מאמר שיטה

הנדסה אפיגנטית של תאי K562: אסטרטגיה אפיזומלית דו-וקטורית למתילציה ממוקדת יציבה של DNA באמצעות חלבוני היתוך dCas9-DNMT3A ו-HDAC1

DOI:

10.3791/69328

⸱

31 באוקטובר 2025

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מערכת מבוססת CRISPR/dCas9 אפיזומלית לא אינטגרטיבית לעריכה אפיגנטית ממוקדת בתאי K562, המשלבת אפקטורים dCas9-DNMT3A ו-dCas9-HDAC1 עם sgRNAs ספציפיים כדי לגרום למתילציה של DNA ספציפי ללוקוס עם דיוק והשפעות מופחתות מחוץ למטרה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירת התפקיד המדויק של מתילציה של DNA בוויסות שעתוק גנים ופיתוח טיפולים המכוונים לדפוסי מתילציה ספציפיים של גנים מציבים אתגרים משמעותיים בשל המחסור בכלים רב-תכליתיים המסוגלים לגרום לשינויים אפיגנטיים ספציפיים לאתר ולטווח ארוך לווסת ביטוי גנים. המחקר נועד לפתח ולתקף מערכת חדשנית מבוססת אפיזומלית כדי להקל על מתילציה יציבה של DNA במיקום גן ממוקד, שעשויה להיות שימושית הן למחקר אפיגנטי בסיסי והן ליישומים טיפוליים. כדי להשיג זאת, קו התאים K562 עבר טרנספטציה משותפת עם שני וקטורים אפיזומליים נפרדים. שני סוגי הווקטורים תוכננו לבטא RNA מנחה (gRNAs) המכוונים לאזור לא מתילציה של 367 bp בתוך האי CpG 326, הממוקם במעלה הזרם של הגן ZBTB7A . כל וקטור קודד צורה מושבתת של אנדונוקלאז Cas9 (מת או dCas9) שהתמזג לתחום הקטליטי של DNA methyltransferase DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) או היסטון דאצטילאז באורך מלא HDAC1 (dCas-HDAC1). רצף ה-dCas כלל שני אותות לוקליזציה גרעינית (NLS) כדי להבטיח את הייבוא הגרעיני של החלבון. קלטת ביטוי מערכת כפולה זו מקדמת מצב כרומטין שעשוי לתרום להשתקה אפיגנטית ארוכת טווח, ומבטיחה תוצאות אפיגנטיות חזקות ועמידות. גישה מתערבת זו לאפיגנום המארח באמצעות שימוש בווקטורים אפיזומליים המשכפלים את עצמם מציעה מספר יתרונות: תחזוקה וביטוי של וקטורים במספרי עותקים נמוכים לאורך חלוקות תאים מרובות ללא אינטגרציה בגנום המארח, ומכאן מזעור השפעות מחוץ למטרה ושמירה על שלמות הגנום. אנו מדווחים על העלייה המדויקת והמשמעותית במתילציה של DNA באי ZBTB7A CpG 326. הממצאים מאמתים כי מערכות ה-CRISPR/dCas האפיזומליות המהונדסות יכולות לעורר מתילציה עמידה וספציפית לאתר. לכן, מערכת זו היא כלי מחקר רב ערך להערכת ההשפעות התפקודיות של שינויים ממוקדים במתילציה ופלטפורמה מבטיחה לפיתוח טיפולים אפיגנטיים עתידיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ויסות אפיגנטי, כולל מתילציה של DNA ושינויים בהיסטון, ממלא תפקיד מרכזי בשליטה על ביטוי גנים, התמיינות תאים ויציבות הגנום. חוסר ויסות של מנגנונים אלה מעורב לעתים קרובות - כסיבה או כתוצאה - במצבים פתולוגיים שונים, במיוחד בסרטן, הפרעות נוירולוגיות ותסמונות הטבעה 1,2,3. יש לציין כי על ידי התערבות מדויקת בנוף האפיגנטי במיקומים גנומיים ספציפיים באמצעות עריכת אפיגנום בטכנולוגיית Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), ניתן להשיג רמות דיכוי גנים דומות לאלו שנצפו במודלים של נוק-אאוט של גנים, מבלי לשנות את רצף ה-DNA הבסיסי4. כתוצאה מכך, עריכה אפיגנטית ממוקדת התגלתה כאסטרטגיה מבטיחה לניתוח מנגנוני ויסות גנים ופיתוח טיפולים מדויקים.

מעכבי DNA methyltransferase (DNMT) ומעכבי היסטון דאצטילאז (HDAC) הם טיפולים אפיגנטיים המאושרים כיום לשימוש קליני. עם זאת, חומרים אלה מכוונים באופן לא סלקטיבי לסמנים אפיגנטיים על פני הגנום, משנים את מצבי הכרומטין הגלובליים, וגורמים להשפעות מחוץ למטרה ולרעילות בחולים5. כדי להתמודד עם המגבלות של סוכני שינוי אפיגנטיים מסורתיים, פותחו עורכים אפיגנטיים ניתנים לתכנות המבוססים על Cas9 מת קטליטית (dCas9) שהתמזגו לתחומי אפקטור, כגון DNA methyltransferases (למשל, DNMT3A), demethylases (למשל, TET1), היסטון אצטיל טרנספראזות (למשל, p300), או דאצטילאז (למשל, HDAC3), פותחו 6,7,8,9 . מערכת האפקטור dCas9 מאפשרת שינוי אפיגנום ספציפי ללוקוס המונחה על ידי מולקולת RNA קטנה, המכונה RNA חד-מוביל (sgRNA), מבלי להכניס שברים דו-גדיליים ברצף המטרה. מחקרים אחרונים הוכיחו את השימוש בהם בשינוי ביטוי גנים, עיצוב מחדש של נגישות הכרומטין ואפילו תכנות מחדש של פנוטיפים תאיים 10,11,12.

למרות ההתקדמות המהירה, מערכות הנדסת אפיגנום מבוססות dCas9 ממשיכות להתמודד עם מגבלות מסוימות. האתגר הנפוץ ביותר הוא השפעות מחוץ למטרה עקב חוסר הספציפיות של תחומי אפקטור אפיגנטיים, במיוחד עם ביטוי חזק או ממושך של כלי ההיתוך dCas913,14. בנוסף, הגודל הגדול של היתוך dCas9 מציב אתגרי אספקה משמעותיים. גודלו של רצף Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) הוא כ-4.2 kb15, הדומה לגודל הקיבולת המקסימלי של וקטורים של נגיף הקשור לאדנו (AAV). בעוד שלוקטורים לנטי-ויראלים יש קיבולת גדולה יחסית (~12-1 kb), המאפשרת אספקה של SpCas9 באורך מלא המשולב עם אפקטורים אפיגנטיים, הם עדיין שומרים על האפשרות של אינטגרציה גנומית אקראית, המסכנת מוטגנזה החדרתית ומגבילה את היישומים הקליניים שלהם16. מצד שני, גישות לא ויראליות כמו טרנספקציה של פלסמיד סובלות משימור לקוי בתאים מתחלקים. גישות אספקה חולפות או "פגע וברח" שוללות את האפשרות של אינטגרציה גנומית, אך לעתים קרובות אינן מצליחות לקיים שינויים במתילציה על פני חלוקות התאים, אלא אם כן משולבות עם משפצי כרומטין או אפקטורים שיתופיים 17,18,19.

כדי להתמודד עם אתגרים אלה, השתמשנו במערכת וקטור אפיזומלי לא אינטגרטיבית, המשכפלת את עצמה (pEPI-S/MAR) להעברת אפקטורים אפיגנטיים התמזגו עם dCas9. וקטור זה נמשך באופן חוץ-כרומוזומלי בחלוקת תאים במספרי עותקים נמוכים (~1-2 לתא), מה שמאפשר ביטוי מתמשך אך מתון, על מנת למזער פונקציות לא רצויות הקשורות לביטוי יתר20,21. אלמנט אזור ההתקשרות של הפיגום/מטריצה (S/MAR) של האפיזום מקיים אינטראקציה עם המטריצה הגרעינית, ותורם לתחזוקה יציבה של האפיזום בגרעין התאים במהלך חלוקת התא22,23. יתר על כן, מערכת וקטור pEPI מונעת סיכונים הקשורים לאינטגרציה ויראלית ומאפשרת אספקת מבנים מבלי לחרוג ממגבלות האריזה.

מחקרים אחרונים הראו כי אזורי מקדם המסומנים על ידי שינויים פעילים בהיסטון, במיוחד אצטילציה של H3K27 (H3K27ac), עמידים לרוב בפני מתילציה מהונדסת של DNA. גישות קומבינטוריות המסירות או מוסיפות סימני היסטון באמצעות כותבים או מחקים של שינויים בהיסטון ובמקביל מכניסות מתילציה של DNA באמצעות DNMT3A הוכחו כמגבירות את היציבות וההתמדה של דיכוי גנים, אפילו בגישות חולפות19,24. בהתבסס על תובנות אלה, שיערנו כי אספקה משותפת של dCas9-HDAC1 ו-dCas9-DNMT3A והתמקדות באזורים גנטיים שכנים יקדמו שיפוץ כרומטין ויאפשרו מתילציה יעילה ועמידה יותר באלמנטים רגולטוריים מטרה.

במחקר זה, מטרתנו הייתה לתכנן ולבנות מערכת המסוגלת לספק מתילציה ממוקדת ויציבה של DNA לאי CpG 326 של ZBTB7A, אזור המאופיין במתילציה אנדוגנית נמוכה וסימני H3K27ac חריגים בתאי K562. מטרת מחקר זה הייתה לספק שני מבנים אפיזומליים המקודדים dCas9 התמזגו לכל אחד מהאפקטורים האפיגנטיים השונים, יחד עם sgRNAs, המכוונים לאזור הרגולטורי העשיר ב-CpG במעלה הזרם של הגן ZBTB7A באמצעות מערכת pEPI בעלת ביטוי נמוך, יציבה ולא אינטגרטיבית. כפי שמוצג באיור 1, טרנספקציה משותפת של תאי K562 עם אפיזומים אלה מאפשרת גיוס כפול של מתחמי העריכה לאי העניין של CpG, שבו HDAC1 מסיר אצטילציה מקומית של היסטון כדי להקל על מתילציה של DNA לאחר מכן על ידי DNMT3A, וכתוצאה מכך שינוי אפיגנטי מתואם וספציפי לאתר.

המערכת המתוארת כאן מתאימה ליישומים שבהם העברת וירוס אינה אפשרית עקב גודל המבנה, חששות בטיחות או מגבלות עלות. הוא תומך בשיבוט מודולרי של sgRNAs שונים והיתוך אפקטור, מה שהופך אותו להתאמה למגוון מיקומי מטרה. כיום הוא מתאים ביותר למחקרים במבחנה או פרה-קליניים בשורות תאים הסובלים טרנספקציה של פלסמיד ובחירת אנטיביוטיקה. ביישום שלנו, אספקה אפיזומלית בתאי K562 הושגה באמצעות ריאגנטים מבוססי ליפופקטמין ונשמרה תחת בחירת G-418.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון sgRNAs

  1. זהה את אי ה-CpG הרצוי או אתרי CpG רגולטוריים באזור המקדם של הגן המעניין באמצעות דפדפן גנום (למשל, דפדפן גנום UCSC). כאן, העיצוב יושם על האי CpG 326 (GRCh38) של הגן ZBTB7A .
  2. עצב RNAs מובילים יחידים (sgRNAs) באמצעות פלטפורמת עיצוב מקוונת של CRISPR sgRNA [למשל, כלי האינטרנט CHOPCHOP (גרסה 3)]. בעת תכנון sgRNAs, עקוב אחר ההמלצות שלהלן כדי להבטיח פעילות גבוהה על המטרה והשפעות מינימליות מחוץ למטרה:
    1. בחר בחלבון SpCas9 כאנדונוקלאז, תוך שימוש ב-5'-NGG-3' כמוטיב הסמוך לפרוטו-ספייסר בקצה 3' (PAM-3').
    2. בחר אורך sgRNA ל-20 bp (מלבד רצף ה-PAM). אפשר התאמות מחוץ למטרה עם שלוש אי-התאמות בלבד ברצף ה-protospacer.
    3. כאשר בוחרים למקד לאזור ספציפי של הגן, בחר באפשרות 'מקדם' והגדר את הטווח במעלה הזרם (למשל, מ-1500 bp עד 3000 bp במעלה הזרם עבור אי CpG 326) כדי למקם את ה-sgRNAs בתוך האזור הרגולטורי.
    4. השתמש בציוני יעילות ממוקדים כמו אלה שפותחו על ידי Doench et al.25, כדי להעריך את פעילות sgRNA.
  3. בעת בחירת sgRNAs לשימוש ניסיוני, שקול את הקריטריונים הבאים:
    1. דרג את כל ה-sgRNA המועמדים לפי יעילות עבור אזור היעד. בחר sgRNAs ב-10-20% העליונים של היעילות החזויה. בעת הבחירה, הימנע מ-sgRNAs עם אי התאמות (MM0, MM1, MM2, MM3) באתרים פוטנציאליים מחוץ למטרה.
    2. בחר sgRNAs המכוונים במקור לאזורים ללא מתילציה או מתילציה חלשה לדיכוי שעתוק באמצעות dCas9-DNMTs. לדיכוי שעתוק באמצעות dCas9-HDACs, התמקד באזורים בעלי אצטילציה גבוהה ליעילות מוגברת. השתמש במאגרי מידע מקוונים (למשל, ChIP-Atlas) כדי לאשר מתילציה של DNA וסימני אצטילציה של היסטון בתאי K562 במיקומי היעד.
    3. השתמש במספר sgRNA כדי לכסות אזורי יעד גדולים מ-100-200 bp26.
      הערה: שינויים אפיגנטיים (מתילציה ודאצטילציה) משפיעים על אזורים במעלה הזרם ובמורד הזרם של אתר הקישור sgRNA, והשפעות אלו עשויות להיות מוגבלות לטווחים גנומיים קצרים.
    4. בחר sgRNA עם תוכן GC בין 40% ל- 80%.
      הערה: תכולת ה-GC של ה-sgRNA חשובה, מכיוון שתכולת GC גבוהה יותר משפרת את יציבות ה-RNA ואת קשירת ה-dCas.
    5. הימנע מ-sgRNAs המכילים רצועות של ארבעה או יותר תימידינים (Ts) ובחר sgRNAs עם נוקלאוטידים של אדנין או תימין הממוקמים ארבעה בסיסים במעלה הזרם של אתר ה-PAM.
      הערה: ארבעה Ts או יותר יכולים להוביל להפסקת שעתוק מוקדמת. sgRNAs עם A או T הממוקמים ארבעה בסיסים במעלה הזרם של אתר PAM עשויים להפגין קשירת dCas חזקה יותר.
    6. בדוק והימנע מ-sgRNAs עם השלמה עצמית גבוהה כדי למזער את הסיכון להיווצרות מבנה משני.
    7. סיים את הבחירה של כמה רצפי sgRNA.
      הערה: ארבעה sgRNAs תוכננו המשתרעים על פני האי CpG 326. רצפי המטרה של sgRNA1-4 ומיקומי המטרה על פני האי CpG 326 מוצגים בטבלה משלימה 1.
  4. הפוך את רצף ה-sgRNA לבחירה (למעט שלישיית ה-PAM) למשלים ההפוך שלו. הוסף GATCG לקצה 5' של הרצף קדימה ו-G לקצה ה-3' שלו, ו-AAAAC לקצה 5' של הרצף המשלים ההפוך ו-C לקצה ה-3' שלו. הזמינו את שני האוליגו הסופיים עבור כל sgRNA מספק אוליגו מסחרי.

2. שיבוט

הערה: סעיף זה מתאר את ההתאמה של פלסמיד pEPI-1 ליצירת וקטורים אפיזומליים הנושאים הן את היתוך האפקטור dCas-epigenetic והן את קלטות ביטוי sgRNA. ראה איור 2 לסקירה מקיפה של זרימת העבודה של השכפול וארכיטקטורת הווקטור. כל תגובות העיכול והקשירה המתוארות להלן בוצעו על פי הפרוטוקולים המומלצים של היצרן עבור כל אנזים ומגיב בשימוש, ומפרטי התגובה מפורטים בפירוט בטבלה משלימה 2.

  1. עכל את הפלסמיד pEPI-1 באמצעות AgeI ו-BspEI, המאגפים את רצף הקידוד eGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר). לאחר עיכול הגבלה, הקהה את התלויות המתקבלות באמצעות שבר Klenow של DNA פולימראז I. קשר את עמוד השדרה של הפלסמיד הקהה באמצעות T4 DNA ligase כדי ליצור את הווקטור שנמחק על ידי eGFP.
    הערה: מחיקת הגן eGFP מתבצעת כדי להקטין את גודל הווקטור הכולל. גודל וקטור גדול יותר עשוי להגביל את שלבי השיבוט והטרנספקציה במורד הזרם.
  2. השג את רצפי הקידוד עבור התחום הקטליטי (CD) של הגן DNMT3A ואורכו המלא של הגן HDAC1 . צרף קודון עצירה בקצה ה-3' (במורד הזרם) של כל רצף קידוד. הוסף אתרי הגבלה BglII (5') ו-AseI (3') משני צדי הרצפים.
  3. עכל את וקטור ה-pEPI-1 שנמחק על ידי eGFP עם BglII ו-AseI. בנפרד, עכל את רצפי הקידוד DNMT3A (CD) ו-HDAC1 המוכנים עם אותם אנזימים. בצע שתי תגובות קשירה עצמאיות:
    1. חבר את מקטע ה-DNMT3A(CD) לתוך הווקטור המעוכל כדי ליצור את מבנה pEPI-1-DNMT3A.
    2. חבר את שבר HDAC1 לווקטור המעוכל כדי ליצור את מבנה pEPI-1-HDAC1.
      הערה: אתרי BglII ו-AseI ממקמים את התוספות במורד הזרם של מקדם ה-pCMV ובמעלה הזרם של אלמנט ה-S/MAR לביטוי אופטימלי.
  4. טרנספורמציה של Escherichia coli בעל יכולת כימית (למשל, NEB 5-alpha Qualified E. coli, High Efficiency) עם תוצרי הקשירה מכל וקטור בנפרד. צלחת התאים המותמרים באגר LB המכיל קנמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. בחר מושבות חיוביות ובודד DNA פלסמיד בשיטת מיני-הכנה מהירה של רתיחהמהירה 27,28.
  5. השג את הרצף המקודד את ה-SpCas9 המת קטליטית (dCas9). הצג את האלמנטים הבאים בסדר שצוין:
    1. בסוף 5': אתר הגבלת AscI, רצף קונצנזוס קוזאק וקידון התחלה (ATG).
    2. בסוף ה-3': NLS, אופציונלי HA-tag, ואחריו אתר הגבלת BamHI.
  6. עכל גם וקטורים pEPI-1-DNMT3A וגם pEPI-1-HDAC1 עם AscI ו-BamHI. בצע את אותו עיכול על תוספת dCas9. קשר את קטע ה-dCas9 לכל וקטור מתאים.
    הערה: אתרי AscI/BamHI מבטיחים ש-dCas9 מוכנס במעלה הזרם של DNMT3A או HDAC1, ישירות במורד הזרם של מקדם ה-pCMV. ודא שיש מקשר קצר או כמה נוקלאוטידים בין dCas9 לאפקטור האפיגנטי כדי לשמור על מסגרת הקריאה הנכונה.
  7. הפוך את מוצרי הקשירה הסופיים לזני E. coli מוכשרים בעלי יעילות גבוהה עם שליטה הדוקה על ביטוי הפלסמיד (למשל, NEB 5-alpha F'Iq Qualified E. coli, High Efficiency). בחר שנאים על לוחות קנמיצין. הכן DNA פלסמיד איכותי משיבוטים חיוביים בשיטת מיני-הכנה מהירה לרתיחה מהירה.
  8. רצף את מבני הפלסמיד הסופיים (pEPI-1-dCas9-DNMT3A ו-pEPI-1-dCas9-HDAC1) באמצעות רצף ננו-נקבוביות כדי לאשר את ההרכבה הנכונה של כל הרכיבים, אמת את מסגרת הקריאה באמצעות כלי תרגום מקוון (למשל, כלי תרגום Expasy 3.0), ובדוק אם יש מוטציות פוטנציאליות או אירועי רקומבינציה באמצעות כלי יישור מקוון (למשל, כלי יישור BLAST).
    הערה: וקטורים גדולים נוטים יותר לרקומבינציה ועלולים לצבור מוטציות. לכן, אימות רצף יסודי הוא חיוני.
  9. זרחן את קבוצות ההידרוקסיל 5' של אוליגונוקלאוטידים sgRNA קדימה ואחורה באמצעות T4 פולינוקלאוטיד קינאז. הכלאה של שני הגדילים המשלימים על ידי חימום התערובת ל-90 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות כדי לפגוע במבנים משניים, ולאחר מכן לאפשר קירור הדרגתי לטמפרטורת החדר למשך הלילה לחישול מלא ל-DNA דו-גדילי.
  10. עכל את וקטור הביטוי sgRNA של pGuide שנבחר עם BamHI ו-Esp3I. קשר את שבר ה-sgRNA הדו-גדילי המחוסל לווקטור הליניארי באמצעות T4 DNA ligase.
  11. באמצעות פריימרים ספציפיים של PCR (טבלה משלימה 3), הגבירו את קלטת ביטוי ה-gRNA המלאה הכוללת (1) מקדם U6, (2) רצף sgRNA משובט ו-(3) פיגום sgRNA. השתמש ב-DNA פולימראז בנאמנות גבוהה שאינו מייצר תלויות של 3 אינץ' (כלומר, פולימראז הגהה) כדי להבטיח מוצרי PCR נקיים וקהים המתאימים לשיבוט במורד הזרם.
  12. חזור על שלבים 2.9-2.11 עבור כל gRNA בודד שתוכנן בסעיף 1. ודא שכל קלטת gRNA מוכנה ומוגברת בנפרד כדי לשמור על ספציפיות היעד.
  13. עכל את הווקטורים pEPI-1-dCas9-DNMT3A ו-pEPI-1-dCas9-HDAC1 עם SacII. הקהה את הקצוות הדביקים באמצעות שבר Klenow של DNA פולימראז I. שכפל את קלטות הפיגום U6 שהוגבר בעבר לתוך וקטורים אלה באמצעות T4 ligase.
    הערה: מספר שילובים של אפקטור gRNA-אפיגנטי (למשל, sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1 וכו') נבנו במהלך שלב הניסוי. עם זאת, רק שני שילובים נבחרים הועברו לניסויים שהוצגו בסעיפים הבאים.
  14. הפוך את מוצרי הקשירה הסופיים לזני E. coli מוכשרים בעלי יעילות גבוהה עם שליטה הדוקה על ביטוי הפלסמיד. בחר שנאים על לוחות קנמיצין. הכן DNA פלסמיד איכותי משיבוטים חיוביים בשיטת מיני-הכנה מהירה לרתיחה מהירה.
  15. רצף את מבני הפלסמיד הסופיים באמצעות ריצוף ננו-נקבוביות, אמת את מסגרת הקריאה ובדוק אם יש מוטציות פוטנציאליות או אירועי רקומבינציה.

3. תרבית תאים וטרנספקציה

  1. שמור על תאי K562 בצלוחיות תרבית T-75 ב-37 מעלות צלזיוס, תחת 5% CO2 ותנאי לחות. השתמשו ב-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1× תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפטומיצין).
  2. הכן פלסמידים לטרנספקציה:
    1. השתמש ב-8 מיקרוגרם של DNA פלסמיד כולל לכל טרנספקציה, ומכאן 4 מיקרוגרם של כל פלסמיד עבור טרנספקציה משותפת של שני פלסמידים. כמת את ה-DNA באמצעות ספיגה ב-260 ננומטר, ולאחר מכן דלל את הכמות הנדרשת ב-90 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד.
    2. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת נתרן אצטט 3 M ו -2.5 נפחים של 100% אתנול ל- DNA המדולל.
    3. מערבבים היטב ודוגרים בחום של -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לזרז את ה-DNA.
      הערה: בעת העברה משותפת של שני פלסמידים עם שילובי אפקטור gRNA-אפיגנטיים מובהקים (למשל, gRNA1-dCas9-DNMT3A ו-gRNA2-dCas9-HDAC1), מומלץ לשלב את שני הפלסמידים לאותו צינור משקעים כדי לפשט את הטיפול בהליכים במורד הזרם.
    4. למחרת, צנטריפוגה את צינורות המשקעים של ה-DNA ב-11,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית, מכיוון ששלב זה יכלול גם טיפול בתאים חיים.
    5. השליכו בזהירות את הסופרנטנט. הוסף 500 מיקרוליטר של 70% אתנול כדי לשטוף את הגלולה. צנטריפוגה בטמפרטורה של 11,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את האתנול לחלוטין. הניחו לגלולה להתייבש באוויר עד שלא יישאר אתנול גלוי.
    7. השעו מחדש את כדור ה-DNA המיובש ביסודיות ב-50 מיקרוליטר של DMEM. שמור את תמיסת הפלסמיד-DMEM בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    8. יש להריץ 400 ננוגרם של ה-DNA האפיזומלי המוכן (כ-2.5 מיקרוליטר מהתמיסה המרחפת) על ג'ל אגרוז של 1% כדי לאמת את הצלחת טיהור ושלמות ה-DNA לפני הטרנספקציה.
  3. הכן תאים:
    1. קצור תאי K562 מבקבוק T-75 כאשר התרביות מגיעות למפגש של 50-60% כדי להבטיח יעילות טרנספקציה.
    2. ספור תאים באמצעות המוציטומטר. העבירו נפח המכיל 2 × 105 תאים לתוך צלחת תרבית בגודל 35 מ"מ המכילה 900 מיקרוליטר DMEM ללא FBS או אנטיביוטיקה.
      הערה: השתמש ב-DMEM ללא סרום עבור כל השלבים בהליך הטרנספקציה. המשך את תנאי התרבות הבינונית המלאה רק לאחר סיום תקופת הדגירה של הטרנספקציה.
    3. מניחים את המנה בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) כדי לשמור על התאים מוכנים להעברה.
  4. השתמש בערכת טרנספקציה מבוססת ליפופקטמין לאספקת פלסמיד. עקוב אחר הוראות היצרן עבור הערכה הספציפית בה נעשה שימוש, והתאם את עוצמת הקול במידת הצורך.
    1. הוסף 3 מיקרוליטר של מגיב P3000 (מסופק בערכת הטרנספקציה) לתמיסת הפלסמיד-DMEM המוכנה. מערבבים בעדינות ומדגרים את תערובת המגיב פלסמיד-P3000 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    2. הוסף 5 מיקרוליטר של מגיב ליפופקטמין 3000 (מסופק בערכת הטרנספקציה) יחד עם מספיק DMEM כדי להגיע לנפח תגובה כולל של 100 מיקרוליטר. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    3. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה המלאה של 100 מיקרוליטר לתבנית המכילה תאים בגודל 35 מ"מ. מנערים בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התערובת, ואז מחזירים את המנה לחממה.
  5. לאחר 24 שעות לאחר הטרנספקציה, הוסף 3 מ"ל של מדיום מלא (DMEM בתוספת 10% FBS ו-1× עט/סטרפטוק) לכל צלחת 35 מ"מ כדי להתחיל התפשטות של תאים שעברו טרנספטציה. 72 שעות לאחר הטרנספקציה, התחל את הליך הבחירה על ידי הוספת אנטיביוטיקה G-418 לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
  6. לאחר שהברירה נקבעת כראוי וספירת התאים הכוללת עולה על 1 × 106, המשך לבודד שיבוטים בודדים (איור 3A) באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS):
    1. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 6 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. יש לשטוף פעם אחת עם 1× תמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS, pH ~7.4) וצנטריפוגה שוב באותם תנאים.
    2. השעו מחדש את גלולת התא ב-1× PBS וקבעו את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר. יש לדלל את המתלה ל-1 ×-106 תאים/מ"ל, תוך הקפדה על השעיה יסודית.
    3. הגדר FCS קצר יותר למצב תא יחיד (מבטיח תא אחד לכל טיפה), תוך שימוש בצלחת שטופלה בתרבית רקמות עם 96 בארות כמכשיר האיסוף. התאם את הגדרות התוכנה במידת הצורך, בהתאם למכשיר המשמש (איור 3B).
    4. קבע את האוכלוסייה העיקרית על סמך הגודל הצפוי (FSC) והגרעיניות (SSC). אל תכלול פסולת (FSC / SSC נמוך) וחומר גרגירי או מת מאוד (SSC גבוה). השתמש בתרשים נקודות FSC-A לעומת FSC-H או SSC-A לעומת SSC-H כדי לשער סינגלים.
    5. מלאו מראש את צלחת 96 הבארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום מלא המכיל 1 מ"ג/מ"ל G-418 לבאר. מחממים את הצלחת בחממה לפני המיון.
    6. בצע את המיון במצב תא יחיד, תוך שמירה על קצב מיון מתחת ל- 300 אירועים לשנייה כדי לשפר את דיוק המיון.
    7. לאחר המיון, בדוק את הבארות במיקרוסקופ כדי לאשר תא אחד לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  7. אפשר לשיבוטים של תא בודד להתרחב בנפרד בצלחת 96 הבארות. לאחר התבססות צמיחה משובטת, הפחיתו את ריכוז ה-G-418 ל-400 מיקרוגרם/מ"ל כדי לשמור על הבחירה.
  8. העבירו שיבוטים שגדלו היטב ברצף לצלחות של 12 בארות, ואז לצלוחיות T-25 ולבסוף T-75 לפי הצורך, עד שכל שיבוט מגיע ל-~1 ×-106 תאים.
  9. אסוף כדורי תאים כפולים במרווחי זמן קבועים. אחסן גלולה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למיצוי DNA גנומי. בנוסף, אחסן גלולה הומוגנית ב-500 מיקרוליטר של מגיב טריזול ב-20 מעלות צלזיוס למיצוי RNA וסינתזת cDNA.
    זהירות: יש לטפל בזהירות במגיב טריזול בשל רעילותו ואופיו הקורוזיבי במכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי, ויש לסמן חומרים מזוהמים לסילוק פסולת מסוכנת.
  10. חלץ DNA גנומי משיבוטים נבחרים באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם מסורתי, ואחריו משקעי אתנול.
    זהירות: פנול: כלורופורם רעיל וקורוזיבי, ויש לטפל בו במכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי. השלך פסולת המכילה פנול וכלורופורם כפסולת כימית מסוכנת.
  11. ודא שה-DNA מושעה במלואו במים נטולי נוקלאז או במאגר TE. מדוד את ריכוז ה-DNA והטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר לפני שתמשיך ליישומים במורד הזרם.
    הערה: DNA זה ישמש בניסויים במורד הזרם כגון PCR ו-Pyrosequencing כדי להעריך את יעילות העריכה האפיגנטית.
  12. חלץ RNA כולל מכדורי תאים באמצעות טריזול ריאגנט, ואחריו משקעים איזופרופנול29. טפל בדגימות RNA בזהירות על ידי הבטחת ריאגנטים וכלים חד פעמיים ללא RNase, ושמירה על דגימות ב-4 מעלות צלזיוס במהלך ההליך.
    הערה: סך ה-RNA ישמש לסינתזת cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוך.

4. PCR כדי לאשר את נוכחותם של שני האפיזומים בשיבוטים

  1. קצור כ -5 × 105 תאים מכל שיבוט תרבית, לאחר השעיית תאים ביסודיות. צנטריפוגה ב-7,000 x גרם למשך 3 דקות ב-25 מעלות צלזיוס. השליכו מדיום סופרנטנט.
  2. שטפו את התא על ידי השעיה ב -1× PBS. שוב צנטריפוגה באותם תנאים.
  3. השליכו את הסופרנטנט והשאירו נפח קטן, ממש מעל מפלס הגלולה. השתמש ב-1 מיקרוליטר של תרחיף התא ישירות כתבנית ל-PCR.
  4. לחלופין, השתמש ב-200 ננוגרם של DNA גנומי מטוהר המופק מהשיבוטים שעברו טרנספטציה.
    הערה: PCR ישיר מתאים שטופים מספק שיטת סינון מהירה אך עשוי להניב תוצאות משתנות. לקבלת ספציפיות ורגישות גבוהות יותר, השתמש ב-DNA גנומי מטוהר כתבנית.
  5. הכן את תערובת המאסטר PCR לפי טבלה 1.
  6. השתמש בשתי קבוצות של פריימרים, עם פריימר קדימה משותף המכוון לרצף dCas9 ופריימרים הפוכים נפרדים ספציפיים לכל וקטור אפקטור אפיגנטי (טבלה משלימה 3).
  7. עקוב אחר תנאי הרכיבה המוצגים בטבלה 2.
  8. הריצו מוצרי PCR על ג'ל אגרוז או נתחו עם אלקטרופורזה נימית כדי לאמת את גדלי המוצרים: 230 bp עבור הווקטור המכיל DNMT3A ו-205 bp עבור הווקטור המכיל HDAC1 (איור 3C). כלול בקרה חיובית (תערובת של שני הפלסמידים בריכוז של 10-20 ננוגרם) כדי לאשר את גדלי הלהקה הצפויים ולאמת את יעילות ה-PCR. כלול פקד ללא תבנית (NTC).
מגיבריכוז/כמות סופית
10× מאגר1×
פריימר קדימה1 μΜ
פריימרים הפוכים0.5 מיקרומטר
דנ א200 נ"ג
פולימראז1.25 יחידות
dNTPs200 מיקרומטר כל אחד
מים, ללא נוקלאזעד 50 מיקרוליטר

טבלה 1: תערובת תגובת PCR לאימות אפיזום.

צעדטמפרטורה, מעלות צלזיוסזמןמספר מחזורים
דנטורציה ראשונית953 דק'1
דנטורציה9530 שניות30
חישול5830 שניות
סיומת721 דק'
הארכה סופית725 דק'1

טבלה 2: תנאי מחזור PCR לאימות אפיזומים.

5. ניתוח pyrosequencing ממוקד

  1. טפל ב-gDNA (1.5 מיקרוגרם) המופק משיבוטים שעברו טרנספטציה עם ערכת המרה של ביסולפיט בהתאם להוראות היצרן.
  2. תכנן פריימרים המאגפים את אתרי ה-CpG בתוך האזור הרגולטורי הממוקד על ידי המבנים. השתמש בכלי ייעודי לעיצוב פריימר ביסולפיט. פעל בהתאם להנחיות העיצוב הבאות:
    1. המר את האי CpG או את אזור הרגולציה של אתר CpG לגרסה המומרת של ביסולפיט.
    2. תכנן פריימר קדימה ואחורה להגברת PCR של DNA שהומר על ידי ביסולפיט. כלול תווית ביוטין על פריימר אחד (בדרך כלל הפוך) לקיבוע על חרוזים מצופים סטרפטווידין.
    3. תכנן פריימר רצף (18-25 bp) פנימי למוצר ה-PCR, במעלה הזרם של ה-CpG הראשון המעניין. כאזור יעד, בחר חלון של 100 bp במעלה הזרם או במורד הזרם של אתר הקישור sgRNA כדי להעריך שינויים אפיגנטיים מקומיים פוטנציאליים.
    4. הימנע מאתרי CpG בתוך רצפי פריימר כדי להבטיח הגברה ללא משוא פנים.
    5. בחר זוג פריימר עם ציון תוכנת Assay Design גדול מ-75% ודירוג איכות של 'גבוה' (כחול), מה שמצביע על כך שניתוח התוכנה לא זיהה בעיות או חששות.
      הערה: לרצפי פריימר המיועדים להתמקד באי CpG 326, עיין בטבלה משלימה 3. הפריימרים תוכננו להיקשר באזורים המאגפים את אתרי הקישור sgRNA1 ו-sgRNA2, מה שמאפשר ריצוף של אתרי CpG המקיפים את הלוקוסים הממוקדים.
  3. הגדר תגובת PCR באמצעות DNA פולימראז התחלה חמה בנאמנות גבוהה המותאם לתבניות ביסולפיט.
  4. נוהל Pyrosequencing:
    1. קשרו מוצרי PCR ביוטיניליים לחרוזי ספרוז מצופים סטרפטווידין ובודדו DNA חד-גדילי באמצעות תחנת עבודה pyrosequencing.
    2. הוסף את פריימר הרצף ל-DNA החד-גדילי במאגר החישול. מחממים את התערובת ל-80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואז מניחים לה להתקרר בהדרגה לטמפרטורת החדר.
    3. בצע תגובות ריצוף באמצעות מכשיר ה-pyrosequencing וסדר החלוקה המוגדר במהלך תכנון פריימר.
  5. ניתוח נתונים:
    1. השתמש בתוכנת pyrosequencing ייעודית כדי לכמת את אחוז המתילציה בכל אתר CpG.
    2. השווה את רמות המתילציה בין שיבוטים שהועברו לשיבוטים שלא עברו טרנספקציה. הערכת יעילות העריכה (איור 3D). שקול לבצע מבחן t דו-זנבי לא מזווג כדי להשוות את רמות המתילציה בין בקרות לא מטופלות וכל שיבוט שעבר טרנספטציה בכל אתר CpG בודד.

6. סינתזת cDNA ו-PCR דיגיטלי לניתוח ביטוי dCas

  1. הכן את סך ה-RNA (1,100 ננוגרם לתגובה) המופק משיבוטים שעברו טרנספטציה ב-12 מיקרוליטר של מים נטולי RNase. שמור דגימות על קרח.
  2. הרכיבו את תערובת חיסול ה-DNA הגנומית על קרח: ערבבו 2 מיקרוליטר של מאגר ניגוב gDNA, דגימת RNA המכילה 1,100 ננוגרם של RNA כולל, ומים נטולי RNase לנפח סופי של 14 מיקרוליטר.
  3. הכן את תערובת מאסטר התמלול ההפוך על קרח: מערבבים 4 מיקרוליטר של RT Buffer עם 1 מיקרוליטר של פריימרים RT, ומוסיפים 1 מיקרוליטר של טרנסקריפטאז הפוך.
  4. שלב 14 מיקרוליטר של תערובת חיסול DNA גנומית עם 6 מיקרוליטר של תערובת אב שעתוק הפוך לנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר. מערבבים בעדינות, ודוגרים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השבת את הטרנסקריפטאז ההפוך על ידי חימום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
    הערה: אחסן cDNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  5. יש לדלל cDNA מכל הדגימות ביחס של 1:1 במים נטולי נוקלאז. השתמש ב-cDNA המדולל לניתוח PCR דיגיטלי במורד הזרם, באמצעות מערכת PCR דיגיטלית עם פריימרים ספציפיים ל-dCas (טבלה משלימה 3):
    1. מכינים את תערובת המאסטר 4× ותערובת התגובה לפי טבלה 3. מוסיפים cDNA מדולל לתערובת ופיפטה בעדינות כדי להבטיח ערבוב יסודי.
      הערה: הגדר תגובות בכפילויות לפחות עבור כל השיבוטים. כלול בקרה שלילית (cDNA מתאי K562 לא מטופלים) ו-NTC.
    2. טען 9 מיקרוליטר מתערובת התגובה לכל באר של לוחית ה-PCR. הגדר את מערכת ה-PCR באמצעות תנאי הרכיבה המוצגים בטבלה 4.
    3. בחר את ערוץ הצבע FAM לזיהוי והתחל את הריצה.
    4. לאחר השלמתו, אחזר את הדגימות ונתח את הנתונים.
      הערה: PCR דיגיטלי מדווח על תוצאות כעותקים לכל מיקרוליטר תגובה.
    5. הכפל את הערך המדווח (עותקים/מיקרוליטר) בנפח התגובה (10 מיקרוליטר) כדי לקבל סך העותקים לכל תגובה. חלקו ערך זה בכמות ה-cDNA בתגובה כדי לקבל עותקים לכל ng cDNA (שווה ערך לקלט ng RNA).
      הערה: אם מקפידים על הפרוטוקול המדויק, כל דגימה מתחילה ב-1,100 ננוגרם של RNA בתגובת RT של 20 מיקרוליטר (55 ננוגרם/מיקרוליטר). לאחר דילול של 1:1, ריכוז העבודה הוא 27.5 ננוגרם/מיקרוליטר, ומכיוון שמתווסף 1 מיקרוליטר לכל תגובת PCR, זה מתאים ל-27.5 ננוגרם של cDNA (שווה ערך ל-RNA) לכל תגובה.
מיקס מאסטר (4×)
מגיבריכוז/כמות סופית
25× צבע ירוק SYBR2×
5× תערובת PCR דיגיטלית4×
מים, ללא נוקלאזעד 100 מיקרוליטר
תמהיל תגובות
מגיבריכוז/כמות סופית
4× מיקס מאסטר1×
פריימר קדימה1 μΜ
פריימר הפוך1 μΜ
cDNA (מדולל)1 מיקרוליטר
מים, ללא נוקלאזעד 10 מיקרוליטר

טבלה 3: 4× מיקס מאסטר ותמהיל תגובה לניתוח PCR דיגיטלי של ביטוי dCas.

צעדטמפרטורה, מעלות צלזיוסזמןמספר מחזורים
דנטורציה ראשונית9610 דק'1
דנטורציה965 שניות40
חישול / הרחבה6015 שניות

טבלה 4: תנאי רכיבה על אופניים ל-PCR דיגיטלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור אם כלי העריכה האפיגנטיים הממוקדים שלנו יכולים לגרום לשינויים במתילציה של DNA ספציפיים לאתר באי ZBTB7A CpG 326, יצרנו תחילה וקטורים אפיזומליים המקודדים dCas9 התמזגו ל-DNMT3A(CD) או HDAC1, יחד עם sgRNAs שונים שתוכננו עם אתרי יעד בתוך האי CpG 326. בתחילה ביצענו טרנספקציה משותפת של תאי K562 עם שילובים של פלסמידים אלה כדי להעריך אם אספקה בו-זמנית של מודולי sgRNA ואפקטור יכולה להוביל לשינויים אפיגנטיים הניתנים לשחזור.

אסטרטגיה ומגבלות ראשו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא התכנון של sgRNAs ספציפיים ביותר. השפעות מחוץ למטרה הן מגבלה ידועה של מערכות עריכה אפיגנטיות מבוססות CRISPR, שלעתים קרובות יכולות לנבוע מבגידה בקשירת dCas9, כמו גם מהפעילות הלא ספציפית של תחומי האפקטור. כדי למזער זאת, יש לתכנן sgRNAs באמצעות כלים ביואינפורמטיים המייעלים לפעילות גבוהה על המטרה ומינימום קשירה מחוץ למטרה30. מומלץ להשתמש בכלי עיצוב ולאמת אתרים חזויים מחוץ למטרה, בעוד שהשוואה בין שיבוטים הנושאים sgRNAs שונים יכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים או לא פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איירין דרקי ווסיליקי צ'ונדרו נתמכים על ידי מלגה תלת-שנתית (מענק מס' 80706) מהחשבון המיוחד של קרנות מחקר (ELKE) של האוניברסיטה הפתוחה ההלנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)מערכות ביולוגיות יישומיותA52490
AgeI-HF NEBR3552
AscINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
BD FACS מיון תאי מלודיהBD
בגללNEBR0144
BspEINEBR0540
תערובת תמיסה של דאוקסינוקלאוטיד (dNTP) (10 mM כל אחד)NEBN0447
רמת רמת סוכר גבוהה ב-DMEM עם גלוטמין יציב, עם מדיום פירובט נתרןביוווסטL0103
DNA פולימראז I, שבר גדול (קלנו)NEBM0210
DNMT3A (CD), רצפי HDAC1IDT
פולימראז DreamTaq DNA  תרמו-סיינטיפיקEP0712
אפיטקטקיאגן59104ערכת המרה לביסולפיט  
ערכת Epitect Bisulfiteקיאגן59104
Esp3INEBR0734
סרום בקר עובריגיבקוA5256701
אנטיביוטיקה סלקטיבית גנטית (G418 סולפט)גיבקו11811031
ערכת טרנספקציה ליפופקטמין 3000InvitrogenL3000015
NEB®   5-אלפא Competent E. coli  (יעילות גבוהה)NEBC2987I
NEB®   5-אלפא F'Iq  מוכשר ו-E. Coli  (יעילות גבוהה)NEBC2992H
רקמת נוקלאוספין מאשרי-נגל740952.50
PBS, 10x תמיסה pH 7.4לונזהBE17-517Q
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100xביוווסטL0022
וקטור pGuideאוריג'ין טכנולוגיותGE100042
פנול: כלורופורם:איזואמיל אלכוהול 25:24:1 רווי ב-10 מ"מ טריס, pH 8.0, 1 מ"מ EDTAסיגמא-אלדריץ'P2069
פריימרים, sgRNAs ו-nbsp;אירופינים
PyroMark Assay Design קיאגןגרסה 2.0כלי עיצוב פריימר ביסולפיט  
מגושי PyroMark Gold Q24קיאגן970802
ערכת PCR של PyroMark  קיאגן978703
PyroMark Q24 MDxקיאגןPyrosequencing workstation 
PyroMark Q24 Software קיאגןv2.0.8Pyrosequencing software 
שאלה 5 ו-reg; פולימראז DNA באיכות גבוההNEBM0491
ערכת תמלול הפוך QuantiTectקיאגן205311
ערכת לוחות QuantStudio Absolute Q MAP16מערכות ביולוגיות יישומיותA52865מערכת PCR דיגיטלית 
צבע ג'ל SYBR Green I Nucleic Acid, מרוכז פי 10,000 ב-DMSOInvitrogenS7563
ליגאז DNA של T4NEBM0202
קינאז פולינוקלאוטידי T4NEBM0201
ריאגנט טריזולInvitrogen15596026

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firdaus, Z., Li, X. Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues. Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).
  2. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: from laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 1-12 (2024).
  3. Wang, S. E., Jiang, Y. -H. Novel epigenetic molecular therapies for imprinting disorders. Mol Psychiatry. 28 (8), 3182-3193 (2023).
  4. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  5. Ptak, C., Petronis, A. Epigenetics and complex disease: from etiology to new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48 (1), 257-276 (2008).
  6. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Res. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  7. Sapozhnikov, D. M., Szyf, M. Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9. Nat Commun. 12 (1), 5711(2021).
  8. Kwon, D. Y., Zhao, Y. -T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nat Commun. 8 (1), 15315(2017).
  9. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  10. Giehrl-Schwab, J., et al. Parkinson's disease motor symptoms rescue by CRISPRa-reprogramming astrocytes into GABAergic neurons. EMBO Mol Med. 14 (5), e14797(2022).
  11. Moreno, A. M., et al. In situ gene therapy via AAV-CRISPR-Cas9-mediated targeted gene regulation. Mol Ther. 28 (8), 1931(2020).
  12. Sokka, J., et al. CRISPR activation enables high-fidelity reprogramming into human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 17 (2), 413-426 (2022).
  13. Galonska, C., et al. Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints. Nat Commun. 9 (1), 1-9 (2018).
  14. Lin, L., et al. Genome-wide determination of on-target and off-target characteristics for RNA-guided DNA methylation by dCas9 methyltransferases. GigaScience. 7 (3), 1-19 (2018).
  15. Kennedy, M. E., Cullen, R. B. Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: a revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology. 479 - 480, 213-220 (2015).
  16. Rothe, M., Modlich, U., Schambach, A. Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 453-468 (2013).
  17. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  18. Hanzawa, N., et al. Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Sci Rep. 10 (1), 1-14 (2020).
  19. O'Geen, H., Tomkova, M., Combs, J. A., Tilley, E. K., Segal, D. J. Determinants of heritable gene silencing for KRAB-dCas9 + DNMT3 and Ezh2-dCas9 + DNMT3 hit-and-run epigenome editing. Nucleic Acids Res. 50 (6), 3239-3253 (2022).
  20. Sgourou, A., Routledge, S., Spathas, D., Athanassiadou, A., Antoniou, M. N. Physiological levels of HBB transgene expression from S/MAR element-based replicating episomal vectors. J Biotechnol. 143 (2), 85-94 (2009).
  21. Lazaris, V. M., et al. Non-viral episomal vector mediates efficient gene transfer of the β-globin gene into K562 and human haematopoietic progenitor cells. Genes. 14 (9), 1774(2023).
  22. Mulia, G. E., Picanço-Castro, V., Stavrou, E. F., Athanassiadou, A., Figueiredo, M. L. Advances in the development and the applications of nonviral, episomal vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1076-1095 (2021).
  23. Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J., Lipps, H. J. A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res. 27 (2), 426-428 (1999).
  24. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  25. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  26. Brezgin, S., Kostyusheva, A., Kostyushev, D., Chulanov, V. Dead Cas systems: types, principles, and applications. Int J Mol Sci. 20 (23), 6041(2019).
  27. Holmes, D. S., Quigley, M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem. 114 (1), 193-197 (1981).
  28. Harwood, A. J. The rapid boiling method for small-scale preparation of plasmid DNA. Methods Mol Biol. 58, 265-367 (1996).
  29. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  30. Labuhn, M., et al. Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications. Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).
  31. Hofacker, D., et al. Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects. Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).
  32. Yang, Q., et al. EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning. Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).
  33. Mu, W., et al. Machine learning methods for predicting guide RNA effects in CRISPR epigenome editing experiments. bioRxiv. , (2024).
  34. Batra, S. S., et al. Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing. bioRxiv. , (2025).
  35. Stavrou, E. F., et al. Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells. Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).
  36. Stavrou, E. F., et al. The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells. Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).
  37. Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).
  38. Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon. BMC Cell Biol. 8, 33(2007).
  39. Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency. Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).
  40. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  41. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  42. Ewaisha, R., Anderson, K. S. Immunogenicity of CRISPR therapeutics-critical considerations for clinical translation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1138596(2023).
  43. Raghavan, R., et al. Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy. Nat Commun. 16 (1), 105(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

dCas9 HDAC1CRISPR

מאמרים קשורים