Method Article

הערכה כמותית אופטימלית של יציבות RNA משפר בתאי גזע עובריים בעכבר

DOI:

10.3791/69325

⸱

November 21st, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מודד כמותית את היציבות ומחצית החיים של RNA מגביר בין-גני ותוך-גני בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות טיפול אקטינומיצין D, RT-qPCR וניתוח רגרסיה לא ליניארית. אסטרטגיות נרמול ספציפיות למיקום משולבות כדי למודל במדויק את דינמיקות דעיכת eRNA באופן תלוי הקשר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA מגביר (eRNA) הם תמלילים שאינם מקודדים המיוצרים מאזורים מגברי שעתוק פעילים ומוכרים יותר ויותר כרגולטורים מרכזיים של ביטוי גנים. למרות חשיבותם הפונקציונלית, דינמיקת היציבות וההתדרדרות של eRNA עדיין מאופיינת בצורה לקויה, במיוחד בתאי גזע עובריים (ESCs), שבהם תוכניות שעתוק דינמיות מאוד ותלויות בהקשר. פרוטוקול זה מציג שיטה כמותית להערכת קינטיקת התפרקות ומחצית החיים של eRNA בין-גני ותוך-גני ב-ESCs של עכברים. השעתוק מעוכב באמצעות אקטינומיצין D, וסך ה-RNA נאסף בנקודות זמן מוגדרות מרובות. cDNA מסונתז באמצעות פריימרים אקראיים של הקסמר ואוליגו (dT) כדי לאפשר זיהוי של תעתיקים פוליאדנילטים ולא-פוליאדניליים. עבור eRNA בין-גני, מתבצעת נרמול באמצעות גן ניקיון או ערך Ct בזמן 0 דקה. עבור eRNA תוך-גני, נעשה שימוש בגישת נורמליזציה כפולה כדי למזער הפרעות מ-mRNA חופף. עקומות הדעיכה מנותחות באמצעות מודל דעיכה מעריכי חד-פאזי, המאפשר הערכה מדויקת של מחצית החיים. הפרוטוקול מגלה כי eRNA ב-mESCs מציגים תחלופה מהירה, עם מחצית חיים של כ-2-3 דקות. מתודולוגיה זו מספקת מסגרת איתנה וניתנת לשחזור לחקר יציבות eRNA, ומספקת תובנות לפעילות משפרים ודינמיקת RNA בהקשרים של תאי גזע פלוריפוטנטיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפרים הם אלמנטים רגולטוריים ציס-רגולטוריים (CREs) שמווסתים ביטוי גנים ספציפי לרקמות ולגירויים על ידי כך שהם משמשים כפלטפורמות קישור לגורמי שעתוק וקו-רגולטורים 1,2,3,4,5,6. למרות שניתן למקם מחזקים במרחק מהגנים היעד שלהם ברמת הגנום הליניארית, מנגנוני לולאת הכרומטין מאפשרים קרבה מרחבית לפרומטרים, ומסייעים בוויסות השעתוק. משפרים פעילים מתועתקים דו-כיווני על ידי RNA פולימראז II (Pol II), ומייצרים RNA ארוכים שאינם מקודדים הנקראים RNA משפרים (eRNAs), שאורכם החציוני בדרך כלל הוא כ-1 קילובארט 1,2,7,8,9. הביטוי של eRNA קשור באופן חזק להפעלה של גני מטרה סמוכים 10,11,12, ומחקרים פונקציונליים הראו בעקביות כי דלדול eRNA מפחית את השעתוק של הגנים המטרה שלהם, מה שמרמז ש-eRNA פועלים כרגולטורים פונקציונליים ולא כתוצרי לוואי שעתוק 13,14,15,16,17. למרות חשיבותם הפונקציונלית, פרוטוקולים ניסיוניים לזיהוי וכימות אמין של eRNA עדיין מוגבלים.

בתאי גזע, פעילות משפרת ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על פלוריפוטנטיות ובהנעת מעברים התפתחותיים18,19. משפרים יכולים להתמקם באזורים בין-גניים (משפרים בין-גניים או חוץ-גניים) או להיות משולבים בגופי גנים כמגברים תוך-גניים8. בעוד שמגבירים בין-גניים נחקרו בהרחבה בסוגי תאים שונים, משפרים תוך-גניים נותרו יחסית לא נחקרים בשל אתגרים טכניים, כגון חפיפת שעתוק עם פרה-mRNA של גן המארח ונוכחות שינויים היסטונים הקשורים להארכת שעתוק20,21. עם זאת, מחקרים עדכניים הראו כי גם משפרים בין-גניים וגם תוך-גניים תורמים לרשתות רגולציה גנטית המעורבות בפלורפוטנטיות22,23 ובהתמיינותמוקדמת 24 ב-ESCs. ראוי לציין שכמעט מחצית מכלל המשפרים עם הערות הם תוך-גניים20,25, ופעילותם משתנה בין שלבי ההתפתחות, לעיתים קרובות עולה ברקמות מובחנות 8,26,27,28. עם זאת, השכיחות והתפקידים התפקודיים של משפרים תוך-גניים ב-ESCs עדיין אינם מובנים במלואם. בפרט, בעוד ש-eRNA בין-גני מתועתק בין גנים, eRNA תוך-גני מתועתק בתוך גופי גנים ועלול לחפוף לתמלולי קדם-mRNA. הבדל מיקום זה מחייב גישות אנליטיות מובחנות בעת פירוש וכימות של eRNA בין-גני ותוך-גני.

בניגוד ל-mRNA, ל-eRNA בדרך כלל אין זנב poly(A) בקוטר 3′, מה שמוביל ליציבות נמוכה ולפגיעה מהירה ב-1,2,7,8,9. חוסר היציבות הפנימי הזה מקשה על ניתוח ביטוי eRNA, במיוחד בניסויים בזמן. בנוירונים, דווח כי eRNA מציג מחצית חיים קצרה עד 7.5 דקותו-17 דקות. עם זאת, עדיין לא ברור אם אי-יציבות זו עקבית בין סוגי תאים שונים, במיוחד ב-ESCs, שבהם גם פעילות המשגברים וגם שעתוק eRNA הם ספציפיים מאוד לסוגתא 7,17,29,30. ESCs מסתמכים על תוכניות ויסות גנים דינמיות לשמירה על פלוריפוטנטיות או ליזום התמיינות, מה שהופך אותם למערכת ייחודית לבחינת מחזור eRNA31,32. בהינתן השינויים המהירים בשעתוק ב-ESCs, הבנת דעיכת eRNA בהקשר זה עשויה לחשוף כיצד פעילות המשפרים מוסדרת זמנית17. יתרה מזאת, הבדלים בין eRNA בין-גני לתוך-גני, כגון חפיפה עם תמלילי גנים של המארח, דורשיםגישות אנליטיות מובחנות. למרות חשיבות השאלות הללו, קיימות מעט שיטות סטנדרטיות למדידת מחצית חיים של eRNA ב-ESCs או להשוואת דינמיקת התפרקות של סוגי eRNA שונים.

מחקר זה מציג פרוטוקול כמותי להערכת היציבות ומחצית החיים של eRNA שהועתקו ממגבירים בין-גניים ותוך-גניים ב-mESCs. עיכוב שעתוק מושג באמצעות אקטינומיצין D (ActD) במרווחי זמן מוגדרים, ולאחר מכן ניתוח PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR) וניתוח רגרסיה לא ליניארי כדי לכמת דעיכת eRNA. כדי להתמודד עם ההבדלים המקומיים בין משפרים בין-גניים לתוך-גניים, השיטה משלבת אסטרטגיות נרמול מובחנות, המאפשרות השוואה שיטתית ומדויקת של דינמיקות פירוק eRNA. מסגרת אנליטית מובנית זו מספקת תובנות חשובות לגבי מחזור eRNA בתאי גזע פלוריפוטנטיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים במחקר זה בוצעו באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר (mESC; E14Tg2A) שלא נוצרו ישירות במעבדתנו אלא הושגו מקו תאים מבוסס, שזמין גם מסחרית מ-ATCC (CRL-1821). לכן, העבודה המתוארת במאמר זה אינה דורשת סקירה של ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) באוניברסיטת צ'ונגנם הלאומית. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים של mESCs

  1. ציפוי מראש של לוחות תרבית תאים עם 6 בארות עם 0.1% ג'לטין (2 מ"ל לבאר). דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  2. שואף את הג'לטין ושוטף כל באר פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS. חטא את הלוחות באמצעות קרינת UV לפחות 15 דקות.
  3. הזרעים mESCs על הלוחות המצופים בג'לטין באמצעות 2 מ"ל מלאים של מדיום תרבית תאים (טבלה 1).
    הערה: הוסף LIF טרי למדיום התרבית בריכוז הנדרש מיד לפני השימוש, בהתאם לנפח המדיום הכולל הנדרש לניסוי.
רכיביםריכוז סופינפח בשימוש
מדיום חיוני מינימלי של גלאזגו (GMEM)-500 מ"ל
תחליף סרום נוקאאוט™ (KOSR)10%50 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיצין0.50%2.5 מ"ל
סרום בקר עוברי (FBS)1%5 מ"ל
נתרן פירובט0.1 מ"מ / 1%5 מ"ל
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (MnEA)0.1 מ"מ / 1%5 מ"ל
2-מרקפטואנול0.1 מ"מ910 uL
גורם מעכב לוקמיה (LIF)1000 U/mL-

טבלה 1: הרכב מדיום התרבות mESC. הרכיבים והריכוזים הסופיים שלהם שימשו להכנת מדיום התרביות mESC. נפחים טיפוסיים מפורטים לכל 500 מ"ל של מדיום כולל.

  1. לשמור על התאים בתנאי תרבית סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנור לח עם 5%CO2 (איור 1A).

figure-protocol-1
איור 1: עיצוב ניסויי לניתוח יציבות eRNA. (א) סכמטי של ניסוי עצור השעתוק. התאים צויפו על לוחות 6 בארות מצופים ג'לטין ב-0.1% וטופלו ב-actD (ריכוז סופי: 5 מיקרוגרם/מ"ל) בנקודות הזמן המצוינות (0 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות ו-30 דקות) לאחר הקציר. (B) פריסת מבחן RT-qPCR. סך ה-RNA עבר תמלול הפוך באמצעות פריימרים אקראיים של הקסמר או אוליגו(dT). דגימות cDNA מכל נקודת זמן נותחו באמצעות RT-qPCR עבור היעדים שהודגשו: Tbp_mRNA, eRNA בין-גני, ו-eRNA תוך-גני. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. טיפול באקטינומיצין D (ActD)

  1. המיס את actD ב-DMSO להכנת תמיסת מלאי בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל33.
    הערה: בעוד שאקטינומיצין D משמש כאן לעיכוב שעתוק קצר טווח, ייתכן שגם מעכבים חלופיים כמו טריפטוליד ישמשו לחסימת התחלת שעתוק במחקרים עתידיים. מכיוון שגם אקטינומיצין D וגם DMSO רגישים לאור, יש להכין את התמיסה המקורית במיקרוצינורות ענבריים, להגן עליו מהאור ולאחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 20°C עד לשימוש.
  2. יומיים לאחר זריעת התאים (או ביום הקציר), מוסיפים את תמיסת המאגר actD לתווך התרבית לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל33. אספו דגימות ב-0 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 ו-30 דקות לאחר הטיפול (איור 1A).
    הערה: בעוד שרוב ה-eRNA מציגים דעיכה מהירה בטווח של 0-30 דקות, ישנם eRNA שעשויים להציג מחצית חיים ארוכה יותר. בהתאם למאפייני מיקום היעד, ניתן לכלול דגימה נוספת בנקודות זמן ממושכות (למשל, 1 שעה, 3 או 6 שעות) כדי ללכוד בצורה מדויקת יותר את קינטיקת התפרקות. במחקר זה, אקטינומיצין D שימש בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל לחסימת שעתוק קצרה (≤30 דקות); עם זאת, לדגירות ארוכות יותר (>1 שעה), מומלץ להוריד את הריכוז ל-1-2 מיקרוגרם/מ"ל כדי למזער תגובות לחץ תאי. מכיוון ש-DMSO עצמו יכול להשפיע על פעילות השעתוק, יש לכלול גם בקרה ל-DMSO בלבד.

3. חילוץ RNA וסינתזת cDNA

  1. הסר את מדיום תרבית התאים באמצעות יניקה, והוסף 1 מ"ל של תגובת טריזול לכל באר. דגרו את הלוחות על שייקר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT)34,35, ואז העבירו את הליזאט לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: לאחר טיפול בטריזול, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של מינוס 80°C עד שבוע לפני חילוץ ה-RNA. מכיוון שריגנט טריזול מכיל פנול וגואנידיניום איזותיוציאנט, שהם רעילים וקורוזיביים מאוד, יש לטפל בו בזהירות רבה. כל פסולת טריזול צריכה להיאסף במיכל פסולת אורגנית ייעודי לצורך הטמנה נכונה.
  2. הוסף 500 מיקרולטר כלורופורם לכל דגימה. נער בחוזקה את הצינורות ודגרה ב-RT למשך 3 דקות.
  3. צנטריפוגה את הדגימות ב-13,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C.
  4. העבר בזהירות את הפאזה המימית לצינור חדש של 1.5 מ"ל המכיל נפח שווה של איזופרופנול. דגרו את התערובת ב-RT למשך 10 דקות כדי לשפר את כמות המשקעים של ה-RNA.
    הערה: העבירו בזהירות רק את הפאזה המימית העליונה השקולה כדי למנוע זיהום בשלב הביניים. לשיפור תפוקת ה-RNA, יש לדוג דגימות בטמפרטורה של -20°C למשך שעה אחת עד לילה (O/N) לאחר הוספת איזופרופנול. לדגימות עם קלט נמוך, הוסף גליקוגן (10-20 מיקרוגרם/מ"ל סופיים) או GlycoBlue ממש לפני הוספת איזופרופנול לשיפור נראות כדורי RNA ויעילות ההתאוששות. איזופרופנול דליק מאוד ועלול להזיק לבריאות האדם; שאיפת אדים או מגע עם עור או עיניים עלולות לגרום לגירוי, כאב ראש, סחרחורת או דיכוי במערכת העצבים המרכזית. יש לטפל בזהירות, ולאסוף את כל התמיסות שנותרו במיכל פסולת אורגנית מאושר לטיפול נכון.
  5. צנטריפוגה שוב ב-13,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
  6. שטפו את כדור ה-RNA המתקבל עם 1 מ"ל של 75% אתנול. צנטריפוגה ב-6,800 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הפכו בעדינות את הצינור לאחר הוספת אתנול כדי להרים את הכדור.
  7. הסר את הסופרנטנט בזהירות וייבש את הכדור באוויר למשך 10 דקות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. החזירו את הכדור היבש למים ללא RNase ודגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: כאשר טוהר ה-RNA גבוה, הכדור הלבן עלול להפוך לשקוף במהלך תהליך הייבוש באוויר. הימנעו מייבוש מופרז של הפלט למשך יותר מ-10 דקות, שכן ייבוש מופרז עלול להפחית את יעילות התלייה מחדש.
  8. מדדו ריכוז וטוהר RNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.
  9. סינתז cDNA ממיקרוגרם RNA באמצעות ערכת סינתזת CDNA M-MLV, בהתאם להוראות היצרן (טבלה 2).
רכיביםנפח בשימוש 
10X M-MLV RT buffer2 uL
dNTP2 uL
פריימר (אקראי / Olido dT)1uL
M-MLV RT1uL
מעכב RNASE0.5 uL
דגימת RNA2ug (נפח מותאם לפי ריכוז דגימת RNA)
DWהנפח מותאם בהתאם לריכוז דגימת ה-RNA (כדי להרכיב את הנפח הסופי)
נפח כולל20 אלומטר

טבלה 2: הרכב תגובת הסינתזה של cDNA (M-MLV reverse transcriptase). נפחים מפורטים וריגנטים המשמשים לשעתוק הפוך של 2 מיקרוגרם RNA כולל באמצעות ערכת סינתזת M-MLV cDNA. נפח דגימת ה-RNA הותאם בהתאם לריכוזו, ונוסף DW ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה הסופי ל-20 מיקרוליטר.

  1. דגרו את תגובת ה-cDNA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ואז השבתו את האנזים בחום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    הערה: אחסן cDNA מסונתז בטמפרטורה של -20°C. ריכוז ה-cDNA הטיפוסי הוא כ-100 ng/μL. כדי לזהות eRNA תוך-גני, יש לסנתז cDNA מאותה דגימת RNA באמצעות פריימרים אקראיים של הקסמר ופריימרים של אוליגו(dT).

4. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR)

  1. הכינו תערובת תגובה של 10 מיקרוליטר המכילה 15 ng cDNA, 5 מיקרוליטר תערובת מאסטר Power SYBR Green PCR, 5 pmol מכל פריימר, ומים מזוקקים (DW).
    הערה: לוקוסי eRNA לעיתים קרובות מכילים או קרובים לרצפים חוזרים, מה שדורש תכנון פריימר קפדני. השתמשו ברצפים עם מסכות חוזרות כדי להגביל אזורים מועמדים ולאמת את הספציפיות של זוג הפריימר בגנום באמצעות BLAST. כאשר אפשר, כלול אזורי בקרה סמוכים כדי להוציא הגברה לא ספציפית36.
  2. לבצע הגברה באמצעות מערכת PCR בזמן אמת עם תנאי מחזור תרמי הבא: שלב הפעלה ודנאטורציה ראשוני בטמפרטורה של 50°C למשך 2 דקות ו-95 °C למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורי דנאטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ומדידת חישול, הארכה ופלואורסצנציה ב-60 מעלות צלזיוס למשך דקהו-34 דקות, 37 (טבלה 3).
במהצעדטמפרטורה (°C)זמןמחזור
במה הולדתעתיק הפוך502 דקות1
דנאטורציה ראשונית9510 דקות1
שלב PCRדנאטורציה9515 ש'40
אנילינג/הרחבה60דקה אחת40
שלב עקומת ההתכהדנאטורציה9515 ש'1
אנילינג60דקה אחת1
דיסוציאציה (עקומת התכה)9515 ש'1

טבלה 3: תנאי מחזור תרמי עבור RT-qPCR. סיכום תנאי טמפרטורה, זמן ומחזור לשעתוק הפוך, qPCR של 40 מחזורים (תגובה של 10 מיקרוליטר), וניתוח עקומת התכה סטנדרטי.

  1. לצורך כימות eRNA תוך-גני, יש לנתח הן את Tbp (או גן אחר) ואת אזור המגבר התוך-גני באמצעות cDNA מסונתז עם פריימרים של אוליגו(dT). ל-eRNA בין-גני, השתמשו רק ב-cDNA מסונתז עם פריימרים אקראיים של הקסמר (טבלה 4 ואיור 1B).
    הערה: הרץ כל דגימה בכפילים טכניים (שני בארות) כדי לאפשר ממוצע במהלך ניתוח הנתונים.
שם הגןגלאי פריימררצף (5'-3')גדלי אמפליקון 
המשךקדימהTGACTCCTGGAATTCCCATC122 נקודות בסיס
הפוךTTGCTGCTGTGTGTGTT
Nsun2_mRNAקדימהGGATGAAGCAGTGATCGCAG93 נקודות בסיס
הפוךATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNAקדימהTCCCTACAGCAGATCACTCAC80 נקודות בסיס
הפוךCGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNAקדימהACAGATGCAACCGATGCACC105 נקודות בסיס
הפוךTGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNAקדימהCCTGAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGT110 נקודות בסיס
הפוךAGGTTAACACATCAGCCCCCA
Pou5f1_eRNAקדימהCACTTCTGTGTCTGG107 נקודות בסיס
הפוךCCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNAקדימהAGTCAGCTACATGGGCAGAG119 נקודות בסיס
הפוךCCCCTCTCTCACCGTACAG
שליטה Nsun2_negativeקדימהCCCCGTGTTTAAGAGGAATGA88 נקודות בסיס
הפוךACTGAGAACACCACCACTAGCA

טבלה 4: רצפי פריימר לניתוח RT-qPCR. רצפי פריימר קדימה ואחוריים המשמשים להגברה ספציפית של כל גן מטרה בניסויי RT-qPCR. פריימרים אלו היו מותאמים כדי להבטיח כימות מדויק של ביטוי mRNA ו-eRNA.

5. ניתוח נתוני יציבות eRNA 22

  1. נתח את כל הנתונים באמצעות שיטת ΔCt, ונרמל את רמות ה-eRNA היחסיות ל-Tbp_mRNA (קובץ משלים 1 ואיור 2A).
    הערה: אם הפרש ערך ה-Ct בין שני שכפולים טכניים עולה על 0.5, יש להוציא את הנתונים מניתוח נוסף. חשב את רמות ביטוי הגנים היחסיות בשיטת ΔCt על ידי חיסור ערך ה-Ct של גן הביקורת (למשל, Tbp_mRNA) מערך הגן היעד (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). ניתן לחשב את הביטוי היחסי כ-2^-ΔCt (קובץ משלים 2B).
  2. לצורך כימות eRNA תוך-גני, נרמול ערכי ביטוי על ידי חלוקת ערכי cDNA שסונתז באמצעות הקסמרים אקראיים באלו של cDNA מסונתז באמצעות פריימרים אוליגו(dT).
    הערה: בצע את כל תגובות qPCR באמצעות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים (n = 3).
  3. נרמל את רמת הביטוי של כל נקודת זמן (המתקבלת בשיטתΔCt) לערך המינימום 0 וצייר את עקומת הדעיכה.
    הערה: למרות שפרוטוקול זה משתמש בטיפול קצר באקטינומיצין D, חשיפה ממושכת למעכבי שעתוק (כגון ActD) עשויה גם להפחית את ביטוי הגנים במשק הבית. לצורך כימות מדויק יותר, אנו ממליצים להוסיף RNA אקסוגני (למשל ERCC) בשלב הליזה של התא כדי לתקן שינויים ביעילות חילוץ ה-RNA, יעילות השעתוק ההפוך ודיוק הפיפטינג, ובכך לאפשר נרמול עקבי יותר בין דגימות38,39.
  4. גרף רמות eRNA מנורמל לאורך זמן והתאים אותן באמצעות מודל רגרסיה לא ליניארי (דעיכה אקספוננציאלית חד-פאזית) בפריזמת GraphPad (קובץ משלים 3).
  5. הערכת מחצית החיים של eRNA משכפולים ביולוגיים בודדים.
    1. פתח את GraphPad Prism ובחר ליצור > XY (אפשרויות: X = מספרים; Y = הזן וצייר ערך Y יחיד לכל נקודה).
    2. הזן את נקודות הזמן (0, 5, 10, 15, 20 ו-30 דקות) כערכי ציר X.
    3. רשום את שמות המדגם בציר Y (קבוצה) והזן את ערך הנתונים היחיד המתאים לכל נקודת זמן.
    4. select: ניתוח > רגרסיה ועקומות > רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה).
    5. בלשונית האקספוננציאלית , בחר במודל דעיכת פאזה אחת .
    6. בגיליון 'טבלה לתוצאות ', חשב את הסטייה הממוצעת והסטיית התקן של ערכי מחצית החיים לכל מדגם באמצעות Excel או תוכנה דומה. שרטט את הערכים המתקבלים.
  6. עקומות דעיכת התאמה עם טווחי ביטחון של 95%
    1. פתח את GraphPad Prism ובחר ליצור > XY (אפשרויות: X = מספרים; Y = הזן 3 ערכים משכפלים בעמודות משנה זו לצד זו).
    2. הזן את נקודות הזמן (0, 5, 10, 15, 20 ו-30 דקות) כערכי ציר X.
    3. רשום את שמות הדגימות בציר ה-Y (קבוצה) והזן את שלושת ערכי השכפול של כל דגימת eRNA לגיליון הנתונים המתאים.
    4. select: ניתוח > רגרסיה ועקומות > רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה).
    5. בלשונית האקספוננציאלית , בחרו במודל דעיכת השלב היחיד לניתוח.
    6. בטבלה לגיליון התוצאות, יש להוציא את ערכי רווח האמון של 95% (CI) שהתקבלו מניתוח הדגימות המשולשות.
      הערה: השתמש במשוואת הדעיכה הבאה: Y = (Y0 - רמה) • e-kt + מישור, כאשר Y הוא רמת ה-eRNA היחסית בזמן t, Y0 הוא רמת ה-eRNA ההתחלתית, ו-k הוא קבוע הדעיכה. אין לקבע את הרמה לאפס במהלך התאמת עקומת eRNA, שכן מחקרים קודמים מראים ש-eRNA עשוי להישאר ולא להתפרק לחלוטין לאורך זמן17,40. עם זאת, יש לקבוע את הפלטו לאפס בעת ניתוח דעיכת mRNA, בהתאם לפרוטוקולי mRNA קודמים41,42. אפשר ל-GraphPad Prism לחשב אוטומטית את מחצית החיים של eRNA (t₁/₂) באמצעות הנוסחה: t1/2 = In(2)/ k. הזן את הזמן בדקה; דווח על ערכי מחצית החיים המתקבלים במינימום.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להעריך את יציבות ה-RNA לאחר עצירת שעתוק, טופלו mESCs ב-actD, וסך ה-RNA נאסף בנקודות זמן מוגדרות (0 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות ו-30 דקות). לאחר סינתזת cDNA, בוצעה RT-qPCR לכימות את ה-eRNA התוך-גני של Nsun2 ו-Sox2, את ה-eRNA הבין-גני של Pou5f1, ואת ה-mRNA המתאים להם. נתונים אלו שימשו ליצירת עקומות התדרדרות התלויות בזמן (איור 2). בניסויים מוצלחים, eRNAs ב-mESCs הראו בדרך כלל ירידה מהי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה וניתנת לשחזור למדידת יציבות eRNA ב-mESCs. שלבים ניסיוניים קריטיים, כולל תרבית תאים, טיפול באקטינומיצין D, חילוץ RNA וכימות RT-qPCR, מוצגים בבירור באיורים ובקבצים המשלימים כדי להנחות את המשתמשים בתהליך העבודה. בנוסף, פרוצדורות אנליטיות מפורטות כגון מידול רגרסיה לא ליניארי ופרשנות של רווחי ביטחון מסופקים בקובץ המשלים 4 לתמיכה בהערכת מחצית חיים מדויקת. בין השלבים הללו, תזמון מדויק וטיפול עקבי בטיפול ב-actD הם חיוניים, שכן הם משפיעים ישירות על זיה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים לגילוי.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת צ'ונגנאם הלאומית [2024-0991-01 (S.-K.K.)]; תוכנית המחקר המדעי הבסיסי [RS-2023-00209842 (S.-K.K.)] ותוכנית פיתוח טכנולוגיה ביו-רפואית [RS-2025-02305916 (S.-K.K.)] של הקרן הלאומית למחקר (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-מרקפטואנולגיבקו21985023
אקטינומיצין Dסיגמא-אלדריץ'A9415
כלורופורםכימיקלים של דאג'ונג2548-4105
DMSOGenDEPOTD2680
סרום בקר עוברי (FBS)סיגמא-אלדריץ'F0392
ג'לטיןסיגמא-אלדריץ'G1890-100G
גלאזגו' מדיום חיוני מינימלי (GMEM)גיבקו11710035
GraphPad Prism (גרסה 9)תוכנת GraphPad
איזופרופנולכימיקלים של דאג'ונג5035-4105
תחליף סרום נוקאאוט (KOSR)Gibco, 10828028
גורם מעכב לוקמיה (LIF)מרקESG1106
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (MnEA)וולג'ןLS005
ערכת סינתזת m-MLV cDNA  אנזינומיקהEZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus KLAB01-QI685-M-16-C
פניצילין-סטרפטומיציןוולג'ןLS202-02
Power SYBR-Green PCR מיקס מאסטר מערכות ביולוגיות יישומיות4368708
QuanStudio1 מערכת PCR בזמן אמת מערכות ביולוגיות יישומיותA40425
נתרן פירובטוולג'ןLS013
טריזול Invitrogen15596018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  3. Joo, J. -Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. -K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  4. Levine, M. Transcriptional enhancers in animal development anfd evolution. Curr Biol. 20 (17), R754-R763 (2010).
  5. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  6. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
  7. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biol. 8 (5), e1000384(2010).
  8. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  9. Songyue, G., et al. The roles of enhancer, especially super-enhancer-driven genes in tumor metabolism and immunity. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142414(2025).
  10. Kim, S. H., et al. Epigenetic regulation of IFITM1 expression in lipopolysaccharide-stimulated human mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 11, 1-12 (2020).
  11. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: Recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  12. Sartorelli, V., Lauberth, S. M. Enhancer RNAs are an important regulatory layer of the epigenome. Nat Struct Mol Biol. 27 (6), 521-528 (2020).
  13. Lam, M. T., et al. Rev-Erbs repress macrophage gene expression by inhibiting enhancer-directed transcription. Nature. 498 (7455), 511-515 (2013).
  14. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  15. Melo, C. A., et al. eRNAs are required for p53-dependent enhancer activity and gene transcription. Mol Cell. 49 (3), 524-535 (2013).
  16. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  17. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  18. Göttgens, B., et al. Establishing the transcriptional programme for blood: The SCL stem cell enhancer is regulated by a multiprotein complex containing Ets and GATA factors. The EMBO J. 21 (12), 3039-3050 (2002).
  19. Wang, H. F., et al. Defining essential enhancers for pluripotent stem cells using a features-oriented CRISPR-Cas9 screen. Cell Rep. 33 (4), 108309(2020).
  20. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117.e106 (2017).
  21. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  22. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 319, 145470(2025).
  23. Tata, P. R., Tata, N. R., Kühl, M., Sirbu, I. O. Identification of a novel epigenetic regulatory region within the pluripotency associated microRNA cluster, EEmiRC. Nucleic Acids Res. 39 (9), 3574-3581 (2011).
  24. Sohni, A., et al. Dynamic switching of active promoter and enhancer domains regulates Tet1 and Tet2 expression during cell state transitions between pluripotency and differentiation. Mol Cell Biol. 35 (6), 1026-1042 (2015).
  25. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  26. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  27. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  28. Pérez-Molina, R., et al. An intronic Alu element attenuates the transcription of a long non-coding RNA in human cell lines. Front Genet. 11, 928(2020).
  29. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  30. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  31. Atlasi, Y., Stunnenberg, H. G. The interplay of epigenetic marks during stem cell differentiation and development. Nat Rev Genet. 18 (11), 643-658 (2017).
  32. Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144 (6), 940-954 (2011).
  33. Ratnadiwakara, M., Änkö, M. -L. mRNA stability assay using transcription inhibition by actinomycin D in mouse pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (21), e3072-e3072 (2018).
  34. Kim, S. -K., et al. Functional coordination of BET family proteins underlies altered transcription associated with memory impairment in fragile X syndrome. Sci Adv. 7 (21), eabf7346(2021).
  35. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (30), e1470(2009).
  36. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).
  37. Kim, S. -K., et al. SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs. Cell Stem Cell. 15 (6), 735-749 (2014).
  38. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. DRUID: A pipeline for transcriptome-wide measurements of mRNA stability. RNA. 24 (5), 623-632 (2018).
  39. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. Determining mRNA half-lives on a transcriptome-wide scale. Methods. 137, 90-98 (2018).
  40. Tsai, P. F., et al. A muscle-specific enhancer rna mediates cohesin recruitment and regulates transcription in trans. Mol Cell. 71 (1), 129-141.e128 (2018).
  41. Woolley, C. R., et al. Full-length mRNA sequencing resolves novel variation in 5' UTR length for genes expressed during human CD4 T-cell activation. Immunogenetics. 77 (1), 14(2025).
  42. Zhang, H., et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 621 (7978), 396-403 (2023).
  43. Kim, T. -K., Shiekhattar, R. Architectural and functional commonalities between enhancers and promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhancer RNAsRNA StabilityMouse Embryonic Stem CellseRNA DecayActinomycin DRT qPCRIntergenic Enhancer RNAIntragenic Enhancer RNARNA Half LifeTranscriptional Arrest

Related Articles