A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
מחקר זה משתמש במודלים של בעלי חיים ותאים כדי לחקור אם מעכב NRF2 ML385 מחליש התקדמות ממאירה הנגרמת על ידי סיליקה של אדנוקרצינומה ריאתית דרך מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2.
חשיפה לסיליקה קשורה לסיכון מוגבר לאדנוקרצינומה של הריאות, אך המנגנון המולקולרי שלה נותר לא ברור. מחקר זה נועד לבסס פרוטוקול ניסיוני הניתן לחזרה כדי לחקור כיצד מעכב הגורם הגרעיני אריתרואיד 2 הקשור לפקטור 2 (NRF2) ML385 מעכב התקדמות ממאירה הנגרמת על ידי סיליקה של אדנוקרצינומה ריאתית על ידי ויסות מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2. ראשית, מודל סיליקוזיס הוקם על ידי זלוף תוך-אף של תרחיף סיליקה בעכברי C57BL/6. מידת הפיברוזיס הריאתי הוערכה על ידי צביעת מאסון, חדירת תאי החיסון נותחה על ידי אימונופלואורסצנטיות, והביטויים של NRF2, קינאז 1 תלוי ציקלין (CDK1) ותעלת אניון תלוית מתח 1 (VDAC1) ברקמת הריאה זוהו על ידי אימונוהיסטוכימיה. לאחר מכן, בניסויים במבחנה, קו תאי המקרופאגים RAW264.7 טופל בסיליקה. רמות השטף האוטופאגי והעקה החמצונית הוערכו על ידי לוקליזציה משותפת של ליזוזום LC3 ובדיקות ROS, ובוצעה התערבות עם מעכב NRF2 ML385. לבסוף, ההשפעות של ML38 על נדידה, פלישה ואפופטוזיס של תאי אדנוקרצינומה של הריאות נותחו על ידי בדיקת שריטות, תאים העוברים דרך נקבוביות בגודל מסוים וזרימה ציטומטרית. התוצאות הראו כי סיליקה יכולה לגרום לפיברוזיס ריאתי, חדירת תאי חיסון והגברת הוויסות של NRF2, CDK1 ו-VDAC1 בעכברים (p < 0.001), ולעכב את השטף האוטופאגי של מקרופאגים ולהפחית את רמות ה-ROS. ML385 יכול להפוך את ההשפעות הללו (עמ' < 0.05). פרוטוקול זה מספק תהליך ניסיוני שלם מבניית מודל in vivo ועד למחקר מנגנון במבחנה, ומציע נתיב טכני תפעולי לחקר המנגנון המולקולרי של אדנוקרצינומה ריאתית הקשורה לסיליקה ואסטרטגיות טיפוליות המכוונות ל-NRF2.
אדנוקרצינומה של הריאות היא הגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם, עם הערכה של 2 מיליון מקרים חדשים ו-1.76 מיליון מקרי מוותמדי שנה. בשנים האחרונות עלתה שכיחות אדנוקרצינומה של הריאות בקרב אנשים שמעולם לא עישנו, מה שעשוי להיות קשור לגורמים סביבתיים כמו זיהום אוויר2. סיליקה היא מזהם סביבתי נפוץ וזוהה כגורם פתוגני פוטנציאלי לאדנוקרצינומה של ריאותאנושיות 3. סיליקה עלולה לגרום לדלקת כרונית מתמשכת, מה שמוביל לחדירה של מקרופאגים, לימפוציטים ונויטרופילים, ולשחרור מיני חמצן תגובתיים וגורמים דלקתיים4. מיקרו-סביבה דלקתית ארוכת טווח זו מקדמת את התרחשות אדנוקרצינומה ריאתית 5,6. למרות שהקשר בין חשיפה לסיליקה לאדנוקרצינומה של הריאות אושר, המנגנון המולקולרי הספציפי שלה לא הובהר במלואו.
גורם השעתוק NRF2, המקודד על ידי הגן NFE2L2, ממלא תפקיד מכריע כמווסת ראשי בשמירה על הומאוסטזיס חמצון חיזור תאי בתגובה לעקה חמצונית 7,8. בנסיבות רגילות, NRF2 מסומן ומתפרק על ידי קומפלקס היוביקוויטין ליגאז KEAP1-CUL3. תחת גירוי של מתח חמצוני או חומרים אלקטרופיליים, הפעילות של KEAP1 מעוכבת, ומאפשרת ל-NRF2 להצטבר ביציבות ולהיכנס לגרעין, ובכך להפעיל את תפקיד ההגנה והוויסות של הליבה9. עם זאת, הפעלה מוגזמת של NRF2 במיקרו-סביבת הגידול עשויה לשפר את הגליקוליזה ואת ההישרדות של תאי הגידול על ידי עצירת הצטברות ROS והגברת העמידות האפופטוטית 10,11. מחקרים הוכיחו כי חשיפה לסיליקה עלולה לגרום להפעלה חריגה של מסלול האיתות NRF2 12,13. לכן, מיקוד NRF2 עשוי להיות אסטרטגיה יעילה להתערבות בהתקדמות הממאירה של אדנוקרצינומה ריאתית הנגרמת על ידי סיליקה14.
מחקר זה נועד להבהיר האם מעכב ה-NRF2 ML385 מעכב התקדמות ממאירה הנגרמת על ידי סיליקה של אדנוקרצינומה ריאתית על ידי ויסות מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2. הקמנו מודל עכברי המושרה על ידי סיליקה כדי לשחזר את המאפיינים העיקריים של המחלה והשתמשנו בשיטות ניסוי במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה בין מקרופאגים לתאי גידול. מצאנו כי סיליקה גרמה לביטוי של מולקולות דלקתיות וחיסוניות וקידמה עוד יותר את היווצרות הגידול דרך מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2. כאשר נעשה שימוש במעכב NRF2 (ML385), ההשפעה המקדמת של סיליקה על היווצרות הגידול הואטה, מה שמרמז על כך שמעכב NRF2 עשוי למלא תפקיד בטיפול בגידולי ריאה המושרים על ידי סיליקה.
כל גושי התורמים התקבלו מדגימות פתולוגיות ארכיוניות שנאספו בין 2016 ל-2018 בבית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג. הדגימות הוסרו לפני השימוש ועובדו בהתאם לפרוטוקולים המאושרים. ועדת האתיקה של בית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג, KY-2024-250-01. הרבייה, הסילוק והיישום של עכברי ניסוי עוקבים בקפדנות אחר התקנות לניהול חיות מעבדה והנחיות בינלאומיות.
בניית מודל עכבר מושרה סיליקה
הכנת עכברים ותרחיף סיליקה: גידול עכברים זכרים C57BL/6, בני 6-8 שבועות, בחדר בעלי חיים עם טמפרטורת חדר של 20-25 מעלות צלזיוס ומחזור אור של 12 שעות / 12 שעות חושך. כדי להכין את תרחיף אבק הסיליקון, 300 מ"ג של אבקת אבק סיליקון נשקלו במדויק והושעו ב-10 מ"ל של מי מלח סטריליים 1x חוצץ פוספט. לאחר מכן, התערובת עברה מערבולת נמרצת ותנודדה במשך 5 דקות, ולאחר מכן טופלה באולטרסאונד במכונה אולטרסאונד לאמבט מים למשך 30 דקות כדי להבטיח פיזור אחיד של החלקיקים ולמנוע צבירה. הריכוז הסופי של תרחיף רזרבה זה הוא 30 מ"ג/מ"ל. יש לעקר אותו על ידי חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לפני כל שימוש, יש צורך לערבל ולנער שוב למשך 2-3 דקות כדי להשעות מחדש את כל החלקיקים המיושבים.
עכברים שאפו תרחיף סיליקה דרך האף. המיקרופיפטה שימשה להחדרת התמיסה לאט וטיפתי לחלל האף של העכברים. העכברים חולקו ל-6 קבוצות עם 20 עכברים בכל קבוצה. נפח השאיפה של כל קבוצה היה 10 מיקרוליטר, 30 מיקרוליטר, 50 מיקרוליטר, 70 מיקרוליטר, 90 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר, בריכוז של 30 מ"ג/מ"ל, פעם ביום במשך 40 ימים רצופים. בעת הזינוק, אחוז בעור מאחורי אוזן העכבר עם האגודל והאצבע המורה של יד שמאל, וקבע את הגוף והזנב של העכבר עם האצבעות האחרות. ודא שהעכבר נמצא במצב שכיבה כשראשו מוטה מעט לאחור כדי לאפשר שאיפה טבעית של המתלה לדרכי הנשימה. מצאנו שלא היה אירוע מוות לאחר היום השני של שאיפת תרחיף סיליקה של 10 מיקרוליטר, 30 מיקרוליטר , 50 מיקרוליטר ו-70 מיקרוליטר בעכברים, בעוד שהיה אירוע מוות לאחר היום השני של שאיפת תרחיף סיליקה של 90 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר בעכברים. לכן, הנפח המרבי של שאיפת סיליקה בעכברים היה 70 מיקרוליטר ליום.
בעת טיפול בסיליקה גבישית, יש לבצע זאת בארון בטיחות ביולוגית או במכסה אדים, ויש ללבוש מסכות N95, משקפי מגן חסיני אבק, כפפות ניטריל וביגוד מגן לאורך כל התהליך. בעת הכנת המתלה, התנועות צריכות להיות עדינות, ויש להשתמש בתא שקילה כדי למנוע יצירת אירוסולים. יש לאסוף את כל פסולת מגע הסיליקה במיכלים אטומים עם עמידות לנקב ולהשליך בהתאם לתקנות לפסולת כימית מסוכנת. חל איסור מוחלט לערבב אותו עם זבל כללי או לשפוך אותו לביוב. יש לאסוף פסולת ביולוגית, כגון מדיום תרבית תאים, בפחי אשפה מיוחדים המכילים חומרי חיטוי ולעקר בלחץ גבוה. יש להניח פגרים ורקמות של בעלי חיים בשקיות פסולת ביולוגיות ולעקר אותם בלחץ גבוה לטיפול לא מזיק.
להעריך את ההצלחה של מודל העכבר המושרה על ידי סיליקה. העריכו בעלי חיים בנקודות זמן שונות לאחר שאיפת סיליקה, כלומר ביום ה-3, ה-14 וה-40. העכברים הוכנסו למכשירי המתת חסד מקצועיים של בעלי חיים, ופחמן דו חמצני הוכנס בקצב מילוי של 30%-50% נפח לדקה. הם היו חשופים ללא הרף עד שהפסיקו לנשום. לאחר אישור המוות, בוצעו ניתוחים נוספים. רקמת הריאה הוסרה. רקמת הריאה נקבעה בתמיסת פרפורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. לאחר הקיבוע, הרקמה יובשה באלכוהול שיפוע, הפכה לשקופה עם קסילן ולאחר מכן הוטמעה בפרפין. חתכים רציפים נעשו באמצעות מכונת חיתוך פרפין בעובי של 4-5 מיקרומטר לצביעה היסטולוגית וניתוח אימונוהיסטוכימי לאחר מכן. רקמת הריאה אינה דורשת טיפול בהסרת אבנית. בדיקה פתולוגית של רקמת הריאה נערכה כדי להעריך יצירת מודל מוצלחת. קריטריוני ההצלחה של בניית מודל סיליקוזיס היו כדלקמן: דלקת ריאות משמעותית, פיברוזיס והופעת קשריות סיליקוזיס.
ניתוח חדירת תאי חיסון במודל העכבר המושרה על ידי סיליקה
רקמות הריאות של עכברים ביום ה-14 לאחר שאיפת סיליקה נצבעו בסמנים פלואורסצנטיים המכילים CD3e (יחס דילול של 1:200), CD8a (יחס דילול של 1:200), CD86 (יחס דילול של 1:200), F4/80 (יחס דילול של 1:200) ו-Nk1.1 (יחס דילול של 1:200) כדי להמחיש את תאי החיסון. תקן חלקי תאים או רקמות וחסום עם אלבומין סרום בקר 5% (BSA) למשך שעה אחת כדי להפחית קשירה לא ספציפית. השתמש בסרום רגיל מאותו מוצא מין כמו הנוגדן החוסם, דלל את הסרום עם PBS ביחס של 1:10 והוסף 100 מיקרוליטר של סרום מדולל לדגימה. לאחר מכן, יש לחסום בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לסרום לחסום נוגדנים אנדוגניים. לאחר האיטום, יש לשטוף בעדינות פעמיים עם PBS. הנוגדנים העיקריים המכילים CD3e (יחס דילול של 1:200), CD8a (יחס דילול של 1:200), CD86 (יחס דילול של 1:200), F4/80 (יחס דילול של 1:200) ו-Nk1.1 (יחס דילול של 1:200) הודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. לאחר שטיפה עם PBS, הנוגדן המשני הפלואורסצנטי נוסף והודגר בחושך למשך שעה.
צביעת מאסון וניתוח אימונוהיסטוכימי
קטעי פרפין הוסרו בשעווה עם קסילן והתייבשו באלכוהול שיפוע, ולאחר מכן בוצעה אחזור אנטיגן במאגר נתרן ציטראט עם pH 6.0 על ידי תיקון תרמי בלחץ גבוה. לתיקון תרמי בלחץ גבוה, הניחו את פרוסות הרקמה הספוגות במאגר תיקון במיקרוגל בחום בינוני למשך 8-12 דקות. פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית נחסמה בתמיסת מי חמצן 3% למשך 20 דקות, ולאחר מכן אתר הקישור הלא ספציפי נחסם עם 5% BSA בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו את הנוגדנים העיקריים NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) ו-VDAC1 (1:500), ודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה 3 פעמים עם PBS, הוסף נוגדן משני נגד ארנב עזים עם תווית HRP (1:500) ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. קטעי פרפין עברו צביעת DAB, צביעה נגדית של המטוקסילין, שקיפות התייבשות ואיטום ג'ל ניטרלי כדי להשיג את התוצאות האימונוהיסטוכימיות המולקולריות המתאימות. כאשר משתמשים ב-DAB לפיתוח צבע, התפתחות הצבע המתונה צריכה להיות צהוב-חום עד חום-חום, והרקע צריך להיות ברור. גם פיתוח צבע מוגזם (חום כהה) וגם לא מספיק (צהוב בהיר) דורש אופטימיזציה של זמן התפתחות הצבע.
דרגת הפיברוזיס הריאתי נותחה כמותית למחצה בשיטת הניקוד של אשקרופט15: חתכים מוכתמים במאסון נצפו תחת מיקרוסקופ הגדלה של פי 100, ורקמת הריאה חולקה באופן אקראי ל-8 אזורים. כל אזור קיבל ציון לפי דרגת הפיברוזיס (0-8 נקודות), כאשר הציון הסופי היה הממוצע של כל האזורים: 0 נקודות (רקמת ריאה תקינה), 1-2 נקודות (פיברוזיס קל), 3-4 נקודות (פיברוזיס בינוני), 5-8 נקודות (פיברוזיס חמור).
התוצאות האימונוהיסטוכימיות נותחו כמותית באמצעות תוכנת Image. חמישה שדות בהגדלה גבוהה נבחרו באופן אקראי, וערך הצפיפות האופטית הממוצע (MOD) של כל שדה נמדד כאינדיקטור לרמת ביטוי החלבון.
בחינת ההשפעה של סיליקה ו-ML385 על אוטופגיה ו-ROS בתאי RAW264.7
שני תאי RAW264.7 ו-A549 (שסופקו על ידי אוניברסיטת אנהוי למדע וטכנולוגיה) תורבבו באמצעות מדיום DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ותמיסת נוגדנים דו-ספציפיים של 1% פניצילין-סטרפטומיצין. התאים 1 x 107 תורבבו באופן אחיד באינקובטור בטמפרטורה קבועה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. 5 מיקרוליטר של תרחיף סיליקה של 30 מ"ג/מ"ל נוספו ל-1 x 105 תאים/מ"ל של תאי RAW264.7. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, התאים נשטפו עם PBS 3x, והאוטופגיה והמתח החמצוני זוהו על ידי בדיקות ROS, LC3 וליזוזום. במקביל, נעשה שימוש ב-ML38516, מעכב של NRF2, כדי לעכב את הביטוי של NRF2 (ריכוז סופי של ML385: 5 mM/L). אוטופגיה ומתח חמצוני זוהו על פי שלבי הניסוי לעיל. העקה החמצונית וזרימת האוטופגיה של שתי הקבוצות נותחו סטטיסטית.
ניתוח אימונוהיסטוכימי של ביטויי VDAC1, CDK1, p62 ו-NRF2 ברקמת אדנוקרצינומה של הריאות
הביטויים של VDAC1, CDK1, p62 ו-NRF2 נבדקו ב-30 חולים. רקמות עם אדנוקרצינומה של הריאות ורקמות בריאות סמוכות התקבלו מבית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג ונותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC). התוצאות של IHC ופיברוזיס ריאתי נותחו סטטיסטית. לאסוף נתוני מטופלים בהתאם למידע על המטופל במערכת בית החולים. שלבי הניסוי הספציפיים הם כדלקמן: קטעי פרפין הוסרו בשעווה עם קסילן והתייבשו באלכוהול שיפוע, ולאחר מכן בוצע תיקון אנטיגן במאגר נתרן ציטראט עם pH 6.0 על ידי תיקון תרמי בלחץ גבוה. פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית נחסמה בתמיסת מי חמצן 3% למשך 20 דקות, ולאחר מכן אתר הקישור הלא ספציפי נחסם עם 5% BSA בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו את הנוגדנים העיקריים NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) ו-VDAC1 (1:500), ודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה 3 פעמים עם PBS, יש להוסיף נוגדן משני נגד ארנב עזים עם תווית HRP (1:500) ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה. התפתחות צבע DAB, צביעה נגדית של המטוקסילין, איטום חניכיים שקוף מיובש, ניטרלי. כאשר משתמשים ב-DAB לפיתוח צבע, התפתחות הצבע המתונה צריכה להיות צהוב-חום עד חום-חום, והרקע צריך להיות ברור. גם פיתוח צבע מוגזם (חום כהה) וגם לא מספיק (צהוב בהיר) דורש אופטימיזציה של זמן התפתחות הצבע.
ניתוח נדידת תאים ופלישה
נחקרה ההשפעה של ML385 וסופרנטנט מהדגירה המשותפת של סיליקה עם תאי RAW264.7 על נדידת תאים ופלישה לאחר הדגירה עם קו תאי אדנוקרצינומה של הריאות A549. הסופרנטנט של תאי RAW264.7 שתרבית משותפת עם סיליקה במשך 24 שעות נוסף לתאי A549. התאים חולקו לקבוצת הסיליקה, קבוצת הסיליקה+ML385 וקבוצת ה-PBS. קבוצת הסיליקה: 5 מיקרוליטר של תרחיף סיליקה של 30 מ"ג/מ"ל נוספה ל-1 x 105 תאים/מ"ל של תאי RAW264.7. לאחר הדגירה למשך 24 שעות, יש להסיר את הסופרנטנטנט של התא לשימוש מאוחר יותר. קבוצת הסיליקה+ML385: 5 מיקרוליטר של תרחיף סיליקה של 30 מ"ג/מ"ל וריכוז סופי של 5 מ"ג/ליטר ML385 נוספו ל-1 x 105 תאים/מ"ל של תאי RAW264.7. לאחר הדגירה למשך 24 שעות, יש להסיר את הסופרנטנטנט של התא לשימוש מאוחר יותר. קבוצת PBS: 5 מיקרוליטר של PBS נוספו ל-1 x 105 תאים/מ"ל של תאי RAW264.7. לאחר הדגירה למשך 24 שעות, יש להסיר את הסופרנטנטנט של התא לשימוש מאוחר יותר. במהלך בדיקת השריטה, תאי A549 נזרעו לראשונה בצלחות של 12 בארות בצפיפות של 5 x 105 לבאר. לאחר שהתאים גדלו לאיחוי של 95%-100%, נעשו שריטות על התאים החד-שכבתיים באמצעות קצה של פיפטה סטרילית של 200 מיקרוליטר. התאים המקולפים נשטפו בעדינות עם PBS. לאחר מכן, תנאי התרבית שונו כך שיכללו מדיום בסיסי של 1% FBS ואת הסופרנטנטים של כל קבוצת טיפול כדי לשמור על כדאיות התא במהלך תקופת הניסוי של 7 ימים. תמונות של אותו מיקום נאספו תחת מיקרוסקופ הפוך בשעה 0 (יום 0) וביום השביעי (יום 7) לאחר השריטה, בהתאמה. לבסוף, אזור השריטה נותח כמותית, ושיעור סגירת השריטות חושב באמצעות תוכנת ImageJ כדי להעריך את ההשפעה של הסופרנטנט מקבוצות טיפול שונות על יכולת הנדידה של תאי A549.
בתאים העוברים דרך נקבוביות של בדיקת פלישה בגודל ספציפי, נעשה שימוש בתא ממברנה פוליקרבונט של 8 מיקרומטר, כאשר קרום החדר העליון מצופה מראש בג'ל המדמה את הסביבה החוץ-תאית מדולל ביחס של 1:8 לבניית מחסום קרום מרתף. תאי A549 הושעו מחדש בתרחיף שנעשה על ידי ערבוב מדיום נטול סרום עם הסופרנטנטים של כל קבוצת טיפול ביחס של 1:1 ולאחר מכן חוסנו בחדר העליון (2 x 104 תאים לתא). בתא התחתון, תמיסה שנעשתה על ידי ערבוב מדיום המכיל 20% FBS עם הסופרנטנטים של קבוצות הטיפול המתאימות (קבוצת סיליקה+ML385, קבוצת סיליקה וקבוצת PBS) באותה פרופורציה כחומר משיכה כימי. הסופרנטנטים של קבוצות הטיפול המתאימות נאספו על ידי יניקה דרך אקדח פיפטה ב-RAW264.7 Cell phagocytosis של סיליקה. לאחר שהתאים הודגרו ברציפות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 7 ימים, התאים הלא פולשניים בתא העליון הוסרו בעזרת צמר גפן, והתאים שחדרו לקרום והגיעו לתא התחתון קובעו ב-4% פרפורמלדהיד ונצבעו ב-0.1% סגול קריסטל. לבסוף, מספר התאים הפולשניים נבחר באופן אקראי מתוך 5 שדות ראייה על ידי מיקרוסקופ אופטי.
ניתוח ההשפעה של סיליקה ו-ML385 על האפופטוזיס של תאי A549 באמצעות ציטומטריית זרימה
הכנת תאים וקיבוץ: נאספו תאי A549 שטופלו בסופרנטנטים של כל קבוצת טיפול (קבוצת PBS, קבוצת סיליקה, קבוצת סיליקה + ML385). התאים נשטפו בעדינות פי 2 עם PBS מקורר מראש, ואז הושעו מחדש במאגר קשירה 1x, וצפיפות התאים הותאמה ל-1 x 106 תאים לצינור / 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, 5 מיקרוליטר של Annexin V-FITC ו-5 מיקרוליטר של תמיסת צביעה PI נוספו לתרחיף התא, מערבול בעדינות לערבוב והודגרו בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב 1x נוספו לכל צינור ונבדקו מיד במכונה. הזיהוי בוצע באמצעות ציטומטר זרימה. נרגש על ידי לייזר 488 ננומטר, אות הקרינה של Annexin V-FITC נאסף דרך ערוץ FITC, ואות הקרינה של PI נאסף דרך ערוץ PE. לפני הניסוי נעשה שימוש בדגימות עם צביעה בודדת להתאמת פיצוי פלואורסצנטי כדי למנוע חפיפה ספקטרלית. בעת ביצוע ניתוח נתונים, תחילה תוחם את אוכלוסיית תאי היעד בעלילת הפיזור FSC-A/SSC-A והסר שברים. לאחר מכן, הידבקויות תאים לא נכללו באמצעות תרשים הפיזור FSC-H/FSC-A; לבסוף, הוקם שער כדי להבחין בין תאים חיים, תאים אפופטוטיים מוקדמים, תאים אפופטוטיים/נמקיים מאוחרים ותאים פגומים מכנית. הנתונים התקבלו ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo V10.
דגם עכבר סיליקה
באיור 1, העכברים קיבלו סיליקה דרך האף במינון של 30 מ"ג/מ"ל ו-70 מיקרוליטר במשך 40 ימים רצופים, מה שהבטיח שלא התרחשו אירועי מוות בעכברים וניתן היה לבסס בהצלחה את מודל עכבר הסיליקה. בינתיים, עכברים עם PBS שימשו כבקרות שליליות. המטרה הייתה לבטל את השפעת הניתוח והממס עצמו ולהבטיח שהפנוטיפ מושרה באופן ספציפי על ידי סיליקה. השכפול המוצלח של מודל פגיעה ריאתית זה המושרה על ידי סיליקה מספק בסיס הכרחי in vivo למחקר הבא על מנגנון ההתקדמות הממאירה והתערבות תרופתית.
ניתוח חדירת תאי חיסון בגושים של עכברים המושרים על ידי סיליקה
באיור 2, על ידי זיהוי חדירת תאי החיסון בגושים של עכברי סיליקה, נמצא שהיה מספר רב של חדירת תאי חיסון (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ ו-Nk1.1+) בגושים, שהיו מעורבים בהיווצרות ובהתפתחות של מחלת ריאות סיליקה. זה מצביע על כך שסיליקה גורמת למיקרו-סביבה דלקתית מתמשכת של גידול, המהווה גורם מקדם מרכזי להתרחשות והתפתחות הגידול, וגם הבסיס הפתופיזיולוגי להשתתפות במסלול ROS/NRF2.
הקשר בין פיברוזיס ריאתי הנגרמת על ידי סיליקה לבין NRF2, CDK1 ו-VDAC1 בעכברים
על ידי זיהוי ביטוי של מולקולות חיסוניות בגושים, נמצא כי NRF2 (יעד מעכב ML385), CDK1 (קשור למחזור התא) ו-VDAC1 (המעורבים בעקה חמצונית מיטוכונדריאלית) באו לידי ביטוי גבוה סביב ובתוך גושים והיו קשורים לפיברוזיס ריאתי (איור 3).
השפעת סיליקה ו-ML385 על אוטופגיה ו-ROS בתאי RAW264.7
באמצעות תרבית משותפת של סיליקה ותאי RAW264.7, נמצא כי סיליקה יכולה לגרום לייצור אוטופאגוזומים. לאחר 24 שעות של תרבית, הלוקליזציה המשותפת של אוטופאגוזום וליזוזום הצטמצמה, זרימת האוטופגיה עוכבה, וגם ייצור ה-ROS הופחת. כאשר נוסף ML385 (מעכב NRF2 ), הקו-לוקליזציה של אוטופאגוזום וליזוזום שופרה, זרימת האוטופגיה שופרה גם היא, וגם ה-ROS הוגדל בהתאם (איור 4).
ניתוח ביטויי VDAC1, CDK1, p62 ו-NRF2 ברקמת אדנוקרצינומה של הריאות על ידי IHC
כפי שמוצג באיור 5, NRF2 (יעד מעכב של ML385), CDK1 (הקשור למחזור התא), VDAC1 (מעורב בעקה חמצונית מיטוכונדריאלית) ו-p62 (מעורב באוטופגיה) מתבטאים מאוד ברקמות אדנוקרצינומה של הריאות ומציגים הבדלים משמעותיים בהשוואה לרקמות סמוכות.
השפעת ML385 וסופרנטנט מהדגירה המשותפת של סיליקה עם תאי RAW264.7 על נדידת תאי A549 ופלישה
סופרנטנט תרבית תאים סיליקה ו-RAW264.7 יכול לקדם את הנדידה וההתפשטות של תאי A549, בעוד ש-ML385 יכול לעכב באופן משמעותי תהליכים אלה (כפי שמוצג באיור 6). תוצאה זו מצביעה על כך שההשפעה מקדמת הגידול של מיקרו-סביבת המקרופאגים המושרה על ידי סיליקה תלויה במסלול NRF2 . עיכוב NRF2 יכול לחסום ביעילות את האפקט מקדם הגידול הזה, ובכך להפחית את ההתקדמות הממאירה של תאי הגידול.
השפעת סיליקה ו-ML385 על האפופטוזיס של תאי A549
איור 7 מראה כי לסיליקה ולתרבית תאים RAW264.7 יש השפעה מעכבת מסוימת על אפופטוזיס של תאי A549, ו-ML385 יכול לקדם אפופטוזיס של תאי A549.
מחקר זה חשף את המסלול המכניסטי שבאמצעותו חשיפה לסיליקה מקדמת את ההתקדמות הממאירה של אדנוקרצינומה ריאתית דרך ציר ROS/NRF2/אוטופגיה באמצעות שיטות in vivo ו-in vitro . ניסויים בבעלי חיים אישרו כי מולקולות מפתח של מסלול האיתות NRF2 מופעלות באופן משמעותי במיקרו-סביבה של פיברוזיס ריאתי הנגרמת על ידי סיליקה. ניסויים בתאים הראו כי סיליקה מעכבת ישירות שטף אוטופאגי במקרופאגים ומפחיתה את רמות ה-ROS, והשפעה זו ניתנת להפיכה באופן ספציפי על ידי מעכב NRF2 ML385. מחקרי מנגנונים הראו כי מקרופאגים שטופלו בסיליקה מקדמים את הנדידה, הפלישה והעיכוב של אפופטוזיס של תאי אדנוקרצינומה של הריאות על ידי הפרשת גורמים, והשפעה מקדמת גידול זו תלויה לחלוטין בהפעלת מסלול NRF2.
זמינות נתונים:
מערכי הנתונים התומכים במסקנה של מאמר זה כלולים במאמר.
איור 1: בניית מודל סיליקה בעכברים. (A) לטפל בעכברים בשאיפת סיליקה מהאף (30 מ"ג/מ"ל) בנפחים שונים (10 מיקרוליטר, 30 מיקרוליטר, 50 מיקרוליטר, 70 מיקרוליטר, 90 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר). 20 עכברים למנת שאיפה. (B) עקומת הישרדות של עכברים. כמות השאיפה המקסימלית היא 70 מיקרוליטר ליום. (C) תוצאות תצפית של צביעת HE היסטופתולוגית של הריאות בעכברים מקבוצת הסיליקה וקבוצת PBS ביום 3, יום 14 ויום 40. (D) תוצאות סטטיסטיות של מספר הגושים הריאתיים שנצפו בעכברים בהגדלה נמוכה, מבחן t, ***p <0.001, p= 0.004, t = 10.61 (יום 14), p = 0.0006, t = 10.02 (יום 40). N = 9. קווי השגיאה מציגים שגיאת תקן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תצפית על חדירת תאי חיסון ברקמה נודולרית של עכברים באמצעות צביעה פלואורסצנטית. חדירה גבוהה של תאי חיסון (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ ו-NK1.1+) בגושים של גושים ריאתיים המושרים על ידי סיליקה בעכברים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח הקשר בין הביטויים של NRF2, CDK1, VDAC1 ופיברוזיס המושרה על ידי סיליקה באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) וצביעה של מאסון. (A) הביטויים של NRF2, CDK1 ו-VDAC1, והתוצאות של צביעת מאסון. (ב) תוצאות IHC. (C) ניתוח סטטיסטי של פיברוזיס ריאתי נערך בין קבוצת הסיליקה לקבוצת העכברים PBS. מבחן t, ***p <0.001, p = 0.0002, t = 13.42 (NRF2), p=0.0008, t = 9.247 (CDK1), p = 0.0009, t = 8.944 (VDAC1), p = 0.0003, t = 11.76 (פיברוזיס ריאתי). N = 9. קווי השגיאה מציגים שגיאת תקן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השפעת סיליקה על אוטופגיה בתאי RAW264.7 והשפעת ויסות האוטופגיה של מעכב NRF2 ML385. (A) אחרי דגירה משותפת של סיליקה עם תאי RAW264.7 במשך 24 שעות, הלוקליזציה המשותפת של אוטופאגוזומים (LC3) וליזוזומים פחתה (ירוק). עם זאת, עם הוספת ML385, הלוקליזציה המשותפת של אוטופאגוזומים וליזוזומים גדלה (צהוב). (B) לאחר דגירה משותפת של סיליקה עם תאי RAW264.7 במשך 24 שעות, ה-ROS שנוצר על ידי קבוצת הסיליקה פחת, אולם גדל לאחר הוספת ML385. (C) ניתוח סטטיסטי של שטף ה-ROS והאוטופגיה של שתי הקבוצות, מבחן t, ***p <0.001, p = 0.0005, t = 10.59 (ROS), p <0.0001, t = 17.08 (Autophagolysosome). N = 6. קווי השגיאה מציגים שגיאת תקן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח אימונוהיסטוכימי של ביטויי VDAC1, CDK1, p62 ו-NRF2 ברקמת אדנוקרצינומה של ריאות אנושיות. (A) ביטויים דיפרנציאליים (VDAC1, CDK1, p62 ו-NRF2) בין רקמת אדנוקרצינומה של ריאות אנושיות לרקמה לא סרטנית סמוכה. (B) ניתוח סטטיסטי של ביטוי דיפרנציאלי בין 30 מקרים של סרטן ורקמות לא סרטניות סמוכות מבית החולים העממי המסונף Huai'an NO.1 של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג, t-test, ***p <0.001, p <0.0001, t = 8.322 (CDK1), p <0.0001, t = 16.4 (NRF2), p <0.0001, t = 15.47 (p62), p <0.0001, t = 17.75 (VDAC1). N = 30. קווי השגיאה מציגים שגיאת תקן. (C) ניתוח סטטיסטי של פיברוזיס ברקמת אדנוקרצינומה של הריאות וברקמה לא סרטנית סמוכה, בדיקת t, ***p <0.001, p = 0.0009, t = 8.854 (פיברוזיס). N = 30. קווי השגיאה מציגים שגיאת תקן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: השפעת ה-ML385 והסופרנטנט מהדגירה המשותפת של סיליקה עם תאי RAW264.7 על נדידת תאים ופלישה לאחר הדגירה עם קו תאי אדנוקרצינומה של הריאות A549. (A) תוצאות השריטה של התאים ביום 0 וביום 7 אחרי הדגירה המשותפת של סופרנטנט ו-ML385 עם תאי A549. (B) התוצאות הפולשניות לתאים ביום 7 לאחר הדגירה המשותפת של סופרנטנט ו-ML385 עם תאי A549. (ג) ביצוע ניתוח סטטיסטי על תוצאות בדיקת שריטות התא. *עמ' <0.05, **עמ' <0.01. מבחן t, p = 0.0020, t = 22.43 (סיליקה + ML385 לעומת סיליקה), p = 0.0135, t = 8.510 (סיליקה + ML385 לעומת PBS), p = 0.0143, t = 8.281 (סיליקה לעומת PBS). N = 6. קווי השגיאה מציגים שגיאת תקן. (ד) ביצוע ניתוח סטטיסטי על תוצאות הבדיקה הפולשנית לתאים. *p <0.05, **p <0.01, t-test, p = 0.0097, t = 10.06 (סיליקה + ML385 לעומת סיליקה), p = 0.0472, t = 4.437 (סיליקה + ML385 לעומת PBS), p = 0.0125, t = 8.857 (סיליקה לעומת PBS). N = 6. קווי השגיאה מציגים שגיאת תקן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניתוח ההשפעה של סיליקה ו-ML385 על האפופטוזיס של תאי A549 באמצעות ציטומטריית זרימה. (A) לזהות את תוצאות האפופטוזיס של תאי A549 באמצעות ציטומטריית זרימה. (B) לבצע ניתוח סטטיסטי של אחוז התאים האפופטוטיים. *p <0.05, **p <0.01, t-test, p = 0.0013, t = 27.29 (סיליקה + ML385 לעומת סיליקה), p = 0.0022, t = 6.973 (סיליקה + ML385 לעומת PBS), p = 0.0048, t = 5.649 (סיליקה לעומת PBS). N = 6. קווי השגיאה מציגים שגיאת תקן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
למחברים אין מה לחשוף.
מחקר זה משתמש במודלים של בעלי חיים ותאים כדי לחקור אם מעכב NRF2 ML385 מחליש התקדמות ממאירה הנגרמת על ידי סיליקה של אדנוקרצינומה ריאתית דרך מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2.
תודה לחברי הצוות על תמיכתם ותרומתם למחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי המעבדה המרכזית להפחתת אבק תעשייתי עמוק ובריאות ובטיחות תעסוקתית של מוסדות להשכלה גבוהה באנהוי (מס' AYZJSGXLK202202006), קרן הסטארט-אפ להצגת כישרונות של בית החולים העממי של שנחאי פודונג (מס' PRYYH202501).
| BeyoGold Transwell | Beyotime Biotechnology | FTW067-48lns | טרנסוול |
| CD3e | ביוסיינס BD | 561827 | FITC ה-HSTER נגד עכבר CD3e(145-2C11) |
| CD86 | ביוסיינס BD | 105013 | CD86 |
| CD8a | ביוסיינס BD | 100713 | CD8a |
| CDK1 | אבקאם | ab133327 | אנטי-CDK1 |
| ערכת זיהוי אפופטוזיס תאית | Beyotime Biotechnology | C1062L | זיהוי אפופטוזיס |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131-25ml | DAPI |
| מכונת הטמעה | P.S.J MEDICAL | BM450A | מכונת הטמעה |
| F4/80 | ביוסיינס BD | 123109 | F4/80 |
| מייבש רקמות אוטומטי לחלוטין | Leica Biosystems | ASP3005 | מייבש רקמות אוטומטי לחלוטין |
| שקופיות מיקרוסקופ זכוכית | ציטוטסט | 250124A1 | שקופיות מיקרוסקופ זכוכית |
| H& צבע E | Beyotime Biotechnology | C0105M | H& צבע E |
| ערכת IHC | ביוטכנולוגיה של אבסין | ABS996-5ML | ערכת IHC |
| גלאי LC3 | Beyotime Biotechnology | C3018M | גלאי LC3 |
| להבי מיקרוטום בעלי פרופיל נמוך | תרמו פישר | 3052835 | להבי מיקרוטום בעלי פרופיל נמוך |
| גשוש ליזוזום | Beyotime Biotechnology | C1046 | גשוש ליזוזום |
| עט טוש | מעדן | SK109 | עט טוש |
| צבע מסון | Beyotime Biotechnology | C0189M | צבע מסון |
| ג'ל מטריקס | Beyotime Biotechnology | C0371-5ml | דבק מטריצה |
| מיקרוטום | Leica Biosystems | HistoCore BIOCUT | מיקרוטום |
| ML385 | אבקאם | AB287109 | מעכב NRF2 |
| NK1.1 | ביוסיינס BD | 561117 | NK1.1 |
| NRF2 | אבקאם | ab1809Y | אנטי-NRF2 |
| עמ' 62 | אבקאם | ab20735 | אנטי-p62 |
| שעוות פרפין | סולרביולוגיה | YA0012 | שעוות פרפין |
| ערכת בדיקה למיני חמצן תגובתי | Beyotime Biotechnology | S0033M | גשושית ROS |
| סיליקה | סיגמא אולדריץ' | S5631 | סיליקה גבישית |
| VDAC1 | אבקאם | ab34726 | אנטי-VDAC1 |
