. לכל תנאי (=well), אחסן את הקואורדינטות של 10 שדות ראייה שונים עם 3-4 תאים במוקד ברשימת נקודות.
    5. צלמו כל מיקום ברשימת הנקודות הזו פעם אחת עם תמונה אחת. אלו הן תמונות הייחוס לפני הוספת VHH-mCherry.
    6. כדי ליזום ספיגה אנדוציטית, הוסף בעדינות 350 מיקרוליטר מתמיסת VHH-mCherry שחוממה מראש לכל באר, מה שמבטיח הפרעה מינימלית לשכבת התא החד-שכבתית. המשך דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    7. צלם כל נקודה ברשימת הנקודות שוב ושוב בניסוי דולג זמן עבור 100 פריימים עם עיכוב של 36 שניות בין פריימים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    8. כדי להפחית את ההלבנה הפוטו, הזמינו את רכישת הערוצים לתמונה תחילה mCherry, ולאחר מכן EGFP.
    9. כדי להגדיל את התפוקה, הורה לרכישה לרכוש תחילה את כל הפוזיציות ברצף וחזור על כך עבור כל נקודת זמן.

7. ניתוח תמונה של קליטה אנדוציטית VHH-mCherry

  1. עיבוד מקדים של תמונה לאחר רכישה וחילוץ נתונים בפיג'י.
    1. טען את התמונה בהילוך מהיר באמצעות תוסף הייבוא Bio-Formats כאשר אפשרות פיצול הערוצים מופעלת.
    2. תקן סחיפה רוחבית באמצעות התוסף MultiStackReg. השתמש בערוץ EGFP כהפניה והחל את השינוי גם על ערוץ mCherry .
    3. לכל תא, צייר אזור עניין (ROI) עם כלי המצולע (למשל, סביב האזור הפר-גרעיני) והוסף אותו למנהל ה-ROI.
    4. עבור שני הערוצים, מדוד את העוצמה הממוצעת בכל החזר ה-ROI ונקודות הזמן באמצעות פונקציית Multi measure של מנהל ה-ROI ושמור את הטבלה המתקבלת כקובץ טקסט.
    5. פתח את תמונת הייחוס המתאימה וחזור על המדידה עבור כל החזר ROI.
  2. ניתוח נתונים לקביעת עקומות קליטה אנדוציטיות
    1. פתח את קובץ הטקסט והחסר כל מספר מסגרת ב-1 כך שיתחיל ב-0, ולאחר מכן הכפל כל מספר מסגרת בהשהיה בין המסגרות ב-s (כלומר, 36).
    2. עבור כל החזר ROI, הפחיתו את העוצמה הממוצעת בערוץ VHH-mCherry של תמונת הייחוס מכל מסגרת של תמונת ה-Time-lapse המתאימה בערוץ VHH-mCherry כדי להסיר אוטופלואורסצנטיות ורקע.
    3. עבור כל מסגרת והחזר ROI, חלקו את עוצמת ה-VHH-mCherry המופחתת ברקע בעוצמה הממוצעת של ערוצי EGFP כדי לקחת בחשבון את תנודות העוצמה בתוך ההחזר על ההשקעה מלבד VHH-mCherry, למשל, על ידי תנועת גולגי, התכווצות תאים, סחיפה z או חוסר יציבות תאורה.
    4. נרמל את העקומה המתקבלת למקסימום משלה.
    5. בחר טווח של מסגרות כדי לא לכלול חפצים בהתחלה (כלומר, הוספת מדיה) או בסוף (כלומר, סחיפה, הלבנה) של קיטועי הזמן.
    6. התאימו את נתוני העקומה לפונקציית דעיכה מעריכית אחת המדגמנת תהליך קינטי מסדר ראשון:
      figure-protocol-1
      כאשר I(t) היא העוצמה המנורמלת בזמן t, ו-t0 מסביר את עיכוב הזמן בין הוספת VHH-mCherry לתחילת ההקלטה. מקבוע הקצב k, חשב את זמן מחצית החיים τ1/2 של התהליך כ:
      figure-protocol-2
      הערה: בעת ביצוע ניסוי עם שדה ראייה מרובה (FOV) לכל נקודת זמן, כל t0 מתאים יכול להיות שונה במקצת, אך עליו לעלות לערכים גבוהים יותר מ-FOV אחד למשנהו.
    7. חזור על ההליך עבור כל ערכות הנתונים ודווח על ערכי מחצית החיים בתרשים תיבות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור הברחת חלבונים לאחור לתאים תוך-תאיים שונים, הקמנו לאחרונה כלי מבוסס ננו-גוף אנטי-GFP לתיוג ומעקב אחר חלבוני היתוך רקומביננטיים מפני השטח של התא17. כאן, אנו מתארים את ייצור החיידקים של ננו-גופים נגזרים כאלה ומדגימים את התועלת שלהם בניטור ספיגה אנדוציטית על ידי הדמיית תאים חיים. בשילוב עם מדווח פלואורסצנטי תושב גולגי, פרוטוקול זה מציע פלטפורמה חזקה לחקר כמותי של הובלה לאחור של חלבוני מטען נבחרים לרשת טרנס-גולגי (TGN) בזמן אמת.

יצרנו אוסף של ננו-גופים אנטי-GFP פונקציונליים מובחנים החולקים ארכיטקטורה מודולרית משותפת, תוך שימוש בטכניקות שיבוט מולקולרי סטנדרטיות17. למרות שהמחקר הנוכחי מתמקד בגרסה הפלואורסצנטית VHH-mCherry, אנו כוללים גם ננו-גופים נגזרים נוספים כדי להמחיש את הרבגוניות של ערכת כלים זו ולהדגיש את הפוטנציאל שלהם ליישומים עתידיים. המבנה הבסיסי ביותר שלנו, VHH-std (std לסטנדרט), כולל את תחום ה-VHH, אפיטופים T7 ו-HA לזיהוי מבוסס נוגדנים, תג C-terminal hexahistidine (His6) לטיהור, ורצף פפטיד מקבל ביוטין (BAP) כדי לאפשר ביוטינילציה אנזימטית ומבחני משיכה מבוססי סטרפטווידין בעלי זיקה גבוהה (איור 1A). מתכנון ליבה זה, פותחו נגזרות ננו-גופים שונות כדי להקל על חקר סחר אנדוציטי ונסיגה באמצעות ניתוח ביוכימי, הדמיה של תאים קבועים וחיים ומיקרוסקופ אלקטרונים.

להדמיית תאים חיים של הובלה אנדוציטית, הנדסנו ננו-גוף פלואורסצנטי אנטי-GFP המשלב פלואורופור עם ספקטרום עירור ופליטה שונה מאלה של GFP, ובכך מבטיח הפרדה ספקטרלית אופטימלית במהלך מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בהתבסס על תכונות הקיפול המעולות שלו ב-E. coli המושרה על ידי IPTG ותכונותיו הפוטופיזיות המאופיינות היטב, בחרנו ב-mCherry כתג הפלואורסצנטי הנבחר. פלואורופורים אחרים בעלי הסטה לאדום, כגון חלבון פלואורסצנטי אדום מונומרי (mRFP), יהיו גם הם חלופות מתאימות באופן עקרוני, אך mCherry הוכיח את עצמו כחזק ויעיל במיוחד במערכת זו.

מה הפוטנציאל של ננו-גופים פונקציונליים אחרים מלבד VHH-mCherry? כדי לחקור את הברחת החלבונים מממברנת הפלזמה לרשת הטרנס-גולגי (TGN), מינפנו את הלוקליזציה הספציפית לתא של TPSTs, השוכנים אך ורק בבורות TGN וטרנס-גולגי. לשם כך, שינינו את VHH-std עם מוטיב טנדם טירוזין סולפטציה (2xTS) שמקורו בפרוכולציסטוקינין29 של חולדות, ובכך אפשרנו קריאה ביוכימית של הגעת המטען לתאים אלה. בעוד שהיתוך של VHH-std ל-mCherry מאפשר הדמיה ישירה של הובלה לאחור על ידי הדמיה קבועה או של תאים חיים, פונקציונליזציה עם פרוקסידאזות כגון APEX230 מאפשרת לוקליזציה אולטרה-מבנית על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, אבלציה ציטוכימית ממוקדת או מבחני ביוטינילציה מבוססי קרבה. יתר על כן, שילוב של אתר מחשוף פרוטאז של וירוס תחריט טבק (TEV) לתוך פיגום הננו-גוף מספק אמצעי ביוכימי להבחין בין ננו-גופים מופנמים וקשורים לפני השטח (איור 1A). בעבר השתמשנו במבנה VHH-tev כדי לנטר קינטיקה של מיחזור של EGFP-CDMPR ו-TfR-EGFP17 הקשורים לננו-גוף. ניתן לזהות בקלות את הופעתם המחודשת של קולטנים המתויגים על ידי ננו-גוף על פני התא על ידי יישום פרוטאז TEV רקומביננטי מחוץ לתא, וכתוצאה מכך אובדן ספציפי של קלטת האפיטופ C-terminal של הננו-גוף. באופן אנלוגי, הכללת אתר מחשוף TEV בתוך הננו-גוף VHH-mCherry המוצג כאן מאפשר הערכה דינמית של מיחזור מדווח EGFP על ידי הדמיית תאים חיים. פונקציונליזציה עם תחומי חלבון חלופיים - כגון פלואורופורים נוספים, תגים אנזימטיים או מוטיבים של רצף לשינוי לאחר התרגום - יכולה להתבצע בקלות על ידי תת-שיבוט של תוספות רצויות לעמוד השדרה של VHH-std על ידי אתרי ההגבלה SpeI ו-EcoRI. כל מבני הננו-גופים הפונקציונליים נגד GFP ששימשו במחקר המקורי17 הופקדו ב-Addgene להפצה ציבורית.

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, כל גרסאות הננו-גופים המוצגות כאן טוהרו לתפוקה וטוהר גבוהים (איור 1B). רק היתוך mCherry הראה גזירה פרוטאוליטית קלה של תחומי חלבון לאחר הטיהור (איור 1B, נתיב 5). שני תוצרי הפירוק שנצפו תואמים ככל הנראה לתחומי ה-VHH וה-mCherry הבודדים, כפי שהוסק ממשקלם המולקולרי לכאורה ואומת על ידי זיהוי אימונובלוגים ספציפיים לאפיטופים (איור 1C). בהיעדר BirA בביטוי משותף, VHH-mCherry התאושש בדרך כלל בתפוקות של כ-20 מ"ג לתכשיר. בהתבסס על הניסיון שלנו, ביטוי משותף של BirA מפחית באופן עקבי את תפוקת הננו-גופים בערך ב-1/3 עד 1 /2. הביוטינילציה הייתה שלמה למדי מכיוון שהננו-גופים מתערובת של 1:1 עם BSA שוחזרו במלואם על ידי סטרפטווידין-אגרוז (איור 1D).

כדי להעריך את ההתאמה של ערכת כלים ננו-גופית זו לחקר הובלה אנדוציטית, יצרנו קווי תאי HeLa יציבים המבטאים חלבוני קולטני פני שטח מתויגים EGFP עם נתיבי סחר תוך-תאיים מובחנים. אלה כללו TfR, שעובר בין קרום הפלזמה לאנדוזומים מוקדמים (מיון ומיחזור); TGN46, העובר בין קרום הפלזמה ל-TGN על ידי אנדוזומים מוקדמים; ושני MPRs, העוברים בין TGN, קרום הפלזמה, ואנדוזומים מוקדמים ומאוחרים17. EGFP התמזג לתחום החוץ-תאי של כל קולטן - באופן ספציפי, הוכנס בין פפטיד האות לרצף הקולטנים עבור CDMPR, CIMPR ו-TGN46 - ולמסוף C של TfR. עיצוב זה שמר על התחומים הציטופלזמיים המקוריים, והבטיח שכל אותות המיון הידועים יישארו שלמים ותג ה-EGFP נגיש לקישור על ידי ננו-גופים אנטי-GFP חוץ-תאיים (איור 1E). עבור CIMPR, שהתחום החוץ-תאי שלו גדול בצורה יוצאת דופן, נעשה שימוש בגרסה קטועה, העולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים המראים כי חיתוך כזה משמר התנהגות סחר נורמלית31,32.

קווי תאים יציבים הוקמו על ידי התמרה רטרו-ויראלית, ואחריה מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי לבודד אוכלוסיות תאים הומוגניות עם רמות ביטוי מתונות ודומות. יש לציין כי EGFP-CDMPR הופיע באופן עקבי כפס כפול באימונובלוטים, בדומה למקבילו האנדוגני33, המעיד על גליקוזילציה הטרוגנית. כדי להעריך אם חלבוני ההיתוך של EGFP מסכמים את דפוסי הלוקליזציה והביטוי במצב יציב של החלבונים האנדוגניים, התאים המבטאים ביציבות עברו תרבית משותפת עם תאי HeLa הוריים ונותחו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית (איור 2B). אות ה-EGFP שיקף נאמנה את התפלגות החלבונים האנדוגניים המתאימים. כצפוי, CDMPR, CIMPR והגרסאות המתויגות EGFP שלהם התמקדו בעיקר באזור הפרי-גרעיני - המשקף TGN ותאים אנדוזומיים מאוחרים - עם תיוג נוסף באנדוזומים היקפיים. גם TGN46 אנדוגני וגם מתויג EGFP נמצאו כמעט אך ורק ב-TGN הפרי-גרעיני, בעוד ש-TfR ו-TfR-EGFP הציגו את התפלגות האנדוזום המוקדמת האופיינית, עם מיון היקפי בולט ואנדוזומים של מחזור פרי-גרעיני. למרות שהנוגדנים ששימשו זיהו הן את הצורות האנדוגניות והן את הצורות המתויגות על ידי EGFP (למעט CIMPR), עוצמת הצביעה הכוללת לא עלתה באופן ניכר בתאים המבטאים את חלבוני ההיתוך, מה שמרמז על כך שמבני ה-EGFP לא היו בעלי ביטוי יתר משמעותי. כללנו את EGFP-TGN46 ו-EGFP-CIMPR באיור 2B להשוואה ישירה עם EGFP-CDMPR ו-TfR-EGFP. הפרוטוקולים המשמשים לקיבוע תאים והדמיית מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתוארים במחקרים קודמים17,19.

באמצעות VHH-mCherry, ניתן לנטר הובלה אנדוציטית של חלבוני מדווח מתויגים EGFP על ידי הדמיית תאים חיים. לשם כך השתמשנו כדוגמאות בתאים המבטאים EGFP-CDMPR ו-TfR-EGFP. התאים צולמו לאורך זמן במיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שדה רחב הפוך עם הוספת VHH-mCherry למדיום (וידאו 1 וסרטון 2). תמונות סטילס בנקודות זמן שונות מוצגות באיור 3. הספיגה כומתה על ידי מדידת האות בערוץ mCherry , הפחתת הרקע האוטו-פלואורסצנטי ונורמליזציה לאות EGFP כדי למנוע תנודות עקב תנועה של תאים מסומנים או תזוזות קטנות פוטנציאליות במישור המוקד. הקרינה של VHH-mCherry בתווך ב-25 ננומטר הייתה זניחה ולא הפריעה למדידות. ניתוח הובלת המדווחים משטח התא לתאים התוך-תאיים שלהם, להתפלגות המצב היציב, הניב את אותן תוצאות קינטיות כמו הניסויים הביוכימיים המוצגים באיור 2 של הפרסום הקודם17, עם מחצית חיים לכאורה של קליטה של ~9 דקות עבור EGFP-CDMPR ו~4 דקות עבור TfR-EGFP, ורוויה לאחר ~43 דקות ו~20 דקות, בהתאמה. ערכים אלה היו דומים לערכים שהתקבלו מניסויי קליטה ביוכימיים באמצעות מבחני אימונובלוטינג17. באופן עקרוני, ניתן לנתח גם את הקינטיקה של הובלה לאחור לאזורים תת-תאיים מעניינים, כגון האזור הפרה-גרעיני של הריכוז הגבוה ביותר של MPR. עם זאת, האזור הפרי-גרעיני מכיל לא רק Golgi/TGN אלא גם מועשר באנדוזומים מאוחרים ובאנדוזומים ממוחזרים. הקינטיקה של קליטת ננו-גופים לאזור הפרי-גרעיני אינה ספציפית מספיק כדי לנתח הובלה לאברון מוגדר. כדי להעריך בצורה מהימנה יותר את הובלת ממברנת הפלזמה ל-TGN, חלבון פלואורסצנטי אחר, חלבון טרנסממברני תושב TGN, חייב להתבטא ביציבות יחד עם חלבון מדווח GFP, באופן שאין חפיפה ספקטרלית של תכונות פלואורופור. שימוש בסמן נוסף זה מאפשר זיהוי של VHH-mCherry מיובא על ידי מדווח, אנלוגי לסולפטציה של טירוזין בתיווך TPSTs, כפי שתועד בעבר19.

figure-results-1
איור 1: תכנון וייצור של ננו-גופים נגזרים עבור מעקב אחר חלבוני פני התא המתויגים על ידי EGFP. (A) סקירה סכמטית של הננו-גופים הנגזרים. מבנה הננו-גוף הסטנדרטי כולל תחום VHH ספציפי ל-GFP, תגי אפיטופ T7 ו-HA, פפטיד מקבל ביוטין (BAP) ותג C-terminal hexahistidine (His6) לטיהור. גרסאות ננו-גוף נוספות כוללות שינויים עם אתרי סולפטציה טנדם טירוזין (2xTS), הפרוקסידאז המהונדס APEX2, או החלבון הפלואורסצנטי mCherry. סרגל קנה המידה מציין את אורך חומצת האמינו (aa). (B) ננו-גופים בעלי ביטוי חיידקי ומטוהרים בזיקה (20-50 מיקרוגרם) נותחו על ידי שיפוע SDS-PAGE והודגמו על ידי צביעת Coomassie. תקני משקל מולקולרי (ב- kDa) מצוינים משמאל. גזירה פרוטאוליטית קלה נצפתה רק עבור VHH-mCherry, ככל הנראה מתרחשת בין תחומי VHH ו-mCherry . (C) ניתוח אימונובלוט של תכשירי ננו-גופים (10 ננוגרם) באמצעות נוגדנים המכוונים כנגד T7, HA או6 האפיטופים שלו, או שזוהו על ידי סטרפטווידין-HRP (SA-HRP) להערכת ביוטינילציה. (D) היקף הביוטינילציה של ננו-גופים הוערך על ידי דגירה של ננו-גופים ביחס של 1:1 עם BSA, ואחריו משיכת סטרפטווידין-אגרוז, גלולה ושטיפת החרוזים. נפחים שווים של הסופרנטנט (S) והחומר הקשור לחרוזים (B) נותחו לאחר מכן על ידי צביעת SDS-PAGE ו-Coomassie. התאוששות כמותית של הננו-גוף בשבר הקשור לחרוזים מצביעה על ביוטינילציה מלאה. נוכחותם של שברי VHH ו-mCherry בשבר הקשור מרמזת על השפלה חלקית, המתרחשת ככל הנראה במהלך הכנת הדגימה לניתוח SDS-PAGE. הקו הלבן בין נתיבים 2 ו-3 מציין מחיקה של שני נתיבים לא קשורים. נתון זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ביטוי ולוקליזציה תוך-תאית של קולטני מטען מתויגים EGFP המסומנים פלואורסצנטית. (A) ייצוג סכמטי של מבני ההיתוך של EGFP. רצפים שמקורם בחלבונים טרנסממברניים מפרישים מתוארים בשחור, עם פפטידי אות N-terminal ותחומים טרנסממברניים פנימיים מודגשים בצהוב. חלק ה-EGFP מתואר בירוק. מבנים באורך מלא נוצרו עבור CDMPR, TfR ו-TGN46, בעוד שגרסה קטומה מאופיינת היטב שימשה עבור CIMPR כדי לשמר התנהגות סחר נורמלית. סרגל קנה המידה מציין את אורך חומצת האמינו (aa). EGFP-CDMPR ו-TfR-EGFP תוארו בעבר17. (B) כדי להעריך לוקליזציה תת-תאית, תאי HeLa המבטאים ביציבות חלבוני היתוך EGFP עברו תרבית משותפת עם תאי HeLa הוריים ונותחו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. (C) תאי HeLa המבטאים ביציבות חלבוני דיווח מתויגים EGFP עברו ליזה, ותמציות חלבון הועברו ל-SDS-PAGE ואחריו אימונובלוטינג באמצעות נוגדנים נגד GFP ואקטין. סמני משקל מולקולרי (ב-kDa) מסומנים בצד ימין. נתון זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הדמיית תאים חיים של קינטיקה של קליטה אנדוציטית של ננו-גוף בתיווך EGFP-CDMPR ו-TfR-EGFP. הדמיית תאים חיים בוצעה לאחר הוספה של 25 ננומטר VHH-mCherry לתאי HeLa המבטאים ביציבות (A) EGFP-CDMPR או (B) TfR-EGFP במדיום שלם נטול אדום פנול ב-37 מעלות צלזיוס. התאים צולמו בתעלות GFP ו-mCherry באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חצי אוטומטי במרווחים של 36 שניות. מוצגות תמונות סטילס ממוזגות מייצגות, מלוות בתצוגות מוגדלות של האזור הפרי-גרעיני (הגדלה: פי 2.2) בערוצים בודדים למטה. (פסי קנה מידה, 10 מיקרומטר) ראה גם סרטון 1 וסרטון 2. ניתוח כמותי של קינטיקה של קליטת ננו-גופים ב-(C) EGFP-CDMPR ו-(D) TfR-EGFP בוצע באמצעות נתונים משלושה ניסויים עצמאיים, שכל אחד מהם לכד כ-40 תאים בודדים. כדי להסביר את תנועת האברונים ושונות מישור המוקד, עוצמת הקרינה של mCherry נורמלה (נורמה) לאות GFP והוגדרה כממוצע ± SD בכל התאים משלושת הניסויים. אות הקליטה המקסימלי הממוצע נורמל ל-1. קינטיקה של קליטה עבור כל תא הותאמה בנפרד באמצעות מודל קינטי מסדר ראשון. הקווים המשורטטים מייצגים את העקומות הממוצעות הנגזרות מהממוצע של קבועי הקצב המתאימים. נתון זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: הדמיה של תאים חיים של קליטת mCherry-nanobody על ידי EGFP-CDMPR. תאי HeLa המבטאים ביציבות EGFP-CDMPR הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס בתווך שלם המכיל 25 ננומטר VHH-mCherry וצולמו הן בתעלות הקרינה EGFP והן ב-mCherry במרווחים של 36 שניות. הסרט עובד בקצב השמעה של 5 פריימים לשנייה, המתאים לדחיסה בזמן אמת של 3 דקות לשנייה. סרט זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 2: הדמיה של תאים חיים של קליטת mCherry-nanobody על ידי TfR-EGFP. תאי HeLa המבטאים ביציבות TfR-EGFP הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס בתווך שלם בתוספת 25 ננומטר VHH-mCherry וצולמו עבור EGFP ו-mCherry פלואורסצנטי במרווחים של 36 שניות. הסרט עובד ב-5 פריימים לשנייה, המייצגים קצב דולג זמן של 3 דקות לשנייה. סרט זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו-גופים מייצגים סוג מתפתח במהירות של פיגומים קושרי חלבון המציעים יתרונות רבים על פני נוגדנים קונבנציונליים: הם קטנים, יציבים מאוד, מונומריים, לא צולבים, חסרי קשרי דיסולפיד, וניתן לבחור אותם לקשירת זיקה גבוהה24. במחקר הקודם שלנו, פיתחנו ויישמנו ננו-גופים פונקציונליים המיוצרים על ידי ביטוי חיידקים כדי לסמן חלבונים שנחשפו לפני השטח ולנטר את הסחר התוך-תאי שלהם לתאים שונים, עם דגש מיוחד על הובלה לאחור לרשת טרנס-גולגי (TGN)17. השתמשנו בננו-גוף אנטי-GFP כדי להבטיח צדדיות, המאפשר מיקוד של חלבוני היתוך המתויגים ב-GFP, YFP או mCerulean חוץ-תאיים - תגים פלואורסצנטיים הזמינים באופן נרחב ולעתים קרובות כבר מאופיינים מראש. פונקציונליזציה של הננו-גוף האנטי-GFP עם מוטיבים של mCherry, APEX2 או טירוזין סולפטציה אפשרה לנו לדמיין את קליטת המטען על ידי הדמיה קבועה ותאית חיה, למקם תאי הובלה לאחור ברמה האולטרה-מבנית, לבצע אבלציה ממוקדת של תאים ולהעריך כמותית את קינטיקת ההובלה ל-TGN. מגבלה אחת של גישה זו היא התנאי המוקדם לשינוי גנטי של קווי תאי המטרה - בין אם על ידי ביטוי יתר יציב או תיוג אנדוגני - לפני שניתן יהיה להשתמש ביעילות בננו-גופים אנטי-GFP פונקציונליים. עם זאת, ניתן להתאים אסטרטגיה זו בקלות לרפרטואר ההולך וגדל של ננו-גופים המכוונים כנגד חלבוני מטרה אנדוגניים לא מתויגים הנוצרים באמצעות חיסון בעלי חיים או ברירה חוץ גופית מספריות VHH סינתטיות באמצעות טכנולוגיות תצוגה של ריבוזום או פאג'ים34. בנוסף, ננו-גופים המכוונים לתגי אפיטופים נפוצים, כגון mCherry, V5 או ALFA, פותחו בשנים האחרונות 35,36,37. יש לציין כי לאחרונה השתמשנו בננו-גוף אנטי-mCherry בעל יכולת סולפטציה כדי לחקור סחר לאחור של CDMPR בתאי HeLa מדוללים GGA2 באמצעות השבתה תפקודית מהירה28. תגי אפיטופים קטנים מציעים את היתרון של שימור הקונפורמציה והתפקוד המקוריים של חלבון המטרה, מכיוון שהם נוטים פחות להפריע לתחומים מבניים קריטיים. ננו-גופים המזהים את האפיטופים הקומפקטיים הללו (למשל, ALFA, V5) יכולים להיות משולבים בצורה חלקה בערכת הכלים הפונקציונלית של ננו-גופים כדי להרחיב את התועלת שלו בחקר מנגנוני סחר אנדוציטיים ונסיגה.

במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את היישום של VHH-mCherry בניסויי הדמיה של תאים חיים. באמצעות EGFP-CDMPR ו-TfR-EGFP כחלבונים מדווחים, הצלחנו לדמיין קליטה אנדוציטית ספציפית לקולטן והתקדמותם לקראת התפלגות במצב יציב. ניתוח כמותי של הסחר של מדווחים אלה מממברנת הפלזמה לתאים התוך-תאיים שלהם חשף קינטיקה התואמת את אלה המתקבלות באמצעות בדיקות ביוכימיות שהוצגו באיור 2 של מחקר קודם17. מצאנו שזמן מחצית החיים לכאורה היה ארוך משמעותית עבור EGFP-CDMPR (~9 דקות) מאשר עבור TfR-EGFP (~4 דקות), כאשר האותות הפכו רוויים לאחר כ-43 דקות ו-20 דקות, בהתאמה. ממצאים כמותיים אלה מתיישבים היטב עם נתונים שפורסמו בעבר על דינמיקת סחר ב-MPR ו-TfR 38,39,40. יש לציין כי מבנה VHH-mCherry זכה לתשומת לב משמעותית מקהילת המחקר, כפי שמעידים בקשות רבות להפצת Addgene, וכבר יושם בהצלחה במספר מחקרים עצמאיים 28,41,42,43,44.

בהתאם לתצורת המיקרוסקופ או לדרישות הניסוי, ננו-גופים אנטי-GFP מתויגים ב-mCherry עשויים לא תמיד להיות אופטימליים. במקרים כאלה, פלואורופורים חלופיים או גרסאות חלבון פלואורסצנטיות עשויות לספק תכונות ספקטרליות מתאימות יותר בשימוש בשילוב עם קווי תאים מדווחים של GFP. כדי לטפל בכך, הקמנו ספרייה של ננו-גופים פונקציונליים המשלבת מגוון רחב של חלבונים פלואורסצנטיים, כולל mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 ו-iRFP670 (243764-68). מבני ננו-גופים נוספים אלה יהיו זמינים באמצעות Addgene. השימוש בפלואורופורים מובחנים ספקטרלית מאפשר הפרדה ברורה של אותות עירור ופליטה, ובכך מאפשר הדמיה חיה אופטימלית בזמן אמת של עד שלושה ערוצי פלואורסצנטיות עם חפיפה ספקטרלית מינימלית.

בעוד שניטור ספיגה אנדוציטית למצב יציב עשוי להיראות פשוט, מעקב אחר הובלה לאחור של חלבונים ל-TGN מהווה אתגר ניסיוני גדול יותר. בנוסף ל-VHH-mCherry וחלבון מדווח מתויג GFP, נדרש סמן TGN נוסף פלואורסצנטי או מצומד לצבע לצורך הדמיה וכימות. עם זאת, חלבונים מסוימים תושבי גולגי מציגים דליפה חלקית לפני השטח של התא, אשר עלולה להחמיר עוד יותר על ידי הפרעות במסלולי סחר תוך-תאיים, כגון אלה שהוכנסו על ידי מניפולציה ניסיונית של רכיבי מכונות הובלה. TGN46, למשל, משמש בדרך כלל כסמן תושב גולגי למרות תפקידו הפונקציונלי כקולטן מטען המתווך הובלה פני השטח של TGN לתא של מטעני הפרשה מסוימים16,45. באופן דומה, גליקוזילטרנספראזות כגון β-1,4-galactosyltransferase זוהו גם בקרום הפלזמה41. למרות שחלבונים אלה יכולים לעבור אל פני השטח, הלוקליזציה היציבה הדומיננטית שלהם נשארת בתוך ה-TGN. תיוג סמנים כאלה עם חלבון פלואורסצנטי מובחן ספקטרלית או תג תואם צבע (למשל, SNAP, Halo וכו') וביטוים ביציבות עם מדווח טרנסממברני מתויג GFP יאפשר הדמיה כמותית של תאים חיים של הגעת TGN. ניתן למדוד זאת באופן אנלוגי לזרימת העבודה שתוארה לעיל, עם כימות המבוסס על הצטברות אות mCherry בתוך תעלת הקרינה המתאימה לחלבון ההיתוך תושב גולגי. האסטרטגיות הנוכחיות לחקירת סחר לאחור בתאים קבועים או חיים מסתמכות לעתים קרובות על מבנים של קולטנים כימריים בשילוב עם נוגדני IgG (למשל, CD8)46,47. עם זאת, הסיכון הגלום בקישור צולב עקב הדו-ערכיות של IgG קונבנציונליים במהלך תיוג פני השטח יכול לשנות באופן משמעותי את הגורל התוך-תאי של החלבון המסומן, ולהפנות אותו לעתים קרובות לפירוק ליזוזומלי לאחר אנדוציטוזיס48,49. לעומת זאת, ננו-גופים, בשל אופיים החד-ערכי וסטוכיומטריה קושרת 1:1, אינם גורמים לקישור צולב, ובכך משמרים את נתיבי הסחר הפיזיולוגיים של חלבון המטרה. זה הופך גישות מבוססות ננו-גוף לחשובות במיוחד לחקר דינמיקת הובלה אותנטית לאחור מבלי להציג חפצי ניתוב מלאכותיים.

ביצועים אופטימליים של פרוטוקול זה להדמיית תאים חיים דורשים טיטרציה זהירה של ריכוז הננו-גוף, שכן כמויות מוגזמות מובילות לפלואורסצנטיות רקע מוגברת מננו-גוף לא קשור במדיום. יתר על כן, יש לקחת בחשבון הבדלים ברמות הביטוי של קווי תאים מדווחים של GFP במהלך הטיטרציה כדי להבטיח השוואה כמותית מדויקת. לייצור ננו-גוף, אינדוקציה בטמפרטורה נמוכה ב-E. coli היא קריטית לקידום קיפול נכון של תחום ה-mCherry. טמפרטורות אינדוקציה גבוהות יותר גורמות בדרך כלל לחלבון מקופל או מתפרק ולכן אינן מומלצות.

הצלחתו של פרוטוקול זה תלויה באופן קריטי בשלושה היבטים מרכזיים: ראשית, הביטוי בעל התפוקה הגבוהה והטוהר של מבני ננו-גופים פונקציונליים כדי להבטיח תיוג עקבי ורקע מינימלי; שנית, השימוש בקווי תאים מאופיינים היטב המבטאים ביציבות חלבוני דיווח מתויגים GFP עם לוקליזציה של פני התא כדי לסכם מסלולי סחר פיזיולוגיים; ושלישית, טיפול ותצורה אופטימליים של מערך המיקרוסקופיה הקרינה, כולל פרמטרי הדמיה והפרדה ספקטרלית, כדי לאפשר ניתוח כמותי ואיכותי מדויק של דינמיקת הובלת מטענים.

השיטה והפרוטוקול המוצגים כאן, המתמקדים בשימוש בננו-גופים אנטי-GFP מתויגים mCherry, מאפשרים מעקב כמותי ואיכותי של חלבוני מטען מפני השטח של התא לתאים אנדוציטיים בתאי יונקים מתורבתים. כאשר היא מתבטאת במשותף עם סמן תושב גולגי המסומן בפלואורסצנט, גישה זו מאפשרת עוד יותר ניתוח של מסלולי הובלה לאחור. ככזה, כלי זה מספק אסטרטגיה רבת עוצמה לניטור הסחר התוך-תאי של חלבונים וקולטנים טרנסממברניים על פני התא שבעבר לא היו נגישים לתיוג עקב היעדר ליגנדים ספציפיים או ריאגנטים מחייבים מונומריים תואמים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת באזל. אנו מודים לפרופ' אם. ד"ר מרטין ספייס על יצירה ופריסה של דמויות, מתקן ליבת ההדמיה (IMCF) של הביוצנטרום לתמיכה ו-PNAS להרשאה להדפסה חוזרת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד GFP סיגמא-אלדריץ'118144600001המוצר מופץ על ידי Sigma-Aldrich, אך מיוצר על ידי Roche
צלחות תרבית תאים 100 מ"מTPPTPP93100
נוגדן אנטי-אקטיןEMD Millipore MAB1501
נוגדן אנטי-HAמהמעבדהמיוצר מ-12CA5 היברידומה
נוגדן Anti-His6Bethyl Laboratories A190-114A
נוגדן נגד T7 Bethyl Laboratories A190-117A
BL21(DE3) מיומן ו-E. coliNEBC2527H
סידן כלוריד די-הידראטמרק מיליפור102382מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 מטר
מלח די-נתרן קרבניציליןאפליקציהA1491מומס במים סטריליים, המלאי הוא 100 מ"ג/מ"ל
קומאסי-R (כחול בריליאנט)סיגמא-אלדריץ'B-0149
D-ביוטיןסיגמא-אלדריץ'B4501הומס ב-500 מ"מ NaH2PO4 או DMSO
עמודי דה-מלח חד-פעמיים PD10GE HealthcareGE17-0851-01
DMEM גלוטמקס-Iתרמו פישר סיינטיפיק61965026
DMEM, סוכר גבוה, ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםתרמו פישר סיינטיפיק31053028
DNase IאפליקציהA3778מומס במים סטריליים
דולבקו' s מלח מפוספט (DPBS) ללא Ca2+/Mg2+סיגמא-אלדריץ'D8537
סרום בקר עוברי (FBS)תרמו פישר סיינטיפיקA5256701
פילטרופור S, PES, פורנגר ואומל; ß e: 0.45 ומיקרו; mסארסטדט83.1826
תגובת טרנספקציה FuGENE HDפרומגה E2311
כיסויי זכוכית (מס' 1.5H)VWR631-0153
HRP נגד עכבר עזסיגמא-אלדריץ'A-0168
HRP נגד עזיםסיגמא-אלדריץ'A-0545
ערכת הבופר שלוסיטביה11003400
עמודי GraviTrap שלוסיטביה11003399
ibidi µ-Slide 4 well, ibiTreat80426-IBIאיבידי
איזופרופיל-ובטא;-D-תיוגלקטופיראנוסיד (IPTG)אפליקציהA1008מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 מטר
סולפט קאנמיציןאפליקציהA1493מומס במים סטריליים, המלאי הוא 100 מ"ג/מ"ל
L-גלוטמיןאפליקציהA3704
ליזוזימה סיגמא-אלדריץ'18037059001המוצר מופץ על ידי Sigma-Aldrich, אך מיוצר על ידי Roche
מגנזיום כלוריד הקסיהידרטמרק מיליפור105833מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 מטר
ג'לים Mini-Protean TGX, 4-20%, 15-wellביו-ראד4561096
הלה קיוטו המותאמתמהמעבדה
NEB5-אלפא Competent E. coliNEBC2987U
NucleoBond Xtra MIDI Plus, 10 הכנותמאשריי-נגל 740412.1
פניצילין/סטרפטומיציןBioconcept 4-01F00-H
פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF)אפליקציהA0999.0025מומס ב-40% DMSO 60% איזופרופנול, מלא ב-500 מ"מ
קו התאים אמפו פיניקסמעבדת נולאן
פוליברן (הקסדימטרין ברומיד)סיגמא-אלדריץ'H9268
פורומיציןאינויווגןאנט-PR-1
נתרן כלורי מרק מיליפור106404מומס במים סטריליים, המלאי הוא 5 מטר
פירובט נתרן  תרמו פישר סיינטיפיק11360039
טרנס-בלוט טורבו פאק, מיניביו-ראד1704158
טריפטוןאפליקציהA1553
תמצית שמרים אפליקציהA1552

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517 (7535), 460-465 (2015).
  4. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  5. Rioux, D. J., Prosser, D. C. A CIE change in our understanding of endocytic mechanisms. Front Cell Dev Biol. 11, 1334798(2023).
  6. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. J Cell Biol. 106 (3), 617-628 (1988).
  7. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (3), 202-212 (2003).
  8. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  9. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Dev Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  10. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nat Cell Biol. 13 (8), 914-923 (2011).
  11. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nat Cell Biol. 10 (2), 178-185 (2008).
  12. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nat Commun. 9 (1), 3737(2018).
  13. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochim Biophys Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  14. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  15. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. J Cell Biol. 125 (2), 253-268 (1994).
  16. Lujan, P., et al. Sorting of secretory proteins at the trans-Golgi network by human TGN46. Elife. 12, 91708(2024).
  17. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  18. Buser, D. P., Spang, A. Protein sorting from endosomes to the TGN. Front Cell Dev Biol. 11, 1140605(2023).
  19. Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J Vis Exp. (144), e59111(2019).
  20. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. J Cell Biol. 100 (3), 826-834 (1985).
  21. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  22. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  23. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  24. Schnider, S. T., Vigano, M. A., Affolter, M., Aguilar, G. Functionalized Protein Binders in Developmental Biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 40 (1), 119-142 (2024).
  25. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annu Rev Physiol. 50, 363-376 (1988).
  26. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  27. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotech. 25 (5), 299-317 (2009).
  28. Buser, D. P., Bader, G., Spiess, M. Retrograde transport of CDMPR depends on several machineries as analyzed by sulfatable nanobodies. Life Sci Allianc. 5 (7), 202101269(2022).
  29. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. J Biol Chem. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  30. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Meth. 12 (1), 51-54 (2015).
  31. Waguri, S., et al. Visualization of TGN to endosome trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells. Mol Biol Cell. 14 (1), 142-155 (2003).
  32. Anitei, M., et al. A high-throughput siRNA screen identifies genes that regulate mannose 6-phosphate receptor trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5079-5092 (2014).
  33. Hoflack, B., Kornfeld, S. Purification and characterization of a cation-dependent mannose 6-phosphate receptor from murine P388D1 macrophages and bovine liver. J Biol Chem. 260 (22), 12008-12014 (1985).
  34. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Meth. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  35. Götzke, H., et al. The ALFA-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bioscience applications. Nat Commun. 10 (1), 4403(2019).
  36. Zeghal, M., et al. Development of a V5-tag-directed nanobody and its implementation as an intracellular biosensor of GPCR signaling. J Biol Chem. 299 (9), 105107(2023).
  37. Katoh, Y., et al. Overall Architecture of the Intraflagellar Transport (IFT)-B Complex Containing Cluap1/IFT38 as an Essential Component of the IFT-B Peripheral Subcomplex. J Biol Chem. 291 (21), 10962-10975 (2016).
  38. Hirschmann, D. T., Kasper, C. A., Spiess, M. Quantitative analysis of transferrin cycling by automated fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. 1270, 365-378 (2015).
  39. Ciechanover, A., Schwartz, A. L., Dautry-Varsat, A., Lodish, H. F. Kinetics of internalization and recycling of transferrin and the transferrin receptor in a human hepatoma cell line. Effect of lysosomotropic agents. J Biol Chem. 258 (16), 9681-9689 (1983).
  40. Hirst, J., Futter, C. E., Hopkins, C. R. The kinetics of mannose 6-phosphate receptor trafficking in the endocytic pathway in HEp-2 cells: the receptor enters and rapidly leaves multivesicular endosomes without accumulating in a prelysosomal compartment. Mol Biol Cell. 9 (4), 809-816 (1998).
  41. Sun, X., Mahajan, D., Chen, B., Song, Z., Lu, L. A quantitative study of the Golgi retention of glycosyltransferases. J Cell Sci. 134 (20), 258564(2021).
  42. Pereira, C., et al. The exocyst complex is an essential component of the mammalian constitutive secretory pathway. J Cell Biol. 222 (5), 202205137(2023).
  43. Podinovskaia, M., Prescianotto-Baschong, C., Buser, D. P., Spang, A. A novel live-cell imaging assay reveals regulation of endosome maturation. Elife. 10, 70982(2021).
  44. Reck, J., Beuret, N., Demirci, E., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. Small disulfide loops in peptide hormones mediate self-aggregation and secretory granule sorting. Life Sci Alliance. 5 (5), 202101279(2022).
  45. Wakana, Y., et al. A new class of carriers that transport selective cargo from the trans Golgi network to the cell surface. EMBO J. 31 (20), 3976-3990 (2012).
  46. Rawat, S., Sharma, M. CD8alpha-CI-M6PR Particle Motility Assay to Study the Retrograde Motion of CI-M6PR Receptors in Cultured Living Cells. Bio Protoc. 14 (9), e4979(2024).
  47. Breusegem, S. Y., Seaman, M. N. Image-based and biochemical assays to investigate endosomal protein sorting. Methods Enzymol. 534, 155-178 (2014).
  48. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  49. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Rep. 21 (11), 3256-3270 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EGFPTime Lapse

מאמרים קשורים