מאמר שיטה

פרופיל אלקטרופיזיולוגי ער של הקורטקס הפרה-פרונטלי הוונטרומדיאלי במודל עכבר של דיכאון ומחלת פרקינסון

DOI:

10.3791/69366

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC), 2August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute (IDIBAPS), 3Biomedical Research Networking Center for Mental Health (CIBERSAM), ISCIII, 4Human Anatomy and Embryology Department, Faculty of Medicine, University of Valencia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מודל עכבר דמוי מחלת פרקינסון (PD) שמבטא יותר מדי את הצורה המוטנטית A53T של אלפא-סינוקלאין אנושי (h-α-Syn) בגרעין הרפה הגבי (DR), פיתחנו שיטת הקלטה אלקטרופיזיולוגית לחקירת תפקיד מעגל הקורטקס הפרה-פרונטלי הוונטרומדיאלי (vmPFC)-DR בהפרעות דיכאון/חרדה בפרקינסון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שמחלת פרקינסון (PD) ידועה בעיקר כהפרעה מוטורית, תסמינים לא מוטוריים מופיעים לעיתים קרובות לפני ליקויים מוטוריים ומשפיעים משמעותית על התקדמות המחלה, והם חיוניים בכל שלבי המחלה. מבין אלה, דיכאון וחרדה הם התסמינים הנפוצים ביותר וגורמים לעומס תסמינים גבוה יותר אצל נשים מאשר אצל גברים. שינויים במערכת הסרוטונרגית (5-HT) קשורים לעיתים קרובות להפרעות מצב רוח, והצטברויות של α-סינוקלאין (α-Syn) נצפתו בגרעעיני הרפה 5-HT (RN) של חולי פרקינסון ודיכאון. לכן, הבנת המעגלים העצביים שמאחורי התסמינים הלא-מוטוריים הללו היא קריטית.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול משופר לחקר תפקיד מעגל הקורטקס הפרה-פרונטלי הוונטרומדיאלי (vmPFC)-גרעין הרפה הדורסלי (DR) בהפרעות מצב רוח הקשורות לפרקינסון, באמצעות מודל עכבר נקבי שמבטא יותר מדי את הצורה המוטנטית A53T של α-סין אנושי (h-α-Syn) ב-DR. השיטה שלנו מאפשרת הערכה ברזולוציה גבוהה של פעילות נוירונים בקורטקס האינפרא-לימבי (IL) והפרהלימביים (PL) הן בתנאים בסיסיים והן במהלך התניה שלילית והכחדה. באמצעות פרדיגמת התניה חושית של צליל-אור בעכברים ערים וקבועים בראש, אנו משתמשים בגשושי אלקטרופיזיולוגיה רב-ערוציים לתיעוד תגובות נוירונליות. הניסויים נערכו במסדרונות מציאות מדומה, תוך שילוב הליכון גלילי עם תצוגה ויזואלית דו-מסכית, כדי לשמור על מעורבות התנהגותית תוך שמירה על שליטה מדויקת בגירויים חושיים ויציבות הקלטה.

פרוטוקול זה בונה על המעורבות המוכחת של קליפת IL ו-PL בהתניה של פחד והכחדה, ומספק מסגרת איתנה לבחינת פעילות עצבית דינמית במעגלים המעורבים בהתנהגויות דיכאון ודומויות חרדה בפרקינסון. על ידי מתן אפשרות למדידות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות בו-זמנית בתנאים מבוקרים, גישה זו מציעה כלי עוצמתי להבהרת המנגנונים הנוירוביולוגיים של תסמינים לא מוטוריים בפרקינסון ולבדיקת התערבויות פוטנציאליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה מוטורית, אך תסמינים לא מוטוריים ידועים כקודמים לתופעות מוטוריות והם קריטיים בכל שלבי המחלה 1,2,3,4. מבין אלה, דיכאון וחרדה הם התסמינים הנוירופסיכיאטריים הנפוצים ביותר, המשפיעים קשות על איכות החיים של חולי פרקינסון וגורמים לעומס תסמינים גבוה יותר על נשיםמאשר על גברים. למרות זאת, לעיתים קרובות הם מאובחנים בצורה לא מספקת ומטופלים בצורה לא מספקת6. מסיבות אלו, חשוב להבין את הנוירוביולוגיה והמעגלים המעורבים בתסמינים הנוירופסיכיאטריים של הפרקינסון, כדי לחלק את המטופלים ולהציע להם טיפול מותאם אישית יותר.

למרות שהאטיולוגיה של PD נותרה חלקית לא ברורה, זוהו מספר תכונות נוירופתולוגיות מרכזיות. המחלה מאופיינת בהדרדרציה ובאובדן של נוירונים וסיבים דופמינרגיים (DA) במערכת הניגרוסטריאטלית, מה שמוביל לליקויים המוטוריים הפרוטוטיפיים הקשורים ל-PD 7,8. סימן נוסף של PD הוא נוכחות גופי לוי (LB) ונויריטים של לוי – הכללות תוך-תאיות הנוצרות מאגריטים חלבונים פיברילריים – המורכבים בעיקר מהחלבון α-סינוקלאין (α-Syn)9,10. מחקרי הדמיה מוחית גם מגלים שמערכות נוירוטרנסמיטר אחרות מושפעות — אפילו לפני מעורבות DA — ביניהן, מערכת הסרוטונרגית (5-HT) 11,12,13. שינויים במערכת הסרוטונרגית (5-HT) קשורים לעיתים קרובות להפרעות מצב רוח, ונמצאו משקעים של α-סינוקלאין (α-Syn) בגרעעיני הרפה 5-HT (RN) של אנשים שאובחנו עם מחלת פרקינסון (PD) ודיכאון14.

גרעיני הרפה הגביים (DR) הם גרעין ה-5-HT הגדול ביותר ב-RN15, ומשחק תפקיד קריטי בוויסות רגשי, תפיסה, תגמול, אגרסיביות ואינטראקציות חברתיות. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי ב-DR קשור להפרעות נוירופסיכיאטריות כגון לחץ, חרדה ודיכאון15,16. בשלב זה, חשוב להדגיש את הקשר התפקודי והאנטומי הדו-כיווני החזק בין ה-DR לבין הקורטקס הפרה-פרונטלי (PFC), אזור מוחי חיוני לתפקודי מוח מדרגה גבוהה. בעוד שהאזורים הגביים יותר של ה-PFC קשורים לתפקודים קוגניטיביים, האזורים הוונטרומדיאליים (vmPFC) ממלאים תפקיד יסודי בוויסות רגשי, שליטה בפעולה, זיכרון וקבלת החלטות. לכן, ה-vmPFC וה-DR יחד משפיעים באופן משמעותי על מצב הרוח, ופעילות משתנה במעגל זה קשורהלתסמינים דיכאוניים. יתרה מזאת, הצטברות צורות מצטברות של α-Syn בנוירוני 5-HT ב-RN הוכחה כמעוררת חרדה ופנוטיפים דמויי-דיכאון 19,20,21.

באמצעות מודל עכבר נקבה עם PD עם פנוטיפ דיכאוני שמבטא יותר מדי את הצורה המוטנטית A53T של α-סין אנושי (h-α-Syn) ב-DR באמצעות וקטור וירוס אדנו-מקושר (AAV), פיתחנו שיטת רישום אלקטרופיזיולוגית. שיטה זו שואפת לחקור את תפקיד מעגל vmPFC-DR בהפרעות דיכאון/חרדה בפרקינסון. גישה זו כוללת הערכת הפעילות הנוירונית של הקורטקס האינפרה-לימבי (IL) והפרה-לימבי (PL) בעכברים ערים באמצעות הקלטות של פוטנציאלי שדה יחיד ומקומי (LFPs). הדבר מתבצע באמצעות גלאי רב-ערוצי בשילוב עם רץ מציאות מדומה. בהכרה במעורבות הקורטקסים של PL ו-IL בהתניה שלילית, אנו גם מודדים את פעילותם במהלך פרדיגמה כזו כדי להעריך את תפקידם במצבים מלחיצים. חשוב להבין שה-PL מניע בעיקר תגובות מותנות, בעוד שקליפת ה-IL ממלאת תפקיד מרכזי בהכחדת תגובות אלו22,23.

הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים להשתלת מוט ראש ולתיעוד חריף של הפעילות החשמלית של הקורטקס PL ו-IL ב-vivo. אנו משיגים זאת באמצעות מסדרון מציאות מדומה, שמשלב הליכון גלילי לעכברים קבועים בראש עם תצוגה ויזואלית כפולה. הפרוטוקול מורכב לארבעה שלבים עיקריים: (1) ניתוח השתלת ראש-מוט, (2) התרגלות, (3) הקלטה ורכישת אותות, ו-(4) ניתוח נתונים: מיון קוצים ועיבוד נתונים מוקדם.

שלושה שבועות לאחר השראת הבעה יתר של h-α-Syn במערכת 5-HT במוח, העכברים עוברים ניתוח השתלת ראש-מוט, שמאפשר קיבוע ראש נוסף. לאחר תקופת התאוששות של שבוע, העכברים מתרגלים למשך 4 ימים הן לניסוי והן למערכת ההליכון ולקיבוע הראש. ביום ההקלטה, מערכת זו משמשת להקלטת פעילות עצבית מקורטקס PL ו-IL בתנאים בסיסיים ובמהלך התניה אברסיבית. הנתונים העצביים הגולמיים מעובדים באמצעות מיון ספייקים אוטומטי עם Kilosort4 ואחריו אוצרות ידנית ב-Phy2, במטרה להפיק אשכולות חד-יחידה איכותיים לניתוח נוסף (איור 1).

פרוטוקול ההקלטה vmPFC הרב-ערוצי המוצע עם ערות וראש קבוע מציע מספר יתרונות בהשוואה לחלופות קלאסיות כמו הכנות מרדימות או ex vivo והקלטות אלחוטיות בבעלי חיים ניידים חופשיים. בניגוד לשיטות הרדמה או אקס ויבו, שיטה זו מאפשרת הערכת פעילות vmPFC תחת גירוי חזותי ושמיעתי מבוקר בסביבת מציאות מדומה, דבר חיוני ליישום פרדיגמות התניה שליליות24,25. בניגוד להקלטות בתנועה חופשית, תצורת הראש הקבועה מספקת שליטה ניסויית מדויקת על קלטים חושיים ותנאי משימה, ובכך מפחיתה שונות ומאפשרת מבני ניסוי עקביים. יתרה מזאת, קיבוע ראש מפחית את הסיכון לניתוק משימה שנצפה בפרדיגמות נעות בחופשיות, במיוחד תחת גירוי שלילי, ועדיין מאפשר הקלטות רב-ערוציות יציבות ובתפוקה גבוהה26.

מבחינה מעשית, פרוטוקול זה דורש שבעלי חיים יהיו רגילים לקיבוע ראש ולריצה על הליכון, אך הוא נהנה ממערכות קיבוע ראש מסחריות ונגישות יחסית הכוללות הליכונים גליליים. דבר זה הופך את הגישה לנגישה למעבדות קטנות יותר, שכן ניתן להשתמש בגלאים מספר פעמים (עד ~10 החדרות), מה שמפחית משמעותית את העלויות בהשוואה לשתלים כרוניים שנעים בחופשיות. כתוצאה מכך, שיטה זו מספקת איזון בין ביקורת ניסויית, רלוונטיות התנהגותית ויעילות עלות. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא יישום פרדיגמת ההתניה השלילית. במחקר זה השתמשנו בעיצוב ניסויי המבוסס על סלידה טבעית של מכרסמים מאור: 10 גוונים שמיעתיים (גירויים מותנים) לוו כל אחד חשיפה קצרה לאור עז (גירוי לא מותנה). למרות שדפוס זה פחות מלחיץ משיטות התניה קלאסיות אחרות, כמו אלו הכוללות שוק חשמלי, הוא מהווה גורם לחץ דומה יותר בעולם האמיתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו עם ביקורת מותאמת גיל, ונהלי בעלי חיים תוכננו בהתאם לכללי ה-3R; התבצעה בהתאם להנחיות אתיות המפורטות בדירקטיבת האיחוד האירופי 2010/63 (22 בספטמבר 2010), בחקיקה ספרדית (RD 1201/2005, L.32/2007, ו-L.6/2013) ואושרה על ידי Generalitat Valenciana (ES462500001003; הפניה 2023-VSC-PA-0073), והוועדה המקומית לביואתיקה של אוניברסיטת ולנסיה (הפניה A20230214153605).

הערה: כדי להבטיח בטיחות ולמנוע זיהום, לאורך כל ההליך, יש ללבוש ציוד מגן אישי, כולל כפפות ומגפיים חד-פעמיים, חלוק מעבדה, מסכה ורשת לשיער. השתמש במערכות החזרה של תרופות וטרינריות לסילוק שאריות הנובעות מהשימוש, בהתאם לתקנות המקומיות ולתוכניות החזרה הלאומיות החלות.

1. יצירת דגמי עכבר

הערה: נקבות בוגרות C57BL/6J (בן 9 שבועות) שוחזקו בתנאי סביבה מבוקרים (22 ± 1 מעלות צלזיוס; מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ולמים.

  1. בהרדמה איזופלורנית (4% לאינדוקציה, 2% לתחזוקה) בתא ההרדמה של העכבר, יש להקצות באקראי את העכברים לקבל מיקרו-הזרקות סטריאוטקסיות ל-DR (קואורדינטות ביחס לברגמה: אנטרופוסטריור [AP] −4.5 מ"מ, מדיאולטרלי [ML] −1.0 מ"מ, דורסווונטרלי [DV] −3.2 מ"מ; זווית הזרקה: 20°) באמצעות מיקרואינגקטור אוטומטי בקצב זרימה של 0.4 מיקרוליטר/דקה, כפי שתואר קודם 19,27,28.
  2. ודא שכל עכבר מקבל נפח כולל של 0.6 מיקרוליטר של וירוס רקומביננטי הקשור לאדנו-אדנו, סרוטיפ 1/2 (AAV1/2; ריכוז: 5.16 × 1012 gp/mL) המקודד את הצורה המוטנטית של H-α-Syn האנושי A53T כדי לגרום לביטוי יתר בנוירוני 5-HT של ה-DR (n = 4) או וקטור AAV1/2 ריק המכיל DNA לא מקודד STUFFER STUFFER (AAV-EV), משמש כקבוצת ביקורת (n=5).
  3. כדי למנוע ריפלוקס, השאר את המחט במקום עוד 8 דקות לפני שמושכים אותה באיטיות בקצב של 320-400 מיקרון לדקה.
    הערה: למען הבטיחות, ודאו שמערכות האיסוף פועלות כראוי ללכידת אדי הרדמה לפני כל ניתוח סטריאוטקסי (סעיפים 1 ו-2). במקרה של דליפת איזופלוראן בעת מילוי מחדש של המאייף, יש לנקות אותו מיד באמצעות חומר אינרטי וסופג, כמו נסורת. השתמש במערכות החזרה של תרופות וטרינריות לסילוק מסנני איזופלוראן וכל שאריות שנוצרות מהשימוש, בהתאם לתקנות המקומיות.

2. ניתוח השתלת מוט ראש

הערה: בצע את ניתוח השתלת מוט הראש לפי השלבים הבאים, 3 שבועות לאחר יצירת דגם העכבר.

  1. הכנה לפני ניתוח והרדמה
    1. הרדימו את בעל החיים באמצעות איזופלוראן (4% לאינדוקציה, 1.5-2% לתחזוקה) שמסופק באמצעות אידוי איזופלוראן.
    2. מקם את העכבר במכשיר הסטריוטקסי על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף לאורך כל התהליך.
    3. פתח בעדינות את פה העכבר כדי למקם את שיניו על מוט הנשיכה ולחבר את המסכה המחוברת למכשיר סטריאוטקסי, כדי להבטיח אספקה רציפה של איזופלורן לצורך תחזוקת ההרדמה.
    4. מרחו טיפות עיניים למניעת כיב עיניים.
    5. יש להעניק הקלה לכאבים לפחות 10 דקות לפני חתך הסקלפל באמצעות הזרקה תת-עורית של בוטורפנול (5 מ"ג/ק"ג בתמיסת מלח).
    6. מרחו לידוקאין אזורי (0.03 מ"ל בכל אוזן, 4 מ"ג/ק"ג, אל תעלה על מינונים מקסימליים של 7 מ"ג/ק"ג או קרם לידוקאין/פרילוקאין [25 מ"ג/גרם לידוקאין ו-25 מ"ג/גרם פרילוקאין]) על האוזן הפנימית כדי להפחית את אי הנוחות מהסורגים באוזניים.
  2. מיקום סטריאוטקסי והכנת גולגולת
    1. מקם את מוטות האוזניים כך שיחזיקו את הראש בצורה בטוחה, כדי להבטיח סימטריה ותנועה מינימלית.
    2. כוונן את מוט השיניים כדי למשוך את הברגמה והלמדה לאותו רמה אופקית, וודא שהם בקו האמצע.
    3. אשר השראה להרדמה על ידי בדיקת אובדן תחושת גמילת הפדלים, רפלקסים פלפברליים, ירידה בקצב הנשימה והיעדר תנועת שפם.
    4. ודא שהעכבר ממוקם נכון במסגרת הסטריאוטקסית עם מוטות האוזניים מכוונים בקפידה.
    5. לגלח את אזור הניתוח ולחטא אותו באמצעות תמיסה חיטוי (פובידון-יוד ואחריו 70% אתנול) כדי למזער את הסיכון לזיהום.
    6. בצע חתך בקו האמצע בקרקפת ומשך בעדינות את הרקמות שמתחת כדי לחשוף את הגולגולת תוך שמירה על המוסטזיס. ודא שהעור פתוח מספיק כדי לראות את הרכסים הפריאטוטמפורליים. כדי להשיג זאת, הניחו ארבעה קליפסים עדינים של בולדוג על הפאסיה מתחת לעור כדי למקסם את החשיפה.
    7. נקו וייבשו היטב את הגולגולת החשופה לצפייה ברורה של נקודות ציון אנטומיות (ברגמה ולמדה).
    8. יישר את הגולגולת בציר הקדמי-אחורי על ידי יישור הברגמה והלמדה באותו מישור אופקי.
    9. יישור הגולגולת בציר הבינוניים על ידי התאמת עומק שני הרכסים הפריאטוטמפורליים.
  3. קידוח ומיקום השתלים
    1. קדחו חור בקוטר 1 מ"מ מעל ה-vmPFC בקואורדינטות AP: +1.75; ML: −0.4; DV: +3.1 (איור 2). השתמשו בזרוע הסטריוטקסית כדי לסמן את ארבעת הקודקודים בדיו כדי להנחות את הכנסת גלאי הסיליקון ביום ההקלטה. בנוסף, צייר צלב על ידי חיבור הנקודות שתוארו קודם עם סכין מנתח ומריחת דיו רב כך שיחדור את החתכים, וכך שהסימנים יישארו יציבים. הסירו כל דיו עודף עם מטלית צמר גפן רטובה ב-70% אלכוהול.
    2. קדחו שני חורים נוספים באזור הגולגולת האחורית מעל המוחון. הכנס חוט ידני לכל חור לצורך התייחסות עתידית והארקה (איור 2), בהתאמה.
      1. חלופה נוספת היא להשתמש בברגי נירוסטה (פלדת אל-חלד A2, מידה M1 × 2, או פלדת אל-חלד 18-8 בקוטר 0.061 אינץ' × אורך 3/16") או בסוודרים זכריים מפלדת אל-חלד. ללא קשר לבחירה, ודאו שהאלמנט המספק מגע חשמלי נשאר במגע ישיר עם משטח המוח מבלי להפעיל לחץ כדי למנוע נזק לרקמות, פגיעה ברווחת בעלי החיים או פגיעה באיכות ההקלטה.
    3. צרו חריצים רדודים על הגולגולת החשופה בעזרת סכין כדי להגדיל את שטח הפנים ולהיצמד להשתל טוב יותר.
    4. מרחו שרף דבק דנטלי ביניים על הגולגולת הנקייה והמיובשת בשתי שכבות עוקבות: תחילה עם תערובת הבסיס-קטלייזר, לאפשר לה להתייבש לחלוטין, ולאחר מכן עם התערובת המכילה אבקה, כדי להבטיח כיסוי של כל המשטח וקצוות הגולגולת. ודאו עם פינצטה שהדבק בין הגולגולת למלט השתל העתידי התקשה לחלוטין לפני הממשיכים.
    5. הניחו מוט ראש מנירוסטה בין חור ההקלטה של ה-PFC לבין חורי ההפניה/הארקה (איור 2). יישר את מוט הראש עם זרוע הסטריאוטקסית כדי להבטיח שהוא יהיה בגובה מלא עם הגולגולת, ובכך לשמור על קואורדינטות סטריאוטאקסיות מדויקות במהלך קיבוע הראש והכנסת גלאי הסיליקון לאחר מכן.
    6. הדביקו את כל רכיבי המתכת לגולגולת באמצעות מלט דנטלי, תוך הימנעות מהקרבה של כניסת מלט לחור ההקלטה.
    7. כסו את הקרניוטומיה באמצעות סיליקון כירורגי דו-רכיבי.
      הערה: אם כל השלבים ייבוצעו בקפידה, צפוי שההשתלה והתפקוד של מוט הראש יתבצעו ללא סיבוכים, עם שיעור הצלחה מוערך מעל 95%.
  4. טיפול לאחר הניתוח
    1. עקבו בקפידה אחרי החלמת העכבר לאחר ניתוח מוח, כדי להבטיח שהחיה תחזור להכרה, תשמור על טמפרטורת גוף ותחווה הקלה בכאב.
    2. עכברי בית בודדים בכלובים ומנטרים אותם עד להחלמה מלאה.
    3. מתן בוטורפנול תת-עורי (5 מ"ג/ק"ג בתמיסת מלח) כל 12 שעות במשך 3 ימים לאחר הניתוח.
      הערה: (קריטי) לאורך כל הניתוח, יש לעקוב באופן רציף אחר סימנים חיוניים (קצב לב ונשימה, רוויה בחמצן ולחץ דם). מרחי טיפות עיניים לפי הצורך כדי למנוע יובש או נזק בקרנית.

3. הרגל

הערה: לאחר שהעכברים מתאוששים ממשקלם לפני הניתוח (כ-5 עד 7 ימים לאחר הניתוח), התחילו פרוטוקול התרגלות של 4 ימים כדי להתרגל בהדרגה למערכת הניסוי.

  1. יום 1: קיימו שני מפגשי טיפול של 10 דקות, עם הפסקת מנוחה של שעה בין המפגשים כדי להכיר את העכברים עם הניסוי. נגעו בעכבר בעדינות כשהוא על האמה כדי להכיר אותו עם הניסוי.
  2. יום 2: לבצע שני סשנים של טיפול של 5 דקות. לאחר כל מפגש, החזק בעדינות את העכברים ליד מוט הראש במרווחים של 10 שניות למשך סך של 5 דקות.
  3. יום 3: לאחר סשן טיפול קצר, אפשר לעכברים לרוץ בחופשיות על ההליכון למשך 7 דקות. לאחר מכן, מקבע את הראש ושמור על העכברים במצב קבוע לראש למשך 5 דקות.
  4. יום 4: ערכו סשן ריצה של 15 דקות עם ראש קבוע בהליכון.
    הערה: (קריטי) בעלי חיים שמפגינים ירידה מופרזת במשקל, ספרות, התנהגות חקרנית ירידה או ירידה בתנועתיות, בהתאם להנחיות רווחת בעלי החיים, חייבים להימשך מהמחקר. השתל חייב להישאר יציב לחלוטין. כל תזוזה דורשת הוצאת בעל החיים מהמחקר, שכן היא עלולה להזיק לגלאי הרב-ערוצי במהלך ההקלטה ו/או לגרום לאותות לא יציבים ורועשים.

4. הכנת גשושית

הערה: כדי לחבר את הגשוש למתאמים (איור 3A) יש לבצע את השלבים הבאים:

  1. חבר את מתאם/מחבר הגשש למתאם זרוע הסטריאוטקסית.
  2. חבר 2 מתאם ראש-שלב (כל אחד Om32) עם מתאם הגשוש (איור 3A), כדי לוודא שהכיוון תואם ולמנוע כוח מופרז.
  3. חבר את הגשש למתאם (איור 3B). כדי לאפשר הקלטות סימולטניות מאזורי IL ו-PL ב-64 עומקים שונים, יש להשתמש בגשושית סיליקון בעלת 64 ערוצים חד-פעמיים (אורך שיניים: 8 מ"מ; עובי שונק: 15 מיקרון) (איור 4A).
  4. כדי להקל על מיקום הגשוש לאחר מכן, ציפו את הגשושית בצבע פלואורסצנטי תואם היסטולוגית או חלקיקים פרומגנטיים, המאפשרים אימות לאחר מכן של אתר הרישום.
  5. מרחו את הצבע באחת מהשיטות הבאות:
    1. טבל את כל השוק בתמיסה.
    2. שחרר טיפה קטנה של התמיסה ממיקרופיפטה אל הגשוש ומרח אותה לאורך השוק (השוק הפתוח).
    3. השתמש במברשת דקה טבולה בתמיסה כדי לצבוע את גב הגלאי.
    4. בשלבים 4.5.2 ו-4.5.3, יש להחיל לפחות שלוש פעימות כדי להבטיח ציפוי תקין של השוק (shank).
      הערה: שלבים 4.1 עד 4.3 נדרשים רק בפעם הראשונה שמשתמשים בגלאי, שכן ניתן להשתמש בו מחדש במספר סשנים של הקלטה. לאחר ההקלטות, נתק את כבלי הממשק ההיקפי הסדרתי (SPI) תוך שמירה על חיבור הגלאי למתאם ולמתאמים המותקנים על מתאם זרוע הסטריאוטקסית.

5. הקלטה ורכישת אותות

  1. מעקב אחרי מחזור האסטרוס, באמצעות פרוטוקול לא פולשני המבוסס על טיפולוגיית תאים בממרחי נרתיק, כדי לוודא שהנקבות בשלב הדייסטרוס 29,30.
  2. אבטח את החיה במצב ראש קבוע על הליכון גלילי המשולב עם מסגרת סטריאוטקסית (איור 4B). ודאו שההליכון והמסגרת מיושרים כראוי כדי לספק יציבות והשוואה בין הנושאים.
  3. כדי להקליט ולרכוש אותות, פעלו לפי שלבים 5.3.1-5.3.15.
    1. השתמשו בעדשת מגדלת כדי להבטיח שהשתל יישאר בלתי נייד לחלוטין.
    2. התקן את מכלול הגשוש – הכולל את הגלאי, המתאמים ומתאמים הראשיים – על זרוע המתאם של המסגרת הסטריאוטקסית.
    3. חבר את כבלי ה-SPI, שבעבר היו מקושרים ללוח הרכש, לראשי השלבים (איור 3B). שמור תיעוד של איזה כבל SPI מחובר לכל שלב ראש, שכן התאמה זו חיונית לשימור פריסת האלקטרודות במהלך מיון הקוצים האוטומטי הבא.
    4. חבר את חוט ההארקה ממתאם הגשוש לגשר הזכרי איפסילטרלי להמיספרה המתועדת, ואת חוט הייחוס לצד הנגדי. מרח מעט פח הלחמה על החוט המוטמע במוח, ואז מרח חום קצר כדי לאבטח את החיבור. הימנע מחום מופרז כדי למנוע נזק לרקמה שמתחת או לאלקטרוניקה של המתאם.
    5. מקם עדשה מגדלת כדי להמחיש את החור שנוצר להכנסת הגלאי לתוך קורטיסי PL ו-IL. ודא שסימני הדיו נשארים גלויים בבירור בכל עת כדי לשמור על קואורדינטות סטריאוטקסיות מדויקות במהלך ההליך.
    6. הנח את הגשושית למרכז חור vmPFC באמצעות זרוע הסטריוטקסית והסימנים המסומנים מראש.
    7. מקם בזהירות את הגשוש במרכז הקרניוטומיה ונגע בעדינות במשטח המוח. מרחו מלח חם על הרקמה החשופה כדי למנוע ייבוש.
    8. התחל להוריד את הגשוש בקצב של 50 מיקרומטר לדקה למשך 4-5 דקות כדי למזער דלקת ברקמות. ודאו ששוק הגשוש אינו מתעקם במהלך ההחדרה הראשונית הזו.
    9. מדדו את ההתנגדות של אתרי ההקלטה והשוו את הערכים לאלו שמספק היצרן. הערכה ראשונית זו מבטיחה שהערוצים הראשונים שנכנסים למוח לא נפגעו או נחסמו במהלך ההכנסה.
      הערה: (קריטי) יש להשוות את התנגדות האלקטרודות לערכי הבסיס של היצרן. סטיות של עד ~30% הן בדרך כלל מקובלות ואינן פוגעות בהקלטות. העלאות בין 30-100% עדיין יכולות להיות שמישות, אך דורשות זהירות ומעקב צמוד יותר. שינויים העולים על 100% לעיתים קרובות מצביעים על נזק או חסימה, והאתרים הנפגעים צריכים להיחשב כבלתי אמינים. במקרים כאלה, יש לנקות את הגלאי כדי להפחית את ההתנגדות כפי שתואר קודם. אם לא ניתן לשחזר את ההתנגדות לטווח מקובל, יש להשליך את הגלאי. עם זאת, בסופו של דבר החוקר הוא בהתחשב בכמה ערוצים לא אמינים ניתן לסבול לפני שהוא משליך את הגלאי; תקן נפוץ הוא שלא ייפרצו יותר מ~10% מהערוצים.
    10. המשך להוריד את הגשוש בקצב של 50 מיקרומטר/דקה תוך כדי ניטור האות החי מהערוצים הנכנסים למוח. ודאו שהאותות הללו דומים לאלו של הערוצים שנבדקו קודם כדי לאשר את ההחדרה הנכונה.
    11. התקדמו את הגשוש עד שהיא מגיעה לעומק של +3.1 מ"מ DV, תוך שמירה על לחות הקרניוטומיה על ידי מריחת מלח חם לאורך כל ההורדה.
    12. הסר את עדשת ההגדלה והסירו כל מקור רעש חשמלי אחר מהחדר.
    13. מדידה מחדש של ההתנגדות כדי לוודא שאף אתר הקלטה לא נחסם במהלך הורדת הגשש.
    14. עוקב אחרי האות מ-4-5 ערוצים רצופים כהתייחסות והמתין 90-120 דקות לייצוב אות הגשוש. לאחר תקופת ייצוב זו, יש לוודא שסטיית האות מינימלית כדי להבטיח שמיון הקוצים האוטומטי הבא יוכל לבודד באופן אמין אשכולות יחידים.
    15. מדדו מחדש את ההתנגדות לפני תחילת איסוף הנתונים כדי לאשר את תנאי אתר ההקלטה הנכונים ולקבוע מדידת התנגדות בסיסית. מרחו סליין חם באופן קבוע כדי למנוע התייבשות של רקמה. שמור את ההקלטה כקובץ בינארי (למשל, .dat או .bin) כדי לאפשר עיבוד מוקדם נוסף של הנתונים.
  4. לאחר היציבות, פעל לפי שלבים 5.4.1-5.4.6.
    1. רשמו פעילות עצבית בסיסית למשך 30 דקות (איור 4C).
    2. התחל את פרוטוקול ההתניה השלילית באמצעות ארדואינו, 30 דקות לאחר ההקלטה הבסיסית. זה מורכב מ-10 צלילים שמיעתיים (10 שניות לטון), המועברים פעם בדקה למשך 10 דקות. כל צליל מלווה מיד בגירוי אור של 10 שניות המוצג דרך מסכי מבוך המציאות המדומה (איור 4C).
    3. הקלט פעילות עצבית במשך 10 דקות ללא גירוי התניה.
    4. רשמו פעילות קורטיקלית PL ו-IL במהלך פרוטוקול ההכחדה, שבו מוצגים 10 גוונים שמיעתיים ללא גירוי אור נוסף.
    5. תעד פעילות עצבית לעוד 10 דקות בהיעדר גירויים.
    6. תעצור את ההקלטה.
  5. נהלים לאחר ההקלטה: לאחר סיום ההקלטה, יש לעקוב אחרי שלב 5.5.1.
    1. משיכת הגשוש: מרחו מלח חם ומשכו את הגשוש בזהירות בקצב של 100-150 מיקרון/דקה, תוך ניטור רציף של אותות האלקטרודה כדי למנוע נזק מכני לגלאי ומתיחת הרקמה, מה שעלול לפגוע בשחזור ההיסטולוגי הבא.
    2. לאחר שהגלאי הוצא מהמוח, יש להשרות מיד את השוק במים מזוקקים למשך 10 דקות כדי למנוע התייבשות של רקמה מחוברת.
    3. הרדימו את החיה עם נתרן פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג). לאחר מכן, בתוך מכסה אדים כימיקלים, יש לפרפיוז את העכבר לרוחב עם 80 מ"ל תמיסת מלח (0.9%), ואחר כך 80 מ"ל פאראפורמלדהיד 4% מדולל ב-PB (0.1 מ', pH 7.6).
      1. כדי להימנע מפרפורמלדהיד, יש להשתמש במגע ובשאיפה בציוד הגנה לעיניים/פנים, בכפפות כימיות ובמסכת אבק. בסיום הפרפוזיה, יש להפקיד את שאר הפרפורמלדהיד במיכל לממסים לא הלוגניים.
      2. במקרה של שפיכה, יש להרטיב את החומר כדי למנוע פיזור אבק ולשים אותו במיכלים אטומים. נקה אזורים מזוהמים ומשטחי עבודה עם אקונומיקה כדי לנטרל את הפרפורמלדהיד.
    4. הסר את המוח, לאחר הטיפול בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ואחסן ב-30% סוכרוז ב-PB (0.1 מ', pH 7.6) בטמפרטורה של 4 מעלות להגנה מקרי. השגת חתכי קורונל של 30 מיקרון באמצעות מיקרוטום קפוא, והרכבת הפרוסות על שקופיות זכוכית ג'לטיניות.
      הערה: קטעים אלו ישמשו לאישור ביטוי יתר של DR α-Syn על ידי אימונוהיסטוכימיה כ-19,20,21 ומיקום הגשוש.
    5. ניקוי גשוש: טבלו את האזור הניתן להשתלה בגלאי בתמיסת אבקה אנזימטית של 1% במים מזוקקים למשך שעה.
    6. השרו את שוק הגשש במים מזוקקים עוד 10 דקות כדי להסיר שאריות אבקה.
    7. יבש 20-30 דקות במצב זקוף. לאחר הייבוש, יש לבדוק את הגשוש תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שאין רקמה או פסולת באתרי ההקלטה. אם הגשוש נקי לחלוטין, טבלו אותו באלכוהול איזופרופיל איכותי למשך דקה ושמרו אותו בקופסה האנטיסטטית המקורית שלו.

6. ניתוח נתונים: מיון קוצים ועיבוד מקדים של נתונים

הערה: כדי לנתח הקלטות עצביות חוץ-תאיות ולייחס קפיצות בודדות לנוירונים ספציפיים, השתמשו באלגוריתם מיון הקוצים Kilosort431 .

  1. בצע מיון קוצים אוטומטי באמצעות Kilosort431. בממשק המשתמש של Kilosort4, בחר את קובץ ההקלטה הבינארי וציין את פריסת הגשוש בהתאם לגיליון התצורה של היצרן. הרץ את מיון הקוצים באמצעות הפרמטרים ברירת המחדל, שהם אידיאליים ללכוד את צורות הגל שנרשמו בקורטקס IL ו-PL ללא התאמות נוספות.
  2. בדוק את פלט ה-Kilosort באמצעות Phy2 (kwikteam/phy) לצורך אוצרות ידנית נוספת. שלב תוספים שפותחו על ידי הקהילה (petersenpeter/phy2-plugins; jiumao2/PhyWaveformPlugin) כדי להוסיף פונקציות נוספות ל-Phy2 ולשפר את איכות הנתונים שנבחרו ברשימה.
  3. סומן כרעש והשליך אשכולות עם תדר <0.05 הרץ או עם פחות מ-500 קפיצות.
  4. כמו כן, סמן את האשכולות הבאים כרעש:
    1. סמנו את אלה שמציגים קורלוגרמות בצורת משולש כרעש.
    2. סמנו את אלה עם צורות גל שלא דומות לקוצים כרעש.
    3. סמנו את אלו שזוהו בערוץ הקלטה יחיד או בכל הערוצים עם עוצמה משתנה כרעש.
    4. סמנו את אלה שמפגינים מחזוריות חזקה באוטוקורלוגרמות שלהם כרעש.
  5. בחרו רק אשכולות שמציגים צורות גל פיזיולוגיות מתאימות, עדויות לעמק עמיד באוטוקורלוגרם, שינויים סבירים במשרעת, ורכיבים עיקריים מופרדים בבירור.
  6. נקה ידנית כל אשכול על ידי יישום הסרת חריגות מבוססת מרחק של Mahalanobis.
  7. המשך לבדוק את צורות הגל ושינויים בעוצמה כאינדיקטורים מרכזיים לתוקף הניקוי הידני.
    הערה: לאחר השלמת מיון הקוצים, ניתן לנתח את דפוסי הפעילות הנוירונליים של ה-vmPFC באמצעות השגרות המיושמות בפייתון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההקלטות האחרונות של פעילות הקורטיקה של PL ו-IL, תוך שימוש בפרוטוקול ניסויי מפורט, חושפות ממצאים משמעותיים: ביטוי יתר של h-α-Syn ב-DR, שגורם לפנוטיפ דמוי חרדה בעכברים נקבות, משנה גם את פעילות vmPFC הוונטרומדיאלית. באמצעות ניתוח מבוסס פייתון, הראינו כי ביטוי יתר של α-Syn בנוירוני 5-HT בגרעין DR שינה את דינמיקת הירי והארגון התפקודי של מעגל vmPFC-DR, והפחית את ההבחנה האלקטרופיזיולוגית בין תת-הסוגים הנוירונים. בבעלי חיים ביקורתיים, תת-הסוגים הנוירונים היו ניתנים להפרדה ברורה על בסיס תכונות אלקטרופיזיולוגיות, מה שאפשר סיווג מד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה חזקה להערכה אלקטרופיזיולוגית in vivo של קליפת PL ו-IL בעכברים ערים עם ראש קבוע, תוך שימוש במערכת מסדרונות מציאות מדומה. המשמעות של שיטה זו טמונה ביכולתה לחקור ישירות את מעגל vmPFC-DR בעכברים ערים ומתנהגים בתוך מודל PD. גם אם קיבוע הראש מגביל תנועות בעלי חיים ועלול להיות מלחיץ, הוא מציע שליטה מדויקת על גירויים, תיעוד יציבות, ומתאים לחקר תפיסה ותהליכים קוגניטיביים, אף על פי שאינו משקף התנהגות טבעית24,25

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק חוקר צעיר BBRF לשנת 2023 31547 (MSA), מענק MCIU/AEI/FEDER EU PID2022-141700OB-I00, MCIN/AEI/10. 13039/501100011033 (AB), AGAUR 2021-SGR-01358, ממשלת קטלוניה (AB), ו-PID2022-141733NB-I00 (VT). נרצה גם להודות לרשת הספרדית למחקר על סטרס, MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ו-CB/07/09/0034 רשת המרכז למחקר ביו-רפואי בבריאות הנפש (CIBERSAM). ל-MSA יש מלגת מרגריטה סלאס (MS21-132) מאוניברסיטת ולנסיה (סיווג מחדש של מערכת האוניברסיטאות הספרדית של משרד האוניברסיטאות של ממשלת ספרד, במימון האיחוד האירופי, הדור הבא של האיחוד האירופי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AAV1/2-CMV/CBA-Human A53T aSyn-WPRE-BGH-polyAנהר צ'ארלסGD1001-RVאדם A53T aSyn
AAV1/2-CMV/CBA-Null/ריק-WPRE-BGH-polyAנהר צ'ארלסGD1004-RVבקרת וקטור ריק
ADPT A64-Om32x2קיימברידג' נוירוטקOmnetics 2228מתאם
סיליקון כירורגי דו-רכיבי וורלד פרסיז'ן אינסטרומנטסקוויק-סיל
Butorphanol וטרינר טורבוגסי / Cymit quí מיקה67753-31-5
DuraLayריליאנס דנטלינג מפקפקינג / קלמה43640מלט דנטלי  
גשושית רב-ערוצית H9קיימברידג' נוירוטקASSY-77 H9
קרם EMLA (לידוקאין / פריקולאין) Lirios Vañ ó בית המרקחת סמפרה679290
Microinjector מכשיר הדיוק העולמיKDS-310-פלוס
MSS Isoflurane Vaporizer ציוד רפואי ושירותים, בריטניהMSSVAP02 
מועצת הרכישה של Open Ephysאופן אפיסOEPS-9029מועצת הרכש; לוח רכישת Open Ephys יכול להזרים עד 512 ערוצים של נתוני עצבים למחשב דרך USB
C& B MetaBond פארקלS380-RDדבק מהיר
פנטוברביטל וטוקווינול דולתל / Merck Life Science, S.L.U.P-010-1MLברביטורט
RHD 32 ערוצים  הבמה הראשיתאינטאן טכנולוגיות#C3314מתאם ראש הבמה 
סיקפלואידמעבדות תיאה S.A. / ליריוס Vañ ó בית המרקחת סמפרה6515167ג'ל עיניים  
ציוד סטריאוטקסי  סטולטינג51730U
מסגרת סטריאוטקסיתנארישיגהSR-6N/SM-15R
טרג-א-זימהסיגמא אולדריץ'Z273287תמיסת ניקוי גשוש

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooney, J. W., Stacy, M. Neuropsychiatric issues in Parkinson's disease. Curr Neurol Neurosci Rep. 16 (5), 49(2016).
  2. Schapira, A. H. V., Chaudhuri, K. R., Jenner, P. Non-motor features of Parkinson disease. Nat Rev Neurosci. 18 (7), 435-450 (2017).
  3. Ahmad, M. H., Rizvi, M. A., Ali, M., Mondal, A. C. Neurobiology of depression in Parkinson's disease: Insights into epidemiology, molecular mechanisms and treatment strategies. Ageing Res Rev. 85 (1), 101840(2023).
  4. Absalyamova, M., Traktirov, D., Burdinskaya, V., Artemova, V., Muruzheva, Z., Karpenko, M. Molecular basis of the development of Parkinson's disease. Neuroscience. 565 (1), 292-300 (2024).
  5. Crispino, P., et al. Gender differences and quality of life in Parkinson's disease. Int J Environ Res Public Health. 18 (1), 198(2020).
  6. Chuquilín-Arista, F., Álvarez-Avellón, T., Menéndez-González, M. Prevalence of depression and anxiety in Parkinson's disease and impact on quality of life:A community-based study in Spain. J Geriatr Psychiatry Neurol. 33 (1), 207-213 (2020).
  7. Greffard, S., et al. Motor score of the Unified Parkinson Disease Rating Scale as a good predictor of Lewy body-associated neuronal loss in the substantia nigra. Arch Neurol. 63 (1), 584-588 (2006).
  8. Mamelak, M. Parkinson's disease, the dopaminergic neuron and gammahydroxybutyrate. Neurol Ther. 7 (1), 5-11 (2018).
  9. Wakabayashi, K., Tanji, K., Mori, F., Takahashi, H. The Lewy body in Parkinson's disease:Molecules implicated in the formation and degradation of alpha-synuclein aggregates. Neuropathology. 27 (5), 494-506 (2007).
  10. Sezgin, M., Bilgic, B., Tinaz, S., Emre, M. Parkinson's disease dementia and Lewy body disease. Semin Neurol. 39 (2), 274-282 (2019).
  11. Jellinger, K. A. The pathobiological basis of depression in Parkinson disease:Challenges and outlooks. J Neural Transm. 129 (12), 1397-1418 (2022).
  12. Wang, J., Sun, J., Gao, L., Zhang, D., Chen, L., Wu, T. Common and unique dysconnectivity profiles of dorsal and median raphe in Parkinson's disease. Hum Brain Mapp. 44 (1), 1070-1078 (2023).
  13. Miquel-Rio, L., Sarriés-Serrano, U., Pavia-Collado, R., Meana, J. J., Bortolozzi, A. The role of α-synuclein in the regulation of serotonin system: Physiological and pathological features. Biomedicines. 11 (2), 541(2023).
  14. Halliday, G. M., Blumbergs, P. C., Cotton, R. G., Blessing, W. W., Geffen, L. B. Loss of brainstem serotonin- and substance P-containing neurons in Parkinson's disease. Brain Res. 510 (1), 104-107 (1990).
  15. Ren, J., et al. Single-cell transcriptomes and whole-brain projections of serotonin neurons in the mouse dorsal and median raphe nuclei. Elife. 8 (1), e49424(2019).
  16. Huang, K. W., et al. Molecular and anatomical organization of the dorsal raphe nucleus. Elife. 8 (1), e46464(2018).
  17. Hiser, J., Koenigs, M. The multifaceted role of the ventromedial prefrontal cortex in emotion, decision making, social cognition, and psychopathology. Biol Psychiatry. 83 (1), 638-647 (2018).
  18. Alexander, L., Wood, C. M., Roberts, A. C. The ventromedial prefrontal cortex and emotion regulation: Lost in translation. J Physiol. 601 (1), 37-50 (2023).
  19. Miquel-Rio, L., et al. Human α-synuclein overexpression in mouse serotonin neurons triggers a depressive-like phenotype. Rescue by oligonucleotide therapy. Transl Psychiatry. 12 (1), 79(2022).
  20. Sarries-Serrano, U., Miquel-Rio, L., Surroca-Lopez, A., Paz, V., Meana, J. J., Bortolozzi, A. Sex-based modulation of endoplasmic reticulum stress and antidepressant response in a mouse model of α-synucleinopathy. Neuroscience Appl. 2 (1), 101028(2023).
  21. Miquel-Rio, L., et al. Early synaptic changes and reduced brain connectivity in PD-like mice with depressive phenotype. NPJ Parkinsons Dis. 11 (1), 242(2025).
  22. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).
  23. Giustino, T. F., Maren, S. The role of the medial prefrontal cortex in the conditioning and extinction of fear. Front Behav Neurosci. 9 (1), 298(2015).
  24. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), e88678(2014).
  25. Nasr, A., Dominiak, S. E., Sehara, K., Nashaat, M. A., Sachdev, R. N. S., Larkum, M. E. Efficient training approaches for optimizing behavioral performance and reducing head fixation time. PLoS One. 17 (11), e0276531(2022).
  26. Bjerre, A. S., Palmer, L. M. Probing cortical activity during head-fixed behavior. Front Mol Neurosci. 13 (1), 30(2020).
  27. Alarcón-Arís, D., et al. Anti-α-synuclein ASO delivered to monoamine neurons prevents α-synuclein accumulation in a Parkinson's disease-like mouse model and in monkeys. EBioMedicine. 59 (1), 102944(2020).
  28. Pavia-Collado, R., et al. Intracerebral administration of a ligand-ASO conjugate selectively reduces α-synuclein accumulation in monoamine neurons of double mutant human A30PA53Tα-synuclein transgenic mice. Int J Mol Sci. 22 (6), 2939(2021).
  29. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389(2012).
  30. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  31. Pachitariu, M., Sridhar, S., Pennington, J., Stringer, C. Spike sorting with Kilosort4. Nat Methods. 21 (5), 914-921 (2024).
  32. Opitz, A., Falchier, A., Linn, G. S., Milham, M. P., Schroeder, C. E. Limitations of ex vivo measurements for in vivo neuroscience. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (20), 5243-5246 (2017).
  33. Sorrenti, V., Cecchetto, C., Maschietto, M., Fortinguerra, S., Buriani, A., Vassanelli, S. Understanding the effects of anesthesia on cortical electrophysiological recordings: A scoping review. Int J Mol Sci. 22 (3), 1286(2021).
  34. Brown, E. N., Purdon, P. L., Van Dort, C. J. General anesthesia and altered states of arousal :A systems neuroscience analysis. Annu Rev Neurosci. 34 (1), 601-628 (2011).
  35. Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Fröhlich, F. Awake vs. anesthetized: Layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
  36. Qiu, J., et al. The volatile anesthetic isoflurane differentially inhibits voltage-gated sodium channel currents between pyramidal and parvalbumin neurons in the prefrontal cortex. Front Neural Circuits. 17 (1), 1185095(2023).
  37. Windels, F. Neuronal activity: From in vitro preparation to behaving animals. Mol Neurobiol. 34 (1), 1-26 (2006).
  38. Belle, A. M., et al. Evaluation of in vitro neuronal platforms as surrogates for in vivo whole brain systems. Sci Rep. 8 (1), 10820(2018).
  39. Juczewski, K., et al. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method:Stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Sci Rep. 10 (1), 12245(2020).
  40. Chen, P. C., Young, C. G., Schaffer, C. B., Lal, A. Ultrasonically actuated neural probes for reduced trauma and inflammation in mouse brain. Microsyst Nanoeng. 8 (1), 117(2022).
  41. Wang, S., et al. Mechanically adaptive and deployable intracortical probes enable long-term neural electrophysiological recordings. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (40), e2403380121(2024).
  42. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
  43. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. Elife. 6 (1), e26839(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ventromedial Prefrontal CortexElectrophysiological ProfilingMouse Model DepressionParkinson s DiseaseDorsal Raphe NucleusSerotonergic SystemAversive ConditioningFear ExtinctionMultichannel ElectrophysiologyVirtual Reality Mice

מאמרים קשורים