מאמר מחקר

ML385 מחליש התקדמות ממאירה של תאי אדנוקרצינומה ריאתית המושרים על ידי סיליקה דרך מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2

483 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69382

⸱

31 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, 2Department of Medical Laboratory, Huaian Hospital of Huaian City, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 6Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 7Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, 8Department of Blood Transfusion, Shanghai Pudong New Area People's Hospital

במאמר זה

סיכום

מחקר זה משתמש במודלים של בעלי חיים ותאים כדי לחקור אם מעכב NRF2 ML385 מחליש התקדמות ממאירה הנגרמת על ידי סיליקה של אדנוקרצינומה ריאתית דרך מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2.

תקציר

חשיפה לסיליקה קשורה לסיכון מוגבר לאדנוקרצינומה של הריאות, אך המנגנון המולקולרי שלה נותר לא ברור. מחקר זה נועד לבסס פרוטוקול ניסיוני הניתן לחזרה כדי לחקור כיצד מעכב הגורם הגרעיני אריתרואיד 2 הקשור לפקטור 2 (NRF2) ML385 מעכב התקדמות ממאירה הנגרמת על ידי סיליקה של אדנוקרצינומה ריאתית על ידי ויסות מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2. ראשית, מודל סיליקוזיס הוקם על ידי זלוף תוך-אף של תרחיף סיליקה בעכברי C57BL/6. מידת הפיברוזיס הריאתי הוערכה על ידי צביעת מאסון, חדירת תאי החיסון נותחה על ידי אימונופלואורסצנטיות, והביטויים של NRF2, קינאז 1 תלוי ציקלין (CDK1) ותעלת אניון תלוית מתח 1 (VDAC1) ברקמת הריאה זוהו על ידי אימונוהיסטוכימיה. לאחר מכן, בניסויים במבחנה, קו תאי המקרופאגים RAW264.7 טופל בסיליקה. רמות השטף האוטופאגי והעקה החמצונית הוערכו על ידי לוקליזציה משותפת של ליזוזום LC3 ובדיקות ROS, ובוצעה התערבות עם מעכב NRF2 ML385. לבסוף, ההשפעות של ML38 על נדידה, פלישה ואפופטוזיס של תאי אדנוקרצינומה של הריאות נותחו על ידי בדיקת שריטות, תאים העוברים דרך נקבוביות בגודל מסוים וזרימה ציטומטרית. התוצאות הראו כי סיליקה יכולה לגרום לפיברוזיס ריאתי, חדירת תאי חיסון והגברת הוויסות של NRF2, CDK1 ו-VDAC1 בעכברים (p < 0.001), ולעכב את השטף האוטופאגי של מקרופאגים ולהפחית את רמות ה-ROS. ML385 יכול להפוך את ההשפעות הללו (עמ' < 0.05). פרוטוקול זה מספק תהליך ניסיוני שלם מבניית מודל in vivo ועד למחקר מנגנון במבחנה, ומציע נתיב טכני תפעולי לחקר המנגנון המולקולרי של אדנוקרצינומה ריאתית הקשורה לסיליקה ואסטרטגיות טיפוליות המכוונות ל-NRF2.

מבוא

אדנוקרצינומה של הריאות היא הגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם, עם הערכה של 2 מיליון מקרים חדשים ו-1.76 מיליון מקרי מוותמדי שנה. בשנים האחרונות עלתה שכיחות אדנוקרצינומה של הריאות בקרב אנשים שמעולם לא עישנו, מה שעשוי להיות קשור לגורמים סביבתיים כמו זיהום אוויר2. סיליקה היא מזהם סביבתי נפוץ וזוהה כגורם פתוגני פוטנציאלי לאדנוקרצינומה של ריאותאנושיות 3. סיליקה עלולה לגרום לדלקת כרונית מתמשכת, מה שמוביל לחדירה של מקרופאגים, לימפוציטים ונויטרופילים, ולשחרור מיני חמצן תגובתיים וגורמים דלקתיים4. מיקרו-סביבה דלקתית ארוכת טווח זו מקדמת את התרחשות אדנוקרצינומה ריאתית 5,6. למרות שהקשר בין חשיפה לסיליקה לאדנוקרצינומה של הריאות אושר, המנגנון המולקולרי הספציפי שלה לא הובהר במלואו.

גורם השעתוק NRF2, המקודד על ידי הגן NFE2L2, ממלא תפקיד מכריע כמווסת ראשי בשמירה על הומאוסטזיס חמצון חיזור תאי בתגובה לעקה חמצונית 7,8. בנסיבות רגילות, NRF2 מסומן ומתפרק על ידי קומפלקס היוביקוויטין ליגאז KEAP1-CUL3. תחת גירוי של מתח חמצוני או חומרים אלקטרופיליים, הפעילות של KEAP1 מעוכבת, ומאפשרת ל-NRF2 להצטבר ביציבות ולהיכנס לגרעין, ובכך להפעיל את תפקיד ההגנה והוויסות של הליבה9. עם זאת, הפעלה מוגזמת של NRF2 במיקרו-סביבת הגידול עשויה לשפר את הגליקוליזה ואת ההישרדות של תאי הגידול על ידי עצירת הצטברות ROS והגברת העמידות האפופטוטית 10,11. מחקרים הוכיחו כי חשיפה לסיליקה עלולה לגרום להפעלה חריגה של מסלול האיתות NRF2 12,13. לכן, מיקוד NRF2 עשוי להיות אסטרטגיה יעילה להתערבות בהתקדמות הממאירה של אדנוקרצינומה ריאתית הנגרמת על ידי סיליקה14.

מחקר זה נועד להבהיר האם מעכב ה-NRF2 ML385 מעכב התקדמות ממאירה הנגרמת על ידי סיליקה של אדנוקרצינומה ריאתית על ידי ויסות מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2. הקמנו מודל עכברי המושרה על ידי סיליקה כדי לשחזר את המאפיינים העיקריים של המחלה והשתמשנו בשיטות ניסוי במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה בין מקרופאגים לתאי גידול. מצאנו כי סיליקה גרמה לביטוי של מולקולות דלקתיות וחיסוניות וקידמה עוד יותר את היווצרות הגידול דרך מסלול ציר האוטופגיה ROS/NRF2. כאשר נעשה שימוש במעכב NRF2 (ML385), ההשפעה המקדמת של סיליקה על היווצרות הגידול הואטה, מה שמרמז על כך שמעכב NRF2 עשוי למלא תפקיד בטיפול בגידולי ריאה המושרים על ידי סיליקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל גושי התורמים התקבלו מדגימות פתולוגיות ארכיוניות שנאספו בין 2016 ל-2018 בבית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג. הדגימות הוסרו לפני השימוש ועובדו בהתאם לפרוטוקולים המאושרים. ועדת האתיקה של בית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג, KY-2024-250-01. הרבייה, הסילוק והיישום של עכברי ניסוי עוקבים בקפדנות אחר התקנות לניהול חיות מעבדה והנחיות בינלאומיות.

בניית מודל עכבר מושרה סיליקה
הכנת עכברים ותרחיף סיליקה: גידול עכברים זכרים C57BL/6, בני 6-8 שבועות, בחדר בעלי חיים עם טמפרטורת חדר של 20-25 מעלות צלזיוס ומחזור אור של 12 שעות / 12 שעות חושך. כדי להכין את תרחיף אבק הסיליקון, 300 מ"ג של אבקת אבק סיליקון נשקלו במדויק והושעו ב-10 מ"ל של מי מלח סטריליים 1x חוצץ פוספט. לאחר מכן, התערובת עברה מערבולת נמרצת ותנודדה במשך 5 דקות, ולאחר מכן טופלה באולטרסאונד במכונה אולטרסאונד לאמבט מים למשך 30 דקות כדי להבטיח פיזור אחיד של החלקיקים ולמנוע צבירה. הריכוז הסופי של תרחיף רזרבה זה הוא 30 מ"ג/מ"ל. יש לעקר אותו על ידי חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לפני כל שימוש, יש צורך לערבל ולנער שוב למשך 2-3 דקות כדי להשעות מחדש את כל החלקיקים המיושבים.

עכברים שאפו תרחיף סיליקה דרך האף. המיקרופיפטה שימשה להחדרת התמיסה לאט וטיפתי לחלל האף של העכברים. העכברים חולקו ל-6 קבוצות עם 20 עכברים בכל קבוצה. נפח השאיפה של כל קבוצה היה 10 מיקרוליטר, 30 מיקרוליטר, 50 מיקרוליטר, 70 מיקרוליטר, 90 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר, בריכוז של 30 מ"ג/מ"ל, פעם ביום במשך 40 ימים רצופים. בעת הזינוק, אחוז בעור מאחורי אוזן העכבר עם האגודל והאצבע המורה של יד שמאל, וקבע את הגוף והזנב של העכבר עם האצבעות האחרות. ודא שהעכבר נמצא במצב שכיבה כשראשו מוטה מעט לאחור כדי לאפשר שאיפה טבעית של המתלה לדרכי הנשימה. מצאנו שלא היה אירוע מוות לאחר היום השני של שאיפת תרחיף סיליקה של 10 מיקרוליטר, 30 מיקרוליטר , 50 מיקרוליטר ו-70 מיקרוליטר בעכברים, בעוד שהיה אירוע מוות לאחר היום השני של שאיפת תרחיף סיליקה של 90 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר בעכברים. לכן, הנפח המרבי של שאיפת סיליקה בעכברים היה 70 מיקרוליטר ליום.

בעת טיפול בסיליקה גבישית, יש לבצע זאת בארון בטיחות ביולוגית או במכסה אדים, ויש ללבוש מסכות N95, משקפי מגן חסיני אבק, כפפות ניטריל וביגוד מגן לאורך כל התהליך. בעת הכנת המתלה, התנועות צריכות להיות עדינות, ויש להשתמש בתא שקילה כדי למנוע יצירת אירוסולים. יש לאסוף את כל פסולת מגע הסיליקה במיכלים אטומים עם עמידות לנקב ולהשליך בהתאם לתקנות לפסולת כימית מסוכנת. חל איסור מוחלט לערבב אותו עם זבל כללי או לשפוך אותו לביוב. יש לאסוף פסולת ביולוגית, כגון מדיום תרבית תאים, בפחי אשפה מיוחדים המכילים חומרי חיטוי ולעקר בלחץ גבוה. יש להניח פגרים ורקמות של בעלי חיים בשקיות פסולת ביולוגיות ולעקר אותם בלחץ גבוה לטיפול לא מזיק.

להעריך את ההצלחה של מודל העכבר המושרה על ידי סיליקה. העריכו בעלי חיים בנקודות זמן שונות לאחר שאיפת סיליקה, כלומר ביום ה-3, ה-14 וה-40. העכברים הוכנסו למכשירי המתת חסד מקצועיים של בעלי חיים, ופחמן דו חמצני הוכנס בקצב מילוי של 30%-50% נפח לדקה. הם היו חשופים ללא הרף עד שהפסיקו לנשום. לאחר אישור המוות, בוצעו ניתוחים נוספים. רקמת הריאה הוסרה. רקמת הריאה נקבעה בתמיסת פרפורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. לאחר הקיבוע, הרקמה יובשה באלכוהול שיפוע, הפכה לשקופה עם קסילן ולאחר מכן הוטמעה בפרפין. חתכים רציפים נעשו באמצעות מכונת חיתוך פרפין בעובי של 4-5 מיקרומטר לצביעה היסטולוגית וניתוח אימונוהיסטוכימי לאחר מכן. רקמת הריאה אינה דורשת טיפול בהסרת אבנית. בדיקה פתולוגית של רקמת הריאה נערכה כדי להעריך יצירת מודל מוצלחת. קריטריוני ההצלחה של בניית מודל סיליקוזיס היו כדלקמן: דלקת ריאות משמעותית, פיברוזיס והופעת קשריות סיליקוזיס.

ניתוח חדירת תאי חיסון במודל העכבר המושרה על ידי סיליקה
רקמות הריאות של עכברים ביום ה-14 לאחר שאיפת סיליקה נצבעו בסמנים פלואורסצנטיים המכילים CD3e (יחס דילול של 1:200), CD8a (יחס דילול של 1:200), CD86 (יחס דילול של 1:200), F4/80 (יחס דילול של 1:200) ו-Nk1.1 (יחס דילול של 1:200) כדי להמחיש את תאי החיסון. תקן חלקי תאים או רקמות וחסום עם אלבומין סרום בקר 5% (BSA) למשך שעה אחת כדי להפחית קשירה לא ספציפית. השתמש בסרום רגיל מאותו מוצא מין כמו הנוגדן החוסם, דלל את הסרום עם PBS ביחס של 1:10 והוסף 100 מיקרוליטר של סרום מדולל לדגימה. לאחר מכן, יש לחסום בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לסרום לחסום נוגדנים אנדוגניים. לאחר האיטום, יש לשטוף בעדינות פעמיים עם PBS. הנוגדנים העיקריים המכילים CD3e (יחס דילול של 1:200), CD8a (יחס דילול של 1:200), CD86 (יחס דילול של 1:200), F4/80 (יחס דילול של 1:200) ו-Nk1.1 (יחס דילול של 1:200) הודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. לאחר שטיפה עם PBS, הנוגדן המשני הפלואורסצנטי נוסף והודגר בחושך למשך שעה.

צביעת מאסון וניתוח אימונוהיסטוכימי
קטעי פרפין הוסרו בשעווה עם קסילן והתייבשו באלכוהול שיפוע, ולאחר מכן בוצעה אחזור אנטיגן במאגר נתרן ציטראט עם pH 6.0 על ידי תיקון תרמי בלחץ גבוה. לתיקון תרמי בלחץ גבוה, הניחו את פרוסות הרקמה הספוגות במאגר תיקון במיקרוגל בחום בינוני למשך 8-12 דקות. פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית נחסמה בתמיסת מי חמצן 3% למשך 20 דקות, ולאחר מכן אתר הקישור הלא ספציפי נחסם עם 5% BSA בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו את הנוגדנים העיקריים NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) ו-VDAC1 (1:500), ודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה 3 פעמים עם PBS, הוסף נוגדן משני נגד ארנב עזים עם תווית HRP (1:500) ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. קטעי פרפין עברו צביעת DAB, צביעה נגדית של המטוקסילין, שקיפות התייבשות ואיטום ג'ל ניטרלי כדי להשיג את התוצאות האימונוהיסטוכימיות המולקולריות המתאימות. כאשר משתמשים ב-DAB לפיתוח צבע, התפתחות הצבע המתונה צריכה להיות צהוב-חום עד חום-חום, והרקע צריך להיות ברור. גם פיתוח צבע מוגזם (חום כהה) וגם לא מספיק (צהוב בהיר) דורש אופטימיזציה של זמן התפתחות הצבע.

דרגת הפיברוזיס הריאתי נותחה כמותית למחצה בשיטת הניקוד של אשקרופט15: חתכים מוכתמים במאסון נצפו תחת מיקרוסקופ הגדלה של פי 100, ורקמת הריאה חולקה באופן אקראי ל-8 אזורים. כל אזור קיבל ציון לפי דרגת הפיברוזיס (0-8 נקודות), כאשר הציון הסופי היה הממוצע של כל האזורים: 0 נקודות (רקמת ריאה תקינה), 1-2 נקודות (פיברוזיס קל), 3-4 נקודות (פיברוזיס בינוני), 5-8 נקודות (פיברוזיס חמור).

התוצאות האימונוהיסטוכימיות נותחו כמותית באמצעות תוכנת Image. חמישה שדות בהגדלה גבוהה נבחרו באופן אקראי, וערך הצפיפות האופטית הממוצע (MOD) של כל שדה נמדד כאינדיקטור לרמת ביטוי החלבון.

בחינת ההשפעה של סיליקה ו-ML385 על אוטופגיה ו-ROS בתאי RAW264.7
שני תאי RAW264.7 ו-A549 (שסופקו על ידי אוניברסיטת אנהוי למדע וטכנולוגיה) תורבבו באמצעות מדיום DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ותמיסת נוגדנים דו-ספציפיים של 1% פניצילין-סטרפטומיצין. התאים 1 x 107 תורבבו באופן אחיד באינקובטור בטמפרטורה קבועה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. 5 מיקרוליטר של תרחיף סיליקה של 30 מ"ג/מ"ל נוספו ל-1 x 105 תאים/מ"ל של תאי RAW264.7. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, התאים נשטפו עם PBS 3x, והאוטופגיה והמתח החמצוני זוהו על ידי בדיקות ROS, LC3 וליזוזום. במקביל, נעשה שימוש ב-ML38516, מעכב של NRF2, כדי לעכב את הביטוי של NRF2 (ריכוז סופי של ML385: 5 mM/L). אוטופגיה ומתח חמצוני זוהו על פי שלבי הניסוי לעיל. העקה החמצונית וזרימת האוטופגיה של שתי הקבוצות נותחו סטטיסטית.

ניתוח אימונוהיסטוכימי של ביטויי VDAC1, CDK1, p62 ו-NRF2 ברקמת אדנוקרצינומה של הריאות
הביטויים של VDAC1, CDK1, p62 ו-NRF2 נבדקו ב-30 חולים. רקמות עם אדנוקרצינומה של הריאות ורקמות בריאות סמוכות התקבלו מבית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג ונותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC). התוצאות של IHC ופיברוזיס ריאתי נותחו סטטיסטית. לאסוף נתוני מטופלים בהתאם למידע על המטופל במערכת בית החולים. שלבי הניסוי הספציפיים הם כדלקמן: קטעי פרפין הוסרו בשעווה עם קסילן והתייבשו באלכוהול שיפוע, ולאחר מכן בוצע תיקון אנטיגן במאגר נתרן ציטראט עם pH 6.0 על ידי תיקון תרמי בלחץ גבוה. פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית נחסמה בתמיסת מי חמצן 3% למשך 20 דקות, ולאחר מכן אתר הקישור הלא ספציפי נחסם עם 5% BSA בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו את הנוגדנים העיקריים NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) ו-VDAC1 (1:500), ודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה 3 פעמים עם PBS, יש להוסיף נוגדן משני נגד ארנב עזים עם תווית HRP (1:500) ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה. התפתחות צבע DAB, צביעה נגדית של המטוקסילין, איטום חניכיים שקוף מיובש, ניטרלי. כאשר משתמשים ב-DAB לפיתוח צבע, התפתחות הצבע המתונה צריכה להיות צהוב-חום עד חום-חום, והרקע צריך להיות ברור. גם פיתוח צבע מוגזם (חום כהה) וגם לא מספיק (צהוב בהיר) דורש אופטימיזציה של זמן התפתחות הצבע.

ניתוח נדידת תאים ופלישה
נחקרה ההשפעה של ML385 וסופרנטנט מהדגירה המשותפת של סיליקה עם תאי RAW264.7 על נדידת תאים ופלישה לאחר הדגירה עם קו תאי אדנוקרצינומה של הריאות A549. הסופרנטנט של תאי RAW264.7 שתרבית משותפת עם סיליקה במשך 24 שעות נוסף לתאי A549. התאים חולקו לקבוצת הסיליקה, קבוצת הסיליקה+ML385 וקבוצת ה-PBS. קבוצת הסיליקה: 5 מיקרוליטר של תרחיף סיליקה של 30 מ"ג/מ"ל נוספה ל-1 x 105 תאים/מ"ל של תאי RAW264.7. לאחר הדגירה למשך 24 שעות, יש להסיר את הסופרנטנטנט של התא לשימוש מאוחר יותר. קבוצת הסיליקה+ML385: 5 מיקרוליטר של תרחיף סיליקה של 30 מ"ג/מ"ל וריכוז סופי של 5 מ"ג/ליטר ML385 נוספו ל-1 x 105 תאים/מ"ל של תאי RAW264.7. לאחר הדגירה למשך 24 שעות, יש להסיר את הסופרנטנטנט של התא לשימוש מאוחר יותר. קבוצת PBS: 5 מיקרוליטר של PBS נוספו ל-1 x 105 תאים/מ"ל של תאי RAW264.7. לאחר הדגירה למשך 24 שעות, יש להסיר את הסופרנטנטנט של התא לשימוש מאוחר יותר. במהלך בדיקת השריטה, תאי A549 נזרעו לראשונה בצלחות של 12 בארות בצפיפות של 5 x 105 לבאר. לאחר שהתאים גדלו לאיחוי של 95%-100%, נעשו שריטות על התאים החד-שכבתיים באמצעות קצה של פיפטה סטרילית של 200 מיקרוליטר. התאים המקולפים נשטפו בעדינות עם PBS. לאחר מכן, תנאי התרבית שונו כך שיכללו מדיום בסיסי של 1% FBS ואת הסופרנטנטים של כל קבוצת טיפול כדי לשמור על כדאיות התא במהלך תקופת הניסוי של 7 ימים. תמונות של אותו מיקום נאספו תחת מיקרוסקופ הפוך בשעה 0 (יום 0) וביום השביעי (יום 7) לאחר השריטה, בהתאמה. לבסוף, אזור השריטה נותח כמותית, ושיעור סגירת השריטות חושב באמצעות תוכנת ImageJ כדי להעריך את ההשפעה של הסופרנטנט מקבוצות טיפול שונות על יכולת הנדידה של תאי A549.

בתאים העוברים דרך נקבוביות של בדיקת פלישה בגודל ספציפי, נעשה שימוש בתא ממברנה פוליקרבונט של 8 מיקרומטר, כאשר קרום החדר העליון מצופה מראש בג'ל המדמה את הסביבה החוץ-תאית מדולל ביחס של 1:8 לבניית מחסום קרום מרתף. תאי A549 הושעו מחדש בתרחיף שנעשה על ידי ערבוב מדיום נטול סרום עם הסופרנטנטים של כל קבוצת טיפול ביחס של 1:1 ולאחר מכן חוסנו בחדר העליון (2 x 104 תאים לתא). בתא התחתון, תמיסה שנעשתה על ידי ערבוב מדיום המכיל 20% FBS עם הסופרנטנטים של קבוצות הטיפול המתאימות (קבוצת סיליקה+ML385, קבוצת סיליקה וקבוצת PBS) באותה פרופורציה כחומר משיכה כימי. הסופרנטנטים של קבוצות הטיפול המתאימות נאספו על ידי יניקה דרך אקדח פיפטה ב-RAW264.7 Cell phagocytosis של סיליקה. לאחר שהתאים הודגרו ברציפות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 7 ימים, התאים הלא פולשניים בתא העליון הוסרו בעזרת צמר גפן, והתאים שחדרו לקרום והגיעו לתא התחתון קובעו ב-4% פרפורמלדהיד ונצבעו ב-0.1% סגול קריסטל. לבסוף, מספר התאים הפולשניים נבחר באופן אקראי מתוך 5 שדות ראייה על ידי מיקרוסקופ אופטי.

ניתוח ההשפעה של סיליקה ו-ML385 על האפופטוזיס של תאי A549 באמצעות ציטומטריית זרימה
הכנת תאים וקיבוץ: נאספו תאי A549 שטופלו בסופרנטנטים של כל קבוצת טיפול (קבוצת PBS, קבוצת סיליקה, קבוצת סיליקה + ML385). התאים נשטפו בעדינות פי 2 עם PBS מקורר מראש, ואז הושעו מחדש במאגר קשירה 1x, וצפיפות התאים הותאמה ל-1 x 106 תאים לצינור / 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, 5 מיקרוליטר של Annexin V-FITC ו-5 מיקרוליטר של תמיסת צביעה PI נוספו לתרחיף התא, מערבול בעדינות לערבוב והודגרו בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב 1x נוספו לכל צינור ונבדקו מיד במכונה. הזיהוי בוצע באמצעות ציטומטר זרימה. נרגש על ידי לייזר 488 ננומטר, אות הקרינה של Annexin V-FITC נאסף דרך ערוץ FITC, ואות הקרינה של PI נאסף דרך ערוץ PE. לפני הניסוי נעשה שימוש בדגימות עם צביעה בודדת להתאמת פיצוי פלואורסצנטי כדי למנוע חפיפה ספקטרלית. בעת ביצוע ניתוח נתונים, תחילה תוחם את אוכלוסיית תאי היעד בעלילת הפיזור FSC-A/SSC-A והסר שברים. לאחר מכן, הידבקויות תאים לא נכללו באמצעות תרשים הפיזור FSC-H/FSC-A; לבסוף, הוקם שער כדי להבחין בין תאים חיים, תאים אפופטוטיים מוקדמים, תאים אפופטוטיים/נמקיים מאוחרים ותאים פגומים מכנית. הנתונים התקבלו ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo V10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דגם עכבר סיליקה
באיור 1, העכברים קיבלו סיליקה דרך האף במינון של 30 מ"ג/מ"ל ו-70 מיקרוליטר במשך 40 ימים רצופים, מה שהבטיח שלא התרחשו אירועי מוות בעכברים וניתן היה לבסס בהצלחה את מודל עכבר הסיליקה. בינתיים, עכברים עם PBS שימשו כבקרות שליליות. המטרה הייתה לבטל את השפעת הניתוח והממס עצמו ולהבטיח שהפנוטיפ מושרה באופן ספציפי על ידי סיליקה. השכפול המוצלח של מודל פגיעה ריאתית זה המושרה על ידי סיליקה מספק בסיס הכרחי in vivo למחקר הבא על מנגנון ההתקדמות הממאירה והתערבות תר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אדנוקרצינומה של הריאות היא אחד הגורמים העיקריים למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם, ושיעורי השכיחות והתמותה שלה עולים משנה לשנה17. סיליקה מסווגת כמסרטן בבני אדם מסוג 1 על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן, והסיכון לאדנוקרצינומה של הריאות עולה עם חשיפה תעסוקתית מצטברת 18,19,20,21. מחקרים קודמים הוכיחו כי סיליקה עשויה להפעיל פיברוזיס ריא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

תודה לחברי הצוות על תמיכתם ותרומתם למחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי המעבדה המרכזית להפחתת אבק תעשייתי עמוק ובריאות ובטיחות תעסוקתית של מוסדות להשכלה גבוהה באנהוי (מס' AYZJSGXLK202202006), קרן הסטארט-אפ להצגת כישרונות של בית החולים העממי של שנחאי פודונג (מס' PRYYH202501).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BeyoGold TranswellBeyotime Biotechnology FTW067-48lnsטרנסוול
CD3eביוסיינס BD561827FITC ה-HSTER נגד עכבר CD3e(145-2C11)
CD86ביוסיינס BD105013CD86
CD8aביוסיינס BD100713CD8a
CDK1אבקאםab133327אנטי-CDK1
ערכת זיהוי אפופטוזיס תאיתBeyotime Biotechnology C1062Lזיהוי אפופטוזיס
DAPIBeyotime Biotechnology P0131-25mlDAPI
מכונת הטמעהP.S.J MEDICALBM450Aמכונת הטמעה
F4/80ביוסיינס BD123109F4/80
מייבש רקמות אוטומטי לחלוטיןLeica BiosystemsASP3005מייבש רקמות אוטומטי לחלוטין
שקופיות מיקרוסקופ זכוכיתציטוטסט250124A1שקופיות מיקרוסקופ זכוכית
H& צבע EBeyotime Biotechnology C0105MH& צבע E
ערכת IHCביוטכנולוגיה של אבסיןABS996-5MLערכת IHC
גלאי LC3Beyotime Biotechnology C3018Mגלאי LC3
להבי מיקרוטום בעלי פרופיל נמוךתרמו פישר3052835להבי מיקרוטום בעלי פרופיל נמוך
גשוש ליזוזוםBeyotime Biotechnology C1046גשוש ליזוזום
עט טושמעדןSK109עט טוש
צבע מסוןBeyotime Biotechnology C0189Mצבע מסון
ג'ל מטריקסBeyotime Biotechnology C0371-5mlדבק מטריצה
מיקרוטוםLeica BiosystemsHistoCore BIOCUTמיקרוטום
ML385אבקאםAB287109מעכב NRF2
NK1.1ביוסיינס BD561117NK1.1
NRF2אבקאםab1809Yאנטי-NRF2
עמ' 62אבקאםab20735אנטי-p62
שעוות פרפיןסולרביולוגיהYA0012שעוות פרפין
ערכת בדיקה למיני חמצן תגובתיBeyotime Biotechnology S0033Mגשושית ROS
סיליקהסיגמא אולדריץ'S5631סיליקה גבישית
VDAC1אבקאםab34726אנטי-VDAC1

מקורות

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Liang, D., et al. Lung Cancer in Never-Smokers: A Multicenter Case-Control Study in North China. Front Oncol. 9, 1354(2019).
  3. Olsson, A., et al. Lung Cancer Risks Associated with Occupational Exposure to Pairs of Five Lung Carcinogens: Results from a Pooled Analysis of Case-Control Studies (SYNERGY). Environ Health Perspect. 132 (1), 017005(2024).
  4. Sato, T., Shimosato, T., Klinman, D. M. Silicosis and lung cancer: current perspectives. Lung Cancer Targets Ther. 9, 91-101 (2018).
  5. Nakano-Narusawa, Y., et al. Single Intratracheal Quartz Instillation Induced Chronic Inflammation and Tumourigenesis in Rat Lungs. Sci Rep. 10 (1), 6647(2020).
  6. Hornung, V., et al. Silica crystals and aluminum salts activate the NALP3 inflammasome through phagosomal destabilization. Nat Immunol. 9 (8), 847-856 (2008).
  7. Dodson, M., et al. Modulating NRF2 in Disease: Timing Is Everything. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 59, 555-575 (2019).
  8. Bae, T., Hallis, S. P., Kwak, M. K. Hypoxia, oxidative stress, and the interplay of HIFs and NRF2 signaling in cancer. Exp Mol Med. 56 (3), 501-514 (2024).
  9. Yamamoto, M., Kensler, T. W., Motohashi, H. The KEAP1-NRF2 System: a Thiol-Based Sensor-Effector Apparatus for Maintaining Redox Homeostasis. Physiol Rev. 98 (3), 1169-1203 (2018).
  10. Weiss-Sadan, T., et al. NRF2 activation induces NADH-reductive stress, providing a metabolic vulnerability in lung cancer. Cell Metabol. 35 (3), 487-503.e7 (2023).
  11. Rojo de la Vega, M., Chapman, E., Zhang, D. D. NRF2 and the Hallmarks of Cancer. Cancer Cell. 34 (1), 21-43 (2018).
  12. Chen, G., et al. n-BuOH extract of Bletilla striata exerts chemopreventive effects on lung against SiO2 nanoparticles through activation of Nrf2 pathway. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 82, 153445(2021).
  13. Song, J., Meng, H., Deng, G., Lin, H. Sustainable Release Selenium Laden with SiO2 Restoring Peripheral Nerve Injury via Modulating PI3K/AKT Pathway Signaling Pathway. Int J Nanomed. 19, 7851-7870 (2024).
  14. Zuo, L., et al. The Nrf2-HMOX1 pathway as a therapeutic target for reversing cisplatin resistance in non-small cell lung cancer via inhibiting ferroptosis. Cell Death Disc. 11 (1), 287(2025).
  15. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
  16. Xu, C., et al. ML385, an Nrf2 Inhibitor, Synergically Enhanced Celastrol Triggered Endoplasmic Reticulum Stress in Lung Cancer Cells. ACS Omega. 9 (43), 43697-43705 (2024).
  17. Qiu, Z., et al. Proteomic characteristics of lung adenocarcinoma tumors that are small but highly invasive. Med Adv. 1 (4), 340-352 (2023).
  18. Christiani, D. C. Occupational Exposures and Lung Cancer. Am J Respirat Crit Care Med. 202 (3), 317-319 (2020).
  19. Requena-Mullor, M., et al. Association between Crystalline Silica Dust Exposure and Silicosis Development in Artificial Stone Workers. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5625(2021).
  20. Wang, Z., et al. Erchen decoction alleviates silicosis by attenuating ferroptosis and fibrosis in alveolar macrophages via modulating the P53/HMOX1 pathway. J Ethnopharmacol. 352, 120227(2025).
  21. Zhou, Y., Zhang, W., Wu, D., Fan, Y. The effect of silica exposure on the risk of lung cancer: A meta-analysis. J Biochem Mol Toxicol. 37 (4), e23287(2023).
  22. Liu, W., et al. Nrf2 Protects Against Oxidative Stress Induced By SiO2 Nanoparticles. Nanomedicine. 12 (19), 2303-2318 (2017).
  23. Li, S., et al. SiO2 particles induce pulmonary fibrosis by modulating NLRP3 through the ROS/Keap1/Nrf2 signaling pathway in rats. Food Chem Toxicol Int J Published Brit Ind Biol Re Associat. 202, 115520(2025).
  24. Wang, G., et al. Nrf2 mediates the effects of shionone on silica-induced pulmonary fibrosis. Chinese Med. 19 (1), 88(2024).
  25. Tian, Y., et al. Nebulized inhalation of LPAE-HDAC10 inhibits acetylation-mediated ROS/NF-κB pathway for silicosis treatment. J Controlled Release. 364, 618-631 (2023).
  26. Baird, L., Yamamoto, M. The Molecular Mechanisms Regulating the KEAP1-NRF2 Pathway. Mol Cell Biol. 40 (13), e00099-e00120 (2020).
  27. Kreß, J. K. C., et al. The integrated stress response effector ATF4 is an obligatory metabolic activator of NRF2. Cell Rep. 42 (7), 112724(2023).
  28. Xie, B., Wang, S., Jiang, N., Li, J. J. Cyclin B1/CDK1-regulated mitochondrial bioenergetics in cell cycle progression and tumor resistance. Can Lett. 443, 56-66 (2019).
  29. Odle, R. I., Florey, O., Ktistakis, N. T., Cook, S. J. CDK1, the Other "Master Regulator" of Autophagy. Trends Cell Biol. 31 (2), 95-107 (2021).
  30. Liu, Y., et al. Hypoxia-induced GPCPD1 depalmitoylation triggers mitophagy via regulating PRKN-mediated ubiquitination of VDAC1. Autophagy. 19 (9), 2443-2463 (2023).
  31. Yuan, M., et al. IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling. Redox Biol. 52, 102289(2022).
  32. Shi, Q., et al. SPOP mutations promote p62/SQSTM1-dependent autophagy and Nrf2 activation in prostate cancer. Cell Death Differentiat. 29 (6), 1228-1239 (2022).
  33. Zheng, Y., et al. Melatonin Alleviates the Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion-Induced Pyroptosis of HEI-OC1 Cells and Cochlear Hair Cells via MT-1,2/Nrf2 (NFE2L2)/ROS/NLRP3 Pathway. Mol Neurobiol. 60 (2), 629-642 (2023).
  34. Cords, L., et al. Cancer-associated fibroblast phenotypes are associated with patient outcome in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 42 (3), 396-412.e5 (2024).
  35. Wu, F., et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer. Nat Comm. 12 (1), 2540(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NRF2ROS NRF2

מאמרים קשורים