מאמר שיטה

אינטרפרומטריית שכבה ביולוגית לחקירת קישור בין מעכבי חלבון ממברנה: מוטנט TACAN ו-GsMTx4 כמערכת מודל

226 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69348

⸱

8 במאי 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לאופטימיזציה וביצוע ניסויי אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) לחקר אינטראקציות חלבון-ליגנד ממברנה עבור חלבוני ממברנה ממוססים בדטרגנטים. באמצעות האינטראקציה בין מוטנט M207A TMEM120A לבין מעכב הפפטידים GsMTx4 כמודל, תהליך עבודה זה מפרט הכנת חלבונים, טעינת חיישנים ביולוגיים ואיסוף נתונים קינטיים.

תקציר

אינטרפרומטריית שכבת ביולוגית (BLI) היא טכניקה ביופיזיקלית יעילה המאפשרת ניתוח כמותי בזמן אמת של אינטראקציות ביומולקולריות. למרות שהם משמשים לעיתים קרובות לחלבונים מסיסים, יישומם לחלבוני ממברנה נותר מאתגר בשל הידרופוביות ותלות בחומרי ניקוי. מחקר זה מציג פרוטוקול BLI אופטימלי לאפיון אינטראקציות בין חלבון ממברנה מומס בדטרגנט למעכב פפטידים.

כמערכת מודל, פפטיד Grammostola mechanotoxin 4 (GsMTx4) נבדק מול מוטנט חלבון ממברנה רב-תכליתי TMEM120A M207A. הווריאנט TMEM120A המסומן ב-FLAG הושתק על חיישני אנטי-FLAG - המייצגים מערכת מבוססת תגיות אך ללא תוויות פלואורסצנטיות ואנזימיות - ונחשף לדילול סדרתי של GsMTx4 כדי למדוד שיעורי אסוציאציה ודיסוציאציה.

הפרוטוקול משלב אופטימיזציה של חומרי ניקוי באמצעות Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG) ואפיון משלים באמצעות פוטומטריית מסה ופלואורימטריה סריקה דיפרנציאלית (DSF). זרימת עבודה זו מאפשרת מדידות קינטיות אמינות ותואמת לסינון בקצב ביניים. הגישה עשויה להיות רלוונטית למערכות חלבון-ליגנד ממברנה אחרות שבהן נשמרת יציבות חומר הניקוי. בסך הכול, המחקר מדגיש פרמטרים מרכזיים המשפיעים על יעילות הקיבוע ואספקת האנליטים, ותומכים בשימושיות הפוטנציאלית של BLI בפרופיל מעכבים ובמחקרים מכניים של אינטראקציות חלבוני ממברנה.

מבוא

חלבוני ממברנה ממלאים תפקידים מרכזיים בתהליכים פיזיולוגיים חיוניים, כולל העברת אותות, העברת יונים ומטבוליטים, וארגון ממברנה. בהתחשב במעורבותם בתקשורת תאית ובהומאוסטזיס, הם מהווים חלק משמעותי ממטרות התרופות בפיתוח קליני. הבנת האינטראקציות בין חלבון לממברנה וליגנד היא קריטית להבהרת תפקוד ולהנחיית עיצוב טיפולי. עם זאת, האופי האמפיפתי של חלבונים אלה ותלותם בסביבות ליפידיות מציבים אתגרים משמעותיים לטיהור, ייצוב ואפיון ביופיזי.

תהודה של פלזמון משטח (SPR) וקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) הן טכניקות בשימוש נרחב לחקר הקינטיקה והתרמודינמיקה של אינטראקציות חלבון-ליגנד בין ממברנה 1,2. כאשר הן מותאמות כראוי, שתי השיטות יכולות לספק תובנות כמותיות מפורטות, אפילו עבור חלבוני ממברנה ממוססים בדטרגנט או מעובדים. תרמופורזה בקנה מידה מיקרו (MST) יושמה גם בהצלחה להערכת זיקות קישור בתנאים קרובים לילידים, במיוחד עבור חלבוני ממברנה³. עם זאת, גישות אלו יכולות להיות מוגבלות על ידי צריכת דגימות משמעותית, קשיים בשמירה על יציבות חלבוני ממברנה, או תאימות מוגבלת עם מערכות דטרגנטיות מסוימות.

אינטרפרומטריית שכבת ביולוגית (BLI) היא טכניקה אופטית בזמן אמת המאפשרת מדידה כמותית של אינטראקציות ביומולקולריות, כולל כאלה הכוללות חלבוני ממברנה ממוססים בדטרגנט או אמפיפול. יחד עם הטכניקות הביופיזיקליות שהוזכרו קודם, BLI מציע פלטפורמה יעילה המאפשרת מדידה ישירה של קינטיקת קישור, כולל אסוציאציה (kon), דיסוציאציה (koff) וקבועי דיסוציאציה בשיווי משקל (KD), עם ריכוזי דגימה נמוכים יותר והתאמה פשוטה לחלבוני ממברנה ממוססים בדטרגנטים או בננו-דיסקים. ראוי לציין גם כי, כמו כל טכנולוגיה ביופיזיקלית, ל-BLI יש מגבלות משלה, שיוזכרו בסעיף הדיונים.

BLI מזהה שינויים בדפוס ההפרעות של אור לבן המוחזר מקצה חיישן ביולוגי, עם שינויים בעובי האופטי התואמים לאירועי קישור ביומולקולריים. הזזות אלו (Δλ, בננומטר) נרשמות כחיישנים והן פרופורציונליות למסה הקשורה על פני החיישן. BLI יושם באופן נרחב לאינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-ליגנד (כולל פפטידים ומולקולות קטנות) ומתאים לטווחי זיקה מננומולר ועד מיקרומולר4. הגמישות שלו, צריכת הדגימה הנמוכה וההגדרה הפשוטה יחסית הופכים אותו לכלי פוטנציאלי יתרון לחקר חלבוני ממברנה ממוססים בדטרגנט 5,6,7.

מחקר זה מציג פרוטוקול BLI לאפיון האינטראקציה בין TMEM120A M207A, חלבון ממברנה, לבין גרמוסטולה מכנוטוקסין 4 (GsMTx4), מעכב פפטידים. TMEM120A הוצע כערוץ יונים רגיש למכנו, המעורב בזיהוי מכני של כאב8; עם זאת, פעילות תערובת היונים שלה נותרה שנויה במחלוקת. מחקרים רבים דיווחו על היעדר זרמים רגישים למכאנוס כאשר TMEM120A מתבטא במערכות הטרולוגיות כמו HEK293 או תאי CHO 1,9,10,11. עד כה, יותר מארבעה מחקרי קריו-EM פתרו את מבנה TMEM120A במצב סגור, ולא נצפה קונפורמציה פתוחה 1,9,10,11.

סימולציות דינמיקה מולקולרית וניתוחים אלקטרופיזיולוגיים מצביעים על כך שמתיונין 207 (M207) בבני אדם מסוג בר TMEM120A עשוי לשמש כמחסום שער בתוך מסלול הולכת היונים11. הוכח כי מוטציה של שארית זו לאלנין (M207A) מגבירה את חדירות היונים, ככל הנראה על ידי שינוי אריזת הליקסים והזזת שרשראות צד הידרופוביות כמו Phe223. כתוצאה מכך, מוטנט M207A נבחר למחקרי קישור עם GsMTx4.

GsMTx4 הוא פפטיד משני גייטינג שמקורו בארס עכביש ומעכב תעלות קטיון רגישות למכנות. הוא מורכב מרצף של 32 חומצות אמינו ומשקלו המולקולרי של 4 עד 5 קילו-דלטון, כולל ערוצי פיזו ו-TRP, בעיקר על ידי אינטראקציה עם שכבת הליפידים במקום חסימה ישירה של נקבובית12,13. מחקרים קודמים הראו כי GsMTx4 מפחית את פעילות TMEM120A במערכות דו-שכבתיות מלאכותיות8. במבחני ה-BLI, מוטנט ה-TMEM120A M207A הושתק על חיישני אנטי-FLAG ונחשף לריכוזים הולכים וגדלים של GsMTx4, מה שאפשר מדידת קצב אסוציאציה (kon) וקצב דיסוציאציה (kכבוי).

עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט לאופטימיזציה של חומרי ניקוי וניתוח קינטי באמצעות אינטרפרומטריית שכבת ביולוגית (BLI). למרות של-BLI יש מגבלות מסוימות, כגון תופעות פוטנציאליות מעומס יתר על חיישנים או השפעות הובלת מסה, והפחתת ההתאמה לאינטראקציות מהירות בקצב אסוציאציה (kon), היא שיטה שימושית לחקר אינטראקציות חלבון-ליגנד בין ממברנה בתנאים ממוססים מבוקרים. הפרוטוקול מתאים למערכות עם זיקות קשירה בינונית עד נמוכה (בדרך כלל בטווח הננומולרית עד המיקרומולרית) וניתן להתאים למטרות הידרופוביות אחרות כאשר מיושמים בקרים ותנאי בופר מתאימים.

פרוטוקול

1. טיהור חלבונים ואופטימיזציה של דגימות

  1. תרבית תאים והעברה
    1. גדלו תאי תלייה HEK293T/SF17 במדיום ללא סרום עם תוספת של 20 מ"מ ל-L-גלוטמין במדגם ניעור בטמפרטורה של 120 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס, 80% לחות ו-8% CO₂. לשמור על תאים על ידי מעבר עד למעבר החמישי; מאפשרים לתאים להגיע לצפיפות של כ-5 × 10⁶ תאים/מ"ל.
    2. העברו את התאים עם פלסמיד TMEM120A M207A (טרמינל N FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) בווקטור pCDNA3.1 באמצעות מגיב טרנספקציה מסחרי לפי הוראות היצרן (ראו טבלת החומרים).
    3. הגלולה עברה תאים בצנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C. אחסן את כדור התא בטמפרטורה של מינוס 80°C עד לטיהור.
  2. ניתוק תאים ומסיסות (איור 1)
    1. החזירו כדור תא בנפח 30 מ"ל בבופר מסיסות המכיל 100 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין אתןסולפוניק חומצה (HEPES), pH 7.8; 300 מ"מ NaCl; 0.5% (w/v) או 4.98 מ"מ לוריל מלטוז ניאופנטיל גליקול (LMNG); קוקטייל מעכב פרוטאז אחד; 50 מיקרוגרם DNase I; 10% (v/v) גליצרול.
    2. לייז את התאים על ידי אולטרסוניקה בעוצמה של 25% באמצעות מחזור פולס של 20 שניות דלוק/20 שניות כבוי למשך 15 דקות, תוך שמירה על הדגימה על קרח כדי למנוע התחממות יתר.
    3. הבהיר את הליזאט באמצעות צנטריפוגציה ב-25,800 × גרם למשך 45 דקות בטמפרטורה של 4°C.
  3. טיהור אפיניטי באמצעות שרף אנטי-FLAG
    1. שרף M2 אנטי-FLAG מאוזן עם בופר שיווי משקל המכיל 25 מ"מ HEPES, pH 7.8; 200 mM NaCl; 0.05% (עם כוכב) או 0.4975 מילימטר LMNG; 10% (v/v) גליצרול.
    2. דגרו את הסופרנטנט המונק עם שרף מאוזן למשך 2 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על נדנדה (נדנם).
    3. שטוף את השרף פעמיים עם בופר כביסה המכיל 25 מ"מ HEPES, pH 7.8; 150 mM NaCl; 0.05% (עם כוכב) או 0.4975 מילימטר LMNG; 10% (v/v) גליצרול.
    4. מפלט את החלבון הקשור באמצעות בופר שחרור המכיל 25 מ"מ HEPES, pH 7.8; 400 mM NaCl; 0.001% (w/v) או 0.00995 mM LMNG; 10% (v/v) גליצרול; פפטיד FLAG של 200 מיקרוגרם/מ"ל.
  4. כרומטוגרפיה של ריכוז והוצאת גודל (SEC)
    1. ריכזו את החלבון המושחרר ל-~500 מיקרוליטר באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם חיתוך של 30 קילו-דלטון.
    2. בצע SEC באמצעות עמודת ההחרגה עם גודל ייחוס המאוזן עם HEPES של 25 mM, pH 7.8; 200 mM NaCl; 0.00015% (ביחס ל-V) או 0.00149 mM LMNG.
    3. אספו ואחסו את חלקי השיא התואמים לחלבון היעד.
    4. ריכוז חלקיקים מרוכזים לריכוז סופי ~3 מ"ג/מ"ל. לאחר טיהור זיקות, יש לאשר כי מונומר החלבון TMEM120A M207A מופיע בעוצמה של כ-43 קילו-דלטון ב-SDS-PAGE (איור 2A). ל-SEC, יש לוודא שהחלבון המטוהר ב-LMNG יוצא כשיא מונודיספיז התואם לכ-150 קילו-דלטון, המייצג את הדימר TMEM120A M207A יחד עם מיצלה הדטרגנט של LMNG (איור 2B).
      הערה: לעיתים, רצועת החלבון המונומרי עשויה להופיע סביב 50 קילו-דלטון, דבר נפוץ בחלבוני ממברנה מסיסים בדטרגנט, שכן הרתחת דגימות חלבון ממברנה אינה טיפוסית.

2. ניתוח יציבות תרמית באמצעות פלואורמטריה סריקה דיפרנציאלית ננו (NanoDSF)

  1. לדלל את חלבון M207A TMEM120A המטוהר ל-0.15 מ"ג/מ"ל בבופר SEC (25 מ"מ HEPES, pH 7.8, 200 מ"מ NaCl, 0.00015% LMNG).
  2. טעין 10 מיקרוליטר מכל דגימה לתוך נימים רגישים מאוד.
  3. הרץ את מבחן ההזזה התרמית על מכשיר NanoDSF עם רמפת טמפרטורה מ-25 מעלות צלזיוס ועד 90 מעלות צלזיוס.
  4. השתמש בתוכנה תואמת כדי להגדיר את הבדיקה ולבצע ניתוח אוטומטי.
  5. אשר כי עקומת מעבר תרמי בודדת (Tm) נראית, המצביעה על אירוע התפתחות שיתופי (איור 3).

3. פוטומטריית מסה לקביעת מצב אוליגומרי

  1. הכינו דגימה מדוללת ל-80 ננומטר בבופר SEC (25 mM HEPES, pH 7.8, 200 mM NaCl, 0.00015% LMNG).
  2. הנח את הדגימה בשקופיות תואמות פוטומטריית מסה מנוקות מראש.
  3. אסוף נתונים באמצעות הגדרות סטנדרטיות וכייל לפי תקני חלבון.
  4. עבד נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ליצירת היסטוגרמות התפלגות מסה (איור 4A-C).

4. פרוטוקול אינטרפרומטריה ביולייר (BLI)

הערה: פרוטוקול זה מתאר מבחן קינטי BLI שנועד לחקור אינטראקציות בין TMEM120A M207A עם תגית FLAG לבין ליגנדים כמו GsMTx4, תוך שימוש בפורמט מיקרופלט 384 בארות. למרות שפותח עבור TMEM120A, זרימת העבודה יכולה להיות מותאמת לחלבוני ממברנה אחרים. כל הניסויים בוצעו באמצעות פלטפורמת אינטרפרומטריה אופטית עם חיישני ביוחיישן FLAG לשיבוט TMEM120A M207A עם תגית FLAG. מיקרופלטה שחורה עם 384 בארות שימשה עם בופר כרומטוגרפיה אופטימלית של SEC המכיל 25 מ"מ HEPES, 200 מ"מ NaCl, 0.00015% (עם וולט) LMNG, ו-0.0005% טווין-20, pH 7.8. Tween-20 נכללה כדי למזער קשירה לא ספציפית. ריכוז החלבון נשמר ב-250 ננומטר, וכל הבדיקות בוצעו בשכפול כדי להבטיח שחזוריות.

  1. שיקולי עיצוב מבחן
    1. איזון טמפרטורה
      1. לפני תחילת מבחן ה-BLI, יש לאזן את כל רכיבי הבדיקה – כולל בופרים, דגימות וגשושי חיישנים ביולוגיים – לטמפרטורת החדר (כ-20-25 מעלות צלזיוס). במהלך איסוף הנתונים, שמרו על טמפרטורת המבחן ב-30 מעלות צלזיוס, מה שמומלץ לניתוחים קינטיים לאופטימיזציה של יציבות חלבונים, קשירת ליגנדים ויכולת שחזור.
        הערה: שלב האיזון הזה מבטיח פרופילים קינטיים עקביים ומפחית ארטיפקטים הנגרמים מתנודות טמפרטורה במהלך הניסוי. יש לאפשר מספיק זמן (לפחות 10-15 דקות) לכל המגבים והחיישנים הביולוגיים להגיע לשיווי משקל תרמי לפני תחילת הבדיקה.
    2. הידרציה והתחדשות חיישנים
      1. הידרציה של חיישני FLAG חדשים ב-250 מיקרוליטר של בופר תואם BLI (בופר SEC המכיל 25 מ"מ HEPES, 200 מ"מ NaCl, 0.00015% עם LMNG ו-0.0005% טווין-20, pH 7.8) בפלטת Max למשך מינימום של 10 דקות לפני השימוש.
        הערה: יש לטפל בחיישנים ביולוגיים בזהירות עם פינצטה נקייה וללא אבק כדי למנוע זיהום, שעלול להפריע לקליטת האות ולהוביל לתוצאות לא עקביות. לשימוש חוזר בחיישן, יש לבצע רגנרציה באמצעות Q buffer (0.3 M גליצין, pH 3.8). הידרציה והתחדשות נכונות הם קריטיים לשמירה על ביצועי חיישנים ושחזוריות, במיוחד בעבודה עם חלבוני ממברנה ממוססים בחומר ניקוי, הרגישים לתנאי סביבה.
    3. טיפול בבופר
      1. הימנע מבועות אוויר בעת הפיזור נוזלים, שכן הן עלולות להפריע לקליטת אות אופטי.
    4. הרכב ועקביות הבופר
      1. השתמש בבופר שממזער אינטראקציות לא ספציפיות תוך שמירה על תפקוד החלבון. עבור TMEM120A M207A, יש להכין את הבופר המכיל 25 מ"מ HEPES, 200 מ"מ NaCl, 0.00015% (ללא זכויות) LMNG, 0.0005% (ביחס ל-Tween 20), pH 7.8.
    5. קיבוע חלבונים
      1. אופטימיזציה של עומס הליגנדים כדי להגיע לרוויית חיישנים של 50-80%. השתמש בריכוז קבוע של חלבון ב-250 ננומטר, עם משך טעינה טיפוסי של כ-120 שניות. טעין את TMEM120A M207A (250 ננומטר) עם תגית FLAG על החיישן הביולוגי למשך 120 שניות כדי להגיע לרוויה של 50-80%.
      2. ודאו שאות החיישן הביולוגי מגיע ל-50 - 80% מקיבולת הקישור המקסימלית בשלב הטעינה.
        הערה: אותות מתחת ל-50% עשויים להעיד על חוסר יישור חלבוני לא מספק, בעוד שאותות מעל 80% עלולים לגרום למגבלות הובלת המסה או להפרעה סטרית, מה שעלול לפגוע במדידות קינטיות.
      3. כדי להעריך השפעות פוטנציאליות של העברת מסה, בצע ניסוי בקרה שבו ריכוז האנליטים (למשל, 100 ננומטר GsMTx4) נשמר קבוע תוך שינוי רמות העומס של TMEM120A-M207A על חיישני FLAG (איור משלים S1).
        הערה: מדידות קינטיות מאוחרות יותר – כולל אסוציאציה, דיסוציאציה, התאמות קשירה גלובליות, וקביעת kעל ו-k off – לא היו שונות באופן מובהק מאלו שהתקבלו במבחן הראשי. תוצאה זו מצביעה על כך שעומס TMEM120A בטווח של 50-80% אינו יוצר ארטיפקטים משמעותיים של הובלת מסה, מה שמאשר שרמת העומס של הביוחיישנים מתאימה לניתוח קינטי אמין.
    6. הערכת KD
      1. קבעו את הזיקה הקשירה (KD) על ידי בדיקת ריכוזי אנליט (GsMTx4) של 0 מיקרומ', 5 מיקרומ', 10 מיקרומ', 20 מיקרומ', 30 מיקרומ', 50 מיקרומום ו-100 מיקרומון.
    7. בקרות אות רקע
      1. לכלול בקרות מתאימות לחיסור מדויק של אותות רקע ולהבטחת מדידות קינטיות אמינות.
      2. השתמש בחישוש FLAG ייחוס כדי להתחשב בקישור או סטייה לא ספציפית שעלולה להתרחש במהלך הבדיקה.
        הערה: גשוש ייחוס זה לא אמור להיות משותק את החלבון היעד, והוא משמש כקו בסיס לתיקון האות המתקבל מהגשואים המכילים דגימה.
      3. חסר את אות ההתייחסות מאות הדגימה כדי לנתח רק אינטראקציות ספציפיות בין TMEM120A M207A עם תגית FLAG לבין האנליטים.
        הערה: ודאו שגלאי FLAG הייחוס מציג אות מינימלי לאורך כל הבדיקה. קו בסיס יציב ונמוך מצביע על קישור לא ספציפי זניח. אם אות ההתייחסות משתנה או עולה, יש להעריך מחדש את הרכב הבופר, טיפול בגלאי או להכין דגימה כדי להפחית אינטראקציות לא ספציפיות לפני המשך ניתוח קינטי.
  2. קונפיגורציה של פרמטרי מבחן בסיסיים לניתוח קינטי
    1. הגדר את תדירות איסוף הנתונים ל-5 הרץ כדי לאסוף 5 נקודות נתונים לשנייה (מומלץ לכל בדיקות הקינטיקה).
    2. בחר לוח 384 בארות כפורמט הלוחות.
    3. הגדר את מהירות השייקר ל-1,000 סל"ד ואת הטמפרטורה בין הסביבה ל-30 מעלות צלזיוס (30 מעלות צלזיוס ששימשו בניסוי זה לתוצאות קינטיות מיטביות).
  3. הגדר את מערכת הלוחות.
    1. נווט ללשונית הגדרת הלוחות והגדר הקצאות בארות הן לפלטת 384 בארות והן לפלטת מקסימום.
    2. הקצה פונקציות באר על לוח ה-384 באר.
      הערה: הסמלים וההערות ששימשו הן לפלטת 384 בארות והן ללוח מקס מסוכמים בטבלה המשליפה S1.
      1. תייג בארות לפי התפקיד: בופר, חלבון (טעינה), ליגנד (דגימה).
      2. יש להוסיף הערות לבארות טעינת חלבון בריכוז (למשל, 250 ננומטר) לבדיקות קינטיות.
        הערה: תיוג מדויק חיוני לחישוב kעל ו-KD (ראו איור משלים S2A).
    3. הגדר את מפת לוח ה-Max (לוח החישוש).
      1. הקצה חיישנים ביולוגיים לבארות מתאימות.
      2. אם מתוכנן התחדשות גשושים, הקצה בארות למאגרי התחדשות ונטרול. יש לסמן בבירור את הבארות הללו בתוכנה כדי להבטיח אוטומציה תקינה במהלך ההתחדשות (ראו טבלה משלימה S2).
        הערה: מאגר הבדיקה כלל 25 מ"מ HEPES (pH 7.8), 200 מ"מ NaCl, 0.00015% (ללא v) LMNG, ו-0.0005% (v/v) טווין-20. שלב ההתחדשות של חיישני הביוסנסור נגד FLAG בוצע באמצעות בופר Q המכיל 0.3% גליצין (pH 3.8), ואחריו שלב ניטרול עם בופר הבדיקה (25 מ"מ HEPES, 200 מ"מ NaCl, 0.00015% LMNG, ו-0.0005% Tween-20, pH 7.8).
  4. בחר בלשונית צעדי הבדיקה .
    1. עבור ללשונית שלבי הבדיקה כדי להגדיר את תהליך הבדיקה הקינטי. יש לציין מיקומי בארות לכל שלב בדיקה, כולל קו בסיס, עומס חלבונים, אסוציאציה ודיסוציאציה (ראו איור משלים S3).
    2. בחר את סוג השלב המתאים מתפריט הנפתח. ודא ששלבי האסוציאציה והדיסוציאציה מסומנים כראוי לניתוח קינטי מדויק.
    3. הזן את משך הזמן לכל שלב בשניות כדי להגדיר זמני חשיפה לכל שלבי האינטראקציה.
      1. קבע את משך הצעד הבסיסי כדי לאפשר איזון חיישנים לפני טעינת חלבון (60 שניות).
      2. קבע את משך שלב טעינת החלבון כדי להשיג את רמות הקיבוע הרצויות של ליגנדים (60 שניות) (איור 5).
      3. הגדר את משך שלב האסוציאציה כדי לאפשר קישור אנליטי מספק (300 שניות) (איור 5).
      4. הגדר את משך שלב הדיסוציאציה כדי ללכוד כראוי את קינטיקת הניתוח (600 שניות) (איור 5).
    4. הגדר את מהירות השייקר (RPM) לכל שלב כדי לשמור על מיקס עקבי ואיכות נתונים אופטימלית (1,000 סל"ד).
  5. שלב יישור וסינון (ראו איור משלים S4 ואיור משלים S5)
    1. בצע תיקון נתונים גולמי על ידי התאמת טווח הנתונים לפי הצורך כדי להסיר ארטיפקטים מצעדים קינטיים.
    2. כדי ליישר את ציר ה-Y, יישר את הנתונים בתחילת שלב האסוציאציה על ידי בחירת אסוציאציה תחת יישור סוג שלב והפעלת אפשרות התחלה .
    3. הפעל את אפשרות תיקון אינטרסטפ כדי לשמור על רציפות בין שלבים במהלך בדיקות קינטיות סטנדרטיות.
    4. סינון: החלקת נתונים כדי להפחית רעש אות מבלי לעוות מגמות. בחר מעובד כדי להשוות נתונים מוחלקים עם אותות גולמיים.
  6. קבע שלב ייחוס (ראה איור משלים S6).
    1. קבע גלש ייחוס על ידי בחירת גלש הייחוס ולחיצה על כפתור Ref. Probe .
    2. בחר גלאי דגימות על ידי לחיצה על מספרי העמודות המתאימים לגלאי הדגימה.
    3. כדי להגדיר את פונקציית החיסור, פתח את עורך הנוסחאות, לחץ על עריכת נוסחה, והגדר את פונקציית החיסור להסרת הרקע.
    4. תצוגת טבלת סקירה כדי לוודא שחיסור ההפניה יושם כראוי.
  7. שלב חיבור הקשירה
    1. נווט ללשונית ההתאמה והגדר פרמטרי ניתוח (איור משלים S7).
    2. בחירת נתונים: כולל גם שלבי אסוציאציה וגם שלבים של פירוק עבור התאמה קינטית מקומית. החריגו חריגים ידנית אם הם מציגים התאמת עקומה לקויה או אות לא יציב.
    3. בחירת מודל קישור: בחר את מודל הקישור 1:1 שיתאים לנתונים אלא אם נצפית התנהגות מורכבת. סקירה של שכבות עקומות ושאריות כדי לאמת את התאמת המודל.
    4. אסטרטגיית התאמה: בחר אחת מהאסטרטגיות הבאות בהתאם לאיכות הנתונים ולמטרות הניסוי:
      1. מקומי: מתאים לכל ריכוז אנליט בנפרד, ומאפשר הערכה עצמאית של קינטיקת אסוציאציה ודיסוציאציה.
      2. גלובלי: מתאים לכל ריכוזי האנליטים בו-זמנית באמצעות סט אחד של פרמטרים קינטיים, ומספק מודל כולל למערך הנתונים.
      3. מלא: מתאים הן לשלב אסוציאציה והן לשלבים של דיסוציאציה ברחבי העולם בכל הריכוזים.
      4. חלקי: מתאים רק לשלב האסוציאציה, ומתעלם מהדיסוציאציה.
        הערה: נתוני BLI נותחו באמצעות מודל קישור לנגמייר 1:1 עם התאמה מקומית מלאה. התאמה מקומית מבטיחה שכל ריכוז אנליט יטופל באופן עצמאי, ומספק ייצוג מדויק של קינטיקת האסוציאציה תוך מזעור ארטיפקטים מהטרוגניות בשלב הדיסוציאציה. גישה זו נמנעת מהתאמת יתר באזורים עם אותות משתנים או לא יציבים, ומאפשרת הערכה אמינה יותר של פרמטרים קינטיים (kדלוק ו-kכבוי) (טבלה 1 וטבלה 2).
  8. ניתוח קינטי
    1. סקירת עקומות מותאמות ושאריות: בחנו את העקומות המותאמות ואת השאריות המתאימות להערכת איכות ותוקף המודל. אשר שהשאריות מתפלגות באקראי סביב אפס ללא סטיות שיטתיות (ראו איור 4E לשאריות מייצגות).
    2. הוצאת נתונים לא מתאימים כראוי: הסרת ריכוזי אנליטים שמציגים אותות שטוחים, רועשים או לא אמינים בדרך אחרת כדי לשפר את דיוק המודל הכולל.
      הערה: לדוגמה, ריכוז 10 מיקרומום הוצא מההתאמה עקב חפיפה עם מערך הנתונים של 5 מיקרומטר, מה שעלול לעוות את הערכת הפרמטרים הקינטיים (ראו איור 6A,B).

תוצאות

המוטנט TMEM120 M207A הובע בתאי תלייה HEK293SF-17 באמצעות וקטור pCDNA3.1 המקודד תג FLAG בקצה N איור 1. טרנספקציה חולפת אפשרה ביטוי חלבונים רקומביננטיים. לאחר קצירת התא, חלבוני ממברנה הומסו ב-LMNG (LMNG), חומר ניקוי לא יוני המתאים לשמירה על מסיסות חלבון ממברנה.

החלק המומס עבר טיהור אפיניטי באמצעות שרף אנטי-FLAG M2. השרף נשטף עם בופר המכיל 0.01% LMNG להסרת חלבונים לא קשורים במיוחד, ו-M207A TMEM120 נשטף בבופר המכיל 0.001% LMNG. ההסרה רוכזה באמצעות מסננים צנטריפוגליים עם חיתוך משקל מולקולרי של 30 קילו-דלטון או 100 קילו-דלטון, בהתאם לתפוקת הדגימה. טיהור נוסף בוצע באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל (SEC). שלב ה-SEC האחרון בוצע בבופר שמכיל 0.00015% LMNG, ויצר פרופיל שחרור מונודיספיזרי התואם להכנת חלבון הומוגני ויציב המתאים לניתוחים מבניים ותפקודיים נוספים (איור 2B).

אופטימיזציה ואפיון ביופיזי של TMEM120 M207A עם תגית FLAG מסוכמים באיור 2. הביטוי והטיהור אושרו על ידי SDS-PAGE, שהראה רצועה אחת בכ-50 קילו-דלטון. הנדידה שנצפתה הייתה מעט מעל המשקל המולקולרי הצפוי של הצורה המונומרית (איור 2A), ככל הנראה בגלל הדגימה הלא מבושלת לפני האלקטרופורזה. הכרומטוגרמה של SEC הציגה שיא סימטרי יחיד שנפלט בנפח התואם למסה מולקולרית נראית לעין של כ-150 kDa ב-LMNG של 0.00015% (עם ז) (איור 2B), בהתאם לדימר TMEM120A M207A במיצלות של דטרגנט LMNG. התנהגות ההסרה הזו מציגה אוכלוסיית חלבונים הומוגנית ומונודיספוזית, מה שהופך אותה למתאימה לאפיון ביופיזי במורד הזרם.

תכונות המיצלות של דטרגנט של LMNG בתנאי בופר ניסיוניים נותחו באמצעות פוטומטריית מסה. המדידות בוצעו בבופר SEC עם ריכוזים משתנים של LMNG בהיעדר חלבון, כדי להעריך את תרומת המיצלות של חומרי הניקוי למסה המולקולרית השקופה. ב-0.001% (w/v) LMNG, ריכוז מעל ריכוז המיצל הקריטי (CMC), השיא הדומיננטי זוהה בכ-69 קילו-דלטון, התואם למיצלות LMNG בלבד ללא חלבון נלווה (איור 4A). כאשר ריכוז ה-LMNG ירד ל-0.0001% (w/v), מתחת ל-CMC, המין העיקרי עבר ל-~48 kDa, מה שמעיד על נוכחות של אגרגטים קטנים יותר של LMNG או הרכבות תת-מיסלריות ללא חלבון (איור 4B). בהמשך (איור 4C), TMEM120A M207A דולל בבופר SEC המכיל ריכוזים שונים של LMNG כדי להעריך את מצבו האוליגומרי באמצעות פוטומטריית מסה. ב-0.00001% LMNG (~20x מתחת ל-CMC, מג'נטה), נצפה שיא דומיננטי בכ-42 kDa, התואם למונומבר של TMEM120A M207A. ב-0.00015% LMNG (~10x מתחת ל-CMC, כחול), האוכלוסייה העיקרית ב~86 kDa העידה על נוכחות דימרים. העלאת ריכוז ה-LMNG ל-0.001% (~2x מעל ה-CMC, כתום) הובילה למין עיקרי ~150 kDa, בהתאם לקומפלקסים של חלבון-דטרגנטים. ב-0.002% LMNG (~4x מעל ה-CMC, ירוק), זוהתה התפלגות רחבה שמרכזתה כ-180 kDa, המייצגת הרכבות רחבות יותר הקשורות למיסלה או אוליגומרים מסדר גבוה יותר. תוצאות אלו מראות כי ריכוז ה-LMNG בתוך בופר ה-SEC משפיע מאוד על מצב האוליגומרי הברור של TMEM120A M207A, כאשר שיווי המשקל המונומר-דימר נצפה מתחת ל-CMC ויצירת קומפלקס דטרגנטי-חלבון השולטת מעל ה-CMC.

היציבות התרמודינמית של TMEM120A M207A שנאספה מהשיא הראשי של ה-SEC ונשמרה בבופר SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.00015% (w/v) LMNG, pH 7.8) הוערכה באמצעות ניתוח דנאטורציה תרמית. החלבון הציג נקודת מפנה של כ-46 מעלות צלזיוס, התואמת לטמפרטורת ההתכה שלו (Tm) בתנאים אלו הממוססים בחומרי ניקוי. ערך T m זה מצביע על יציבות תרמית בינונית, מה שמרמז ש-TMEM120A M207A שומר על קונפורמציה מקופלת כראוי בתוך המיצלות של LMNG אך עשוי להתחיל להיפתח או להצטבר בטמפרטורות גבוהות יותר.

אינטרפרומטריית שכבה ביולוגית (BLI) מראה זיקת קישור μM של TMEM120A M207A ל-GsMTx4T. העקבות באיור 5 ממחישים חמישה שלבים ניסיוניים: (1) קו בסיס, (2) TMEM120A טעינת דגימה ב-M207A, (3) קו בסיס להסרת קישור לא ספציפי ועודף TMEM120A M207A, (4) אסוציאציה, ו-(5) דיסוציאציה. הסטת אורך גל (nm) מתוארת לאורך זמן עבור ריכוזים עולים של GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 ו-100 מיקרומון) האינטראקציה עם TMEM120A M207A המשותק.

במהלך קו הבסיס הראשוני (שלב 1), האות נשאר יציב, ואישר שיווי משקל חיישנים בבופר. TMEM120A עומס M207A (שלב 2) יצר עלייה אופיינית באות, התואמת ~50-80% רוויית גלאי על פני חיישנים. שלב הטעינה הראה תגובה מעט מעוקלת ולא רמה חדה, מה שעשוי לשקף מגבלה חלקית של הובלת מסה, שבה דיפוזיה TMEM120A M207A למשטח החיישן איטית יותר מקצב הקישור – אפקט נפוץ בחלבונים ממוססים במממברנה או בדטרגנטיקה שיכולים להשפיע על כיסוי פני השטח לכאורה.

שלב הבסיס הבא (שלב 3) הסיר למעשה TMEM120A M207A הלא קשור או מחובר ברפיון. במהלך שלב האסוציאציה (שלב 4), עלייה בריכוזי GsMTx4 הובילה לעלייה ברורה ותלויה בריכוז בשינוי אורך הגל. במהלך דיסוציאציה (שלב 5), החיישן הביולוגי הוכנס לבופר SEC המכיל LMNG בגובה ~10x מתחת ל-CMC. 5-10 השניות הראשונות של דיסוציאציה הראו ירידה מהירה באות, ככל הנראה שחרור מהיר של GsMTx4 מאתרים נגישים בקלות, ואחריו דעיכה איטית יותר שעשויה לשקף קומפלקסים יציבים יותר TMEM120A M207A-GsMTx4 עם קינטיקת דיסוציאציה איטית. אותות הגשוש הייחוס נשארו שטוחים לאורך כל הניסוי, מה שמעיד על קישור מינימלי לא-ספציפי. בסך הכול, נתונים אלו מראים אינטראקציות ספציפיות TMEM120A M207A-GsMTx4; עם זאת, יש לפרש בזהירות את הקינטיקה הנצפית בשל סביבת חומרי הניקוי וההשפעות הפוטנציאליות של העברת מסה.

האסוציאציה והחיישנים של הנתונים המעובדים לאחר חיסור של גשושית ייחוס (איור 6A) הראו תגובות תלויות בריכוז עבור GsMTx4 בטווח של 5-100 מיקרומטר. ריכוזי הליגנדים ההולכים וגדלים יצרו הזזות אורך גל גבוהות יותר, ואחריהן ירידה הדרגתית ואיטית במהלך שלב הדיסוציאציה של 200 שניות. מערך הנתונים של 10 מיקרומולר הוצא מההתאמה בשל חפיפה עם מסלול 5 מיקרומטר, מה ששיפר את איכות המודל הכוללת.

ניתוח קינטי בוצע באמצעות מודל אסוציאציה-דיסוציאציה של לנגמייר 1:1 עם אסטרטגיית התאמה מלאה מקומית, שבה ריכוזי האנליטים הבודדים הותאמו באופן עצמאי במסגרת קינטית משותפת (איור 6B). העקומות המותאמות (אדום) היו תואמות היטב עם עקבות הניסוי, והניבו קבוע פירוק מוערך (KD) בטווח המיקרומולר הנמוך. ניתוח שאריתי (איור 6C) לא חשף סטיות שיטתיות משמעותיות, מה שמעיד שהמודל המיושם מתאים למערך הנתונים. הבדלים מינוריים שנצפו בשלב האסוציאציה המוקדם עשויים לשקף מגבלות בהובלה המונית או את השפעות סביבת המיצלות הדטרגנטיות. דוגמאות נוספות לעקומות אסוציאציה ודיסוציאציה מותאמות, גרפים שאריתיים וסטטיסטיקות התאמה בין מספר שכפולי בדיקה ומיקומי בדיקה מוצגות באיור המשלים S8.

בנתונים הגולמיים (איור 5), 5-10 שניות הראשונות של דיסוציאציה הראו ירידה מהירה באות, ככל הנראה מייצגת שחרור מהיר של GsMTx4 מאתרים נגישים בקלות, ואחריו דעיכה איטית יותר שעשויה לשקף קומפלקסים יציבים יותר TMEM120A M207A-GsMTx4 עם קינטיקת דיסוציאציה איטית. לכן, בטבלה 2, מאות השניות הראשונות של דיסוציאציה הוסרו מההתאמה. היעדר סטייה שיטתית מצביע על התאמה טובה למודל לנגמייר 1:1 המקומי המלא-מתאים עבור TMEM120A M207A בכל הריכוזים שנבדקו (איור 7).

ניתוח קינטי של קישור GsMTx4 ל-TMEM120A M207A חשף אסוציאציה תלויה בריכוז והתנהגויות דיסוציאציה בטווח הליגנד של 5-100 מיקרומו (טבלה 1). קבועי קצב האסוציאציה שנצפו (kon) עלו במידה מתונה עם עליית ריכוז GsMTx4, שנע בין כ-1.0 × 10⁻⁶ ל-3.2 ×-10-6 1/M·s, בעוד שקבועי קצב הדיסוציאציה המשוערים (koff) נשארו קרובים לאפס בתוך שגיאת הניסוי, מה שמרמז על שלב דיסוציאציה איטי או זניח בתנאים שנבדקו. קבועי הדיסוציאציה המחושבים בשיווי משקל (Kd) היו בטווח המיקרומולרי הנמוך עד האמצעי (~0.8-3.3 מיקרומון), בהתאם לאינטראקציה בינונית. התאמה מלאה מקומית באמצעות מודל קישור 1:1 של לנגמייר הניבה התאמות איכותיות בכל ריכוזי GsMTx4, עם מקדמי קורלציה העולים על 0.99 וערכי χ2 נמוכים יחסיים הן לשלב האסוציאציה והן לשלב ההפרדה (טבלה 1). קבועי הדיסוציאציה המחושבים בשיווי משקל היו עקביים בין ריכוזים ומשוכפלים, כאשר ערכי KD בטווח מיקרומולרי נמוך (~1-2 מיקרומול), המצביעים על קישור בינוני אך ספציפי בין TMEM120A M207A ל-GsMTx4.

מערכי הנתונים המשוכפלים בכל ריכוז הראו שחזוריות, כפי שמצוין על ידי מקדמי קורלציה גבוהים (R² > 0.99) עבור התאמות אסוציאציה ודיסוציאציה. הערכים המלאים והיחסיים של χ² היו נמוכים וניתנים להשוואה בין שכפולים, מה שתומך עוד יותר בעמידות של מודל הקישור 1:1 של לנגמייר שהוחל בניתוח. בריכוזי ליגנד גבוהים יותר (≥50 מיקרומון), נצפו ערכי kon ו-KD מעט מוגברים, שעשויים לשקף השפעות נשיאת מסה קלות או הטרוגניות מקומית על פני השטח ולא שינויים אמיתיים באפיניות. עקביות קינטית בין מספר שכפולים ומיקומי גלאים מודגמת עוד באיור המשלים S9.

הפרופילים הקינטיים מראים כי GsMTx4 מתקשר באופן ספציפי ויציב עם TMEM120A M207A, ויוצר קומפלקסים יציבים יחסית המאופיין בדיסוציאציה איטית ובזיקה לקישור מיקרומולרית.

figure-results-1
איור 1: תהליך הטיהור של מוטנט M207A TMEM120A המובע בתאי תלייה HEK293SF-17. סקירה סכמטית של תהליך טיהור החלבונים. TMEM120A M207A התבטא מפלסמידים pCDNA3.1 בתאי HEK293SF-17. תאים עברו מסיסות ב-0.5% LMNG, ואחריה טיהור זיקה באמצעות שרף אנטי-FLAG M2. השרף נשטף עם בופר המכיל 0.01% LMNG להסרת חלבונים שאינם קשורים במיוחד. TMEM120A M207A הוצמד בבופר המכיל 0.001% LMNG. האלואט רוכז באמצעות מסנני חיתוך משקל מולקולרי של 100 kDa או 30 kDa וטוהר נוסף באמצעות כרומטוגרפיה ללא גודל בבופר המכיל 0.00015% LMNG. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: כרומטוגרפיית הדרת גודל ועמוד SDS של TMEM120A מטוהר M207A בדטרגנט LMNG (A) SDS-PAGE של TMEM120A M207A עם תגית FLAG שטוהר על ידי כרומטוגרפיה של הוצאת גודל. רצועת החלבון מופיעה ב-~50 kDa בנתיב 1, התואם למונומר הצפוי. (B) פרופיל SEC של TMEM120A מטוהר M207A על עמודת SEC בבופר SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.00015% LMNG, pH 7.8). שחרור חלבונים מצביע על מין מונודיספיז דומיננטי המתאים לבדיקות ביופיזיקליות במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: פלואורמטריה דיפרנציאלית בסריקה של TMEM120A מטוהר M207A ב-LMNG. DSF מגלה נקודת פנייה תרמודינמית בטמפרטורה של 46 מעלות צלזיוס, המצביעה על יציבות תרמית של החלבון בתנאי הבופר שנבדקו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: אפיון TMEM120A M207A מטוהר בדטרגנט LMNG באמצעות טכניקת פוטומטריית מסה. (א,ב) פוטומטריית מסה של בופר SEC בריכוזי LMNG משתנים. ב-0.001% LMNG (מעל הריכוז הקריטי של המיצלות, CMC), המשקל המולקולרי הנראה הוא ~69 kDa, המתאים בעיקר למיצלות LMNG. ב-0.0001% LMNG (פי עשרה מתחת ל-CMC), השיא נראה ~48 קילו-דלטון. (ג) ניתוח פוטומטריה מסה של השפעות התלויות בריכוז LMNG על TMEM120A אוליגומריזציה. TMEM120A ב-0.00001% LMNG (~20x מתחת ל-CMC, מג'נטה) מציג אוכלוסייה עיקרית של כ-42 kDa (מונומר). ב-0.00015% LMNG (~10x מתחת ל-CMC, כחול), נצפית אוכלוסייה ב-~86 kDa, בהתאם לדימר. ב-0.001% LMNG (~2x מעל CMC, כתום), מין עיקרי בעומק ~150 kDa מתאים לקומפלקסים של חלבון-דטרגנטה. ב-0.002% LMNG (~4x מעל CMC, ירוק), התפלגות רחבה שמרכזת ~180 kDa מצביעה על הרכבות רחבות יותר הקשורות למיסלה או אוליגומרים מסדר גבוה. תוצאות אלו מראות שריכוז ה-LMNG משפיע מאוד על המצב האוליגומרי הנראה של TMEM120A, כאשר שיווי המשקל בין מונומר לדימר נצפה מתחת ל-CMC ויצירת קומפלקס חלבון-חומר ניקוי השולט מעל ה-CMC. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: נתונים גולמיים מתוכנה המציגים TMEM120A אינטראקציות M207A-GsMTx4. אינטרפרומטריית ביו-שכבה מראה כי TMEM120A (M207A) קושר את מעכב התעלה המכנו-רגיש GsMTx4 עם זיקה מיקרומולרית. האיור מציג את נתוני תגובת BLI גולמיים שהתקבלו מתוכנת Gator Prime, ומפרט את חמשת שלבי הבדיקה המרכזיים: (1) קו בסיס ראשוני, שבו האות נשאר יציב; (2) קיבוע חלבון (עומס), שמוביל לעלייה של כ-1.5 ננומטר בהסטת אורך הגל; (3) קו בסיס שני, המאפשר הסרת חלבון לא קשור או קשור באופן רופף; (4) שלב האסוציאציה (קישור ליגנד), שבו ריכוזי GsMTx4 עלייה בתגובה יצרה עליית תגובה עד ~5.5 ננומטר בתוך 300 שניות; ו-(5) שלב דיסוציאציה (שחרור ליגנד), המראה דעיכה הדרגתית של האות לאורך 600 שניות. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: קינטיקת קישור של TMEM120A M207A עם פפטיד GsMTx4. (A) אסוציאציה וחיישני דיסוציאציה של TMEM120A M207A באינטראקציה עם GsMTx4 בחמישה ריכוזים: 5 מיקרומאל, 20 מיקרומם, 30 מיקרומם, 50 מיקרומום ו-100 מיקרומון. מערך הנתונים של 10 מיקרומטר הוצא מההתאמה עקב חפיפה עם עקומת 5 מיקרומטר, מה ששיפר את ההתאמה הכוללת של המודל. קווים אדומים מקווקו אנכיים מציינים את תחילת וסיום שלב הדיסוציאציה. (ב) התאמת הסנסורגרמים בוצעה באמצעות מודל לנגמייר 1:1 אסוציאציה-דיסוציאציה של התאמה מלאה מקומית. עקומות אדומות מייצגות את המודל המותאם, בעוד שעקבות ניסיוניות מתאימות לנתוני האסוציאציה והדיסוציאציה שנמדדו עבור כל ריכוז GsMTx4 (שני שכפולים לכל תנאי). (ג) גרפים שאריתיים המראים את הסטייה בין הנתונים הניסיוניים לבין המודל המותאם הן לשלב האסוציאציה והן לשלב הדיסוציאציה, המאשרים את טוב ההתאמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-7
איור 7: גרפים שאריתיים התואמים לעקומות הקישור המותאמות המוצגים. כל גרף מייצג את השאריות (ההפרש בין הנתונים הניסיוניים לבין המודל המותאם) עבור ריכוז GsMTx4 יחיד: 5 מיקרומ', 20 מיקרומ', 30 מיקרומ', 50 מיקרומולר ו-100 מיקרומ'. שאריות מוצגות כסטיית הזזה (ננומטר) לעומת זמן (שניות), ומראות התפלגות אקראית סביב אפס הן בשלבי אסוציאציה והן בשלבי דיסוציאציה. היעדר סטייה שיטתית מצביע על התאמה טובה למודל ה-1:1 המקומי של לנגמייר בהתאמה מלאה עבור TMEM120A M207A בכל הריכוזים שנבדקו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: סיכום הפרמטרים הקינטיים לקישור TMEM120A M207A ל-GsMTx4. פרמטרים קינטיים התקבלו מהתאמה מלאה מקומית באמצעות מודל קישור 1:1 של לנגמייר. אסוציאציה (kon), דיסוציאציה (koff), קבועי קצב נצפים (kobs) וקבועי דיסוציאציה שיווי משקל (KD) מדווחים עבור כל ריכוז GsMTx4 ומשוכפלים. איכות ההתאמה הוערכה באמצעות ערכי R² ו-χ² עבור שלבי מלאות, אסוציאציה ודיסוציאציה. בכל הריכוזים, התאמות הראה מקדמי קורלציה גבוהים (R² > 0.99) וערכים יחסיים נמוכים של χ², מה שמעיד על ביצועי מודל אמינים. הערות: M Conc. מציין את ריכוז GsMTx4 (μM). kOBS מייצג את קבוע הקצב הנצפה המשקף תהליכי אסוציאציה ודיסוציאציה משולבים. שגיאות שדווחו עבור kobs, kon, ו-koff משקפות אי-ודאות בהתאמה. ערכי R² מציינים התאמה מלאה, אסוציאציה וניתוק. ערכי χ² יחסיים מייצגים מדדי טוב התאמה מנורמלים, בעוד שערכי χ² מוחלטים מצביעים על סטייה שאריתית בין נתונים שנצפו לנתונים מותאמים. קיצורים: kon = קבוע קצב האסוציאציה (1/M·s); kכבוי, = קבוע קצב הפרידה (1/ש); kobs = קבוע קצב נצפה (1/ש); KD = קבוע פירוק שיווי משקל; Rמקסימום = תגובה מקסימלית; Req = תגובת שיווי משקל. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: פרמטרי עיבוד ושאריות של התאמה קינטית. פרמטרי עיבוד: התחלת אסוציאציה, 0 שניות; סיום האגודה, 300 שניות; התחלת דיסוציאציה, 100 שניות; סיום דיסוציאציה, 300 שניות. ערך R² מינימלי, 0.9; ערך מקסימלי של χ², 8. שלב יישור: קצה של שלב אחד (אינדקס = 1, ממוצע = 0). תיקון בין שלבים יושם במהלך שלב האסוציאציה. ממוצע איגוד, 50; ממוצע דיסוציאציה, 0. ההחלקה בין סביצקי לגולאי הושבה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

איור משלים S1: ניסוי אופטימיזציה לטעינת ריכוזים שונים של חלבון M207A TMEM120A על גשושי אנטי-FLAG בריכוז קבוע (100 ננומטר) של פפטיד GsMTx4. (A) סנסורגרמים גולמיים של BLI המציגים את חמשת שלבי המדידה הקינטית: (1) קו בסיס בבופר SEC או בופר מבחן (25 mM HEPES, pH 7.8; 200 mM NaCl; 0.00015% (ללא v) LMNG; 0.0005% (v/v) Tween-20); (2) טעינת ארבעה ריכוזים שונים של TMEM120A M207A על גשושית FLAG, כאשר הגלאי הייחוס (כתום) משמש כבקרה שלילית לאישור היעדר קישור לא ספציפי; (3) בצעד הבסיס השני; (4) שלב האסוציאציה, ו-(5) שלב הדיסוציאציה. (B) מודל קישור גלובלי 1:1 מתאים לארבעת ריכוזי M207A TMEM120A האינטראקציה עם פפטיד GsMTx4 של 100 ננומטר. (ג) גרפים שאריתיים הן לשלב האסוציאציה והן לשלב הדיסוציאציה, המראים סטיות מינימליות מהמודל המותאם (<0.05 ננומטר). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים S2: הגדרת הלוחות ותצורת הבדיקה. (א) עיצוב לוחות ללוח עם 384 בארות, שבו ניתן להקצות פרמטרים שונים. הדגימות תואמות לליגנד (GsMTx4) בריכוזים שונים. בארות כתומים מצביעים על TMEM120 חלבון M207A ב-250 ננומטר. בארות מייצגות שכפולים של חלבון ב-250 ננומטר, ואותו בופר שימש לשלבים בסיסיים, אסוציאציה ודיסוציאציה. (B) תצוגת Max Plate המציגה ארבעה חיישנים ביולוגיים נגד FLAG: גשוש ייחוס אחד ושלושה גשושים לשכפולי חלבונים. כל הגלאים הוספקו מראש בבופר הבדיקה, התחדשו בבופר Q, ונונטרלו בבופר הבדיקה. אותו בופר שימש לאורך שלבי הבסיס, האסוציאציה והדיסוציאציה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים S3: מחזורי הקמת מבחן, כולל קו בסיס, טעינת חלבון, קו בסיס שני, אסוציאציה ודיסוציאציה. קיצורים: B = בופר; L = עומס; 0, 5, 10, 20, 30, 50 ו-100 = ריכוזי GsMTx4 במיקרומטר. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S4: תהליך ניתוח קינטי חדש (K). בחר סמל ניסוי , שמספק סקירה של כל הבדיקות שבוצעו בניסוי אחד. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים S5: תהליך ניתוח קינטיקה (K) חדש.אייקון Align and Filter, שבו ניתן לסקור ולנתח נתונים גולמיים של שלבי אסוציאציה ודיסוציאציה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים S6: תהליך ניתוח קינטי חדש (K).הגדר אייקון ייחוס, המשמש לבחירת חיישן ההתייחסות המתאים לחיסור רקע ולפרשנות מדויקת של נתונים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים S7: שלבי התאמת קישור בתהליך הניתוח הקינטי. הגדרות פרמטר התאמה קינטית המשמשות לניתוח נתוני אינטראקציה של קישור. המודל מניח אינטראקציה של 1:1 עם אתר קישור יחיד של ליגנאד. סוג ההתאמה מוגדר למקומי, וכל עקומת ריכוז מתאימה באופן עצמאי ולא גלובלית. אפשרות ההתאמה המלאה עם תפר מלא מופעל כוללת את כל עקומות האסוציאציה והדיסוציאציה הרציפה. חלונות זמן לשלבי אסוציאציה ודיסוציאציה נקבעים בין 0 ל-300 שניות ו-0 עד 200 שניות, בהתאמה. ברקע, גרף התאמת הקשר, גרף השאריות ועקומות הבדיקה האישיות ממחישים איכות התאמה ושונות ניסויית. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים S8: שלבי התאמת קישור בתהליך הניתוח הקינטי. גרף התאמת קישור המראה שלבי אסוציאציה ודיסוציאציה על פני מספר בדיקות משכפל ומיקומי בדיקה (C1 ו-D1). הגרף השאריתי למטה מעריך את איכות ההתאמה, כאשר שאריות מציינות הבדלים בין הנתונים הניסיוניים לבין המודל המותאם; ערכים קרובים לאפס משקפים התאמה טובה. הטבלה הנלווית מסכמת סטטיסטיקות התאמה, כולל ערכי R² מלאים, אסוציאציה R², דיסוציאציה R² וערכי חי-ריבוע (X²) עבור כל שכפול. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים S9: שלבי התאמת קישור בתהליך הניתוח הקינטי. ניתוח קינטי של אינטראקציות קישור ממספר שכפולים ועמדות פרוב (C1 ו-D1). שינוי תגובת החיישן (nm) לאורך זמן מציג שלבי אסוציאציה ודיסוציאציה, כאשר כל עקומה מקודדת בצבעים לפי מבחן ומיקום בדקירה. הקו האדום המקווקו האנכי מסמן את המעבר בין שלבי אסוציאציה (0-300 שניות) לבין שלבי דיסוציאציה. להלן, הטבלה מדווחת על פרמטרים קינטיים שמקורם בהתאמה של מודל הקישור 1:1, כולל ריכוז האנליט (M Conc.), קבוע קצב האסוציאציה (kon), קבוע קצב הפרידה (koff), שגיאות, וקבוע הפרידה בשיווי משקל (KD). איכות ההתאמה העקבית תומכת בעמידות המדידות הקינטיות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה S1: טבלה המציגה את הסמלים ששימשו הן בלוח 384 בארות והן בלוח מקס. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה S2: פרמטרים קינטיים שהושגו עבור ארבעת הריכוזים של TMEM120A M207A הטעונים על חיישני FLAG הפועלים עם פפטיד GsMTx4 של 100 ננומטר, תוך שימוש בערכי קון וקוף קבועים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

אפיון אינטראקציות חלבוני ממברנה נותר מאתגר בשל הצורך בטיהור חלבונים קפדני, אופטימיזציה מדויקת של ריכוז חומרי הניקוי ועיצוב בדיקה מדויק. מחקר זה מציג תהליך עבודה מפורט עבור TMEM120A M207A, הממחיש גם טיהור וגם ניתוח קינטי באמצעות GsMTx4 עם אינטרפרומטריית שכבה ביולוגית (BLI).

שלבים קריטיים ואופטימיזציה:
אחד השלבים הקריטיים החשובים היה ריכוז חומרי הניקוי, שזוהה כגורם מרכזי ליציבות חלבונים. תהליך הטיהור כלל מיסת תאים עם בופר המכיל 0.5% LMNG, ואחריה שטיפה רציפה עם 0.005% LMNG, שחרור עם 0.001% LMNG, וכרומטוגרפיה סופית של הדרת גודל (SEC) בבופר המכיל 0.00015% LMNG. אסטרטגיית הדטרגנט הזו, המבוססת על ריכוז המיצל הקריטי הנמוך (CMC) של LMNG וקצב האטה, סיפקה יציבות משופרת של החלבון במיצלות במהלך הטיהור. בופר ה-SEC הכיל חומר ניקוי בריכוז פי 10 מתחת ל-CMC של LMNG (0.001%), מה שמפחית למעשה את השפעתו על בדיקות ביופיזיקליות במורד הזרם. הומוגניות חלבונים והיעדר אגרגציה אושרו באמצעות ספקטרומטריית מסה וניתוח יציבות תרמית. איור 2, איור 3 ואיור 4 ממחישים אופטימיזציה מוצלחת של טיהור וייצוב חלבונים בריכוזי אבקה תת-CMC.

קיבוע החלבון על החיישן הביולוגי נשלט בקפידה כדי להשיג רוויה של 50-80% בפאב. רמת עומס של 50-80% עלולה להכניס מידה מסוימת של מגבלה בתחבורה המונית; עם זאת, טווח זה נבחר כדי לספק עוצמת אות מספקת במערכת BLI, כאשר הגשושים נעו בין בארות במהלך הבדיקה. השגת רמת קיבוע ליגנדה זו סייעה לשמור על איכות אות עקבית, אם כי רמות עומס כאלה כוללות יתרונות ומגבלות פוטנציאליות. הכללת גשושית ייחוס הייתה קריטית לניסויי BLI.

ניסוי ביקורת נוסף שבו נבדקו ארבע רמות שונות של TMEM120A משותקים בריכוז פפטיד יחיד (100 ננומטר). נתונים אלו כלולים כעת בכתב היד המתוקן (איור משלים S1). הגדלת כמות החלבון המקובע יצרה אותות טעינה גבוהים יותר, אך בכל המקרים, ההזזה נשארה מתחת ל-1 ננומטר מהקו הבסיסי (איור משלים S1A). דיווחנו על עקומות האסוציאציה והדיסוציאציה המותאמות באמצעות מודל קישור גלובלי 1:1, וכללנו גם את הגרפים השאריתיים, המראים הבדלים קטנים ולא משמעותיים בין הנתונים המותאמים לניסוייים.

בבדיקות הקינטיות העיקריות (אנליט 5-100 מיקרומול), קבועי קצב ההתאמה הראו את המגמות התלויות בריכוז הצפויות. ערכי ה-k של ה-k נעו בין בערך 1.48 × 10⁻⁴ ל-1.43× 10⁻³ s⁻¹, בעוד שערכי kעל נעו בין 1.12 × 10² ל-1.26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹. שינויים הדרגתיים אלו לאורך סדרת הריכוז תואמים להתנהגות האסוציאציה התלויה באנליט ולהתנהגות הדיסוציאציה הנורמלית.

בניסוי הבקרה, שבו נבדקו רמות טעינה שונות בריכוז אנליט יחיד (100 ננומטר), כל ארבעת העקבות הניבו קבועים קינטיים דומים מאוד. ערכי ה-k היו בעקביות 1.42 × 10⁻¹ s⁻¹, וערכי kעל היו באופן עקבי 2.76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ בכל רמות העומס. היעדר השונות הזה מרמז כי לא שלבי האסוציאציה ולא הדיסוציאציה הושפעו מצפיפות הגשושים, מגבלות הובלת המסה או קישור מחדש של אנליטים.

צפוי גם שהדיסוציאציה ב-100 ננומטר תופיע מהר יותר בניסוי הבקרה. ריכוז האנליט של 100 ננומטר הוא בערך סדר גודל מתחת ל-KD, ובריכוזים הרבה מתחתל-K D הקומפלקס פחות יציב, והתפיסה האפקטיבית נמוכה. בתנאים כאלה, הדיסוציאציה מתקדמת מהר יותר משום שהזיקה לקישור חלשה יותר בריכוזי אנליטים נמוכים, והאסוציאציה מחדש בשלב הדיסוציאציה מינימלית. התנהגות זו תואמת את מה שנצפה בדרך כלל כאשר ריכוז האנליט נמוך משמעותית מ-KD.

ביחד, העקביות של הפרמטרים הקינטיים בין עומסי הגשוש וההתנהגות הצפויה בריכוזי אנליטים נמוכים תומכים ברעיון שהקבועים הנצפים משקפים תכונות קשירה אמיתיות ולא ארטיפקטים של עומס פני שטח או השפעות העברת מסה.

קינטיקה וקשירה ופרשנות:
ניתוח קינטי בוצע באמצעות מודל אסוציאציה-דיסוציאציה של לנגמייר 1:1 עם אסטרטגיית התאמה מלאה מקומית, שבה ריכוזי האנליטים הבודדים הותאמו באופן עצמאי במסגרת קינטית משותפת (איור 6B). גישה זו נבחרה על פני התאמה גלובלית מסורתית, משום שמאגרי נתונים מסוימים, במיוחד בריכוזי ליגנד נמוכים יותר, הראו חפיפות קלות או סטיות בשלב מוקדם, ככל הנראה נגרמו ממגבלות הובלת המסה והשפעות מיצל דטרגנט על דיפוזיית חלבונים. התאמה גלובלית מניחה שכל העקבות פועלות לפי אותה התנהגות קינטית, שיכולה להיפגע כאשר נגישות פני השטח או המיקרו-סביבה המקומית משתנה מעט בין ריכוזים. התאמה מלאה מקומית אפשרה למודל כל ריכוז אנליט באופן עצמאי תוך שמירה על מסגרת קינטית עקבית, תוך הבטחת שהפרמטרים הנגזרים משקפים במדויק את ההתנהגות בכל ריכוז. העקומות המותאמות (אדום) התאימו במידה רבה לעקבות הניסוי, והניבו קבוע פירוק מוערך (KD) בטווח המיקרומולרי הנמוך. ניתוח שאריתי (איור 6C) לא חשף סטיות שיטתיות משמעותיות, מה שתומך בהתאמת המודל לאינטראקציות חלבוני ממברנה מומססות אלו.

TMEM120A M207A ו-GsMTx4 הראו ערכיK D בטווח מיקרומולרי נמוך (∼0.8-3.3 מיקרומון). קצב האסוציאציה (kon) עלה במידה מתונה עם ריכוז הליגנדים, בעוד שקצב הדיסוציאציה (koff) נשאר איטי מאוד, מה שמעיד על היווצרות מורכבות יציבה. הדעיכה המהירה הראשונית של האות במהלך 5-10 שניות הראשונות של הדיסוציאציה שיקפה ככל הנראה אתרי קישור נגישים בקלות, בעוד שהשלב האיטי ייצג אינטראקציות יציבות יותר (איור 6A). תצפיות אלו מדגישות את החשיבות של בחירה זהירה של חלונות דיסוציאציה והתחשבות במגבלות ההובלה המונית בעת ניתוח חלבוני ממברנה מסיסים בדטרגנט (טבלה 2).

מגבלות ופתרון תקלות:
יש לשקול מספר מגבלות לחלבוני ממברנה ממוססים בדטרגנט כמו TMEM120A M207A. השפעות הובלת המסה יכולות להתרחש בשלב האסוציאציה המוקדם, כאשר החלבון עשוי להתפשט לאט אל פני השטח של הביוסנסר, מה שעלול לעוות מעט את המדידות הקינטיות. עומס יתר של חיישנים אפשרי אם רוויית הגשוש חורגת מהטווח המומלץ של 50-80%, מה שעלול להגביל את דיוק הניתוח הקינטי הגלובלי ולהשפיע על ערכי קון וקוף. השפעות התלויות בחומרי ניקוי עשויות להשפיע על יציבות החלבון, מצב האוליגומרי או נגישות פני השטח, במיוחד בריכוזים מעל או קרוב ל-CMC. גורמים נוספים כוללים סטייה קלה בקו הבסיס, קישור לא ספציפי, ואתגרים בלכידת הקינטיקה של דיסוציאציה איטית מאוד.

רבות מהבעיות הללו ניתנות להקלה על ידי התאמות פשוטות: הפחתת עומס חלבון כדי למנוע רוויה יתר, אופטימיזציה של הרכב הבופר, והכללת גשושי ייחוס לתיקון סטייה בסיסית או אותות לא ספציפיים. במחקר זה, בופר ה-SEC המכיל 0.00015% LMNG וריכוזים נמוכים של טווין-20 צמצם למעשה את הקשירה הלא-ספציפית תוך שמירה על יציבות החלבון. בחירה מדויקת של חלון הדיסוציאציה להתאמה קינטית, יחד עם מדידות שכפול וניתוח שארית, הייתה גם חשובה לאישור אמינות הפרמטרים הקינטיים. אסטרטגיות אלו בדרך כלל משפרות את השחזוריות ועוזרות לייצר נתונים חזקים וניתנים לפרשנות רבה יותר. התאמה מלאה מקומית שימשה במקום התאמה גלובלית כדי להתחשב בהבדלים קטנים בין עקבות בריכוזי ליגנד בודדים, ולהבטיח שפרמטרים קינטיים ישקפו במדויק את התנהגות כל מאגר נתונים.

BLI וטכניקות ביופיזיות נוספות:
בהשוואה לתהודה של פלזמון שטח (SPR) וקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC), אינטרפרומטריית ביו-שכבה (BLI) מציעה מספר יתרונות מעשיים לניתוח אינטראקציות חלבון-ליגנד בין ממברנה. כמו SPR ו-ITC, BLI יכול לספק תובנות מפורטות לגבי אינטראקציות קישור, כולל קצבי אסוציאציה (kon), קצבי דיסוציאציה (koff) וקבועי דיסוציאציה בשיווי משקל (KD), מבלי לדרוש מערכות מיקרופלואידיות מורכבות או ריכוז חלבון גבוה14. פורמט הבאר הפתוחה, דיפ-אנד קריאה מאפשר חילופי בופר מהירים ועיבוד מקבילי של מספר דגימות במקביל, ותומך בתפוקה ניסיונית גבוהה יותר. בניגוד ל-ITC, שדורש כמויות גדולות של חלבון טהור מאוד ומספק נתונים תרמודינמיים, BLI יכול למדוד הן את קצב היווצרות הקומפלקס והן את הדיסוציאציה מריכוז דגימה מינימלי בננומולר. BLI תואם גם לבופרים המכילים דטרגנטים או ליפידים, מה שהופך אותו למתאים לחלבוני ממברנה בעלי תפוקה נמוכה או לא יציבים, שמאתגרים לחקר בשיטות ביופיזיקליות אחרות. למרות יתרונות אלה, טכניקות משלימות כמו SPR או ITC נשארות שימושיות לאישור עקביות תרמודינמית ולאימות פרמטרי קישור בתנאים ללא דטרגנטים ובתנאי דטרגינט, אך דורשות ריכוז חלבון גבוה3.

כיוונים לעתיד:
תהליך עבודה זה יכול להיות מורחב לחקר חלבוני ממברנה אחרים, אינטראקציות חלבון-שומן, או סינון מודולטורים של מולקולות קטנות. שילוב BLI עם גישות אורתוגונליות כמו פוטומטריית מסה, אפיון מבני או קריו-EM יכול לספק תובנות מפורטות יותר על אוליגומריזציה, סטוכיומטריה ומנגנוני קשירה. אופטימיזציה נוספת עשויה גם לאפשר ניתוח של ליגנדים בעלי זיקה גבוהה, אינטראקציות רב-ערכיות או קומפלקסים בסביבות ליפידים דומות יותר לילידים.

לסיכום, שליטה קפדנית על קיבוע חלבונים, ריכוז חומרי ניקוי ותנאי בופר מאפשרת ל-BLI לייצר נתונים קינטיים אמינים וניתנים לשחזור עבור TMEM120A M207A וחלבוני ממברנה מאתגרים דומים. למרות שיש מגבלות מובנות, השיטה מספקת פלטפורמה איתנה לחקר אינטראקציות חלבון-ליגנד ספציפיות בעלות זיקה בינונית בתנאים ניסיוניים מוגדרים היטב.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים בכנות לפלטפורמת המחקר של אוניברסיטת מלבורן, מתקן אפיון החלבון של מלבורן (MPC), על התמיכה בטיהור ואפיון חלבונים. המחקר נתמך על ידי מענק רעיונות של המועצה הלאומית למחקר בריאות ורפואה (NHMRC) (2020/GNT2000934 ל-I.R.) ומהמועצה האוסטרלית למחקר (מרכזי הכשרה לשינוי תעשייתי, IC200100052 ל-I.R. ול-M.M.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008Purification
Anti-FLAG probeGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220-10MLPurification
BioRenderBioRenderhttps://biorender.comFigure 1 creation 
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich9048-46-8Mass photometry
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019Cell culture
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High PerformanceEppendorfNAPurification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMerck11836170001Purification
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-Aldrich9003-98-9Purification
ExpiFectamine 293 Transfection KitThermofisherA14524Transfection
Gator Bio softwareGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061Cell culture
GsMTx4 trifluoroacetateSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growthATCCATCC CRL11268Cell culture
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)ThermofisherA50940Purification
Max PlateGator Bio130062BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001Purification
Prometheus High Sensitivity CapillariesNano TemperPR-C006Thermodynamic stability
Prometheus PantaNano TemperNAThermodynamic stability
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell DisrupterQsonicaNAPurification
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44Purification
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-LinkerGenScript BiotechNAPlasmid
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNAMass photometry

מקורות

  1. Rong, Y., et al. TMEM120A contains a specific coenzyme A-binding site and might not mediate poking- or stretch-induced channel activities in cells. eLife. 10, e71474(2021).
  2. Livnat-Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real-time measurements of membrane protein-receptor interactions using surface plasmon resonance (SPR). J Vis Exp. (93), e51937(2014).
  3. Kovachka, S., Soule, P., Mus-Veteau, I. Microscale thermophoresis to evaluate the functionality of heterologously overexpressed membrane proteins in membrane preparations. Methods Mol Biol. 2507, 445-461 (2022).
  4. Ciesielski, G. L., Hytönen, V. P., Kaguni, L. S. Biolayer interferometry: a novel method to elucidate protein-protein and protein-DNA interactions in the mitochondrial DNA replisome. Methods Mol Biol. 1351, 223-231 (2016).
  5. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12, 791-800 (2009).
  6. Apiyo, D. O. Biolayer interferometry (Octet) for label-free biomolecular interaction sensing. Handbook of Surface Plasmon Resonance. Schasfoort, R. B. N. , 2nd edn, Royal Society of Chemistry. 356-397 (2017).
  7. Egan, D., Slaybaugh, C., Wang, R. Getting started: kinetics assay using bio-layer interferometry. Gator Bio Technical Note. , (2023).
  8. Beaulieu-Laroche, L., et al. TACAN is an ion channel involved in sensing mechanical pain. Cell. 180 (5), 956-967.e17 (2020).
  9. Niu, Y., et al. Analysis of the mechanosensor channel functionality of TACAN. eLife. 10, (2021).
  10. Xue, J., et al. TMEM120A is a coenzyme A-binding membrane protein with structural similarities to ELOVL fatty acid elongase. eLife. 10, e71220(2021).
  11. Chen, X., et al. Cryo-EM structure of the human TACAN in a closed state. Cell Rep. 38, 110445(2022).
  12. Suchyna, T. M. Piezo channels and GsMTx4: two milestones in our understanding of excitatory mechanosensitive channels and their role in pathology. Prog Biophys Mol Biol. 130, 244-253 (2017).
  13. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  14. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic surface plasmon resonance sensors: from principles to point-of-care applications. Sensors (Basel). 16 (8), 1175(2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GsMTx4TMEM120AFLAG
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים