פרוטוקול זה פותח כדי ליצור מערכת אמינה ונגישה לרישום EEG של מכרסמים הנעים בחופשיות.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה פותח כדי ליצור מערכת אמינה ונגישה לרישום EEG של מכרסמים הנעים בחופשיות.
אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG) משמשת ככלי בסיסי למעקב אחר פעילות חשמלית במוח והפכה לחשובה יותר ויותר הן באבחון קליני והן במחקר פרה-קליני בבעלי חיים. בעוד ש-EEG של מכרסמים מציע פלטפורמה רבת עוצמה למידול הפרעות נוירולוגיות אנושיות, הקלטות ארוכות טווח מוגבלות לרוב על ידי העלות הגבוהה, הפולשניות או המורכבות הטכנית של מערכות קיימות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אמין, נגיש, בר קיימא מבחינה כלכלית ופולשני מינימלי לרכישת EEG קליפת המוח הכרונית מרובת האתרים בעכברים הנעים בחופשיות. הטכניקה כוללת ייצור חוטי פלטינה-אירידיום עם אלקטרודות בורג המחוברות לממשק מסוג אפיק טורי אוניברסלי (USB), המעוגנות באופן אפידורלי באמצעות ברגי עצם ומאובטחות עם דבק ומלט דנטלי. המערכת מאפשרת לכידת אותות יציבה לאורך מספר חודשים, כפי שהודגם בעכברי C57BL/6J מסוג בר עם שיעור הישרדות של 85% לאחר הניתוח (n = 20). EEG נדגם ב-1,000 הרץ וסונן בין 1 הרץ ל-500 הרץ באמצעות מערך מגבר דיפרנציאלי. כדי לאמת את המערכת, ניתן פנטילנטטרזול (20 מ"ג/ק"ג) כדי לגרום לפעילות דמוית התקף, מה שהוביל לעלייה ניכרת בהפרשות אינטריקטליות - מ-2-5 בנקודת ההתחלה ל-20-51 אירועים לאחר ההזרקה - מלווה במשרעת אות מוגברת. פריקות זוהו על סמך מורפולוגיה של צורת גל ומאפייני אות התואמים לקריטריונים אלקטרופיזיולוגיים מוכרים. ההתקנה תואמת למעקב וידאו התנהגותי וצינורות ניתוח קוד פתוח, ותומכת באינטגרציה עם מחקרים פרמקולוגיים, גנטיים או נוירומודולציה. שיטה זו מספקת פלטפורמה יציבה וניתנת להתאמה לחקירת דינמיקת רשת המוח במודלים של מכרסמים, עם יישומים בחקר אפילפסיה ומעבר לכך.
אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG) מספקת מדד ישיר לפעילות החשמלית של המוח ונמצאת בשימוש נרחב באבחון אפילפסיה1. בשנים האחרונות, טכניקות EEG הותאמו יותר ויותר לשימוש במודלים של חיות קטנות לחקר הפרעות נוירולוגיות, פיזיולוגיה של שינה ודינמיקה של רשת המוח 2,3,4. עם הופעתם של מודלים של עכברים מהונדסים גנטית והתקדמות משמעותית בטכנולוגיות הקלטה, EEG מכרסמים הפך לכלי חיוני למחקר פרה-קליני, המציע תובנות חשובות לגבי מנגנוני תרגום הרלוונטיים לבריאות המוח האנושי 5,6.
לכידת ומניפולציה של פעילות עצבית בו זמנית היא קריטית לחקר הדינמיקה של המוח ברמת המאקרו והמיקרו-מעגלים. גישה כפולה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של הרשתות העצביות המעורבות בהתחלת ההתקף והתקדמותו. אפילפסיה, המאופיינת בהתקפים חוזרים ולעתים קרובות בלתי צפויים, נובעת משיבושים במעגלים מורכבים במוח4. למרות מחקר מקיף, המנגנונים השולטים בהתפשטות ההתקפים ובהופעתם עדיין אינם מובנים במלואם, בין היתר בשל שימוש מוגבל בטכנולוגיות המאפשרות הקלטות בו זמנית עלפני אזורי מוח מרובים.
רישום EEG ממודלים של בעלי חיים המסכמים הפרעות נוירולוגיות אנושיות חשף קפיצות אינטריקטליות, פריקות ספייק וגלים ודפוסי הופעת התקפים המשקפים באופן הדוק את אלה שנראו בחולים אנושיים 8,9, ובכך מקדמים את הבנתנו את השינויים האלקטרופיזיולוגיים המתרחשים במוח האנושי. באופן דומה, חריגות EEG שזוהו במודלים של מחלת אלצהיימר, הפרעת הספקטרום האוטיסטי וסכיזופרניה מספקות תובנות קריטיות לגבי פעילות תנודתית עצבית משובשת ומדגישות מטרות טיפוליות פוטנציאליות10.
למרות ההבדלים באנטומיה ובקנה מידה של המוח, EEG של עכברים ובני אדם מציגים קווי דמיון מדהימים 2,11. שניהם מציגים פסי תדרים תנודתיים אופייניים - דלתא, תטא, אלפא, בטא וגמא - עם ספקטרום הספק בדרך כלל עוקב אחר התפלגות 1/f 2,11. מעברים בין מצבי מוח, כגון הופעת פעילות דלתא במהלך שנת תנועת עיניים לא מהירה (NREM) או סנכרון גמא מוגבר במהלך משימות קשב וזיכרון, נשמרים בין מינים. יתר על כן, פעילות אפילפטית, כולל תנודות בתדר גבוה (HFOs) ודפוסים איקטליים, מראים פרופילים זמניים וספקטרליים דומים הן בעכברים והן בבני אדם7.
המאפיינים השמומרים של EEG של מכרסמים ואנושיים הופכים את המודלים של עכברים לתרגום גבוה ביותר לחקר הפרעות מוחיות. EEG של עכבר מאפשר הקלטות פולשניות ברזולוציה גבוהה המאפשרות ניתוח מפורט ברמת המעגל12. הוא גם תומך בבדיקה של אסטרטגיות נוירומודולטוריות, כולל חומרים פרמקולוגיים, בקרה אופטוגנטית וגירוי לולאה סגורה13,14, שניתן לשלב עם כלים התנהגותיים ומולקולריים כדי לחקור במדויק תפקוד עצבי.
עם זאת, יש לנקוט משנה זהירות בעת אקסטרפולציה של ממצאים. הגודל הקטן יותר והמבנה הפשוט יותר של קליפת המוח של העכבר יכולים להשפיע על התפשטות האות, ופוטנציאלים קוגניטיביים הקשורים לאירועים (ERP) עשויים להיות פחות בולטים בהשוואה לבני אדם15. הבטחת עקביות במיקום האלקטרודות, הפניה לאותות וצינורות אנליטיים היא קריטית לשיפור יכולת השחזור והתוקף חוצה מעבדות16.
רישום EEG בחיות קטנות מציג גם הזדמנויות וגם אתגרים. EEG של עכבר נרכש בדרך כלל באמצעות אלקטרודות מושתלות כרוניות הממוקמות באופן אפידורלי על פני הגולגולת או כאלקטרודות עומק המוחדרות למבנים תת-קורטיקליים17,18. אלקטרודות פני השטח, כגון אלקטרודות בורג או חוט המונחות על הדורה מאטר, הן זעיר פולשניות ומתאימות להקלטות ארוכות טווח ואורכיות. אלקטרודות כאלה נמצאות מתחת לעצם, מה שמספק מחסום עכבה גבוה להקלטה. בהתאם לכך, ניתן לחשוב על אלקטרודות דוראליות במכרסמים כדומות יותר לאלקטרוקורטיקוגרפיה (eCoG) מאשר ל- EEG. אלקטרודות עומק, לעומת זאת, מציעות רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ומאפשרות גישה לאזורי מוח עמוקים כמו ההיפוקמפוס, התלמוס או האמיגדלה, מה שמקל על מחקרים על רשתות התקפים וצימוד תנודתי בין אזורים התפלגות 2,11.
מערכות EEG מודרניות למכרסמים תומכות בהקלטה רב-ערוצית ברזולוציה זמנית גבוהה ולעתים קרובות משולבות עם ניטור וידאו למתאם התנהגותי18. בנוסף, מערכות EEG אלחוטיות מאפשרות רכישה ללא כבילה בזמן אמת בבעלי חיים המתנהגים בחופשיות, תוך מזעור אילוצי תנועה ומתח19. למרות שעם הזמן המודרניזציות הללו הפכו לזמינות מסחרית, הן יקרות מאוד או פולשניות מכדי לחקור את מודל המכרסמים לאורך תקופה ארוכה.
כדי להתמודד עם פער זה, אנו מציגים פרוטוקול רב-תכליתי וחסכוני לרכישת EEG מרובה אתרים במודלים של מכרסמים, המתאים למחקרים ארוכי טווח עם פולשניות מינימלית. גישת רישום EEG זו מתאימה במיוחד למחקרים הדורשים הערכה ברזולוציה גבוהה של פעילות קליפת המוח בעכברים בתנאי ניסוי מבוקרים. זה מיושם בצורה הטובה ביותר כאשר (i) בעל החיים יכול לסבול הרדמה קצרה במהלך השתלת אלקטרודה ולהתאושש לחלוטין, (ii) מובטח מיקום ראש יציב או תנועה מינימלית במהלך ההקלטות, (iii) רצוי ניטור ארוך טווח או חוזר של פעילות עצבית, ו-(iv) תכנון הניסוי יכול להכיל הקלטה מרובת בעלי חיים בודדים או מוגבלים בהתאם לקיבולת המגבר. על החוקרים לשקול את האילוצים הללו כדי לקבוע אם שיטה זו תואמת את מטרות הניסוי שלהם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול זה קיבל אישור מהוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אוגוסטה. המדריך של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה עקב אחר כל שלב של הניסוי. כל האמצעים האפשריים יושמו כדי למזער את מספר בעלי החיים ששימשו במחקר זה. העכברים ששימשו למחקר זה הם C57Bl6J בני חודשיים. הזמן הנדרש לביצוע כל שלב כלול בשלבים המתאימים.
1. הכנת סיכות תקע עם אלקטרודות (5 דקות)
2. שתילת אלקטרודות (30 דקות)
3. הקלטת EEG (65 דקות)
4. פרשנות נתונים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אלקטרודות הושתלו ב-20 עכברים על רקע C57Bl6J, כולל 5 עכברי C57Bl6J מסוג פרא, עם שיעור הישרדות לאחר ניתוח של 85% שנשמר עד 6 חודשים לאחר הניתוח (איור 4B). לאחר 6 חודשים, כובעי הראש החלו להתנתק, וכל העכברים הורדמו בגיל 8 חודשים. המשקל הממוצע של מכלול מכסי הראש, כולל המחבר והברגים, היה 1.13 גרם (n = 20). העכברים חזרו להכרה תוך 30 דקות לאחר הניתוח וחזרו לתנועה רגילה ולמבט תוך 12 שעות.
רישומי EEG התקבלו לפני ואחרי מתן של 20 מ"ג/ק"ג פנטיל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
במחקר זה, פיתחנו ואימתנו פרוטוקול חזק, חסכוני וזעיר פולשני להקלטת EEG כרונית מרובת אתרים בעכברים הנעים בחופשיות. ההשתלה המוצלחת של אלקטרודות בורג ואלקטרודות פלטינה-אירידיום בהתאמה אישית המולחמות למחבר USB, יחד עם שיעור ההישרדות הנצפה ואיכות ההקלטה, מדגימים את ההיתכנות והאמינות של הטכניקה בהקלטות כרוניות. יש לציין כי פרוטוקול זה מאפשר איסוף נתונים אלקטרופיזיולוגיים מדויקים ללא התערבות כירורגית נרחבת או חומרה יקרה במיוחד, מה שהופך אותו לנגיש למגוון רחב של מעבדות ועיצובים ניסיוניים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
DTB הוא יועץ בתשלום של קרן אלפרד מאן. למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים בהתאם לעבודה זו.
DTB נתמך על ידי R01EY036089 מענק NEI ומענק NIA RF1AG060754. XF נתמך על ידי מענקים מקרן ג'יימס פיקל לחקר מחלת האלצהיימר, EY028158 ו-EY032488.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חוט פלטינה אירידיום 0.003" | מערכות AM | 777000 | |
| מברגי עצם בקוטר 1.5 מ"מ | התמחויות במיניאטורות אנטרין | 000-120X1/16 SL BIND MS SST | |
| מגבר AC | מערכות AM | ||
| קרפרופן | קובטרוס | 11695-6935-1 | |
| בסיס אקרילי לתותבות Coldpac | חברת יייטס מוטלואיד | https://www.yates-motloid.com/collections/coldpac/denture-base | |
| מקדחה דנטלית 1.4 מ"מ | וולבר GX | לא זמין | |
| דקסמתזון | VEDCO | 50989-437-12 | |
| סיכה לעיניים | אופטיקס קייר | https://theoptixcare.com/ | |
| מי חמצן | סיגמא אולדריץ' | 7722-84-1 | |
| NIDAQ USB | כלים לאומיים | https://www.ni.com/en/shop/data-acquisition/entry-level-usb-daq.html | רכישת נתונים והתניה של אותות USB |
| פנטילנטרטרזול | קיימן כימיקלים | 18682 | |
| משחת זרם שרף להלחמה | וולר | https://www.weller-tools.com/us/en/consumer/products/soldering-accessories/ | |
| חוט הלחמה 0.32" | רדיו שאק | לא זמין | |
| דבק סופר | לוקטיט | לא זמין | |
| תקעי נקבה מסוג USB מסוג B | מוכר QM | X00292ABU9 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה