מאמר שיטה

יצירה יעילה ומהירה של CAR-T ותאי הרג מונעים מציטוקין במכשירים הניתנים להרחבה GMP

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69369

⸱

5 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה ניתנת להרחבת מוצרי טיפולי תאים מאמצים (ACT), כלומר קולטני אנטיגן כימרי (CAR)-תאי T ותאי Cytokine Killer (CIK), תוך שימוש במכשירי התרחבות מהירה חדירת גז (G-Rex), המדגימים גדילה יעילה וחזקה בסביבה קלינית רלוונטית.

תקציר

טיפולי תאים מאמצים (ACT) התקדמו במהירות בשנים האחרונות, ושיחקו תפקיד מרכזי באימונותרפיה בסרטן והשפיעו משמעותית על תוצאות הטיפול. שלב קריטי בפיתוח טיפול תאי, הן בשלבים פרה-קליניים והן בשלבים קליניים, הוא תהליך הייצור. שיטות תרביות סטטיות קונבנציונליות דורשות מניפולציה תכופה של התאים ולעיתים מוגבלות על ידי ירידה בהחלפת גזים ובאספקת חומרים מזינים, מה שעלול לפגוע בתפוקת התאים ובפנוטיפ. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב, ניתן לשחזור וניתן להרחבה של שני מוצרי ACT , כלומר קולטני אנטיגן כימרי (CAR)-T ותאי Cytokine Induced Killer (CIK), באמצעות מכשירי התרחבות מהירה חדירה לגז (G-Rex). מכשירי G-Rex מיועדים במיוחד לשיפור חילופי חומרים מזינים ולתמוך בתרביות בצפיפות גבוהה עם התערבות מינימלית של המשתמש. מבין גישות ACT שונות, תאי CAR-T הראו הצלחה מרשימה בטיפול במאירויות המטולוגיות, מה שמאפשר התקדמות מהירה ממחקר ניסויי ליישומים קליניים. בנוסף לתאי CAR-T, תאי CIK יושמו גם באופן נרחב בניסויים קליניים בשל הפנוטיפ האופייני שלהם והיעדר תופעות לוואי הקשורות לטיפול ומחלת השתל מול מארח (GvHD). פרוטוקול זה מפרט את השלבים הטכניים המרכזיים לשני סוגי התאים, החל מבידוד וזריעה של תאי דם מונו-גרעיניים היקפיים (PBMCs). בקצרה, PBMCs מעוררים בנוגדנים אנטי-CD3/CD28, ולאחר מכן טרנסדוקציה לנטיוויראלית להרחבת תאי CAR-T, או עם אינטרפרון-γ (IFN-γ), נוגדן אנטי-CD3 ואינטרלוקין 2 (IL-2) לקבלת תאי CIK. ציטומטריית זרימה משמשת למעקב אחר הקיימות והפנוטיפ של התאים, ומבצעים בדיקות פונקציונליות לאישור הפוטנציאל הטיפולי של מוצר התא ולאמת את יכולת ההרחבה של הגישה. בסך הכול, פרוטוקול זה מספק פתרון מעשי לייצור מספר רב של תאי אפקטור בסביבה פרה-קלינית, ומקל על יישום קליני עם מספר אוכלוסיות תאי חיסון. לבסוף, הוא מציע פתרון ניתן להרחבה לייצור תאי אפקטור בעלי תפוקה גבוהה.

מבוא

טיפול תאי אימוץ (ACT) הפך לעמוד תווך חשוב של טיפולים מתקדמים לטיפול בסרטן. גישה זו מבוססת על מתן מוצרים תאיים מורחבים מחוץ לחיים להשגת יעילות אנטי-גידולית1. עד כה, סוגי תאים רבים שימשו ב-ACT, החל מגישות אנטי-ספציפיות, לדוגמה, רוצח טבעי (NK)2, רוצח מושרה ציטוקין (CIK)3,4, קוטל טבעי T (NKT)5, או γδ תאי T6, ועד תאי T ספציפיים ואישיים מאוד, כגון לימפוציטים חודרים לגידול (TILs)7 וטיפולים מהונדסים מבוססי תאים, כגון קולטן אנטיגן כימרי (CAR)1, 8 ותאי קולטני תאי T (TCR) 9,10.

תאי CAR-T הם תאי T מהונדסים גנטית שנוצרים על ידי טרנסדוקציה ויראלית אקס ויבו כדי לבטא קולטן חיסוני סינתטי שנועד לזהות מטרה מולקולרית מסוימת. מבנה ה-CAR מורכב מנוגדן משתנה שרשרת יחיד (scFv) ספציפי לאנטיגן, בשילוב עם תחומי איתות תוך-תאיים, כולל שרשרת TCRζ ומולקולות קוסטימולטוריות. בעת הפעלת האנטיגן, הדומיין התוך-תאי מספק אותות הפעלה המעודדים התרבות תאי T ופעילות אנטי-גידולית11.

תאי CIK הם אוכלוסייה הטרוגנית של לימפוציטים T מופעלים המקבלים ביטוי של CD56 במהלך התרחבות אקס ביבו, מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) או מדם חבל הטבור (UCB)12. הרחבה זו כוללת גירוי באמצעות אינטרפרון-γ (IFN-γ), נוגדן מונוקלונלי אנטי-CD3, ואינטרלוקין-2 (IL-2), ואחריה תרבית ב-IL-2 למשך 14 ימים. תאי CIK דומים פונקציונלית לתאי NK ו-T, ומפעילים פעילות אנטי-גידולית דרך מנגנונים תלויי קומפלקס היסטוקומפליטיות עיקרי (MHC) ותלויים 13,14,15,16. תכונות אלו מאפשרות שימוש בתאי CIK הן בסביבות טיפוליות אלוגניות והן באוטולוגיות עם סיכון מינימלי למחלת השתל נגד המארח (GvHD)17.

בפרקטיקה קלינית, גם טיפולי תאי CAR-T וגם CIK דורשים מתן של מספר רב של תאים. תאי CAR-T מוזרמים ב-50-200 מיליון מנות לכל מטופל18. באופן דומה, תאי CIK ניתנים בדרך כלל במינונים של עד 10 מיליארד תאים בכל עירוי, כאשר מטופלים מקבלים לעיתים קרובות מספר עירויים בהתאם לפרוטוקול הטיפול19. שיטות תרביות תאים מסורתיות המשתמשות בבקבוקים או לוחות אינן יעילות, גוזלות זמן ודורשות מעבר תכוף, מה שהופך את ההתרחבות בקנה מידה גדול לבלתי אפשרי ומעלה את הסיכון לזיהום. מערכות אוטומטיות או חצי-אוטומטיות המשתמשות בתרביות שקיות או ביוריאקטורים מאפשרות התרחבות רחבת היקף אך יש להן מגבלות, כלומר מאמץ גזירה או צורך בהתאמות צפיפות והזרמת נוזל בינונית תכופה20,21, וטיפול באצווה אחת בכל פעם, מה שמוביל לעלויות גבוהות הן בהקשרים אקדמיים והן בתחום. במצב מאתגר זה, חלופה מיוצגת על ידי מכשיר ההתפשטות המהירה החדירה לגז (G-Rex), שיטת תרבית סטטית הכוללת ממברנת סיליקון בתחתית הבאר, שמבטיחה חילוף חמצן יעיל וגובה מוגבר של כלי הים, ומאפשרת קיבולת בינונית בנפח גבוה. לכן, המערכת תומכת בצמיחת התאים ללא החלפת מדיום או התאמת צפיפות22,23. מערכות G-Rex-M הוכיחו יכולת הרחבה של עד 5000 מ"ל ותואמות למערכות קציר אוטומטיות, המספקות פלטפורמת תרביות סגורה וללא זיהום שניתן לתרגם בקלות מסביבות אקדמיות לקליניות לפיתוח מוצרי טיפול רפואיים מתקדמים (ATMPs)24.

בהליך שפורט, ניצלנו את היתרונות והמאפיינים של מכשירי G-Rex כדי לייעל את פרוטוקול ההרחבה של תאי CAR-T ו-CIK. הראינו שניתן להרחיב ולהגדיל את שני סוגי התאים ביעילות, תוך שמירה על פרופיל פנוטיפ ותפקודי עקבי במערכות תרביות שונות. סקירה סכמטית של פרוטוקול ההרחבה עבור תאי CIK ו-CAR-T מוצגת באיור 1.

איור 1
איור 1: סקירה של פרוטוקולי הרחבת תאי CAR-T ו-CIK באמצעות מכשירי תרבית G-24 או G-6M. תאי CAR-T ו-CIK מתרחבים מ-PBMCs מבודדים החל מהיום ה-0. להרחבת תאי CAR-T, תאי PBMC מגרים ביום הראשון בנוגדנים נגד CD3 ו-anti-CD28, מהונדסים גנטית ביום השני, ולאחר מכן מתרבתים עם תוספי hIL-7 ו-hIL-15 כל 3-4 ימים, עם קציר סופי לבדיקות פונקציונליות ביום התשיעי. בפורמט G-6M, תוספת ציטוקינים מוגבלת ליום השני, ללא צורך בהזנה נוספת של ציטוקינים לאורך כל תקופת הגידול. להרחבת תאי CIK, PBMCs מעוררים ביום הראשון עם rhIFN-γ וביום 2 עם נוגדן אנטי-CD3 ו-rhIL-2, הניתן כל 3-4 ימים. ב-G-24, נדרש שינוי בינוני במקביל לתוסף הציטוקינים. תאי CIK נאספים ביום ה-14 לבדיקות פונקציונליות במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרוטוקול

מעילים אנונימיים של באפי מתורמים בריאים שנבדקו בעבר בהיעדר זיהום פתוגן (למשל, HIV, HCV, HBV, עגבת) התקבלו מבנק הדם של בית החולים פדובה לפני הסכמה מדעת בכתב. דגימות הדם נבדקו בארונות בטיחות ביולוגית מוסמכים, והצוות לבש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים.

הערה: כל ההליכים הכוללים וקטורי לנטי-וירוס בוצעו בתנאי BioSafety Level 2 (BSL-2), בהתאם להנחיות המוסדיות. טיפול בווקטורים לננטיויראליים דורש אמצעי זהירות נוספים, כולל כפפות כפולות. פסולת ביו-מסוכנת (כולל חומרים ויראליים, תאים מומרת ודגימות שמקורן באדם) עברה אוטוקלבה לפני ההשלכה, בעוד שפסולת כימית (כולל צבעים פלואורסצנטיים ותגובות) דרשה הפרדה לפי פרוטוקולי פסולת מסוכנת מוסדיים. יש לשים לב שדרישות בטיחות ביולוגית מסוימות עשויות להשתנות בין מוסדות ויש לאמת אותן לפני יישום הפרוטוקול.

1. בידוד PBMCs

  1. בודד PBMCs ממעילי באפי בריאים של תורם או מדגימות דם היקפיות באמצעות צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות. מדלל את שכבת הבאפי בנפח שווה של מי מלח סטריליים מסוג 1x Phosphate Buffer Saltine (PBS) ושכבו בזהירות את הדם המדולל על אותו נפח של לימפופרפ בצינור קוני של 50 מ"ל. דילול עם 1x PBS אינו הכרחי לדם ההיקפי. צנטריפוגה בעוצמה של 400 x g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בלי בלם.
  2. לאחר הצנטריפוגה, אספו את שכבת ה-PBMCs בממשק הפלזמה-לימפופרפ ושוטפים אותה עם PBS סטרילי 1x. צנטריפוגה והשעה מחדש של PBMCs בתווך תרבית תאים המטופואטית (CM) בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (להלן cCM). הערכו את ספירת התאים ועמידותם באמצעות מבחן ההוצאה Trypan Blue.

2. התרחבות תאי CAR-T מ-PBMCs בכלי תרבית G-24

  1. הפעלת PBMCs (יום 0)
    1. החזר 2 x 106 PBMCs מבודדים טריים ב-2 מ"ל cCM עם תוספת של 5% סרום בקר עוברי (FBS) (להלן cCM-F), מה שמוביל לצפיפות זריעה סופית של 1 x 106 PBMCs/ס"מ2/מ"ל, והעברה לבאר של כלי תרבית G-Rex (G-24) עם 24 בארות. זרעו כמה בארות כמו מספר תנאי ההעברה השונים שיש לבצע ביום הראשון (שלב 2.2 - יום 1).
    2. הוסף 4 מיקרוליטר של אנטי-CD3 (דרגה טהורה-פונקציונלית, ריכוז סופי: 0.2 מיקרוגרם/מ"ל) ו-20 מיקרוליטר אנטי-CD28 (דרגה טהורה-פונקציונלית, ריכוז סופי: 1 מיקרוגרם/מ"ל) ישירות לכל באר כדי להפעיל תאי T. תאי תרבית באינקובטור לח נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2.
  2. העברת תאי T עם וקטורים לנטיויראליים (יום 1)
    1. לאחר גירוי לילה, קציר וסופר את תאי ה-T המופעלים באמצעות בדיקת החרגה של Trypan Blue להערכת כדאיות. חשב 1 x 106 של תאים פעילים ברי קיימא לכל באר של G-24 (שטח באר 2 ס"מ רבוע), בהתאם לצפיפות זריעה של 0.5 x 106 תאים לסמ"ר. להעביר תאים בצינור ובצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
    2. הכינו את מדיום הטרנסדוקציה לכל באר על ידי שילוב נפח הווקטור הלנטי-ויראלי המתאים, בהתבסס על הריכוז (TU/mL) של הכנת וקטור הלנטיוויראלי (כאן, לנטיווירוס CD19-CAR-BBζ שהושג מבית החולים לילדים סנט ג'וד25; ריבוי זיהום (MOI) 20), עם 5 מיקרוליטר של פרוטמין סולפט מגביר הטרנסדוקציה (תמיסת מלאי 8 מ"ג/מ"ל מתקבלת על ידי המסה של סולפט פרוטמין ב-1x PBS וסונון סטרילי באמצעות פילטר של 0.2 מיקרומטר; ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל). השתמשו במדיום CM בתוספת 5% FBS ללא תוספת פניצילין/סטרפטומיצין כדי להגיע לנפח סופי של 0.8 מ"ל לבאר (0.4 מ"ל/ס"מ²). לצורך שליטה לא מומרת (UTD) הכינו את מדיום ההעברה המתואר, תוך הימנעות מהוספת וקטור לנטיויראלי.
    3. החזירו את התאים הגולגולים (שלב 2.2.1) במדיית טרנסדוקציה של 0.8 מ"ל לבאר וציפו אותם בבאר G-24 חדשה. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2.
      הערה: אם מתוכננת העברה של מספר בארות עם אותו וקטור לנטיויראלי, יש להכין תערובת ראשית של מדיום ההעברה המכיל את הנגיף וסולפט הפרוטמין בריכוז הרצוי. ערבב היטב כדי להבטיח הומוגניות. לאחר מכן, יש להוסיף 0.8 מ"ל מהתערובת הראשית הזו לכל שפופרת של תאים מגולגלים כדי להבטיח תנאי המרה אחידים בכל הדגימות.
  3. תרבית והתרחבות תאי CAR-T (יום 2 עד יום 9)
    1. ביום השני, הגדילו את נפח התרבית לנפח סופי של 8 מ"ל לבאר על ידי הוספת 7.2 מ"ל של cCM-F טרי, בתוספת אינטרלוקין-7 אנושי (hIL-7) ואינטרלוקין-15 (hIL-15) האנושי בריכוז סופי של 10 ng/mL כל אחד (נפח הציטוקינים מחושב בהתחשב בנפח כולל של 8 מ"ל לבאר).
    2. ביום החמישי, רעננו את מדיום התרבית על ידי הסרה זהירה של 6 מ"ל של מדיום מותאם מכל באר מבלי להפריע לתאים בתחתית הבאר והחלפתם ב-6 מ"ל של cCM-F טרי בתוספת hIL-7 ו-hIL-15 (ריכוז סופי: 10 ng/mL מחושב בהתחשב בנפח כולל של 8 מ"ל לבאר). אם עובדים עם מספר בארות, הכינו תערובת ראשית של מדיום cCM-F בתוספת ציטוקינים hIL-7 ו-hIL-15 כדי להבטיח הפצה אחידה של הציטוקינים.
    3. ביום התשיעי, תאי CAR-T מורחבים ביעילות ומוכנים ליישומים במורד הזרם. כדי לקצור את תאי CAR-T, יש להסיר בעדינות ולזרוק 5 מ"ל של מדיה מותאמת. באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר, החזירו את תאי CAR-T ל-3 מ"ל המדיה הנותרים והעבירו אותם לצינור של 15 מ"ל. ספרו תאי CAR-T ובדקו את הקיימות שלהם באמצעות מבחן החרגה של Trypan Blue. בדרך כלל, מתקבלים כ-3 x 107 תאי CAR-T (3.24 ± 1.67 x 107 תאים) מכל באר G-24 (טבלה משלימה 1).

3. התרחבות CIK בכלי גידול G-24

  1. הפעלת PBMCs (יום 0)
    1. זרעים 1 x 106 PBMCs מבודדים טריים לכל באר של כלי גידול G-24, התואם צפיפות של 0.5 x 106 לסמ"ר, ב-8 מ"ל cCM בתוספת אינטרפרון-γ האנושי הרקומביננטי (rhIFN-γ, ריכוז סופי: 1000 IU/mL). דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2.
  2. גירוי והתרחבות תאי CIK (יום 1 עד יום 14)
    1. ביום הראשון, 22-24 שעות לאחר גירוי rhIFNγ, הוספו ישירות לכל באר 4 מיקרוליטר נוגדן אנטי-CD3 (ריכוז סופי: 50 ng/mL) ו-4 מיקרוליטר של אינטרלוקין-2 רקומביננטי אנושי (rhIL-2, ריכוז סופי: 500 IU/mL). דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2.
    2. כל 3 עד 4 ימים (ביום 5, 9 ו-12 של תרבית התא), החליפו 6 מ"ל של מדיום מותאם ב-cCM טרי ו-rhIL-2 (ריכוז סופי: 500 IU/mL), תוך חישוב הריכוז הסופי של rhIL-2 ביחס לנפח מלא של 8 מ"ל.
    3. ביום ה-14, קצור תאי CIK על ידי השלכת 5 מ"ל של מדיה מותאמת והשעתם מחדש ב-3 מ"ל הנותרים של המדיה המותאמת. העבר תאים לצינור של 15 מ"ל והעריך את מספר התאים הכולל ואת חיוניות התאים באמצעות בדיקת החרגה של Trypan Blue. בדרך כלל, מתקבלים כ-8 x 107 תאי CIK בתפזורת (8.6 ± 4.58 x 107 תאים) מכל באר (טבלה משלימה 2).
      הערה: במהלך שינויים בתווך, יש לשאוב בזהירות את הסופרנאנט, תוך זהירות שלא להפריע לאוכלוסיית שכבת התאים או ליצור קשר עם הממברנה החדירה לגז. נזק לממברנה עלול לפגוע בהחלפת גזים ולהשפיע לרעה על חיוניות התא.

4. ייצור תאי CAR-T ו-CIK בקנה מידה גדול

הערה: פרוטוקולי הרחבת תאי CAR-T ו-CIK המתוארים בסעיפים 2 ו-3 ניתנים להרחבה בקלות למכשירי תרבית G-Rex גדולים יותר, כלומר לפורמט G-6M. בעת המעבר מפורמט G-24 (שטח פנים: 2 ס"מ2) למכשיר G-6M (שטח פנים: 10 ס"מ 2), כל הריכוזים והצפיפויות נשמרים קבועים, בעוד שכל הנפחים והכמויות המוחלטות מוגדלים באופן פרופורציונלי פי 5 כדי להתאים לשטח הפנים המוגדל. משמעות הדבר היא שצפיפות הזריעה של התאים, ריכוזי תוספי המדיה וריכוזי הציטוקינים נשארים ללא שינוי, אך נפחי המדיה הכוללים, מספר התאים שהוזרעו והכמויות המוחלטות של הציטוקינים שנוספו יוגדלו באופן יחסי. תכונת ההרחבה הזו מאפשרת מעבר חלק מפרוטוקולי מחקר בקנה מידה קטן לייצור פרה-קליני או קליני מוקדם ללא צורך בשינויים משמעותיים בפרוטוקול, ובכך שומרת על מאפייני תא אפקטור עקביים.

  1. התרחבות תאי CAR-T במכשירי פורמט G-6M
    1. בצע את הפעלת PBMCs ביום 0 ואת הטרנסדוקציה של הלנטיווירוס ביום 1, כפי שמתואר בסעיף 1, תוך שמירה על כל הריכוזים והצפיפויות תוך הגדלת נפחים וכמויות מוחלטות פי 5.
    2. ביום השני, הביאו את נפח התרבית ל-100 מ"ל באמצעות מדיום cCM-F. מחשבים והוספים hIL-7 ו-hIL-15 כדי להגיע לריכוז הסופי של 10 ng/mL בהתאם.
      הערה: בניגוד לפורמט G-24, העיצוב הגבוה יותר של מכשיר G-6M מאפשר נפח בינוני גדול יותר, ומאפשר אספקה יציבה של חומרים מזינים וציטוקינים לאורך כל תקופת הגידול ללא צורך בהחלפת מדיה (גישת "מלא ושכח" ). לכן, אין צורך בציטוקינים נוספים ביום החמישי.
    3. כדי לקצור תאי CAR-T ביום התשיעי, יש להשליך כ-90 מ"ל מדיום מכל באר באמצעות פיפטה סרולוגית ולהחזיר את התאים ל-10 מ"ל הנותרים. העבר תאים לצינור של 15 מ"ל והשתמש בהם לבדיקות הבאות.
  2. התרחבות תאי CIK במכשירי פורמט G-6M
    1. בצע זריעה של PBMCs ביום 0 בהתאם לפרוטוקול המתואר בסעיף 3 ולהגדיל את כל הנפחים והריאגנטים פי 5 כדי להתאים לפורמט המכשיר הגדול יותר (G-6M).
    2. ביום הראשון, כוונו את נפח התרבית לסך של 100 מ"ל עם מדיה cCM. יש להוסיף ריכוז סופי של 500 IU/mL rhIL-2 ו-50 ng/mL אנטי-CD3 לכל באר.
    3. הוספי 500 IU/mL rhIL-2 כל 3-4 ימים (ימים 5, 9 ו-13) לכל באר ללא שינוי בינוני.
    4. קצור תאי CIK ביום ה-14 על ידי הסרת כ-90 מ"ל מדיום מכל באר באמצעות פיפטה סרולוגית. החזירו את התאים ל-10 מ"ל שנותרו, העבירו אותם לצינור של 15 מ"ל, והשתמשו בהם לבדיקות הבאות.

5. אפיון פנוטיפ של תא אפקטור באמצעות ציטומטריית זרימה

הערה: בסיום פרוטוקול ההרחבה, מתבצע ניתוח סמן משטח באמצעות ציטומטריית זרימה על תאי CAR-T ו-CIK להערכת הפנוטיפ שלהם, כולל מצבי התמיינות מובחנים, כלומר, נאיבי (CD45RA+CD62L+), זיכרון מרכזי (CM, CD45RA-CD62L+), זיכרון אפקטור (EM, CD45RA-CD62L-), וזיכרון אפקטור CD45RA חיובי (EMRA, CD45RA+CD62L-; איור משלים 1A-B).

  1. אסוף 3 x 105 תאים לכל צינור צביעה. שטפו תאים ב-1x PBS עם 1% FBS (PBS-F), צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות, והחזירו את כדור התא לתמיסת תערובת נוגדנים של 50 מיקרולטר שהוכנה בבופר צביעה (חלק אחד בופר צבע Brilliant וחלק אחד PBS-F) לפי לוח הצביעה הרצוי (טבלה 1 וטבלה 2).
  2. דגרו את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנים מאור, ואז שטפו את התאים המוכתמים והצנטריפוגה. אם נדרש שלב צביעה שני, יש לבצע את הצביעה עם תערובת הנוגדנים הספציפית, כפי שתואר קודם (שלב 5.1).
  3. לבסוף, שטוף תאים וצביעה עם צבע חיוני, כאן Fixable Viability Stain 780 (FVS780), בנפח 50 מיקרוליטר של 1x PBS, דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנת מאור. שלב שטיפה אינו נדרש לאחר צביעת היתכנות. לאחר הדגירה, הוסף 200 מיקרוליטר של 1x PBS לכל דגימה, וממשיך ברכישת ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית שער מפורטת מוצגת באיור המשלים 1A-B.
יעדשיבוטפלואורוכרוםריכוז/דילולתכלית
שלב הצביעה הראשוןrhCD19-שלו//2 מיקרוגרם/מ"לזיהוי מולקולות CAR
דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות
שלב הכביסה
שלב הצביעה השנישלוGG11-8F3.5.1חינוך גופני1/50זיהוי מולקולות CAR
CD3UCHT1BV5101/40השושלת
CD4SK3BV6501/40השושלת
CD8RPA-T8BV4211/20השושלת
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83בגרות
CD62LDREG-56FITC1/10הנחיתה, הפעלה
דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות
שלב הכביסה
שלב הצביעה השלישיFVS780//1/5000אפליה בין תאים חיים/מתים
דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות

טבלה 1: פאנל נוגדנים המשמש לצביעת תאי CAR-T. פאנל צביעה שימש להערכת ביטוי CAR, פנוטיפ תאי T ומצב התמיינות. מדווחים על שיבוט נוגדנים, ריכוז ופלואורוכרום מצומד לכל מטרה מעניינת.

יעדשיבוטפלואורוכרוםדילולתכלית
שלב הצביעה הראשוןCD56HCD56חינוך גופני1/40השושלת
NKG2D1D11נגמ"ש1/83ההפעלה
CD3UCHT1BV5101/40השושלת
CD4SK3BV6501/40השושלת
CD8RPA-T8BV4211/20השושלת
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83בגרות
CD62LDREG-56FITC1/10הנחיתה, הפעלה
דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות
שלב הכביסה
שלב הצביעה השניFVS780//1/5000אפליה בין תאים חיים/מתים
דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות

טבלה 2: פאנל נוגדנים המשמש לצביעת תאי CIK. לוח צביעה שימש להערכת תת-אוכלוסיות CIK, פנוטיפ ומצב התמיינות. מדווחים על שיבוט נוגדנים, ריכוז ופלואורוכרום מצומד לכל מטרה מעניינת.

6. הערכת הפעילות הציטוטוקסית הספציפית של תאי CAR-T ו-CIK

הערה: הפעילות הציטוטוקסית של תאי CAR-T ו-CIK נמדדת על ידי שילוב תרבותם עם תאי המטרה ביחס תאי אפקטור-למטרה (E:T) הרצוי. סוג הבדיקה תלוי בסוג תאי המטרה, האם הם מקורם בגידולים מוצקים או בממאירות המטולוגית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת צבע פלואורסצנטי לתאי תלייה ובדיקת RTCA (ניתוח תאים בזמן אמת) מבוססת אימפדנס לתאים דבקים.

  1. בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת צבע פלואורסצנטי
    הערה: ניתן להעריך ציטוטוקסיות ספציפית לאנטיגן נגד ממאירות המטולוגית באמצעות בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת צבע פלואורסצנטי. לפני קו-קולטורציה, תאי היעד מסומנים בצבע פלואורסצנטי כדי לאפשר זיהויים. לאחר קולטורציה משותפת עם תאי אפקטור, מוות תאי המטרה מוערך על ידי צביעה בצבע חיוני. ניתוח ציטומטרי זרימה מאפשר כימות של הרג ספציפי לאנטיגן, בהתבסס על שיעור התאים החיוביים לצבע פלואורסצנטי שאינם ברי קיימא.
    1. לכל מצב קו-קולטורציה, לאסוף 2 x 105 תאי מטרה ולהחזיר אותם ל-400 מיקרוליטר של מדיום תרבית מלא כדי להגיע לריכוז סופי של 5 x 105 תאים/מ"ל. הוסף צבע פלואורסצנטי בריכוז סופי של 5 מיקרומולר (כאן צבע Cell Trace Violet, CTV). דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מוגנים מאור. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם מדיום מלא והחזירו את הכדור בריכוז סופי של 4x105 תאים/מ"ל.
    2. יש לשחרר 500 מיקרוליטר של תאי מטרה צבועים (כאן 2 x 105 תאי Raji כדגם תאי יעד עם תלייה CD19+ ) לצינורות נקיים בנפח 5 מ"ל לפי ההגדרה הניסויית. אישור צביעה מוצלחת באמצעות ציטומטריית זרימה על ידי זיהוי תאי מטרה כתאים חיוביים לצבע פלואורסצנטי (SSC-A לעומת CTV). כ-98% מהתאים החיוביים לצבע פלואורסצנטי מומלץ.
    3. במקביל, ספרו והכינו תאי אפקטור (כאן 5 x 106 של תאי CD19 CAR-T) לכל תנאי קו-קולטורה. שטפו את התאים והחזירו אותם למדיום תרבית מלא בריכוז המתאים כדי להתאים ליחס האפקטור-למטרה (E:T) הרצוי. הוסף 500 מיקרו-ליטר של תליית תא האפקטור לכל צינור מתאים המכיל תאי מטרה.
      1. כדי להשיג יחס E:T של 25:1, הוסף 5 תאי CAR-T CD19 עם6 אפקטורים ל-2 תאי מטרה באורך 105 רג'י בכל צינור, והכין את מספר הצינורות הנדרש לעיצוב הניסוי.
    4. דגרו את הקו-תרביות במשך 6 שעות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5%CO2. כלול מצב ביקורת הכולל רק תאי מטרה למדידת מוות תאים ספונטני. בקרה זו חשובה להבחנה בין מוות רקע לבין ציטוטוקסיות ספציפית לתאי אפקטור.
    5. שטפו את התאים המעובדים יחד וצבועו אותם בצבע חיוני FVS780 מדולל ב-1x PBS (דילול סופי 1:5000). דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C, מוגנים מאור. שטפו את התאים והחזירו את כדור התא הסופי ל-600 מיקרוליטר של בופר PBS-F. המשך ברכישת ציטומטריית זרימה להערכת ציטוטוקסיות ספציפית לתא אפקטור.
      1. בצע את אסטרטגיית השער של ציטומטר הזרימה כדלקמן: זהה את תאי המטרה כתאים חיוביים לצבע הפלואורסצנטי (SSC-A לעומת CTV), ואז, בתוך אוכלוסייה זו, חשב את אחוז תאי המטרה המתים (SSC-A לעומת FVS780, איור משלים 1C). חישוב ליזיס ספציפי על ידי הפחתת מוות תאי מטרה ספונטני (%FVS780+ בתוך CTV+ בתנאי המטרה בלבד) מהציטוטוקסיות הספציפית לתא האפקטור (%FVS780+ בתוך CTV+ בתנאי קו-קולטור של אפקטור-מטרה).
  2. בדיקת ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA)
    הערה: מבחן RTCA הוא שיטה להערכת הפעילות הציטוטוקסית של תאי אפקטור מול תאי מטרה דבקים26. מוות תא המטרה מזוהה כהבדל באות ההתנגדות הנובעת מניתוק התאים מלוח ה-E המעורב היטב במכשיר xCELLigence. בצע את בדיקת RTCA בהתאם לפרוטוקול המומלץ על ידי היצרן כדי להבטיח ביצועי בדיקה מיטביים ושחזוריות.
    1. תת-תרבית מתמקדת בתאים יום אחד לפני הבדיקה (יום ראשון) כדי להבטיח שיגיעו למפגש של 60%-80% עד יום 0. שלב זה קריטי לשמירה על התרבות פעילה של התאים בתחילת הניסוי. מומלץ להשתמש בתאי מטרה בין המעברים 5-20, עם מינימום שבוע (3-4 מעברים) לאחר ההפשרה כדי להבטיח ביצועים מיטביים של התאים.
    2. ביום 0, הוסיפו בזהירות 50 מיקרולטר של מדיום תרבית לכל באר של לוח ה-E, הפעילו את הלוח בתוך המכשיר, וקבלו את אות הרקע. לאחר מכן, העבר את הפלטה חזרה למכסה המנוע לשלב הזריעה של התאים.
    3. ספירת תאי מטרה והעבירה את המספר הכולל הנדרש לצינור נקי. החזירו תאים בנפח מתאים של מדיום תרבית כדי להגיע לריכוז הרצוי לזריעה לפלטת E, והעבירו 100 מיקרוליטר של תאי מטרה לכל באר (כאן 4 x 104 תאי MCF-7 כמודל קו תאי גידול דבק). השאר את הלוח בתוך מכסה המנוע בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות כדי להבטיח חיבור אחיד של תאי המטרה. הפעילו את הפלטה בתוך המכשיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוסבאינקובטור CO 2 והתחילו ברכישה בזמן אמת (מרווח רכישה של 15 דקות למשך 22 שעות).
      הערה: בצע טיטרציה של תאי המטרה לפני השימוש בקו תאים יעד חדש, כפי שהומלץ על ידי היצרן.
    4. ביום הראשון (כ-20-22 שעות לאחר זריעת תאי היעד), ספרו את תאי האפקטור והשאירו אותם מחדש במדיום תרבית חדש, תוך התאמת ריכוז התאים להשגת יחס אפקטור למטרה (E:T) הרצוי. לדוגמה, כדי להגיע ליחס E:T של 10:1, הוסף 4 תאי CIK עם5 אפקטורים ל-4 תאי מטרה של 4 x10 4 MCF-7 לכל באר.
    5. הכינו כל תנאי טיפול בכפילים טכניים באמצעות פלטת U-bottom סטרילית עם 96 בארות ואיזון אותה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C. יש לשחרר 50 מיקרו-ליטר של מתלה תא האפקטור לכל מצב באמצעות פיפטה רב-ערוצית. החזר את ה-E-Plate למכשיר והמשך ברכישה בזמן אמת (מרווח רכישה של 15 דקות למשך 24 שעות). חשב ליזיס ספציפי באמצעות המשוואה הבאה:
      משוואה 1

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מספק זרימת עבודה יעילה וחזקה להרחבה ולהנדסה של תאי אפקטור מחוץ לחיים מ-PBMCs מבודדים, כלומר תאי CAR-T ו-CIK. שיטה זו דורשת מניפולציה מינימלית של תאים ומנצלת את קיבולת החלפת הגזים של מכשירי G-Rex, ומספקת זמינות וכמות חמצון עדיפות יותר בהשוואה למערכות תרביות סטטיות קונבנציונליות23,24. יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא יכולת ההרחבה הטבועה בו ממכשירים קטנים של 24 בארות (G-24), המתאימים למחקרים פרה-קליניים, ועד למכשירי 6M גדולים יותר (G-6M), התואמים לצרכי ייצור תרגומיים או קליניים, ללא צורך בשינויים בפרוטוקול מלבד קנה מידה פרופורציונלי.

באמצעות פרוטוקול זה, גם תאי CAR-T וגם תאי CIK הורחבו בהצלחה במקביל מ-PBMCs תורמים בריאים בפורמטים G-24 ו-G-6M, כפי שמתואר בסעיפים 2-4. בסיום תקופת התרבית, שני סוגי התאים הציגו התרחבות קיפול גבוהה וכדאיות, עם התרבות דומה בין שני פורמטי המכשירים (איור 2, טבלה משלימה 1, טבלה משלימה 2), מה שמדגיש את השחזוריות של הפרוטוקול בקני מידה שונים של תרביות.

כדי לאמת את יכולת ההרחבה של מכשירי התרבית, תאי האפקטור אופינו עוד יותר מבחינה פנוטיפית ותפקודית. עבור תאי CAR-T של CD19, כמתנו את ביטוי CAR והערכנו את תת-הקבוצות CD4+ ו-CD8+, תוך הבחנה בדומיננטיות של תאי T מסוג CD19 CAR+ CD8+ (איור 3A-B, טבלה משלימה 1). עבור תאי CIK, הערכנו את תדירות אוכלוסיות T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) ו-CIK (CD3+CD56+) (איור 3D), וכן את ביטוי הקולטן המפעיל NKG2D (איור 3E, טבלה משלימה 2). יתרה מזאת, ראינו פנוטיפים דומים ובביטוי של סמנים ספציפיים בין פורמטי התרבית G-24 ו-G-6M עבור תאי CAR-T ו-CIK. מצב ההבחנה של מוצרי תאי CD19 CAR-T ו-CIK נותח באמצעות צביעת CD62L ו-CD45RA (איור 3C-F, טבלה משלימה 1, טבלה משלימה 2), וחשף זיכרון ופנוטיפים דומים של אפקטור בין תאים שגודלו בפורמטים G-24 ו-G-6M. ממצאים אלו מראים כי הגדלת התהליך אינה פוגעת בשלמות הפנוטיפית או במצב ההתמיינות של אוכלוסיות תאי האפקטור המורחבות.

לבסוף, כדי להעריך עוצמה פונקציונלית, השתמשנו בבדיקות ציטוטוקסיות ספציפיות למטרה. גם תאי CD19 CAR-T וגם תאי CIK שהורחבו באחד מהמכשירים הראו פעילות ציטוליטית חזקה, מה שאישר את שמירת תכונות פונקציונליות בכל קנה מידה (איור 4). בסך הכול, תוצאות אלו תומכות בהתאמת המוצרים המורחבים ליישומים בהמשך הזרם במודלים פרה-קליניים ואולי גם בבדיקות קליניות.

איור 2
איור 2: התרבות וחיוניות של תאי CAR-T ו-CIK של CD19. תאי CAR-T (n = 5) ותאי CIK (n = 6) שהורחבו מ-PBMCs בלוחות G-24 ו-G-6M נאספו ביום 9 ו-14 של ההתרחבות, בהתאמה, לביצוע ספירת תאים והערכת העלייה בקפלים (A-C) ואחוז (B-D) של תאים ברי קיימא. היסטוגרמות מייצגות את הביטוי הממוצע ± סטיית התקן (SD), והנקודות מציינות תורמים בודדים (ראו טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2 לערכים בודדים). הנתונים נותחו באמצעות מבחן t זוגי דו-זנבי (A-C) או מבחן דירוג זוגות תואמים של וילקוקסון דו-זנבי מרובה (B-D), עם תיקון הולם-סידאק להשוואות מרובות (*p < 0.05). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: הערכת הפנוטיפ של תאי CD19 CAR-T ו-CIK התרחבה במכשירי G-24 ו-G-6M. הביטוי של מולקולות CAR בתאי CD19 CAR-T (n = 5) נותח באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להעריך (A) את יעילות ההעברה בפרוטוקולי התרחבות G-24 ו-G-6M, וכן את הביטוי של (B) CD4+/CD8+ ו-(C) תתי-אוכלוסיות נאיביות/זיכרון בתת-הקבוצה CD3+CAR+. הפנוטיפ של תאי CIK בתפזורת (n = 6) נותח באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לבדוק (D) את אחוז CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) ו-T (CD3+CD56-), וכן את הביטוי של (E) NKG2D ו-(F) תת-אוכלוסייה נאיבית/זיכרון בתת-הקבוצה CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). נאיבי (CD45RA+CD62L+), זיכרון מרכזי (CM, CD45RA-CD62L+), זיכרון אפקטור (EM, CD45RA-CD62L-), וזיכרון אפקטור חיובי CD45RA (EMRA, CD45RA+CD62L-). היסטוגרמות מייצגות את הביטוי הממוצע ± SD, והנקודות מציינות תורמים בודדים (ראו טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2 לערכים אישיים). הנתונים נותחו באמצעות מבחן t זוגי דו-זנבי (B-C-D-F) או מבחן דירוג התאמה דו-זנבי של וילקוקסון (A-E), עם תיקון הולם-סידאק להשוואות מרובות (*p < 0.05). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4
איור 4: הערכת CD19 CAR-T וציטוטוקסיות של תאי CIK. (א) ניתוק ספציפי של תאי CD19 CAR-T (כתום, n = 5) או תאי UTD לא מועברים (אפור, n = 5) נגד קו תאי לימפומה של בורקיט ראג'י (כמודל קו תאי תלוי) בוצע באמצעות בדיקת הרג מבוססת ציטומטריה בזרימה של 6 שעות. התוצאות מוצגות כליזה הספציפית הממוצעת ± SD. (B) ציטוטוקסיות של תאי CIK שגודלו ב-G-24 (כחול בהיר, n = 7) או G-6M (כחול כהה, n=6) נגד קו התאים MCF-7 של סרטן השד (כמודל קו תאים דבק) ננטרה כל 15 דקות במשך 24 שעות באמצעות אנלייזר תאים בזמן אמת. התוצאות מוצגות כליזה הספציפית הממוצעת ± SEM. הנתונים נותחו על ידי מבחן מאן-וויטני, תיקון הולם-סידאק להשוואות מרובות (*p < 0.05). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: אסטרטגיית גייטינג המשמשת לניתוחי ציטומטריית זרימה. גרפים מייצגים הממחישים את אסטרטגיות השער עבור (A) תא CAR-T ו-(B) אפיון פנוטיפי של תאי CIK, ו-(C) בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת צבע פלואורסצנטי. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 1: גדילה, חיוניות ופנוטיפ של תרביות תאי CAR-T של CD19 מתורמים בודדים. מספר התאים הכולל, עלייה בקיפול, חיוניות ואפיון פנוטיפי של תאי CD19-CAR T שנקטפו ביום 9 של התרבית במכשירי G-24 ו-G-6M מוצגים עבור כל תורם. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 2: גדילה, חיוניות ופנוטיפ של תרביות תאי CIK מתורמים בודדים. מספר התאים הכולל, עלייה בקפלים, חיוניות ואפיון פנוטיפי של תאי CIK שנקטפו ביום ה-14 של התרבית במכשירי G-24 ו-G-6M מוצגים עבור כל תורם. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר את יישום פלטפורמה יעילה וניתנת להרחבה לייצור שני מוצרי ACT שונים, כלומר תאי CAR-T ותאי CIK, מ-PBMCs המשתמשים במערכות תרביות G-Rex. יישמנו בדיקות פונקציונליות ופנוטיפיות להוכחת היתכנות כדי לאמת את יכולת ההרחבה של הגישה. הראינו כי גם הפנוטיפ וגם הפעילות של התאים המורחבים נשמרים במהלך ההגדלה, מה שמבטיח את התאמת המערכת ליישומים מחקריים ולתרגום קליני ישיר. אכן, הצלחנו להראות שניתן להרחבה יעילה של תאי CAR-T ו-CIK עם תפוקת תאים גבוהה, תוך שמירה על פנוטיפ של אפקטור פונקציונלי וטוטוקסיות אנטיגן ייחודית חזקה בין מכשירי תרבית שונים.

בשילוב עם טכנולוגיית הממברנה החדירה לגז של מכשירי התרבית, פרוטוקול הרחבה זה מוביל לקינטיקת התפשטות מהירה יותר, מפחית טיפול ידני ומאפשר תפוקות גבוהות ועקביות בין התורמים. תכונות אלו הופכות את הפרוטוקול לשכפול גבוה ופחות דורש עבודה בהשוואה למערכות תרביות סטנדרטיות20,21, שלרוב כוללות החלפות מדיה מרובות וסיכון מוגבר לאובדן תאים וזיהום.

יתרה מזאת, פרוטוקול זה מאפשר מעבר חלק בקני מידה ייצוריים: ממערכות פתוחות בקנה מידה קטן (G-24, המתאימות למחקר פרה-קליני וסינון, לדוגמה, של מבני CAR, שילובי ציטוקינים או שונות תורמים) למערכות פתוחות בקנה מידה גדול יותר (G-6M, לאימות קדם-GMP), ולבסוף למערכות סגורות בקנה מידה גדול יותר (לייצור GMP). כפי שמתואר במחקר זה, המעבר ממערכות בקנה מידה קטן למערכות פתוחות גדולות יותר דורש רק התאמות פרופורציונליות בנפח ובקלט התאים יחסית לגודל המכשיר, מה שמייצג יתרון מעשי משמעותי. באופן דומה, היישום היחיד הנדרש למעבר ממערכות פתוחות לסגורות לייצור GMP, ובכך להתאים את פרוטוקול G-6M לייצור GMP בקנה מידה גדול, הוא שימוש בתגובות GMP מתאימות והתקני מערכת סגורה (G-10M-CS עם שטח פנים של 10 ס"מרבוע, המתאים לבאר G-6M אחת, או G-100M-CS עם שטח פנים של 100 ס"מ²), תואם לגרסה הפתוחה של G-100M) ללא כל שינוי נוסף בפרוטוקול עצמו. מכשירים סגורים אלו שונים מהמקבילים הפתוחים שלהם בשילוב חיבורי צינורות סטריליים לטיפול אוטומטי במדיה, הפועלים בשילוב עם משאבת טיפול בנוזלים (GatheRex) ליצירת סביבה סגורה לחלוטין. גישה זו של מערכת סגורה מבטלת החלפות מדיה ידניות ומפחיתה סיכוני זיהום, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד לסביבות ייצור התואמות GMP שבהן סטריליות ושחזוריות הן חיוניות. ראוי לציין כי יכולת ההרחבה מייצגת מאפיין קריטי לגישור הפער בין גילוי בשלבים מוקדמים לתרגום קליני, במיוחד בסביבות אקדמיות או ביוטכנולוגיות מוקדמות עם משאבים מוגבלים.

יישום נוסף של פרוטוקול זה לעמידה מלאה ב-GMP צריך לשקול מעבר ממדיה המכילת FBS לפורמולציות ללא סרום/זנו, בהתאם למגמות הרגולטוריות הנוכחיות של ה-FDA וה-EMA, במטרה לבטל את השונות בין אצווה, להסיר סיכוני זיהום זנוגניים פוטנציאליים ולשפר את הציות לרגולציה27.

יתרה מזאת, ההתערבות המינימלית הנדרשת על ידי מערכת ההרחבה המוצעת מספקת פלטפורמה אידיאלית ליישום פרופילינג פנוטיפי רב-ממדי28 על ידי הפחתת ארטיפקטים שנגרמו על ידי פרוצדורות שעלולים לבלבל ניתוח פנוטיפי במהלך הליכי הייצור. בנוסף, מעבר לתאי CAR-T ו-CIK, המערכת יכולה להיות גמישה מאוד לאוכלוסיות לימפוציטים ותאי חיסון מהונדסים אחרים, מה שהרחיב את תועלתה בפיתוח אימונותרפיה.

למרות שהפרוטוקול חזק ואינו דורש שינויים, מספר שלבים קריטיים במיוחד להצלחה. להתרחבות תאי CIK, תזמון הוספת הציטוקינים חיוני להבטחת התמיינות והתרחבות מיטבית. בתאי CAR-T, ההמרה צריכה להתרחש 24 שעות לאחר ההפעלה כדי למקסם יעילות, ויש להפשיר אליקווטים של לנטיויראל רק פעם אחת, שכן מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים מפחיתים משמעותית את יעילות ההעברה31.

שונות ביולוגית בין תכשירים לתאים ראשוניים תורמת באופן טבעי להבדלים בקצב ההתרחבות ובפעילות התפקודית, המשקפת את המגוון של התורמים. השונות הבלתי נמנעת והפנימית הזו יכולה להיות מנוהלת ביעילות על ידי ביצוע הרחבות מקבילות ממספר תורמים, תוך הבטחת תוצאות חזקות וניתנות לשחזור בין ניסויים.

לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר הרחבה מהירה, ניתנת להרחבה ואמינה של לימפוציטים אפקטוריים פונקציונליים ישירות מ-PBMCs, ומציע גמישות הן למחקר בשלבים מוקדמים והן לתרגום קליני בקנה מידה גדול. מערכת זו ניתנת להתאמה בקלות לסוגי תאים שונים ולשינויים גנטיים, ומספקת פלטפורמה גמישה לפיתוח אימונותרפיה.

תודות

מבנה CAR סופק במסגרת MTA על ידי בית החולים לילדים סנט ג'וד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק G-Rex של ScaleReady לשנת 2025; אוניברסיטת פדובה - SOMMAGGIO_BIRD24_01; קרן AIRC תחת תוכנית 5x1000 2019 - ID. 22759; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. מחקר זה קיבל מימון מ"ריצ'רקה קורנטה" ממשרד הבריאות האיטלקי לכיסוי עלויות הפרסום. הדמויות נוצרו באמצעות GraphPad Prism 9 Software ו-BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בופר כתמים מבריקיםBD ביוסיינסס566349
נוגדן CD28, אנטי-אנושימילטני ביוטק130-093-375שיבוט 15E8
נוגדן CD3, אנטי-אנושימילטני ביוטק130-093-387שיבוט OKT3
CD3 BV510BD ביוסיינסס740147שיבוט UCHT1
CD314 APC (NKG2D)ביולג'נד320808שיבוט 1D11
CD4 BV650BD ביוסיינסס563875שיבוט SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD ביוסיינסס563429שיבוט HI100
CD56 PEביולג'נד318306שיבוט HCD56
CD62L FITCBD ביוסיינסס555543שיבוט FREG-56
CD8 BV450BD ביוסיינסס562428שיבוט RPA-T8
ערכת התרבות תאי סגול CellTraceתרמופישר מדעיC34557
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)תרמופישר מדעיD2650
Dulbecco ו-Prime; s מלח עם בופר פוספט (D-PBS)סיגמא אולדריץ'D5652
לוחית E 16אג'ילנט5469813001
סרום בקר עוברי (FBS), ערךתרמופישר סיינטיפיקA5256701
כתם חיוני 780 שניתן לתיקון (FVS780)BD ביוסיינסס565388
פלטת באר G-Rex 24  וילסון וולף80192M
פלטת באר G-Rex 6M  וילסון וולף80660M
פתרון מאגר HEPESלונזהECM0180D
הנוגדן שלומילטני ביוטק130-120-718
אלבומין אנושי 20%CSL בהרינג
חלבון רקומביננטי IL-15 אנושיPeproTech200-15
חלבון רקומביננטי IL-7 אנושיPeproTech200-07
LSRFortessa X-20BD ביוסיינסס
לימפופרפטכנולוגיות STEMCELL18060
MCF-7ATCCHTB-22קו תאי סרטן השד  
פניצילין וסטרפטומיציןלונזהECB3001D
תמיסה פיזיולוגית (0.9% נתרן כלורי)מוניקו
פרוטמין סולפטסיגמא אולדריץ'P3369
ראג'יATCCCCL-86קו התאים של לימפומה של בורקיט 
IFN-גמא אנושית רקומביננטיתR& D Systems285-IF-100/CF
IL-2 רקומביננטי (פרולוקין)נוברטיס
rhCD19-שלוInvitrogenA42607
מכון רוזוול פארק ממוריאל 1640 (RPMI-1640)EurocloneECB9006L
L-גלוטמין יציבלונזהECB3004D
תמיסת טרייפן-בלוסיגמא אולדריץ'T8154
ניתוח תאים בזמן אמת xCELLigenceאג'ילנט
מדיום תאים המטופואטיים ללא סרום X-VIVO 15לונזה02-053Q

מקורות

  1. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  2. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  3. Cappuzzello, E., et al. How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits. Front Immunol. 14, 1229540(2023).
  4. Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. 30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective. J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).
  5. Bayatipoor, H., et al. Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed. Med Oncol. 40, 29(2022).
  6. Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. Cancer immunotherapy by γδ T cells. Science. 386, 6717(2024).
  7. Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option. J Immunother Cancer. 6, 102(2018).
  8. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  9. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).
  10. Zhang, J., Wang, L. The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review. Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).
  11. Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  12. Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells. Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).
  13. Palmerini, P., et al. A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks. Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).
  14. Pietà, A. D., et al. Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells. J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).
  15. Pievani, A., et al. Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity. Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).
  16. Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies. OncoImmunology. 5, e1199311(2016).
  17. Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells. Front Immunol. 15, 1459175(2024).
  18. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).
  19. Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).
  20. Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy. J Biol Eng. 15, 13(2021).
  21. Smith, T. A. CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25. Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).
  22. Ludwig, J., Hirschel, M. Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform. Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).
  23. Vera, J. F., et al. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J Immunother. 33, 305-315 (2010).
  24. Bajgain, P., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex "M" series. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).
  25. Talleur, A. C., et al. Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy. Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).
  26. Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system. J Vis Exp. (66), e3683(2012).
  27. Eberhardt, F., et al. Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells. Int J Mol Med. 52, 58(2023).
  28. Cadiñanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).
  29. Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor. Front Immunol. 15, 1412378(2024).
  30. Noldner, P. K., et al. Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing. Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).
  31. Bandeira, V., et al. Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks. Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CAR TG Rex2
יצירה יעילה ומהירה של CAR-T ותאי הרג מונעים מציטוקין במכשירים הניתנים להרחבה GMP
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.