הדמיית דינמיקה מרחבית-זמנית של נוירוני קורטקס סומטוסנסורי במהלך דיקור אלקטרואקופונקטורה באמצעות הדמיה דו-פוטונית ב-vivo

Shu-xiu Zhu; Fan Wu; Qiang Fu; Xue-Fei Hu

doi:10.3791/69340

Method Article

הדמיית דינמיקה מרחבית-זמנית של נוירוני קורטקס סומטוסנסורי במהלך דיקור אלקטרואקופונקטורה באמצעות הדמיה דו-פוטונית ב-vivo

DOI:

10.3791/69340

⸱

January 16th, 2026

Shu-xiu Zhu¹ , Fan Wu¹ , Qiang Fu¹ , Xue-Fei Hu¹

¹Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משלב חלונות גולגולת בעכברים טרנסגניים של Thy1-GCaMP6f, דיקור אלקטרו-דיקורטיבי סטנדרטי, ודימות בשני פוטונים כדי להמחיש את דינמיקת האנסמבל הקורטיקלי בקנה מידה של אלפיות שנייה במהלך הגירוי, וחושף פלסטיות ייחודית לשכבה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה יוצר מסגרת ניסויית מקיפה לחקירת דינמיקת המעגלים הקורטיקליים במהלך גירוי EA (אלקטרואקפונקטור). המתודולוגיה משלבת שלושה מרכיבים מרכזיים: השתלת חלון גולגולתי כרונית בעכברים טרנסגניים Thy1-GCaMP6f, גירוי EA סטנדרטי בנקודת ST36 באמצעות פולסים דו-פאזיים בתדר 2/100 הרץ, ודימות סידן דו-פוטוני ברזולוציה גבוהה. גישה משולבת זו מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של פעילות האנסמבל העצבי בקורטקס הסומטוסנסורי הראשי (S1) בדיוק טמפורלי של אלפיות שנייה, ולוכדת פרטים שלא היו נגישים קודם לכן של תגובות ברמת הרשת לנוירומודולציה. הטכניקה חושפת בהצלחה דפוסי הפעלה ייחודיים לשכבה ושינויים בפלסטיות לאורך זמן, ומספקת תובנות קריטיות לגבי המנגנונים הקורטקליים שעומדים מאחורי השפעות ה-EA. על ידי התגברות על המגבלות הבסיסיות במרחב-זמן הטבועות בטכניקות fMRI ואלקטרופיזיולוגיות קונבנציונליות, פלטפורמה ברזולוציה גבוהה זו מציעה יכולות אנליטיות חסרות תקדים למיפוי מעגלים עצביים דינמיים. העיצוב החזק של הפרוטוקול והתוצאות הניתנות לשחזור הופכים אותו ליקר ערך במיוחד לאופטימיזציה של טיפולי נוירומודולציה ממוקדים ולקידום הבנתנו של פלסטיות ברמת המעגל בתגובה לגירוי היקפי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיקור אלקטרו, התאמה מודרנית של דיקור מסורתי המשלבת זרמים חשמליים מבוקרים המופעלים באמצעות מחטים בנקודות דיקור ספציפיות, מוכרת בוויסות מעגלים עצביים המעורבים בעיבוד כאב, שליטה מוטורית ותפקוד אוטונומי. מאמינים שהשפעותיו כוללות מפלי איתות מורכבים המתחילים על ידי הפעלת עצבים תחושתיים היקפיים (בעיקר סיבי Aδ ו-C), מה שמוביל לשחרור נוירוטרנסמיטרים (כגון אופיאטים, סרוטונין, GABA) ולמידולציה^{ברמות עמוד} השדרה, גזע המוח והקורטיקה ^1,2. המבנים המרכזיים המעורבים כוללים קורטיסים סומטוסנסוריים. בתוך הקורטקס S1, שמעבד מידע מישושי ומידע נוציספטיבי, EA ככל הנראה משפיע הן על איזון מעכב-מעורר מקומי והן על קישוריות לטווח ארוך ^3,4. עם זאת, רצף הזמן המדויק של ההפעלה/עיכוב בין אוכלוסיות נוירונים שונות (למשל, נוירונים פירמידליים, אינטרנוירונים) ושכבות בתוך S1 במהלך ומיד לאחר גירוי EA נותר ברובו לא ממופה בשל המגבלות המתודולוגיות שהוזכרו קודם ^5,6. הבנת דינמיקות בזמן אמת חיונית לאופטימיזציה של פרמטרי EA ולחיזוי תוצאות טיפוליות.

שיטות מסורתיות לחקירת ההשפעות הנוירו-מודולטוריות של EA (אלקטרואקפונקטורה על מעגלים קורטיקליים), כגון מחקרים התנהגותיים וניתוחי פוסט-מורטם, מציעות תובנות חשובות אך אינן מצליחות ללכוד פעילות עצבית בזמן אמת ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה ^7,8. כדי להתגבר על מגבלות אלו, הדמיית סידן דו-פוטונית ב-vivo מתגלה כחלופה עוצמתית, המאפשרת הדמיה ישירה של דינמיקת האנסמבל העצבי במהלך גירוי ^8,9. טכניקה זו מספקת יתרונות חסרי תקדים למחקרים כרוניים לאורך זמן, ומאפשרת לחוקרים לצפות – ברזולוציה תאית – בפעילות המהירה והמפוזרת על פני שכבות הקורטקס בבעלי חיים ערים ומתנהגים. בניגוד לאלקטרופיזיולוגיה חריפה, שמציעה רזולוציה זמנית גבוהה אך כיסוי מרחבי מוגבל, הדמיה בשני פוטונים מאפשרת ניטור רחב היקף של מאות עד אלפי נוירונים בו-זמנית בשדה ראייה מוגדר ^9,10. יתרה מזאת, בהשוואה להדמיית תהודה מגנטית פונקציונלית (fMRI), שמצטיינת בכיסוי מוח מלא אך פועלת בקנה מידה זמני איטי יותר וחסרה ספציפיות תאית, הדמיית סידן בשני פוטונים מספקת זיהוי מדויק של פעילות מאוכלוסיות נוירונים ספציפיות בטווח זמן רלוונטי לתהליכים סינפטיים ומעגליים^11,12. לכן, הדמיית שני פוטונים ממוקמת באופן ייחודי כדי לגשר על פער קריטי בהבנתנו כיצד גירויים של EA פריפריאליים מתורגמים לדפוסי הפעלה קורטיקליים מדויקים במרחב-זמן, במיוחד באזורים כמו הקורטקס הסומטוסנסורי הראשוני (S1). כמרכז העיקרי לעיבוד סומטוסנסורי (כולל אותות מנקודות דיקור), ובהינתן ש-EA מווסת באופן חזק את פעילותו, S1 מהווה שער אסטרטגי לחקר דינמיקת מעגלים קורטיקליים המושרה על ידי דיקור אלקטרו.

מיקרוסקופ סורקת לייזר דו-פוטוני (2PLSM) בשילוב עם מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP6, מהווים כלי מהפכני למדעי המוח. הוא מאפשר הדמיה כרונית ברזולוציה גבוהה של פעילות עצבית ב-vivo עם ספציפיות תאית ותת-תאית¹³. GECIs פלואורסציה ביחס לחולפים תוך-תאי של סידן, ומשמשים כפרוקסי אמין לירי נוירונים¹⁴. חשוב לציין, השימוש של 2PLSM באור עירור אינפרא-אדום קרוב מספק חדירת עומק גבוהה יותר (מאות מיקרונים) בהשוואה למיקרוסקופיה קונבנציונלית, ומאפשר המחשת פעילות בשכבות קורטיקליות שטחיות ועמוקות אף יותר (למשל, L2/3, L4, L5). החתך האופטי הטבוע בו ממזער פלואורסצנציה מחוץ לפוקוס ונזק פוטוגרפי, מה שהופך אותו לאידיאלי למחקרים אורכיים לאורך שבועות או חודשים 15,16,17. טכנולוגיה זו מייצגת התקדמות מהפכנית במחקר EA, עם פוטנציאל לשנות באופן יסודי את הבנתנו אותה, ומציעה פוטנציאל לעקוב אחר דינמיקה בקנה מידה של מאות עד אלפי נוירונים בודדים בו-זמנית בנפח קורטיקסי מוגדר במהלך הגירוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים השתמשו בעכברי Thy1-GCaMP6f טרנסגניים בני 8-12 שבועות¹⁸. כל ההליכים הניסיוניים ופרוטוקולי הטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך המכון הלאומי לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת המדע והטכנולוגיה של חואז'ונג (IACUC; מספר אישור פרוטוקול: 3603). נעשה כל מאמץ למזער את מספר בעלי החיים בשימוש ואת סבלם. סכמטיקה של המבנה הניסויי מוצגת באיור 1.

1. השתלת חלון גולגולתי כרונית

השראה של הרדמה וייצוב סטריאוטקסי
1. התחל הרדמה על ידי הכנסת עכבר Thy1-GCaMP6f בן 8-12 שבועות לתא השראה המסופק ב-4-5% איזופלוראן (נפח/נפח) בחמצן רפואי 100% בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה.
2. לאחר אובדן רפלקס היישור (בדרך כלל תוך 2-3 דקות), העבר את החיה לכרית חימום מבוקרת תרמוסטטית (נשמרת על 37 מעלות צלזיוס) המשולבת במסגרת סטריאוטאקסית דיגיטלית.
3. אבטח את העכבר באמצעות קונוס אף שמספק 1.5-2.0% איזופלוראן לתחזוקה כירורגית. מרחו משחה עינית (למשל, משחת Puralube Vet) לשתי העיניים כדי למנוע ייבוש בקרנית.
4. הכנס מוטות אוזניים לא טראומטיים בזהירות לתוך המיתוס החיצוני של השמיעה, כדי להבטיח מיקום סימטרי ללא לחץ מופרז שעלול לגרום לנזק לרקמה או לקרע בקרום הטימפני¹⁹.
5. אבטח את החיך העליון באמצעות מהדק האף, תוך הימנעות מחסימת דרכי הנשימה.
6. אישור הרדמה עמוקה בהיעדר רפלקס גמילה מדווסה, לצביטה קשה של האצבע וקצב נשימה יציב ואיטי (80-120 נשימות לדקה). מעקב רציף אחר טמפרטורת הגוף המרכזית באמצעות גלאי רקטלי וכיוון את כרית החימום בהתאם.
7. מתן הקלה תת-עורית (s.c.) מראש לכאבים (למשל, קרפרופן, 5 מ"ג/ק"ג) ותמיכה נוזלית (סליין סטרילי, 0.5-1 מ"ל לעיר). בדוק פרמטרים פיזיולוגיים יציבים (SpO₂ > 95%, נשימה סדירה) לאורך כל ההגדרה.
חשיפה כירורגית של הגולגולת
1. גלח את הקרקפת הגבית בקפידה באמצעות מכונה חשמלית, ולאחר מכן מרח קרם כימי להסרת שיער מלאה. שטוף היטב עם מי מלח סטריליים.
2. בצע אנטיספסיסיה רציפה: שפשף את העור החשוף שלוש פעמים, לסירוגין בין דגימות פובידון-יוד (10%) ל-70% איזופרופיל אלכוהול, וסיים בתמיסה של כלורהקסידין גלוקונאט (2%).
3. באמצעות מספריים סטריליים עם מיקרו-דיסקציה ומלקחיים דקים (Dumont #5), בצעו חתך סגיטלי בקו אמצע (~15-20 מ"מ אורך) דרך העור ורקמת החיבור שמתחת, החל ~2 מ"מ אחורי לעיניים וממשיך עד לצומת הבין-פוקפיטלית.
4. השתמשו במלקחיים מיקרו-המוסטטיים או בצריבה דו-קוטבית (הגדרה נמוכה) כדי לשלוט בדימום נימי לאורך שולי החתך. משכו בעדינות את דפנות העור לרוחב באמצעות מיקרו-רטרקטורים מעוקלים או תפרי משי 5-0 המעוגנים לווילון הסובב.
5. חשפו את כל הגולגול הגבי, כולל עצמות המצחיות, הפריאטליות והבין-פריאטליות. באמצעות מיקרו-קורט (#00), גרדו בקפידה את הפריוסטאום - ממברנה וסקולרית סיבית הדבוקה לפני העצם - בהגדלה גבוהה (מיקרוסקופ כירורגי).
6. יש לבצע תנועות עדינות ומשיקיות כדי למנוע חריצת הגולגולת או פגיעה בתפרים (ברגמה, למדה, סגיטל, קורונל). השגת משטח עצם חלק ואוסקולרי, החיוני לקרניוטומיה מדויקת ולדבק דביק.
7. השקיו את השדה לעיתים קרובות עם מלח סטרילי, חם (37 מעלות צלזיוס) ו-0.9% להסרת אבק עצם ושמירה על הידרציה של הרקמות.
מיקוד סטריאוטקסי באזור הגפה האחורית של S1
1. באמצעות זרוע מניפולטור סטריאוטקסית מדויקת מאוד, מקם את קצה עט סימון כירורגי דק או מקדח מיקרו ישירות מעל הברגמה האנטומית (נקודת החיתוך של התפרים הקורונליים והסגיטליים). אשר קואורדינטות תחת ויזואליזציה במיקרוסקופ (10x).
2. כוונן את המניפולטור כך שיזיז את הסמן בדיוק לכיוון הקדמי האחורי (AP) -1.5 מ"מ (אחורי לברגמה) ו-2.0 מ"מ (חצי הכדור הימני) ביחס לקו האמצע (תפר סגיטלי).
  הערה: מיקום זה מתאים לאזור הייצוג של הגפה האחורית (S1) בקורטקס הסומטוסנסורי הראשוני (S1).
3. חריטו בעדינות צלבת קטנה (<0.5 מ"מ) על פני העצם הפריאטלית החשופה בקואורדינטה זו, כדי להבטיח ראות מבלי לחדור לעצם.
4. אמת היעדר כלי דם עיקריים על פני השטח החוצים את האתר המסומן; אם קיימים כלי דם משמעותיים, יש להתאים את קואורדינטות ה-ML למינימום (±0.1-0.2 מ"מ) כדי להימנע מהן, שכן כלי דם דורליים עלולים לדמם במידה רבה אם הם נפרצים ולהפריע לבהירות האופטית.
5. תעד את הקואורדינטות הסופיות שהותאמו.
ביצוע מדויק של קרניוטומיה
1. מרכזי מחורר ביופסיה סטרילי חד-פעמי בקוטר 3 מ"מ בדיוק מעל הקואורדינטה המסומנת S1HL. הפעילו לחץ חזק ויציב כלפי מטה תוך סיבוב האגרוף בעדינות כדי לשרוט את שכבת העצם הקורטיקלית החיצונית סביב ההיקף לחלוטין. הסר את האגרוף.
2. באמצעות מקדחת מיקרו-כירורגית מהירה (למשל, עם קוץ קרביד בקוטר 0.5-0.8 מ"מ) שמחוברת לזרוע סטריאוטקסית תחת השקיה קבועה של 0.9% מלח (קירור והסרת פסולת), מדללים בזהירות את העצם בתוך המעגל המסומן.
3. קדחו בפרצים קצרים באמצעות תנועת מילינג קלה ומשיקית, המתקדמים באופן שיטתי מהפריפריה אל המרכז. עקבו מקרוב אחרי שקיפות העצם תחת הגדלה.
4. הפסק את הקידוח מיד לאחר הבחנה במראה עדין של הדורה מאטר שמתחת, מה שמעיד על עובי עצם מינימלי (<50 מיקרון). עברו למיקרו-מלקחיים עדינים (Dumont #5/45) ולמיקרוסיסורים כדי להרים ולקלף את שאר שברי העצם הדקים בקפידה, תוך עבודה רדיאלית החוצה מהמרכז.
5. שמרו על הדורה מאטר שלם - ודאו שהוא נראה שקוף ומבריק ללא קרעים או דימום משמעותי. שלטו מיד בדימום דוראלי קל על ידי לחיצה עדינה עם פלדגט קצף דחוס סטרילי טבול ב-0.9% סליין או ת'רומבין.
6. שטוף את הדורה החשופה בשפע בנוזל מוחי שדרתי מלאכותי חם וסטרילי (aCSF) או במי מלח של 0.9% כדי להסיר את כל שאריות העצם. הימנע מהתייבשות ^17,20.
השתלה כרונית בחלון הגולגולת וקיבוע מוט ראש
1. הכינו כיסוי זכוכית עגול סטרילי בקוטר 3 מ"מ, בעובי #1 (כ-150 מיקרון). רצוי לצפות את פני השטח הפנימיים בשכבה דקה של אלסטומר סיליקון לבהירות אופטית ולהפחתת ההידבקות.
2. מקם את ה-coverslip בדיוק מעל הקרניוטומיה באמצעות מלקחיים דקים. הכינו מלט דנטלי שמתייבש במהירות ובאור (למשל, Metabond או Charisma) בהתאם להוראות היצרן.
3. בעבודה מהירה (<90 שניות), מרח טיפה דקה של מלט סביב היקף הכיסוי, ישירות על פני השטח היבש והנקי של הגולגולת. ודאו שהמלט אוטם לחלוטין את קצה הכיסוי אך אינו מתנפל מתחת לדורה.
4. מייבשים את המלט מיד באמצעות אור ריפוי דנטלי (אור כחול, 450 ננומטר) למשך 20-30 שניות לרבע. חיזקו את האיטום בשכבות מרובות של מלט דנטלי אקרילי באורך 5 מ"ל (למשל, Jet Repair Acrylic או Paladur), ובנו כיסוי מלט חזק ונמוך (<2 מ"מ) שמגיע כמה מילימטרים מעבר לשפת הקרניוטומיה אל הגולגולת הסובבת.
5. הטמיעו מוט ראש קל משקל מפלדת אל-חלד או טיטניום (למשל, באורך 15-20 מ"מ עם פתח מרכזי) בתוך כיסוי המלט במהלך שלב הייבוש הראשוני.
6. ודאו שמוט הראש ממוקם במקביל לתפר הסגיטל וממוקם במרכז החלון, ומספק נקודות קיבוע קשיחות ומאוזנות למשענת ראש עתידית תחת המיקרוסקופ מבלי להפריע לגישה אופטית.
7. תן למלט להתייבש לגמרי (≥15 דקות). בדוק המוסטזיס מלא ובהירות החלון²¹.
החלמה ומעקב לאחר ניתוח
1. לאחר ייבוש המלט, שחרר בזהירות את העכבר ממוטות האוזניים וממהדק האף. הפסיקו איזופלוראן ונתנו 100% חמצן עד שהנשימה הספונטנית תתחדש במלואה.
2. נתנו בופרנורפין HCl (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג ל-s.c.) מיד לאחר הניתוח להקלה על כאבים. העבר את בעל החיים לתא התאוששות מחומם מראש (30-32 מעלות צלזיוס), עם תוספת חמצן, המצופה במצעי נייר נקיים.
3. יש לעקוב באופן רציף עד שהשכיבה של עצם החזה והליכה מלאה מתקבלות (בדרך כלל 30-60 דקות). נתנו מנה שנייה של קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג ל-s.c.) 24 שעות לאחר הניתוח. ספק תמיסת רינגר חמוצה מחוממת (1 מ"ל לבקרה) לתמיכה בהידרציה במידת הצורך.
4. הכניסו את העכבר לבד בכלוב סטנדרטי המועשר בחומרי קינון כדי למנוע מבני הכלוב לפגוע בשתל הראש. שמור על תנאי סביבה (22-24 מעלות צלזיוס, 40-60% לחות, מחזור אור/חושך של 12:12 שעות) עם גישה חופשית למזון והידרוג'ל.
5. עקוב אחרי העכבר לפחות פעמיים ביום במשך 7 ימים לאחר הניתוח לסימנים לכאב/מצוקה (יציבה כפופה, זקפה, ירידה בפעילות, ירידה במשקל >15%), זיהום (הפרשה מוגלתית, נפיחות, אדמומיות), ליקוי נוירולוגי או שחרור מוט הראש.
6. יש לאפשר תקופת החלמה מינימלית של ≥7 ימים לפני תחילת כל הליך ניסיוני (הדמיה או EA) כדי להבטיח הקלה של דלקת כירורגית חריפה, שיקום התנהגות תקינה ופינוי גלימפה, וייצוב פעילות קורטיקלית בסיסית. שקלו את החיה מדי יום כדי לעקוב אחרי ההתאוששות²².

2. גירוי אלקטרואקפונקטורה

מיקום אנטומי מדויק של נקודת ST36
1. כוון את נקודת ה-ST36 ("Zusanli") בהתבסס על נקודות ציון אנטומיות מוכרות בגפה האחורית של העכבר. לפני הכנסת המחט, יש למשש את הטיביה הקדמית הפרוקסימלית כדי לזהות את השחצנית בטיביאלית - הבליטה הגרמית הבולטת הממוקמת ממש רחוק ממפרק הברך, שם מוכנס הרצועה הפיקה.
2. באמצעות קליפרים עדינים או סמן סטרילי, יש למדוד 2 מ"מ לרוחב (לכיוון הפיבולה) ו-2 מ"מ זנב (אחורי) ביחס למרכז השחשית השוקית. מיקום זה תואם לשריר הקדמי של הטיביאליס, שטחי לענף העצב הפרונאלי העמוק ופרוקסימלי לפיצול העורק הקדמי של הטיביאל.
3. אשר את היעדר כלי דם שטחיים עיקריים באתר באמצעות טרנסליומינציה, אם יש צורך.
  הערה: הדיוק הוא קריטי, שכן סטיות קלות (>0.5 מ"מ) יכולות לשנות משמעותית את המבנים העצביים המופעלים ואת התגובות הקורטיקליות ב-S1. זיהוי נקודות ציון צריך להתבצע בעקביות על ידי אנשי צוות מיומנים כדי למזער שונות בין מפעילים^23,24.
  הערה: שיטות להבטחת יציבות המחט הן: (i) לאחר הכנסת המחט והקיבוע שלה, מותרת תקופת הסתגלות לעכבר ולהפחית את המאבק הראשוני. (ii) תדר הרטט שנוצר על ידי מגרה האלקטרואקופונקטורה (למשל, 2 הרץ) הוא נמוך מטבעו בעוצמה. יתרה מזאת, המחטים העדינות (למשל, Φ0.16 מ"מ) מחזיקות בקשיחות מספקת כדי לעמוד ביעילות ברטט מינימלי זה. (iii) לאורך כל הניסוי, המפעיל עוקב באופן רציף אחרי מיקום קצה המחט. נתוני הניסוי יוחרגו אם תיראה תזוזה משמעותית הנגרמת מתנועת בעלי חיים.
טכניקת הכנסת מחט סטרילית
1. לאחר חיטוי העור (לסירוגין של 70% אתנול וכלורקסידין), הכניסו מחט דיקור סטרילית חד-פעמית מפלדת אל-חלד (קוטר נומינלי: 0.18 מ"מ, שווה ערך ל-36 גייג'; אורך: 13 מ"מ) בניצב לעור בקואורדינטת ST36 המסומנת.
2. התקדמו את המחט בעקביות דרך העור, הרקמה התת-עורית ואל שריר הטיבאליס הקדמי שמתחת באמצעות תנועה סיבובית חלקה כדי למזער טראומה ברקמה.
  הערה: עומק ההחדרה במטרה הוא 3 מ"מ מפני העור. עומק זה מבטיח מעורבות מיטבית של אפרנטים מסוג II/III (סיבי Aδ) וסיבים סומטיים בקוטר קטן, מבלי לסכן מגע עם הטיביה הבסיסית או עם חבילות נוירו-וסקולריות עמוקות.
3. אבטחו את מרכז המחט היטב באמצעות כרית דבק סטרילית קטנה או קליפס מותאם אישית כדי למנוע התנתקות במהלך גירוי חשמלי נוסף ותנועות עדינות אפשריות של הגפיים.
4. בדוק את מיקום המחט היציב על ידי תצפית על פאסיקולציה מקומית קלה וחולפת בשריר בעת ההחדרה - אינדיקטור פיזיולוגי למיקום תוך-שריר תקין.
5. שמור על טכניקה אספטית קפדנית לאורך כל הזמן כדי למנוע זיהום, במיוחד בפרדיגמות גירוי כרוניות²³.
פרמטריזציה והעברה של גירוי אלקטרואקפונקטורה
1. חבר את הידית המבודדת של המחט המוכנסת לערוץ היציאה של האנודה (+) של מגרה אלקטרואקפונקטורה מתוכנת (למשל, HANS Acupoint Neur Stimulator, דגם LH202).
2. מקם אלקטרודת קתודה ייחוס (-), בדרך כלל פלטת פלדת אל-חלד קטנה או אלקטרודת קליפס מצופה בג'ל מוליך, על כף הרגל האחורית הדו-צדדית (למשל, משטח כף הרגל ליד העקב).
3. יש להבטיח מגע בטוח והתנגדות נמוכה (<5 kΩ) בשני האתרים. תכנתו את הממריץ לספק פולסים דו-פאזיים בגל מרובע (פאזות חיוביות/שליליות מאוזנות) כדי למזער את קיטוב האלקטרודות ונזק לרקמות.
4. הגדר את פרדיגמת הגירוי למצב פיזור צפוף: התפרצויות מתחלפות של 2 הרץ (תדר נמוך) למשך 3 שניות, ואחריהן 100 הרץ (תדר גבוה) למשך 3 שניות.
  הערה: דפוס התדר המשולב הזה (לעיתים מסומן כ-2/100 הרץ) הוכח אמפירית כמגביר את שחרור אופיאטים אנדוגניים (למשל, β-אנדורפינים, אנקפלין) ומונואמין (למשל, סרוטונין, נוראפינפרין) במערכת העצבים המרכזית בצורה יעילה יותר מאשר בתדרים בודדים בלבד.
5. כוונן את עוצמת הזרם בהדרגה החל מ-0.1 mA עד שנצפה עווית קלה של כף רגל (כיפוף אצבעות או קרסול) – בדרך כלל בין 1.0 mA בעכברים בוגרים תחת הרדמה קלה. סף העווית הזה מצביע על גיוס מספק של אפרנטים מוטוריים ושל אפרנטים בקוטר גדול (סיבי Aβ), המאשר הפעלה פיזיולוגית מבלי לגרום למצוקה או מאבק עז. שמרו על עוצמה מכוונת זו לאורך סשן הגירוי של^{20 דקות 25}^, ²⁶.
בקרות פרוצדורליות קריטיות ומעקב פיזיולוגי
1. הפחתת ארטיפקטים בגירוי
  1. הפרד פיזית בין כבלי EA לציוד הדמיה/במה ראשית.
  2. הטמעת הארקה חזקה: חבר את מסוף ההארקה של המגרה להארקה ייעודית וודא שמסגרת המיקרוסקופ ומשטח החימום של בעלי החיים חולקים נקודת הארקה משותפת.
  3. סנכרן זמנית את פולסי הגירוי עם אות הריקון של המיקרוסקופ אם קיים, או השתמש בעיבוד אותות פוסט-הוק להסרת ארטיפקטים חשמליים שנותרו משאריות סידן.
2. יציבות פיזיולוגית
  1. יש לעקוב באופן רציף אחרי טמפרטורת הליבה (נשמרת על 37.0 ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום מבוקרת משוב), קצב נשימה (80-120 נשימות לדקה), ו-SpO₂ (>95%) לאורך כל 20 דקות של מפגש EA.
  2. שמרו על הרדמה איזופלורנית קלה (1.0-1.5%) לחוסר תנועה במהלך הדמיה/גירוי משולב. מתבונן שוב ושוב בתנועת הכף שנגרמה; אם היא פוחתת או מפסיקת, בדוק מגע עם המחט והתנגדות, והתאם מעט את העוצמה (≤0.1 mA) כדי לשמור על הפעלה מוטורית עקבית ומתונה.
  3. הפסק את הגירוי מיד אם מופיעים סימני מצוקה (למשל, טכיפנאה, מאבק עז).
3. שכפול
  1. השתמש באותו סוג מחט, עומק החדרה, מודל מגרה ושיטת כיול (סף תנועת כפה) בכל בעלי החיים והמפגשים. תעד את עוצמת הגירוי הסופית לכל נבדק.
  2. יש לאפשר תקופת החלמה מינימלית של 5 דקות לאחר הגירוי לפני הפסקת ההרדמה או ביצוע הליכים נוספים^27,28.

3. הדמיית שני פוטונים במהלך EA

הכנת בעלי חיים, קיבוע ראש ותחזוקה פיזיולוגית
1. לאחר ≥7 ימי החלמה לאחר הניתוח, קיבעו את עכבר Thy1-GCaMP6f בראש באמצעות מוט הראש המושתל בתוך מכשיר קיבוע מותאם אישית ומותקן על שלב XY ממונע.
2. מקם את החיה בנוחות על הליכון גלילי עם חיכוך נמוך ומשומן באוויר, ומאפשר תנועה חופשית של הגפיים האחוריות. שמור על הרדמה ניתוחית קלה באמצעות מתן איזופלוראן 0.5-0.8% ב-100% O₂ באף הנוף. רמת איזופלוראן מופחתת זו ממזערת את דיכוי הפעילות העצבית תוך הבטחת חוסר תנועה מספיק להדמיה ברזולוציה גבוהה.
3. מעקב ותיעוד רציף של טמפרטורת הליבה (נשמרת על 37.0 ± 0.2 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום מבוקרת משוב), קצב נשימה (100-140 נשימות לדקה), ורוויית חמצן היקפית (SpO₂ > 95%).
4. מרחו ג'ל עיניים למניעת ייבוש בקרנית במהלך הדמיה ממושכת. ודא שהגפה האחורית במקביל לחלון הגולגולת של S1HL נגישה להחדרת מחט EA ב-ST36.
5. יש להקדיש 15-20 דקות לייצוב פיזיולוגי לאחר קיבוע הראש לפני תחילת הדמיה²⁹.
מיקוד אופטי ואופטימיזציה להדמיית שכבות II/III
1. קבעו בדיוק את מישור המוקד לקבלת אותות נוירונליים איכותיים. פעל לפי תהליך האימות הזה.
  1. הפחת את עוצמת הלייזר לרמה נמוכה (בדרך כלל 10-20% מהספק ההדמיה, למשל 5-10 מיליוואט) כדי למנוע הלבנה מיותרת ונזק פוטוגרפי במהלך מיקום המטוס.
  2. באמצעות מנוע ציר ה-Z של מיקרוסקופ שני הפוטונים, הזיזו את המטרה באיטיות בשלבים מיקרוניים. התחילו במשטח החלון הגולגולתי והתקדמו עמוק יותר לתוך רקמת המוח.
  3. במצב תצוגה מקדימה חיה , זהה את מישור המוקד באמצעות אינדיקטורים ויזואליים אלה כפי שמתואר בשלבים 3.2.1.4 ו-3.2.1.5.
  4. למישור המוקד הנכון בשכבת סומה נוירונלית: ודאו שהתמונה מראה מבנים ברורים, בהירים ומנוקדים (סומטה נוירונלית) הנראים עגולים או אליפטיים עם ניגודיות רקע טובה. ודאו שגבולות התאים חדים ומציגים מראה מובחן של "מלח ופלפל".
  5. למישור מוקד שגוי: אם התמונה נראית מטושטשת או הומוגנית ללא מבני נקודות מוגדרים היטב, יש להכיר בכך שהמוקד נמצא באזור נטול סומטה. אם צללים גדולים, כהים ובלתי מובנים של כלי דם נראים לעין, יש לזהות זאת כשכבת כלי הדם.
2. אימות קו הבסיס הפלואורסצנטי המתאים
  1. לאשר קו בסיס פלואורסצנציה בריא ויציב לפני הפעלת גירוי ניסויי כדי להבטיח פרשנות תקיפה של אותות הסידן הבאים (ΔF/F). בצע שלבים 3.2.2.2-3.2.2.4.
  2. כוון את עוצמת הלייזר לרמת ההדמיה הפורמלית (למשל, 30-50 mW).
  3. צלם תמונות לכמה שניות במצב תצוגה מקדימה מהירה וברזולוציה נמוכה.
  4. התבונן בעוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת המוצגת בזמן אמת (או מנטר ישירות את בהירות התמונה). ודאו שהאות נשאר יציב ואינו מראה סימני הלבנה מהירה לפני המשך לאיסוף נתונים ניסיוניים.
3. מרכז את שדה הראייה של ההדמיה בתוך חלון הגולגולת.
  1. מרחו ג'ל אולטרסוני או מים מזוקקים בין האובייקטיב לכיסוי הכיסוי לצורך חיבור טבילה (coversion). באמצעות קונטרסט גרדיאנט Dodt באינפרא-אדום או תאורה אפיפלואורסצנטית, זיהו את כלי הדם של פני השטח ויישר את שדה הראייה (FOV) כדי להימנע מכלי שטח גדולים (>20 מיקרון).
  2. מעבר למצב עירור של שני פוטונים באמצעות לייזר Ti:Sapphire עם פולסים פמטו-שניות שניתן לכוונן. הגדר את אורך גל העירור ל-920 ננומטר - אופטימלי לעוררות GCaMP6f (שיא ~920 ננומטר) תוך מזעור אוטופלואורסצנציה ירוקה ונזק פוטוגרפי לעומת אורכי גל קצרים.
  3. הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר (בדרך כלל 20-50 מ"וואט הנמדד בדגימה) תוך מיקוד דרך הדורה השקופה אל פני הקורטיקלית (פיה מטר). כוונן את מיקום ה-Z של המטרה באמצעות מכשיר פיזואלקטרי ננו-פוקוס כדי להגיע לעומק של 200 ±-10 מיקרון מתחת לפני השטח של הפייאל, התואם לשכבת הקורטיקה II/III.
  4. אשר עומק באמצעות צפיפות ומורפולוגיה נוירונים אופייניים: אוכלוסייה צפופה של נוירונים פירמידליים קטנים עד בינוניים (קוטר 10-15 מיקרון) עם דנדריטים אפיקליים נראים לעין.
  5. אופטימיזציה של עוצמת הלייזר והגדרות הגבר של צינור הפוטומולטיפלייר (PMT) להשגת פלואורסצנציה בסיסית חזקה של GCaMP6f (F₀) ללא רוויה (עוצמת פיקסלים ~50-70% מהמקסימום של הגלאי) ומינימום רקע^30,31.
    הערה: במהלך ההדמיה, ההספק הממוצע של אור העירור בקוטר 920 ננומטר נשמר בדיוק ב-30-50 mW במטרה. רמת הכוח הזו אושרה בניסויים פיילוטים על רקמות בעלי חיים שעברו ניתוחים זהים, מה שהבטיח קליטת אות יעילה למשך סריקה של עד 25 דקות תוך מזעור נזק פוטוגרפי ופלואורסצנציה.
פרוטוקול רכישת הדמיית סידן במהירות גבוהה
1. הגדר את סורק התהודה לרכישת פריימים במהירות גבוהה:
  גודל פריים: 512 × 512 פיקסלים (שדה ראייה טיפוסי: ~450 × 450 מיקרון, גודל פיקסל ~0.88 מיקרון)
  קצב פריימים: 7 פריימים לשנייה (fps) שהושגו באמצעות סריקה דו-כיוונית (קצב קו ~14 קילוהרץ). קצב זה מדגם כראוי את קינטיקת דעיכת GCaMP6f (τ~500 ms) תוך איזון יחס אות לרעש (SNR) ומזעור פוטו-הלבנה.
  זמן השהייה בפיקסלים: ~0.8 מיקרושניות (מותאם ל-SNR ב-7 הרץ).
2. התחל רכישת טיימלפס רציפה באמצעות תוכנות רכישה (למשל, ScanImage, Prairie View). רשמו תקופת בסיס של 5 דקות לפני תחילת גירוי EA כדי לקבוע את דינמיקת הפעילות העצבית לפני הגירוי (F₀).
3. בדיוק ב-t = 5 דקות, התחל גירוי EA ב-ST36 בזמן שההדמיה נמשכת ללא הפרעה. אסוף נתונים באופן רציף לאורך תקופת הגירוי של 20 דקות ל-EA. משך הסריקה הכולל = 25 דקות (1500 שניות, ~10,500 פריימים).
4. שמרו נתונים כסטאק רב-TIFF או פורמט בינארי קנייני עם חותמות זמן מוטמעות, המסונכרנות לפולסים של EA באמצעות ערוץ קלט TTL.
5. מעקב אחר יציבות עוצמת הלייזר וסטיית המיקוד (<2 מיקרון) בזמן אמת; עצור לרגע למיקוד מחדש רק אם מתרחשת סטייה משמעותית (למשל, >5 מיקרון), תוך ציון נקודת הזמן^32,33.
תיקון תנועה קפדני ורישום מרחבי
1. לאחר הרכישה, עבדו את ערימת ההדמיה הגולמית באמצעות NoRMCorre (תיקון תנועה לא קשיח) ב-MATLAB כדי להסיר ארטיפקטים מרחביים מתנועות מיקרו שנותרו (למשל, נשימה, דופק).
2. ראשית, חלק את הסטאק לתיקונים מרחביים חופפים (למשל, 64 × 64 פיקסלים, חפיפה של 50%). לכל תיקון, חשב תבנית ייחוס על ידי ממוצע מסגרות SNR גבוהות מתקופת הבסיס.
3. באמצעות קורלציה צולבת מבוססת פורייה, מחשבים הזזות תרגומיות X-Y עבור כל פריים ביחס לתבנית. יישם את ההזזות הללו באמצעות אינטרפולציה תת-פיקסלית.
4. לאחר מכן, התמודדו עם עיוותים לא קשיחים: מדמו עיוותים מקומיים בתוך טלאים באמצעות טרנספורמציות אפיניות חתיכותיות (תרגום + גזירה). עדכן את התבנית באופן איטרטיבי כדי לשפר את דיוק הרישום. פרמטרים מרכזיים:
  max_shift: 20 פיקסלים (מגבלה לתרגום)
  max_dev: 3 פיקסלים (סטייה מקסימלית שאינה קשיחה)
  bin_width: 50 פריימים (שידור זמני לעדכוני תבניות)
5. המחישו את יעילות התיקון על ידי בדיקת גרף המתאם בין פריים לפריים (אמור להתייצב קרוב ל-1.0 לאחר התיקון) ויצירת מפת הפרש הקרנת תמונה ממוצעת (לפני ואחרי התיקון). שמור את המערך המתוקן בתנועה לניתוח במורד הזרם. שלב זה קריטי לניתוח מדויק פיקסלי של חולפות סידן, במיוחד במהלך תנועות עדינות של גפיים המושרות על ידי EA.

4. ניתוח דינמיקה מרחבית-זמנית

מחסנית ההדמיה המתוקנת בתנועה עוברת סגמנטציה אוטומטית של נוירונים וחילוץ אותות באמצעות צינור Suite2p (v0.12.3) בפייתון. שלבי עיבוד מרכזיים כוללים:

זיהוי טביעת רגל מרחבית
1. ייסלו פירוק מטריצה לא שלילית מוגבלת (CNMF) כדי לפרק את המחסנית לרכיבים מרחביים.
2. אתחול אזורי עניין (ROIs) בגישה מבוססת קורלציה: מיזוג פיקסלים עם קורלציה מרחבית צולבת > 0.7 ו-SNR מקומי > 4 ל-ROI מועמדים. הבחין בין ROI סומטי לדנדריטים/אקסונים לפי גודל (קוטר 8-15 מיקרון) ומעגליות (סף קומפקטיות >0.6).
תיקון זיהום נוירופיל
1. לכל ROI, הגדר טבעת נוירופיל קונצנטרית (רדיוס פנימי: 1.5× רדיוס ROI, רדיוס חיצוני: 2.5× רדיוס ROI).
2. חישוב מקדם נוירופיל (r_neuropil) באמצעות רגרסיה של ריבועים מינימליים:
  F_corrected(t) = F_raw(t) - 0.7 × F_neuropil(t)
  (המקדם אומת אמפירית עבור עכברי Thy1-GCaMP6f).
דה-קונבולוציה של אותות
1. הסקת פעילות קפיצה באמצעות OASIS (דה-קונבולוציה רגולריזציה l₁) עם מודל רעש AR(2) כדי להעריך הסתברות S(t) של קוצים מעקבות ΔF/F:
  ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
  כאשר 'k' הוא גרעין הסידן החולף ו-ε הוא רעש גאוסיאני.
בקרת איכות
1. החריגו ROIs עם SNR <3, חפיפה מרחבית >30%, או קורלציה לנוירופילים >0.3. אימות ויזואלי מתבצע באמצעות Suite2p GUI³⁴.
  פעולות ספציפיות ואלמנטים מממשק מסופקים בקובץ משלים 1. קובץ ה-TIFF המתוקן בתנועה שנוצר למעלה הוזן ישירות לצינור Suite2p. בעוד שהסביבה המשולבת של Suite2p כוללת תיקון תנועה קשיח משלה, שלב פנימי מיותר זה הושבת מכיוון שכבר הוחל תיקון מדויק יותר לא-קשיח. ROIs נוירונים שהופקו אוטומטית ניתן למצוא בקובץ המשלים 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון מבני של קליפת S1 ופעילות עצבית בסיסית
התחלנו בקביעת בסיס מבני ופונקציונלי באיכות גבוהה לניסויי ההדמיה שלנו. ניתוח מורפולוגיית הרקמות חשף הבדלים מבניים ניכרים בין הכנות חלון גולגולתי שאינן מוכנות (איור 2A) לבין הכנות חלון גולגולתי שהוחל על ידי כיסוי (איור 2B). בעוד שיישום כיסוי החיצוני יצר ארטיפקטים קלים של דחיסה (ראשי חץ, איור 2B), הוא שמר ביעילות על שלמות המבנה הכוללת של א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לגשר על הפער הקריטי בהתבוננות בזמן אמת בהשפעות הקורטקס של אלקטרואקפונקטורה (EA), אנו מציגים פרוטוקול משולב מקיף המשלב השתלת חלון גולגולת כרונית לגישה אופטית, גירוי EA סטנדרטי, ודימות סידן דו-פוטוני אורך המיועד לקורטקס הסומטוסנסורי הראשוני (S1).

פרוטוקול משולב זה מציע מספר יתרונות ברורים על פני שיטות מסורתיות לחקר השפעות הקורטיקה של EA. ראשית, הוא מספק רזולוציה מרחבית-זמנית חסרת תקדים, ולוכד דינמיקות בקנה מידה של אלפיות שנייה של פעילות עצבית במאות נוירונים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82405550). אנו מודים לחברי מעבדת ג'אנג על הדיונים המועילים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
קרפרופן	MCE	לא זמין	5 מ"ג/ק"ג למשכך כאבים
מסגרת סטריאוטאקסית דיגיטלית	הנעה אחורית	קופף דגם 1900
מגרה אלקטרואקפונקטורה	HANS LH202 (פולסים דו-פאזיים בתדר 2/100 הרץ)	לא זמין	HANS LH202 (פולסים דו-פאזיים בתדר 2/100 הרץ)
איזופלוראן	הנעה אחורית	R510-22-10	רמת רפואי, נשא חמצן 100%
מערכת מיקרו-קידוח	הנעה אחורית		קרב קרביד 0.5 מ"מ, מקורר במי מלח
פובידון-יוד	MCE	HY-B2234	פתרון של 10%
ScanImage	ScanImage	https://scanimage.org/
סליין סטרילי	ביונטיאן	ST341-500ml	0.9% NaCl
מיקרוסקופ כירורגי	צייס	https://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html	10-40& הגדלה
עכברים טרנסגניים Thy1-GCaMP6f	סיגן	5523978	בן 8-12 שבועות, זכר/נקבה
מיקרוסקופ דו-פוטוני	ניקון A1MP	ניקון A1MP	לייזר Ti:Sapphire (גירוי 920 ננומטר)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Li, X., et al. A central and peripheral dual neuromodulation strategy in pain management of zoster-associated pain. Sci Rep. 14 (1), 24672(2024).
Xia, R., et al. Autonomic nervous system in bone remodeling: From mechanisms to novel therapies in orthopedic diseases. Orthop Surg. 17 (6), 1561-1576 (2025).
Arvanitidis, M., Falla, D., Sanderson, A., Martinez-Valdes, E. Does pain influence force steadiness? A protocol for a systematic review. BMJ Open. 11 (1), e042525(2021).
Urits, I., et al. An evidence-based review of galcanezumab for the treatment of migraine. Neurol Ther. 9 (2), 403-417 (2020).
Barbeau, E. J., Chauvel, P., Moulin, C. J., Regis, J., Liegeois-Chauvel, C. Hippocampus duality: Memory and novelty detection are subserved by distinct mechanisms. Hippocampus. 27 (4), 405-416 (2017).
Dannenberg, H., Young, K., Hasselmo, M. Modulation of hippocampal circuits by muscarinic and nicotinic receptors. Front Neural Circuits. 11 (7), 102(2017).
Shang, Q., et al. Erp evidence for consumer evaluation of copycat brands. PLoS One. 13 (2), e0191475(2018).
Shariff, S., et al. Advances in understanding the pathogenesis of epilepsy: Unraveling the molecular mechanisms: A cross-sectional study. Health Sci Rep. 7 (2), e1896(2024).
Wahl, A. S. State-of-the-art techniques to causally link neural plasticity to functional recovery in experimental stroke research. Neural Plast. 2018 (1), 3846593(2018).
Zheng, X. S., Yang, Q., Vazquez, A. L., Tracy Cui, X. Imaging the efficiency of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) doped with acid-functionalized carbon nanotube and iridium oxide electrode coatings for microstimulation. Adv Nanobiomed Res. 1 (7), 2000092(2021).
De Pasquale, F., et al. A cortical core for dynamic integration of functional networks in the resting human brain. Neuron. 74 (4), 753-764 (2012).
Stamatakis, A. M., et al. Miniature microscopes for manipulating and recording in vivo brain activity. Microscopy (Oxf). 70 (5), 399-414 (2021).
Gu, Z., Jamison, K., Sabuncu, M. R., Kuceyeski, A. Human brain responses are modulated when exposed to optimized natural images or synthetically generated images. Commun Biol. 6 (1), 1076(2023).
Li, J., et al. Pedot:Pss-based bioelectronics for brain monitoring and modulation. Microsyst Nanoeng. 11 (1), 87(2025).
Lee, C. R., Najafizadeh, L., Margolis, D. J. Investigating learning-related neural circuitry with chronic in vivo optical imaging. Brain Struct Funct. 225 (2), 467-480 (2020).
Kirwan, P., et al. Development and function of human cerebral cortex neural networks from pluripotent stem cells in vitro. Development. 142 (18), 3178-3187 (2015).
Gomez, J., Neco, P., Difranco, M., Vergara, J. L. Calcium release domains in mammalian skeletal muscle studied with two-photon imaging and spot detection techniques. J Gen Physiol. 127 (6), 623-637 (2006).
Sylte, O. C., Muysers, H., Chen, H. L., Bartos, M., Sauer, J. F. Neuronal tuning to threat exposure remains stable in the mouse prefrontal cortex over multiple days. PLoS Biol. 22 (1), e3002475(2024).
Imori, T., Matsuda, H., Tohjo, M., Kamata, Y. An experimental production of suppurative otitis media in dog, and a trial to evaluate the therapeutic effect of cefmetazole on this otitis media. Jpn J Antibiot. 35 (9), 2277-2287 (1982).
Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
Bray, M. A., et al. Cell painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 11 (9), 1757-1774 (2016).
Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
Fang, K., Cheng, W., Yu, B. Effects of electroacupuncture at varied frequencies on analgesia and mechanisms in sciatic nerve cuffing-induced neuropathic pain mice. J Mol Neurosci. 74 (4), 98(2024).
Hsiao, I. H., Liao, H. Y., Lin, Y. W. Optogenetic modulation of electroacupuncture analgesia in a mouse inflammatory pain model. Sci Rep. 12 (1), 9067(2022).
Han, J. S. Acupuncture: Neuropeptide release produced by electrical stimulation of different frequencies. Trends Neurosci. 26 (1), 17-22 (2003).
Zeng, L. T., et al. Study on optimization of image processing parameters of pneumoconiosis by DR. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 41 (12), 897-900 (2023).
Costa, F. F., et al. Identification of microRNAs as potential prognostic markers in ependymoma. PLoS One. 6 (10), e25114(2011).
Gazerani, P., Aloisi, A. M., Ueda, H. Editorial: Differences in pain biology, perception, and coping strategies: Towards sex and gender specific treatments. Front Neurosci. 15, 697285(2021).
Masamoto, K., Kanno, I. Anesthesia and the quantitative evaluation of neurovascular coupling. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1233-1247 (2012).
Korsunsky, I., et al. sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat Methods. 16 (12), 1289-1296 (2019).
Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: Flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (1), 13(2003).
Friedrich, J., et al. Multi-scale approaches for high-speed imaging and analysis of large neural populations. PLoS Comput Biol. 13 (8), e1005685(2017).
Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain Neurosci Adv. 1 (1), 2398212816689792(2017).
Yang, W., Yuste, R. Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Curr Opin Neurobiol. 50 (1), 211-221 (2018).
Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nat Commun. 8 (1), 2153(2017).
Pfeffer, C. K., Xue, M., He, M., Huang, Z. J., Scanziani, M. Inhibition of inhibition in visual cortex: The logic of connections between molecularly distinct interneurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1068-1075 (2013).
Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, e28728(2018).
Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
Godenschweger, F., et al. Motion correction in MRI of the brain. Phys Med Biol. 61 (5), R32-R56 (2016).
Hattori, R., Danskin, B., Babic, Z., Mlynaryk, N., Komiyama, T. Area-specificity and plasticity of history-dependent value coding during learning. Cell. 177 (7), 1858-1872.e15 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

הדמיית דינמיקה מרחבית-זמנית של נוירוני קורטקס סומטוסנסורי במהלך דיקור אלקטרואקופונקטורה באמצעות הדמיה דו-פוטונית ב-vivo

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles