מאמר שיטה

מיקום של ממברנת הפלזמה וקולטני אצטילכולין ניקוטיניים תוך-תאיים באמצעות הדמיה כמותית בתאי יונקים

DOI:

10.3791/69371

⸱

19 בדצמבר 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר ביטוי וכימות של תת-יחידות קולטני אצטילכולין נוירונליים באמצעות קו התאים Neuro-2a ביונקים. תגיות פלואורסצנטיות רגישות ל-pH ומיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרים הערכה מדויקת של מיקום הקולטנים בממברנת הפלזמה לעומת אלו המובעים במחלקות תוך-תאי ניטרליות pH, ומסייעים לחקר תנועת nAChR ומודולציה פרמקולוגית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימות קולטני ניקוטין עצביים (nAChRs) המובע על ממברנת הפלזמה של תאי יונקים חשוב לפיתוח טיפולים חדשניים סלקטיביים למטרה ולחקר חלבוני צ'פרון המווסתים את תנועת הקולטנים. מחקר זה מציג סט מתודולוגיות חזק לביטוי nAChR הומומרי והטרומרי בתאי Neuro2a (N2a) ביונקים ולכימות את המיקום פני השטח לעומת התוך-תאי שלהם באמצעות תגיות פלואורסצנטיות רגישות ל-pH. pHuji ו-pHluorin סופר-קליפטי (SEP) הם חלבונים רגישים ל-pH שניתן להנדס לתייג חלבונים רקומביננטיים, מה שמאפשר ויזואליזציה של ההתפלגות המרחבית של תת-יחידות nAChR. תגיות פלואורסצנטיות אלו פולטות ב-pH ניטרלי אך מדוכאות בסביבות חומציות. כדי לעקוב אחר המיקום הפנימי היחסי לעומת ממברנת הפלזמה של תת-יחידות α7, α4 ו-β2 nAChR, מחוברים או pHuji או SEP לקצה C של כל מבנה DNA. כדי לבטא α7-pHuji יחד עם המלווה שלו NACHO, או (α4-SEP; β2-pHuji) בתאי N2a, משתמשים בריאגנט DNA מבוסס ליפידים. תגובת הטרנספקציה ו-DNA הפלסמיד מודגרים בנפרד במדיום סרום מופחת בטמפרטורת החדר, ואז משולבים ליצירת קומפלקסים של DNA ליפידי שמקלים על העברת הפלסמיד לתאים. לאחר הדגירה, תאים מדומים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים בתנאי pH גבוה ונמוכים או בנוכחות ליגנד פלואורסצנטי סלקטיבי תת-סוג. התמונות מנותחות באמצעות פלואורסצנציה כוללת מתוקנת בתעלות הפלואורופור הרלוונטיות, ומספקות מידע כמותי על התפלגות תת-יחידות nAChR מתויגות פלואורסצנטיות בין ממברנת הפלזמה לתחום התוך-תאי. הדמיה קונפוקלית של תאים חיים מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר מיקום תת-יחידות nAChR כדי להבחין בהבדלים בין אוכלוסיות הקולטנים הפנימיות לאוכלוסיית השטח. ביטוי ממברנת פלזמה עמיד של α7-pHuji או (α4-SEP; β2-pHuji) מושג בתוך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכלול משייכים נוספים, תת-יחידות עזר או ליגנדים פלואורסצנטיים לחקר תנועת nAChR, מודולציה פרמקולוגית ושינויים הקשורים למחלות בביטוי nAChR.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קולטני אצטילכולין ניקוטיניים נוירונליים (nAChRs) הם תעלות יונים טרנסממברנליות עם שערי ליגנד המובעות על ממברנת הפלזמה של סוגי תאים רבים, כולל נוירונים, תאי גליה ותאי חיסון. קולטנים אלו מורכבים מתת-יחידות α (α2-α10) או β (β2-β4) שמתאספות ליצירת תת-סוגים הומומריים או הטרומריים, כאשר α7 ו-α4β2 nAChR הם הנפוצים ביותר במוח 1,2. דיסרגולציה של תת-הסוגים הללו נקשרה למחלת אלצהיימר, הפרעת שימוש בניקוטין, אפילפסיה היפרמוטורית הקשורה לשינה, מחלת פרקינסון ודיכאון מג'ורי,בין מצבים נוירולוגיים ופסיכיאטריים נוספים 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . שיטות מהירות ואמינות לביטוי וכימות של nAChR הן חיוניות להבנת מנגנוני המחלה ולפיתוח טיפולים סלקטיביים למטרות מטרה. עם זאת, השגת ביטוי חזק של קולטנים אלו בפלזמה היא לעיתים קרובות מאתגרת וגוזלת זמן. השיטה המתוארת כאן מאפשרת ביטוי חזק על פני השטח של nAChRs בתוך כ-24 שעות לאחר העברת DNA וניתן לשלב אותה עם ליגנדים או חלבוני צ'פרון המווסתים את תנועת הקולטנים.

קיימות מספר גישות לביטוי nAChRs, כולל טרנספקציה זמנית של DNA או יצירת קווי תאים יציבים שמבטאים את תת-הסוג הרצוי. למרות שיצירת קווי תאים יציבים שימושית למחקרים ארוכי טווח עם אותו תת-סוג קולטן, התהליך דורש עבודה רבה ויכול להידרש מספר חודשים. לאחר הקמתם, קווי תאים כאלה עשויים להציג ביטוי משתנה של קולטנים במעברים, אובדן ביטוי לאורך זמן, או הטיית בחירה עבור שיבוטים עם תפקוד או צפיפות לא אופטימלית של קולטנים13. ירידה בטמפרטורת הדגירה מ-37°C ל-30°C, הוספת שפרונים מולקולריים כמו ניקוטין, או הארכת זמן הדגירה יכולים לקדם ביטוי פני שטח 13,14,15. מגבלות אלו בולטות במיוחד עבור nAChR הטרומריים, שדורשים הרכבה ותנועה נכונה של תת-יחידות, ובמחקרים המתמקדים בוויסות קולטנים בעזרת מלווה. לכן, יש צורך באימות שגרתי של ביטוי תת-סוג קולטנים בין מעברים כאשר עובדים עם קווי תאים יציבים המבטאים nAChR.

לעיתים קרובות, חוקרים מתעניינים בווריאנטים של תת-יחידות nAChR ובתת-יחידות חלבון צ'פרון או עזר, ולכן נדרשים לבטא מגוון DNA ברצף מהיר כדי לאפשר גמישות מהירה בבדיקות שלהם. ביטוי חולף של nAChRs הוא יתרון בהקשר זה, שכן ניתן להשלים את התהליך במהירות, מה שמאפשר לחוקר לחקור מספר תת-סוגים של קולטנים או תנאים ניסיוניים מבלי להמתין חודשים ליצירת קווי תאים יציבים. תופעה נפוצה, אפילו בביטוי חולף, היא שרבים מ-nAChR נשארים בתוך התא 24 שעות לאחר האינדוקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מה שדורש תקופות דגירה נוספות של > 48 שעות16,17. לדוגמה, ללא חלבון הצ'פרון העמיד למעכבים של הכולינסטראז (RIC)-3, רק ~1% מ-α7 nAChR מבוטאים על ממברנת הפלזמה של תאי SHE-P ביונקים18. בביטוי משותף של RIC-3, כ-20% מ-α7 nAChR מזוהים על פני השטח. למרות שזה מייצג שיפור, שפע הקולטנים הכולל נשאר נמוך. ביטוי משותף של α7 nAChRs עם NACHO יכול לשפר עוד יותר את ביטוי פני השטח, אם כי עדיין פחות מ-40% מסך אוכלוסיית הקולטנים עוברים לממברנת הפלזמה19. גישה נוספת כוללת דגירה של תאים שעברו טרנספקט בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי לשפר את ביטוי ממברנת הפלזמה20,21. עבור α4β2 nAChR, ירידה זו בטמפרטורה יוצרת עלייה פי חמישה בצפיפות הקולטנים על פני השטח ללא עלייה מקבילה בחלבון תת-היחידההכולל 21. עם זאת, שיפור זה דורש לפחות יום נוסף נוסף ושימוש רב יותר בצרכנים, תגובות ומכשירים.

העבודה המוצגת מציעה מערך שיטות אופטימיזציות לביטוי וכימות תת-סוגים ספציפיים של nAChR בתוך 24 שעות לאחר הטרנספקציה בתאי N2a ביונקים, עם השגת כ-83% עבור α7, 77% עבור α4, ו-56% לתת-יחידות β2 הממוקמות בממברנת הפלזמה. במקרה של α7 nAChRs, ניתן לכמת את ביטוי ממברנת הפלזמה באמצעות α7 סלקטיבי פלואורסצנטי α-בונגרוטוקסין (αBTX) או באמצעות תיוג פלואורסצנטי רקומביננטי. כדי לסמן כל תת-יחידה, החלבונים הפלואורסצנטיים הרגישים ל-pH pHuji ו-pHluorin סופר-אקליפטי (SEP)22,23,24 מהונדסים על קצה C של תת-יחידות nAChR25,26. pHuji ו-SEP הם וריאנטים רגישים ל-pH של חלבונים פלואורסצנטיים אדומים וירוקים, בהתאמה, שזוהרים ב-pH 7.4 אך מדוכאים בתנאים חומציים יותר27,28. מכיוון שפלואורסצנציה של SEP ו-pHuji מדוכאות ב-pH < 6, כל אות תוך-תאי שנצפה משקף פלואורופורים הממוקמים במחלקות ניטרליות ולא על ממברנת הפלזמה. ראוי לציין שחלק מהאברונים, כמו מכשיר גולג'י, מכילים לומן חומצי; לכן, פלואורופורים המחוברים לאזור C-טרמינל של תת-יחידות nAChR אינם מזוהים כאשר תת-היחידות עוברות דרך נתיב ההפרשה29. ההבדל בין פלואורסצנציה כוללת ב-pH 7.5 לבין זה ב-pH < 6 מייצג את האות שנוצר על ידי nAChRs הממוקם על ממברנת הפלזמה. צילום תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של תא חי מספק רזולוציה מרחבית גבוהה, המאפשרת כימות מדויק של מיקום תת-יחידות. בנוסף, ביצוע כל הניסויים על תאים חיים מאפשר לכל תא לשמש כבקרה עצמאית, תוך התחשבות בשונות בביטוי החלבונים בין תאים בכל קבוצת טיפול30. שיטה זו ניתנת להתאמה נוספת לכלול חלבוני צ'פרון נוספים, כגון NACHO או אחרים, לחקר הברחת nAChR. יישומים נוספים כוללים מודולציה פרמקולוגית, שילוב תת-יחידות עזר, וניתוח שינויים בביטוי nAChR הקשורים למחלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ההליך הבא מתאר שיטות שנעשה בהן שימוש מוצלח להעברה זמנית של קו התאים N2a עם תת-יחידות nAChR (איור 1). ביטוי חזק של ממברנת הפלזמה מושג תוך 24 שעות, כפי שנלכד במיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים.

figure-protocol-1
איור 1: הצגה סכמטית של השיטות הבודדות המוצגות בפרוטוקול. תאים גדלים עד שהם מגיעים ל-70%-80% מתאחדים בצלחות הדמיה. התאים מטופלים לאחר מכן בריאגנט הטרנספקציה ובקומפלקס ה-DNA. (למעלה) 24 שעות לאחר מכן, ניתן לטפל בתאים בליגנד מתויג פלואורסצנטי כדי לסמן תת-יחידות המובעות על ממברנת הפלזמה ואז להדגמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. (למטה) לחילופין, עבור גנים תת-יחידות של nAChR שעברו שינוי לתויג עם חלבון רגיש ל-pH 24 שעות לאחר הטרנספקציה, ניתן לדמות תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי ללכוד את הפלואורסצנציה הכוללת של התאים. בופר ההדמיה pH 7.4 מוחלף לאחר מכן לבופר הקירור pH 5.5. זה יפסיק את הפלואורסצנציה של החלבונים הרגישים ל-pH המסומנים לתת-יחידות nAChR הממוקמות על ממברנת הפלזמה של התא, ויאפשר רק לתת-היחידות הפנימיות להישאר פלואורסצנטיות. אותם תאים מוצגים שוב. ניתוח תמונה מתבצע באמצעות ImageJ לכימות הביטוי של תת-יחידות פנימיות וחיצוניות. ניתן לשנות פרוצדורות אלו לשילוב חלבונים מלווים וחלבונים עזר. נוצר ב-BioRender. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

1. טרנספקציה חולפת של N2a nAChR

הערה: קו התאים N2a נבחר משום שהוא מציג פנוטיפ נוירוני וביטוי אנדוגני נמוך של nAChRs. תת-הגנים α7-pHuji, α4-SEP ו-β2-pHuji מאוחסנים כל אחד בנפרד בווקטור הביטוי pcDNA3.1(+) היונקי. חלבון הצ'פרון NACHO מבוטא מ-pREP9 (שניתן בנדיבות על ידי ד"ר ר. לורינג, אוניברסיטת נורת'איסטרן). בכל השלבים, השתמשו בטכניקות סטריליות ועבדו בתוך ארון בטיחות ביולוגית. לבשו מעיל מעבדה נקי, משקפי מגן וכפפות. נקה את כל החומרים הנכנסים או היוצאים מארון הבטיחות הביולוגית עם 70% אתנול. השלבים הבאים מתארים טרנספקציה בצלחת זכוכית מצופה פולי-די-ליזין בקוטר 35 מ"מ, המתאימה להדמיה. ניתן להתאים את הנפחים לפי הצורך עבור כלי גידול שונים.

  1. תרבית תאי N2a בבקבוק תרבית רקמה T25 (או דומה) המכיל את המדיום החיוני המינימלי של איגל (EMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ואם נדרש, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ עד שהתאים מגיעים ל-~90% קונפלינסי. תדמיין באמצעות אובייקטיב של מיקרוסקופ אור 4x.
  2. יש לעקוב אחרי המפגש מדי יום באמצעות מיקרוסקופ קל ולהחליף את מדיום הגידול כל יום-יומיים כדי לשמור על תנאים מיטביים. כאשר התאים מגיעים ל-~90% קונפלינציה, הם מוכנים לעבור לתוך צלחות הדמיה.
  3. חמם מראש את כל התגובות ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים. נקה את ארון הבטיחות הביולוגית ואת כל החומרים עם 70% אתנול לפני תחילת ההליך.
    זהירות: 70% אתנול הוא נוזל ואדים דליקים מאוד שיכולים לגרום לגירוי חמור בעיניים. הימנע מחום, ניצוצות, להבות פתוחות ומקורות הצתה אחרים. אחסן באזור מאוורר היטב עם מיכלים סגורים היטב. לבש כפפות מגן והגנה לעיניים/פנים בעת הטיפול. במקרה של מגע עם עור או עיניים, יש לשטוף מיד במים ולפנות לטיפול רפואי אם הגירוי נמשך. ניתן להשתמש במקום זאת חומר חיטוי חלופי, כמו תמיסת אקונומיקה של 5%-10%.
  4. שאופי את המדיום הישן מהבקבוקון ושוטפים תאים עם 5 מ"ל של PBS. מוסיפים 1 מ"ל טריפסין לבקבוק וסובבו בעדינות. דגור עד שהתאים מתרוממים (<5 דקות). כדי למנוע עיכול יתר, הוסף מיד 4 מ"ל של מדיום גדילה EMEM ופיפט עדין ליצירת תלייה חד-תאית.
  5. באמצעות המוציטומטר, קבעו את ריכוז התאים וחישבו את נפח המדיה הנדרשת של EMEM כדי לכוון את התלייה כך ש-1 מ"ל יכיל 0.5-2 x 10⁵ תאים.
  6. יש לוחית 1 מ"ל של תליית תא לכל צלחת של 35 מ"מ ולהוסיף מספיק מדיום גידול EMEM כדי להביא את הנפח הכולל ל-2 מ"ל. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. התאים מוכנים לטרנפקציה ב-70%-80% קונפלוקציה.
  7. ביום הטרנספקציה, מגיבים לפני חימום ל-37 מעלות צלזיוס, מפשירו לחלוטין את DNA תת-היחידה של nAChR, ומביאים את מגיב הטרנספקציה לטמפרטורת החדר. נקה את כל המגבים עם 70% אתנול לפני שמניחים אותם בארון הבטיחות הביולוגית.
  8. לביטוי α7 nAChR: בצינור מיקרוצנטריפוגה, מדללים 4 מיקרוגרם של α7 (1 מיקרוגרם/μL) ו-1 מיקרוגרם של NACHO (1 מיקרוגרם/מיקרוליטר) של DNA פלסמיד יורד לתוך מדיום סרום מצומצם (ללא אנטיביוטיקה) לנפח סופי של 250 מיקרוליטר. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג לאחר הוספת DNA.
    1. לביטוי α4β2 nAChRs: דילל 4 מיקרוגרם מכל DNA תת-יחידה בסך הכל 250 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג. כוונן את היחס של כל תת-יחידה כדי לייעל ביטוי של איזופורמים ספציפיים של קולטנים.
    2. כדי לבטא α4β2 nAChRs עם פלסמיד נוסף, מוסיפים כמויות שוות של DNA של כל פלסמיד. החלבון הפלואורסצנטי הכחול mTagBFP2³¹ ב-pcDNA3.1(+) משמש כפלסמיד בקרה וניתן להחליפו בכל צ'פרון α4β2.
  9. ערבבו בעדינות את תגובת הטרנספקציה של ה-DNA לפני השימוש. בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד, מדלל 8 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה ב-250 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. המשך לשלב הבא תוך 25 דקות.
  10. לאחר 5 דקות, משלבים את ה-DNA המדולל עם תגובת הטרנספקציה המדוללת (סך הכל = 500 מיקרוליטר) בירידה. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. קומפלקסי DNA-ליפידים נשארים יציבים עד 6 שעות.
  11. בזמן שהקומפלקסים נוצרים, יש להסיר את צלחות התרבית מהאינקובטור ולהחליף את המדיום ב-1 מ"ל EMEM ללא סרום (ללא אנטיביוטיקה).
  12. הוסף 500 מיקרו-ליטר של קומפלקס ה-DNA-transfection לכיוון הזרם לכל צלחת (נפח סופי = 1.5 מ"ל). ערבבו בעדינות על ידי נדנוד הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד על פני המנה, במיוחד על פני משטח הזכוכית. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ואז החליפו את המדיום לאחר 4-6 שעות כדי לקדם את בריאות התא.

2. תיוג תאים חיים של α7 nAChRs המובע על ידי ממברנת הפלזמה באמצעות αBTX Alexa Fluor 647

הערה: ההליך הבא מתבצע בדרך כלל 24 שעות לאחר הטרנספקציה. הגנו על αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) מאור כדי למנוע הרס פוטואור של הפלואורופור.

  1. חימום כל החומרים ל-37 מעלות צלזיוס והפשרה של תמיסת αBTX-AF647 (2.3 מיקרומון). נקה עם 70% אתנול ומניח בארון הבטיחות הביולוגית.
  2. הוצאו את הצלחת המכילה את התאים שהועברו ל-α7 ו-DNA של NACHO מהאינקובטור, נקו את החלק החיצוני עם 70% אתנול, והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגית.
  3. זרוק את המדיום הישן בשאיבת ואקום. כדי לשטוף את התאים, הוסף 2 מ"ל של מדיום גידול טרי של EMEM.
  4. הסר את מדיום הכביסה בשאיבת ואקום. הוסיפו 2 מ"ל מדיום גידול EMEM למנות.
  5. החלפת כמות המדיה המתאימה ב-αBTX-AF647 כדי להגיע לריכוז סופי של 80 ננומטר. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  6. בבוקר, חימום מוקדם של PBS או מדיום הדמיה מועדף ונקה עם 70% אתנול. העבר לארון הבטיחות הביולוגית.
  7. הסר תאים שהועברו מהאינקובטור, נקה, והנח אותם בארון הבטיחות הביולוגית.
  8. הסר את המדיום הישן המכיל αBTX-AF647 והנח אותו במיכל פסולת מתאים.
  9. שטוף תאים עם 2 מ"ל PBS ל-3 פעמים, 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. השטיפות מסירות את הליגנד והלכלוך, וניתן לשנות את הזמן כדי להתאים לצרכי החוקר. הסר את ה-PBS אחרי כל כביסה.
  10. הוסף 2 מ"ל של PBS או מדיום הדמיה מועדף והמשך להדמיית תאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

3. הדמיית תאים חיים של α7-pHuji nAChRs כולל ופנימי

הערה: ההליך הבא עושה שימוש בפלסמיד α7-pHuji pcDNA3.1 שמיוצר בבית, המשולב יחד עם המלווה NACHO. פרוטוקול דומה שימש לביטוי α4-SEP ו-β2-pHuji ב-pcDNA3.1 עם הפלסמיד הבקרה mTagBFP2 pcDNA3.1, כפי שמתואר בסעיף התוצאות. הגנו על דגימות מפני אור לאורך כל התהליך כדי למנוע הרס פוטואורי של הפלואורופור.

  1. הכינו בופר הדמיה pH 7.4 (טבלה 1) ובופר קירור pH 5.5 (טבלה 2) כפי שמתואר23.
  2. חימום מוקדם ל-37 מעלות צלזיוס, ניקוי עם 70% אתנול, והעבר לארון הבטיחות הביולוגית. הסר את התאים המועברים מהאינקובטור, נקה עם 70% אתנול, והנח אותם בארון הבטיחות הביולוגית.
  3. הסר את המדיום הישן בשאיבה. שטוף את הצלחת עם 2 מ"ל PBS ל-3 פעמים, 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. הוסיפו 2 מ"ל של בופר הדמיה pH 7.4.
  4. הביאו את המנה למיקרוסקופ הקונפוקלי. הכנס את צלחת ההדמיה עם בופר הדמיה pH 7.4 למחזיק השקופית ומניח את המחזיק בתא הסביבתי המחמם מראש במיקרוסקופ הקונפוקלי.
  5. חבר את צינור המשאבה הפריסטלטית למחזיק צלחות ההדמיה וסגור את החדר.
  6. פתח את תוכנת ההדמיה ובחר לייזרים עבור הפלואורופורים המעניינים (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm, ו-mTagBFP2 359/461 nm).
  7. סרוק את הצלחת כדי לאתר תאים להדמיה באמצעות אובייקטיב 10x-60x. הגדילו את ההגדלה במידת הצורך והתאימו את עומק המיקוד לפי הצורך.
  8. כוון את עוצמת הלייזר ורגישות הגלאי כדי להמחיש את הפלואורסצנציה ללא אות רקע. כוון את הצמצם כדי להעלות את אות הפלואורסצנציה, אם צריך.
  9. בחר את הרזולוציה המועדפת וצלם את התמונה היחידה באמצעות המטרה הרצויה (למשל, 60x).
  10. רשמו את המיקום במפת הצלחת כדי להעביר את אותם תאים לאחר שינוי הבופר לבופר pH 5.5 לקירור pH 5.5.
  11. חזור על תהליך ההדמיה למספר אזורים בצלחת, והקלט כל מיקום חדש. השתמש באותן הגדרות לכידה לכל התמונות (קבוצות ניסוי וביקורת) כדי לאפשר השוואות תקפות.
  12. כשמשאירים רק את קו היציאה מחובר למשאבה הפריסטלטית, שואבים לאט את בופר ה-pH 7.4 מהצלחת אל מיכל פסולת.
  13. כאשר רוב הבופר מוסר (ללא ייבוש תאים), העבר את קו הכניסה לבופר הקירור pH 5.5.
  14. הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי להוסיף בופר pH 5.5 באיטיות (1.5 מ"ל לדקה) לצלחת, כדי להבטיח שהתאים נשארים מחוברים.
  15. הפעל את המשאבה במשך 20 דקות, תוך הבחנה שהבופר זורם נכון פנימה והחוצה מהצלחת.
  16. כבה את המשאבה ודוגר את התאים עם בופר הקירור pH 5.5 למשך 20 דקות נוספות כדי לאפשר שיווי משקל.
  17. כדי לחזור על ההדמיה, טען את המיקומים השמורים מהמפגש הקודם כדי לחזור לאותם אזורים.
  18. ודאו שעומק המוקד והמיקום נכונים, שכן הם עשויים להשתנות לאחר החלפת הבופר.
  19. חזרה על הדמיה בכל המיקומים השמורים בתנאי pH-קוונץ'.
מגיבריכוז (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl21.8
HEPES20
d-גלוקוז1
כוון את התמיסה ל-pH 7.4

טבלה 1: מתכון לבופר הדמיה. החומרים הבאים נוספו יחד, והתמיסה הותאמה ל-pH 7.4.

מגיבריכוז (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
d-גלוקוז1
כוון את התמיסה ל-pH 5.5

טבלה 2: מתכון לכיבוי בופר. החומרים הבאים עורבבו יחד, והתמיסה שהתקבלה הותאמה ל-pH של 5.5.

4. כימות תמונה

הערה: הליך זה מסביר כיצד לנתח תמונות תאים באמצעות ImageJ (המכון הלאומי לבריאות, Bethesda, MD) ושיטת הפלואורסצנציה הכוללת של התא המתוקנת (CTCF)32.

  1. פתח את ImageJ ופתח את התמונה לניתוח. התמונה תופיע כמחסנית כאשר כל ערוץ שצולם מופרד בתוך אותו פריים.
  2. נווט לערוץ הפאזה . אם התמונה בהירה מדי (נפוץ באזורים ריקים או רקע), בחר תהליך > שיפור ניגודיות, ואז לחץ על אישור.
  3. באמצעות כלי זכוכית מגדלת, התקרב (+) לתא אחד. באמצעות כלי הבחירה Freehand, עקבו אחרי קווי המתאר של התא בערוץ הפאזה.
  4. עברו לערוץ הפלואורסצנטי המתאים לפלואורופור הרצוי. הגדר את המדידות הרצויות על ידי בחירת ניתוח > Set Measurements. ודאו ששטח, ערך אפור ממוצע וצפיפות משולבת נבדקו.
  5. כדי למדוד את האזור הנבחר, בחר ב-Analyze > Measure או לחץ על Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).
  6. בצע שלוש מדידות רקע על ידי מעקב אחרי אזורים ריקים ליד התא. חזור על השלבים עבור מספר התאים הרצוי.
  7. נתוני מדידה יופיעו בחלון תוצאות נפרד ב-ImageJ. העתק והדביק את הנתונים האלה ל-Excel לניתוח.
  8. חשב את ממוצע הרקע הממוצע מתוך שלוש מדידות הרקע.
  9. חשב את ערך ה-CTCF עבור כל תא באמצעות הנוסחה הבאה:
    CTCF=צפיפות משולבת−(שטח התא x פלואורסצנציה רקע ממוצעת)
  10. חזרו על תהליך זה עבור מספר תאים ותמונות עבור כל קבוצת ניסוי (ותנאי pH, אם רלוונטי). ייצוא את כל התוצאות לתוכנת ניתוח נתונים לעיבוד סטטיסטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר פרוצדורות הטרנספקציה הנ״ל, α7 nAChRs וחלבון NACHO chaperone בוטאו יחד בתאי N2a. גם התאים שלא עברו טרנספקציה וגם שתאים שעברו טרנספקט סומנו ב-αBTX-AF647 24 שעות לאחר טרנספקטציה DNA. מכיוון ש-αBTX אינו חדיר לממברנה, כל הפלואורסצנציה שמזוהה נובעת מקולטנים הנמצאים על ממברנת הפלזמה. באיור 2A,A′, נצפתה צביעת αBTX-AF647 חלשה בתאי N2a שלא עברו טרנספקציה, כפי שמצופה. תאי N2a מבטאים באופן אנדוגני כמות קטנה של α7 nAChR, מה שמסביר את הסימון המינימלי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתודולוגיות שהוצגו לביטוי וכימות תת-יחידות nAChR בתאי N2a ביונקים מתמודדות עם אתגרים ארוכי טווח בהשגת ביטוי מהיר (~24 שעות) ושופע של nAChR (> 60%) בממברנת הפלזמה לגילוי, לוקליזציה ומחקרי סחר תרופות. חוזק מרכזי של מערך פרוטוקולים זה הוא ההתאמה שלו הן ל-nAChR הומומרי (α7) והן להטרומרי (α4β2), וסביר שהוא ישים לתת-סוגים אחרים של nAChR, יחד עם הביטוי המשותף של חלבוני צ'פרון. באמצעות תוויות רגישות ל-pH כמו SEP ו-pHuji, הגישה מאפשרת הבחנה וכימות בין תאים חיים בין אוכלוסיות nAChR של ממברנת הפלז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לג'יימס יאנוסו על מומחיותו במיקרוסקופיה טכנית ולמרכז למחקר טרנספורמטיבי במטבוליזם (המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר P20GM130443) על תמיכתו בליבת המיקרוסקופיה באוניברסיטת אלסקה פיירבנקס. מאמציו של LW נתמכו חלקית על ידי מימון מקרן ההשקעות להשכלה גבוהה, שסופקה על ידי מדינת אלסקה דרך אוניברסיטת אלסקה. מאמצי SMS נתמכו על ידי פרס פיתוח מוסדי (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות במסגרת מענק מספר P20GM103395. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש של המכון הלאומי לבריאות (MMW לפי פרס מספר R03MH135358) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (MMW לפי פרס מספר R16GM150455) של המכון הלאומי לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTA (1X) גיבקו25200-056תגובת ניתוק תאים
אלפא-בונגרוטוקסין אלקסה פלואר 647InvitrogenB35450קונוגט אלפא-בונגארוטוקסין
ארון בטיחות ביולוגית ברמת BSL 1 נוארהNU-425-400אזור עבודה לתרבות תאים סטרילית
כלוריד סידןאוונטור/VWRBDH9224רכיב מאגר
D-(+)-גלוקוזMilliPore Sigma G8270רכיב מאגר
EMEM עם L-גלוטמיןATCC30-2003מדיום תאים
DNA נטול אנדוטוקסיןמיוצר בתוך הבית באמצעות ערכות Zymoלא רלוונטיDNAים של nAChR לשימוש בטרנספקציות חולפות של תאים
צינורות מיקרוצנטריפוגה ללא אנדוטוקסין, 0.5 מ"ל אוונטור/VWR89000-010DNA והכנת טרנספקטציה
צינורות מיקרוצנטריפוגה ללא אנדוטוקסין, 1.5 mL אוונטור/VWR20170-038DNA והכנת טרנספקטציה
סרום בקר עובריאוונטור/VWR97068-085תוסף סרום
Fluoview FV10iאולימפוסFV10iמיקרוסקופ קונפוקלי
צלחות MatTek עם תחתית זכוכיתMatTekP35GC-0-10-Cצלחות הדמיה
GraphPad Prism v. 10פריזמת GraphPadhttps://www.graphpad.com/featuresתוכנת ניתוח נתונים
HEPESMilliPore Sigma H3375רכיב מאגר
ליפופקטמין 2000Invitrogen11668019תגובת טרנספקציה
מגנזיום כלוריד הקסיהידרטתרמו-מדעי413410025רכיב מאגר
MES הידרטיMilliPore Sigma M5287רכיב מאגר
mTagBFP2-pBADAddGene 54572DNA בקרה שישמש לטרנספקציה חולפת של תאים&nb;
תאי נוירו-2a (N2a)אוסף תרבות הטיפוס האמריקאיתCCL-131תאים המשמשים לטרנספקציות DNA ולביטוי nAChR
אופטי-MEMגיבקו31985-070מדיום סרום מופחת
פניצילין/סטרפטומיציןאוונטור/VWRK952-100mLאנטיביוטיקה
משאבת פריסטלטיקהגילסוןMiniPuls3הבופר משתנה בזמן הדמיה 
סליין ממוגן בפוספטאיכות ביולוגית119-069-131בופר מלח
פיפט איידדרומונד  140084העברת נוזל מדויקת
קצות פיפט (סטריליים וללא אנדוטוקסין, 1000 מיקרוליטר)ריינין30389216העברת נוזל מדויקת
קצות פיפט (סטריליים וללא אנדוטוקסין, 20uL)ריינין30389229העברת נוזל מדויקת
קצות פיפט (סטריליים וללא אנדוטוקסין, 250uL)ריינין30389246העברת נוזל מדויקת
פיפטות, עמוד 10Rainin L-10XLSהעברת נוזל מדויקת
פיפטות, P100Rainin L-100XLSהעברת נוזל מדויקת
פיפטות, P1000Rainin L-1000XLSהעברת נוזל מדויקת
כלוריד אשלגןMilliPore Sigma P3911רכיב מאגר
פיפטות סרולוגיות (סטריליות וללא אנדוטוקסין, 10 מ"ל)אוונטור/VWR89130-898העברת נוזל מדויקת
פיפטות סרולוגיות (סטריליות ונטולות אנדוטוקסין, 25 מ"ל)אוונטור/VWR89130-900העברת נוזל מדויקת
פיפטות סרולוגיות (סטריליות ונטולות אנדוטוקסין, 5 מ"ל)אוונטור/VWR76201-710העברת נוזל מדויקת
פיפטים סרולוגיים (סטריליים ונטולי אנדוטוקסין, 50 מ"ל)אוונטור/VWR75816-088העברת נוזל מדויקת
כלוריד נתרןאוונטור/VWRBDH9286רכיב מאגר
בקבוק תרבית רקמותפלקון353109גידול כלים
ערכת מקסיפרפ פלסמיד ZymoPure IIמחקר זימוD4203-A + D4203-Bייצור DNA נטול אנדוטוקסינים
α 4-ספטמבר ThermoFisher Scientific GeneArt שירותי סינתזת גנים    https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlשירותי סינתזת גנים מותאמים אישית
α 7-פוג'יטוויסט ביוסיינסhttps://www.twistbioscience.com/שירותי סינתזת גנים מותאמים אישית
&בטא; 2-פוג'יThermoFisher Scientific GeneArt שירותי סינתזת גנים    https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlשירותי סינתזת גנים מותאמים אישית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
  2. Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann New York Acad Sci. 757 (1), 48-72 (1995).
  3. Picard, F., et al. Alteration of the in vivo nicotinic receptor density in ADNFLE patients: a PET study. Brain. 129 (8), 2047-2060 (2006).
  4. Breese, C. Abnormal Regulation of High Affinity Nicotinic Receptors in Subjects with Schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 23 (4), 351-364 (2000).
  5. De Luca, V., Voineskos, S., Wong, G., Kennedy, J. L. Genetic interaction between α4 and β2 subunits of high affinity nicotinic receptor: analysis in schizophrenia. Exp Brain Res. 174 (2), 292-296 (2006).
  6. Maskos, U., et al. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436 (7047), 103-107 (2005).
  7. Picciotto, M. R., et al. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391 (6663), 173-177 (1998).
  8. Staley, J. K. Human Tobacco Smokers in Early Abstinence Have Higher Levels of β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors than Nonsmokers. J Neurosci. 26 (34), 8707-8714 (2006).
  9. Gotti, C., Zoli, M., Clementi, F. Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance. Trends Pharmacol Sci. 27 (9), 482-491 (2006).
  10. Mineur, Y. S., Mose, T. N., Blakeman, S., Picciotto, M. R. Hippocampal α7 nicotinic ACh receptors contribute to modulation of depression-like behaviour in C57BL/6J mice. British J Pharmacol. 175 (11), 1903-1914 (2018).
  11. Fernandes, S. S., et al. Enhanced cholinergic-tone during the stress induce a depressive-like state in mice. Behav Brain Res. 347, 17-25 (2018).
  12. Ren, J. M., Zhang, S. L., Wang, X. L., Guan, Z. Z., Qi, X. L. Expression levels of the α7 nicotinic acetylcholine receptor in the brains of patients with Alzheimer's disease and their effect on synaptic proteins in SH-SY5Y cells. Mol Med Rep. 22 (3), 2063-2075 (2020).
  13. Letchworth, S. R., Whiteaker, P. Progress and Challenges in the Study of α6-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem Pharmacol. 82 (8), 862-872 (2011).
  14. Nelson, M. E., et al. Functional Properties of Human Nicotinic Achrs Expressed by Imr-32 Neuroblastoma Cells Resemble Those of α3β4 Achrs Expressed in Permanently Transfected Hek Cells. J General Physiol. 118 (5), 563-582 (2001).
  15. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits *. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  16. Harkness, P. C., Millar, N. S. Inefficient cell-surface expression of hybrid complexes formed by the co-assembly of neuronal nicotinic acetylcholine receptor and serotonin receptor subunits. Neuropharmacology. 41 (1), 79-87 (2001).
  17. Dhara, M. Polyamine regulation of ion channel assembly and implications for nicotinic acetylcholine receptor pharmacology. Nat Commun. 11 (1), (2020).
  18. Vallés, A. S., Roccamo, A. M., Barrantes, F. J. Ric-3 chaperone-mediated stable cell-surface expression of the neuronal α7 nicotinic acetylcholine receptor in mammalian cells. Acta Pharmacol Sinica. 30 (6), 818-827 (2009).
  19. Dawe, G. B., et al. α7 nicotinic acetylcholine receptor upregulation by anti-apoptotic Bcl-2 proteins. Nat Comm. 10 (1), (2019).
  20. Peng, J. H., et al. Inducible, heterologous expression of human α7-nicotinic acetylcholine receptors in a native nicotinic receptor-null human clonal line. Brain Res. 825 (1-2), 172-179 (1999).
  21. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  22. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  25. O'Brien, B. C. V., Weber, L., Hueffer, K., Weltzin, M. M. SARS-CoV-2 spike ectodomain targets α7 nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 299 (5), 104707(2023).
  26. O'Brien, B. C. V., et al. The human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a host target for the rabies virus glycoprotein. Front Cell Infect Microbiol. 14, (2024).
  27. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  28. Sankaranarayanan, S., Angelis, D. D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophy J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  29. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J General Physiol. 143 (1), 51-66 (2013).
  30. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  31. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  32. Fitzpatrick, M. Measuring cell fluorescence using ImageJ. , http://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html#measuring-cell-fluorescence-using-imagej (2025).
  33. Srinivasan, R., et al. Nicotine up-regulates α4β2 nicotinic receptors and ER exit sites via stoichiometry-dependent chaperoning. J Gen Physiol. 137 (1), 59-79 (2011).
  34. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  35. Matta, J. A., et al. NACHO Mediates Nicotinic Acetylcholine Receptor Function throughout the Brain. Cell Rep. 19 (4), 688-696 (2017).
  36. Flores, C. M., Rogers, S. W., Pabreza, L. A., Wolfe, B. B., Kellar, K. J. A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat brain is composed of alpha 4 and beta 2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol Pharmacol. 41 (1), 31-37 (1992).
  37. Mazzaferro, S., Whiteman, S. T., Alcaino, C., Beyder, A., Sine, S. M. NACHO and 14-3-3 promote expression of distinct subunit stoichiometries of the α4β2 acetylcholine receptor. Cell Mol Life Sci. 78 (4), 1565-1575 (2021).
  38. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  39. Fasoli, F., et al. In vivo chronic nicotine exposure differentially and reversibly affects upregulation and stoichiometry of α4β2 nicotinic receptors in cortex and thalamus. Neuropharmacology. 108, 324-331 (2016).
  40. Wada, E., et al. Distribution of alpha2, alpha3, alpha4, and beta2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: A hybridization histochemical study in the rat. J Comparative Neurol. 284 (2), 314-335 (1989).
  41. Zoli, M., Léna, C., Picciotto, M. R., Changeux, J. P. Identification of Four Classes of Brain Nicotinic Receptors Using β2 Mutant Mice. J Neurosci. 18 (12), 4461-4472 (1998).
  42. Briggs, C. A., et al. and Low-Sensitivity Subforms of α4β2 and α3β2 nAChRs. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 11-12 (2006).
  43. Weltzin, M. M., George, A. A., Lukas, R. J., Whiteaker, P. Distinctive single-channel properties of α4β2-nicotinic acetylcholine receptor isoforms. PLoS One. 14 (3), e0213143(2019).
  44. Moroni, M., Bermudez, I. Stoichiometry and Pharmacology of Two Human α4β2 Nicotinic Receptor Types. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 95-96 (2006).
  45. Nelson, M. E., Kuryatov, A., Choi, C. H., Zhou, Y., Lindstrom, J. Alternate Stoichiometries of α4β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 63 (2), 332-341 (2003).
  46. Tapia, L., Kuryatov, A., Lindstrom, J. Ca2+ Permeability of the (α4)3(β2)2 Stoichiometry Greatly Exceeds That of (α4)2(β2)3 Human Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 71 (3), 769-776 (2007).
  47. Eaton, J. B., et al. The Unique α4(+)/(−)α4 Agonist Binding Site in (α4)3(β2)2 Subtype Nicotinic Acetylcholine Receptors Permits Differential Agonist Desensitization Pharmacology versus the (α4)2(β2)3 Subtype. J Pharmacol Exp Ther. 348 (1), 46-58 (2014).
  48. Mazzaferro, S., et al. Additional Acetylcholine (ACh) Binding Site at α4/α4 Interface of (α4β2)2α4 Nicotinic Receptor Influences Agonist Sensitivity. J Biol Chem. 286 (42), 31043-31054 (2011).
  49. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Bio Chem. 286 (36), 31241-33124 (2011).
  50. Asokan, A., Cho, M. J. Exploitation of Intracellular pH Gradients in the Cellular Delivery of Macromolecules. J Pharma Sci. 91 (4), 903-913 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

pHChaperoneNeuro2aImageJ

מאמרים קשורים