הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דימות פלואורסצנציה כמותי של זיהום באלפא-וירוס (Alphavirus) לסריקות אנטי-ויראליות

64 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69384

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן מוצג פרוטוקול חסון וגמיש לוויזואליזציה רציפה של זיהומי alphavirus. פרוטוקול זה מספק גישה לחקירת השכפול של alphavirus ולהערכת היעילות של תרכובים אנטי-ויראליים ברמה התאית, בהתבסס על דימות פלואורסצנציה.

תקציר

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מציעה גישה רגישה ורב-גונית לחקר זיהום באלפאו-וירוס (alphavirus) ברמה התאית. באמצעות שילוב של נגיפים המסומנים בפלואורסצנט עם ניתוח כמותי של תמונות, שיטה זו מאפשרת אפיון מרחבי וזמני מפורט של דינמיקת הזיהום, כולל זיהוי הבדלים דקים בקינטיקת השכפול ובהפשטה מתא לתא. מטרה מרכזית של פרוטוקול זה היא יישומו בבדיקות לסריקת תרופות נוגדות נגיפים. כימות מבוסס תמונה של עוצמת הפלואורסצנציה מספק אמצעי חזק וניתן לשחזור להערכת היעילות של תרכובים נוגדי נגיפים, מה שמאפשר זיהוי מוקדם ורגיש של השפעות מעכבות בתאים נגועים. דבר זה מקל על זיהוי פגיעות (hits) מבטיחות של תרופות נוגדות נגיפים ותומך בהערכת תגובות התלויות במינון. הגישה מתאימה גם למחקרים השוואתיים של זני אלפאו-וירוס שונים או מוטנטים, שכן שינויים בהתנהגות השכפול ובדפוסי ההפשטה הופכים גלויים בקלות. הגמישות שלה, התאימות למספרי קווי תאים שונים והשילוב הפשוט בפלטפורמות דימות אוטומטיות הופכות את השיטה לניתנת להרחבה ומתאימה למסעות סריקה בספיקה גבוהה (high-throughput screening). באופן כללי, פרוטוקול זה מקדם את הגילוי וההערכה של אסטרטגיות נוגדות נגיפים. בהתחשב בכך שמספר אלפאו-וירוסים גורמים למחלות אנושיות ווטרינריות משמעותיות, חסרים עבורם טיפולים נוגדי נגיפים מאושרים, והם ממשיכים להתרחב גיאוגרפית עם התפרצויות חדשות, זיהוי תרופות נוגדות נגיפים חדשות נותר בעדיפות דחופה. לכן, זרימת העבודה מבוססת הפלואורסצנציה הזו מהווה תרומה בעלת ערך ובזמן למחקר המודרני של אלפאו-וירוס.

מבוא

אלפאווירוסים (Alphaviruses) הם נגיפים בעלי מעטפת, עם חומצה ריבנוקלאית (RNA) בעלת גדיל יחיד עם פולריות חיובית, השייכים למשפחת ה-Togaviridae1,2,3. הם מועברים בעיקר על ידי יתושים ואחראים למגוון מחלות בבני אדם ובבעלי חיים. סוג האלפאווירוס כולל מספר נגיפים בעלי חשיבות רפואית, כגון נגיף הצ'יקנגוניה (CHIKV), נגיף סינדביס (Sindbis virus), נגיף דלקת המוח של סוסי המזרח (Eastern equine encephalitis virus) ונגיף דלקת המוח של סוסי ונצואלה (Venezuelan equine encephalitis virus)4,5. פתוגנים אלו גורמים לתסמינים הנעים בין מחלה חוםית ופריחה לבין סיבוכים נוירולוגיים חמורים6. באופן מדאיג, נגיף ה-CHIKV הופיע מחדש כבעיה מרכזית בבריאות הציבור. מאז תחילת שנת 2025 לבדה, דווחו למעלה מ-220,000 מקרים ב-14 מדינות, שהביאו לפחות ל-80 מקרי מוות7. למרות ששיעור התמותה נמוך, חלק משמעותי מהאנשים המודבקים מפתחים כאבי מפרקים כרוניים, שעלולים להוביל לנכות ארוכת טווח ולירידה בניידות8. כדי לפתח אסטרטגיות אנטי-ויראליות ממוקדות, חיוני להגיע להבנה מקיפה יותר של השכפול של אלפאווירוסים ושל האינטראקציות בין הפתוגן למארח. בינתיים, חלק מהאלפאווירוסים, כמו נגיף יער סמליקי (SFV), מראים פתוגניות נמוכה בבני אדם, למרות דמיון גנטי ומבני גבוה לאלפאווירוסים וירולנטיים יותר. דבר זה הופך את ה-SFV למודל אידיאלי לחקר אלפאווירוסים מבלי להוות סיכון גבוה לבריאות האדם9,10,11.

בדיקות מסורתיות כגון בדיקות פלאק (plaque assays), בדיקת מינון זיהומי ל-50% תרביות רקמה (TCID50) ואנליזת תגב תגובה שרשרתית של פולימראז כמותית (qPCR) הן בעלות ערך לכימות של טיטרים ויראליים וביטוי גנים, אך הן מוגבלות למדידות של נקודת סיום ומחייבות ליזיס או קיבוע של תאים. כתוצאה מכך, הן אינן יכולות ללכוד באופן ישיר את דינמיקת הזיהום בתוך אותם תאים לאורך זמן12,13. כדי להתגבר על מגבלות אלו, דימות פלואורסצנטי בזמן אמת מספק גישה עוצמתית שאינה הרסית לניטור קינטיקת זיהום לאורך נקודות זמן מרובות. שימוש בנגיפים המסומנים פלואורסצנטית, כגון SFV המסומן ב-mCherry, מאפשר ויזואליזציה וכימות ישירים של אות הנגיף הדיווח (reporter virus) והפצתו בתאים חיים14,15. עבור הניסויים המתוארים כאן, נעשה שימוש בקווי תאים הנפוצים במחקר על ארבו-נגיפים (arboviruses). תאי U4.4, המופקים מזחלי Aedes albopictus, הם תאי יתוש התומכים בשכפול יעיל של ארבו-נגיפים רבים ומסייעים למחקרים על אינטראקציות בין וקטור לנגיף16,17. במקביל, תאי BHK-21, קו תאים של יונקים דמויי פיברובלסטים שמקורם ברקמת כליה של המסטר, מספקים מערכת מאכסנת חולייתית המאפשרת זיהום (permissive), המשמשת לעיתים קרובות להרביית נגיפים ולבדיקות של וירולוגיה מולקולרית18.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הניטור של ביטוי רפורטר ויראלי ואת האפיון של תרכובות אנטי-ויראליות, תוך שימוש במעכבי פורין (furin inhibitors) כדוגמה. פורין הוא פרו-פרוטאין קונברטאז הנמצא באאוקריוטים רבים וממלא תפקיד מרכזי בהפעלה של מקדימים של גורמי גדילה, הורמונים, מטריקס מטאלופרוטאינזים, חלבוני פלזמה וקולטנים19,20. אלפא-וירוסים רבים מנצלים את הפורין כדי לבקוע ולהפעיל את חלבוני השטח שלהם, שלב מכריע לשכפול מוצלח20. מעכבי פורין הם תרכובות שתוכננו סינתטית כדי לחסום את פעילות הפורין, ובכך  להפחית את השכפול הוויראלי21,22,23. בהינתן הזמינות המוגבלת של פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח אוטומטי של זיהומי אלפא-ויראליים המבוסס על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית באמצעות קורא רב-מצבי לדימוי תאים, מוצג כאן זרימת עבודה מפורטת לאפיון תרכובות אנטי-ויראליות בתאי aedine. הפרוטוקול מפרט את השלבים לתרבית תאים, ייצור נגיף, הדבקה, טיפול בתרכובת אנטי-ויראלית (מעכב פורין), דימוי פלואורסצנטי וניתוח תמונות. עם זאת, ניתן להתאים בקלות את השיטות המתוארות כאן לנגיפים אחרים ולסממנים פלואורסצנטיים חלופיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בטיחות ביולוגית

הערה: נגיף יער סמליקי עם תג mCherry רקומביננטי (SFV-mCherry) המשמש בפרוטוקול זה הוא מושבב גנטית24,25,26. שילוב של גן דגל פלואורסצנטי מסווג אותו כגוף שעבר שינוי גנטי, מה שהופך אותו לכפוף לדרישות הכלה ובקרה רגולטוריות נוספות. עבודה עם אלפאווירוסים אחרים, ובמיוחד נגיפים פתוגניים יותר כגון CHIKV, עשויה לדרוש היתרים ואמצעי הכלה נוספים.

  1. נקה את תא הבטיחות הביולוגית עם חומר חיטוי מתאים והפעל קרינת UV למשך 30 min לפחות לפני ואחרי בדיקות ויראליות.
  2. השמד את כל החומרים המזוהמים בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות. אסוף פסולת מוצקה ונוזלית בנפרד במכלים הניתנים לעיקור באוטוקלאב, ועקר אותם באוטוקלאב לפני ההשלכה.

2. הכנת תרכובות אנטי-ויראליות

הערה: מעכבי הפורין MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), ו-MI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide) ששימשו במחקר זה, הם דוגמאות לתרכובות אנטי-ויראליות שנבחרו לבדיקה. מעכב הפורין MI-1148 שימש כביקורת שלילית בבדיקת הציטוטוקסיות וכביקורת חיובית בבדיקה האנטי-ויראלית.

  1. המס את התרכובות האנטי-ויראליות בממס מתאים. במידת האפשר, השתמש במים סטריליים כדי למנוע השפעות ציטוטוקסיות. ניתן להשתמש ב-Dimethyl sulfoxide או במתנול בריכוז מקסימלי של 2% (v/v). מומלץ להשתמש בתמיסות סטוק בריכוז של 10 mM במים סטריליים.
  2. אחסן את תמיסות הסטוק בטמפרטורה של -20 °C, בהתאם ליציבות ולמסיסות, אלא אם צוין אחרת על ידי היצרן.

3. תרבית תאים

  1. תרבתו תאי U4.4 במצע Leibovitz's L-15 בתוספת 10% fetal bovine serum (FBS), 1% MEM non-essential amino acids, 1% tryptose phosphate broth, 1% glutamine, ו-1% penicillin/streptomycin (Pen/Strep) (צפיפות זריעה: כ-1 × 106 תאים לבקבוק T25, נפח תרבית: 5 mL). שמרו את התאים בטמפרטורה של 28 °C. בצעו מעבר (Passage) לתאי U4.4 ביחס של 1:6 פעם בשבוע, אך התאימו את צפיפויות הזריעה בהתאם לצרכים הניסיוניים.
    הערה: שורות תאים נוספות, כגון תאי C6/36, תואמות אף הן לפרוטוקול זה. ניתן להשתמש במצעים ובתוספים חלופיים לפי הצורך. הוספת אנטיביוטיקה היא רשות וניתן להשמיטה.
  2. תרבתו תאי כליה של המסטר בייבי (BHK-21) במצע Dulbecco's Modified Eagle's Medium בתוספת 10% FBS, 1% glutamine או שיווי משקל סטטי, ΣFx=0, גרף, ניתוח מאזן כוחות, תרשים יציבות מכנית.‑alanyl‑שיווי משקל סטטי, ΣFx=0, גרף, ניתוח מאזן כוחות, תרשים יציבות מכנית.‑glutamine, ו-1% Pen/Strep (צפיפות זריעה: כ-1 × 106 תאים לבקבוק T75, נפח תרבית: 10 mL). שמרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח הכיל 5% CO2. בצעו מעבר לתאים ביחס של 1:12 כל 4-5 ימים, עם גמישות לשינוי צפיפויות הזריעה לפי הצורך.
  3. ודאו שהתאים נשארים בריאים ומתרבים באופן פעיל.

4. ייצור נגיף

  1. הכנת מלאים של SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) בתאי BHK-21.
    1. תרבית תאי BHK-21 (צפיפות זריעה: כ-1 × 105 תאים לבאר, נפח תרבית: 500 µL) בפלטת תרבית תאים של 24 בארות שקופה תחת התנאים שתוארו לעיל.
    2. במסביב ל-90% קונפלואנסיות (קונפלואנסיות יעד: כ-2 × 105 תאים), בצע טרנספקציה לתאי BHK-21 עם הפלסמיד SFV6-2SG-mCherry באמצעות סוכן טרנספקציה בתווך הדבקה (DMEM מועשר ב-1% Pen/Strep ו-0.2% bovine serum albumin). לשם כך, דלל 1 µL של סוכן טרנספקציה ב-25 µL של תווך עם סרום מופחת.
    3. במבחנה נפרדת, דלל 0.5 µg של DNA פלסמידי ו-1 µL של תוסף קנייני ב-25 µL של תווך עם סרום מופחת. הוסף את תמיסת ה-DNA המדוללת לתמיסה המכילה את סוכן הטרנספקציה המדולל והדגש למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 50 µL מהקומפלקס שהתקבל לתאים.
      הערה: ניתן להשתמש בסוכני טרנספקציה אחרים, בתנאי שהם תואמים לקו התאים הספציפי, וההוראות עשויות להשתנות בהתאם לסוכן שבו נעשה שימוש.
    4. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, אסוף את העליון (supernatant) המכיל את הנגיף באמצעות פיפטה, חלק לנפחים של 250 µL למבחנה נטולת DNA/RNA, ואחסן ב-80 °C-.
  2. טיטרציה באמצעות בדיקת TCID50.
    1. תרבית תאי BHK-21 (צפיפות זריעה: כ-2 × 104 תאים לבאר, נפח תרבית: 100 µL) בפלטת 96 בארות שחורה המיועדת لديמות (imaging grade) תחת התנאים שתוארו לעיל.
    2. הפשר חלק מהנגיף, הכן דילולות סדרתיות של פי 10 של דגימת הנגיף בתווך הדבקה (15 µL דגימת נגיף + 135 µL תווך הדבקה), השלך את התווך הישן, והוסף 100 µL מהדילולות לתאים.
    3. הדגש את התאים למשך שעה אחת ב-37 °C באינקובטור לח הכיל 5% CO₂ והחלף לאחר מכן את האינוקולום ב-100 µL של תווך הדבקה טרי.
    4. 48 שעות לאחר ההדבקה (hpi), העरक את השכפול הנגיפי באמצעות מדידת פלואורסצנציה בעזרת קורא פלטות רב-מצבים לדימות (תיאור מפורט בסעיף 7) וקבע את האפקט הציטופתי שנגרם מהדבקת הנגיף. חשב את ערך ה-TCID50 על בסיס שיטת Reed-Muench28 והמר לטיטרים נגיפיים מוערכים (PFU/mL) באמצעות קירוב סטנדרטי מבוסס פואסון שבו 1 TCID50 מקביל ל-0.7 PFU.

5. קביעת ציטוטוקסיות

  1. תרבת תאי U4.4 (צפיפות זריעה: כ-3 × 104 תאים לבאר, נפח תרבית: 100 µL) בצלחת תרבית תאים שקופה בעלת 96 בארות, תחת התנאים שתוארו לעיל.
    הערה: בארות חיצוניות (שורות A ו-H; עמודות 1 ו-12) זורעו בתאים אך הוצאו מהניתוח הניסויי כדי למנוע אפקטים של שוליים, כולל אידוי מוגבר.
  2. בהגעה ל-90% התמזגות (confluency) (יעד התמזגות: כ-6 × 104 תאים), טפל את התאים ב-100, 50, 25 ו-12.5 µM של מעכבי הפורין MI-1130 ו-MI-1131 בנפח כולל של 100 µL. הוסף את MI-1148 (בריכוזים זהים לאלו של MI-1130 ו-MI-1131), תאים לא מטופלים ותאים שטופלו במים כביקורות שליליות, ו-ionomycin (בריכוז 100 µM בבדיקה) כביקורת חיובית לציטוטוקסיות.
  3. 48 שעות לאחר הטיפול (hpt), העरक את חיוניות התאים באמצעות בדיקה לומניסצנטית המבוססת על כימות ATP. הוסף נפח שווה של ריאגנט הבדיקה הלומניסצנטית לכל באר (יחס של 1:1 ביחס למצע התרבית), נער את הצלחת במשך 2 דקות כדי להבטיח ליזיס של התאים, והדגר למשך 10 דקות בחושך לפני מדידת הלומניסצנציה.
    הערה: ניתן להשתמש גם בבדיקות חיוניות תאים אחרות המבוססות על עקרונות זיהוי שונים.
  4. רשום את נתוני הלומניסצנציה בצלחת 96 בארות שחורה או לבנה באמצעות קורא רב-מצבי (multimode reader).

6. הדבקה נגיפית וטיפול בתרכובת אנטי-ויראלית

  1. תרבתו תאי U4.4 (צפיפות זריעה: כ-3 × 104 תאים/באר, נפח תרבית: 100 µL) בפלטה שחורה בעלת 96 בארות המיועדת לדימוג (imaging-grade) בתנאים המתוארים לעיל.
    הערה: הבארים החיצוניות (שורות A ו-H; עמודות 1 ו-12) זורעו בתאים אך הוצאו מהניתוח הניסויי כדי למנוע אפקטי שוליים, כולל אידוי מוגבר.
  2. הדביקו את התאים (צפיפות מטרה: כ-6 × 104 תאים) עם SFV-mCherry בריבוי הדבקה (MOI) של 0.01 במצע L-15 ללא תוספות, תוך שימוש בנפח הזרקה של 100 µL, והדגרירו למשך 1 h ב-28 °C.
    הערה: יש להשתמש רק במאגרי נגיף רפורטר במעברים נמוכים (low-passage), במיוחד בעבודה עם MOIs נמוכים מאוד והדבקות הנמשכות מספר ימים.
  3. דללו את מעכבי הפורין MI-1130, MI-1131 ו-MI-1148 לריכוזים סופיים של 100, 50, 25 ו-12.5 µM בפלטת 96 בארות נפרדת בעלת תחתית V, תוך שימוש במצע L-15 עם תוספות. הכינו 110 µL לכל באר כדי לאפשר רזרבה של 10%, והעבירו 100 µL (נפח סופי) על התאים. עבור הביקורות, השתמשו בתאים מודבקים שטופלו בממס של התרכובות האנטי-ויראליות, ובתאים מודבקים המכילים את הנגיף בלבד כביקורת שלילית. יש להוסיף גם תאים שאינם מודבקים ושאינם מטופלים כדי למדוד את הפלואורסצנציית הרקע.
  4. לאחר תקופת הדבקה של 1 h, הסירו את התמיסה המדביקה (inoculum) והעבירו 100 µL של מעכבי הפורין המדוללים מפלטות ה-V-bottom לפלטות השחורות המיועדות לדימוג.
  5. הדגרירו את התאים ב-28 °C.

7. דימוי פלואורסצנציה של תאים חיים, ניתוח תמונה כמותי והצגת נתונים

  1. מדידת ביטוי של רפורטר ויראלי באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה (ראו Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6, and Supplementary Figure 7 להגדרות התוכנית).
    1. ב-24 וב-48 hpi, צבעו את גרעיני התאים על ידי הוספת 8 µL של תמיסת צבע נגדי גרעיני חודר-תאים לכל באר. דגרו למשך 30 min ב-28 °C.
      הערה: ניתן לנטר את ההדבקה במספר נקודות זמן. עם זאת, מדידות ב-48 h לאחר ההדבקה מספקות את האות החזק ביותר (ראו Supplementary Figure 8) ומאפשרות להעריך את ההשפעות האנטי-ויראליות באופן המהימן ביותר. קריאות ב-24 h או בנקודות זמן ביניים הן אפשריות, אך הארכת הדגירה מעבר ל-48 h מגבירה את הסיכון לצמיחת יתר של התאים. בחרו צפיפות תאים (confluency) מתאימה בתחילת הניסוי כדי להבטיח שהתאים לא יגיעו לצמיחת יתר עד לנקודת הזמן הנבחרת לקריאה. דבר זה ימנע הפרעה לספירה מדויקת של התאים.
    2. לאחר הדגירה (ובנוסף למכסה השקוף), הוסיפו רדיד איטום שקוף המכסה את חלקו העליון של הפלטה למטרות בטיחות.
      הערה: בעת שימוש במכשיר דימות, חיוני לבחור את סוג הפלטה הנכון. הגדרות התאורה, זמן האינטגרציה וההגבר (gain) ישתנו בהתאם לגן הרפורטר. מומלץ מאוד לבצע מדידות מקדימות כדי לקבוע את הפרמטרים האופטימליים. הגדרות התאורה, האינטגרציה וההגבר הראשוניות ששימשו לביסוס הפרוטוקול תחת התנאים הנתונים מופיעות ב-Supplementary Figure 2, שם הגדרות התוכנית מתוארות בפירוט.
    3. רכשו תמונות של כל הבאר באמצעות תפירת תמונות (image stitching) (ארבעה שדות לבאר בהגדלה של 4x) באמצעות הקורא הרב-מצבי (multimode reader).
    4. מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה האדומה באמצעות קוביית פילטר Texas Red (עירור: 586/15 nm; פליטה: 647/57 nm).
    5. קבעו את סך מספר התאים באמצעות ערוץ DAPI עם ההגדרות הבאות (עירור: 377/50 nm; פליטה: 447/60 nm).
  2. ניתוח תמונות כמותי (ראו Supplementary Table 1 לנתונים גולמיים).
    הערה: עבור מדידות הפלואורסצנציה, נעשה שימוש בקורא דימות של מיקרופלטות. פרמטרים מפורטים ששימשו לבדיקה זו ניתן למצוא ב-Supplementary Figure 2.
    1. עבדו את התמונות באמצעות תוכנת דימות מתאימה.
    2. בפאנל צמצום הנתונים, בחרו Image Stitching לערוצי DAPI ו-Texas Red כדי ליצור תמונה אחת מהבארים.
    3. הוסיפו Image Statistics ובחרו Total intensity בערוץ ה-Texas Red Stitched. בצעו Image Preprocessing כדי להסיר רעשי רקע מערוץ ה-DAPI Stitched.
    4. הריצו Cellular Analysis על ערוץ ה-DAPI Stitched שעבר עיבוד מקדים (Preprocessed).
    5. חשבו את עוצמת הפלואורסצנציה האדומה הממוצעת לתא על ידי הפחתת הפלואורסצנציה הממוצעת של בארי הביקורת הלא-מדובקים והבלתי-מטופלים מכל באר מטופל, ולאחר מכן חלוקת התוצאה בסך מספר התאים בבאר המתאימה.
  3. פתרון בעיות
    1. נטרו את יציבות המיקוד במהלך המדידה, במיוחד במדידות דימות ארוכות או בעת שימוש בפלטות רגישות לטמפרטורה.
    2. הפעילו מיקוד אוטומטי (autofocus) והגבירו את תדירות המיקוד האוטומטי אם נצפתה סטיות במיקוד. הפחיתו את מהירות הרכישה או אפשרו לפלטות להגיע לשיווי משקל עם טמפרטורת המכשיר לפני הדימות אם הסטיות נמשכות.
    3. השתמשו בפלטות המיועדות לדימות כדי להבטיח איכות אות עקבית במהלך הרכישה. מנעו זליגת אור (bleed-through) וחשיפת יתר על ידי הימנעות מתאורה מוגברת וזמני אינטגרציה ארוכים.
    4. הפחיתו את עוצמת העירור, קצרו את זמן האינטגרציה או הפחיתו את ההגבר עד שרוויית האות תימנע. ודאו שערוצי הפלואורופור מופרדים היטב והתאימו את הגדרות הפילטר לפי הצורך.
      הערה: זליגת אור בין DAPI ל-mCherry היא בדרך כלל נמוכה אך תלויה בבניית הרפורטר שנעשה בה שימוש (למשל, GFP).
    5. הימנעו מצפיפות יתר של תאים כדי לשמור על קינטיקת הדבקה תקינה ורגישות של הבדיקה. אם התרחשה צפיפות יתר, קצרו את זמן הדגירה לפני המדידה.
    6. נטרו השפעות הקשורות לצבע על חיוניות התאים ואיכות האות, במיוחד בריכוזים גבוהים. הפחיתו את ריכוז הצבע או קצרו את זמני הדגירה אם נצפתה רעילות הקשורה לצבע או רקע רווי מדי.
    7. הכינו ואחסנו את הצבעים בהתאם להמלצות היצרן כדי לשמור על יציבות האות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעבודה זו מוצג פרוטוקול מפורט לניטור התפשטות של alphavirus ולהערכה של תרכובות אנטי-ויראליות (למשל, מעכבי furin) באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בפורמט של פלטה רב-בארית. כדי להדגים את הוויזואליזציה של ההשפעות המעכבות על ביטוי דגישן ויראלי, נבחרו שלושה מעכבי furin שסונתזו בעבר לבדיקה בקו התאים aedine U4.4: MI-1148, MI-1130 ו-MI-1131. סקירה כללית של זרימת העבודה הניסויית מומחשת ב-איור 1.

לפני הערכת היעילות האנטי-ויראלית, חיוני להעריך את הציטוטוקסיות כדי להבטיח שכל ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היכולת לצפות בשכפול alphavirus בזמן אמת מציעה נקודת מבט רצפית ומצטברת המשלימה את הבדיקות המסורתיות לנקודת סיום. פרוטוקול דימות תאי חיים רב-נקודתי זה מהווה מודל שימושי לחקר alphaviruses, שכן הוא מספק פלטפורמה דינמית לצפייה בהתפשטות הויראלית.

ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה במספר פרמטרים. ראשית, חשוב להעריך את רעילות התאים (cytotoxicity) של התרכובות לפני ביצוע בדיקה אנטי-ויראלית, כדי לשלול תוצאות חיוביות שגויות הנובעות ממות תאים. לאחר ביצוע הערכת ההשפעות הציטוטוקסיות, ניתן להעריך את הפעילות האנטי-וי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לפרופ' ד"ר Andres Merits מאוניברסיטת טרטו, אסטוניה, ולפרופ' ד"ר Andreas Pichlmair מהאוניברסיטה הטכנית של מינכן, גרמניה, על אספקת pCMV-SFV6-2SG-mCherry. אנו מודים לפרופ' ד"ר Stefanie Becker מאוניברסיטה לרפואה ווטרינרית, הנובר, גרמניה, על תאי C6/36. אנו מודים לפרופ' ד"ר Torsten Steinmetzer מאוניברסיטת מרבורג, מרבורג, גרמניה, על אספקת מעכבי הפורין. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz של משרד ההשכלה הגבוהה, המחקר והאמנויות של חסן (Hessian), באמצעות מרכז LOEWE לגנומיקה של מגוון ביולוגי תרגומית (LOEWE-TBG) תחת קוד מימון: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, ועל ידי ה-BMFTR (פרויקט ASCRIBE-מספר מענק 01KI2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלבומין בקר, פראקציה V, pH 7.0אלקטרופורזה של SERVA11930.03
DMEM יציב על השולחן (BenchStable)Thermo Fisher ScientificA4192101
תאי BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, אפלהיים, גרמניה603126
בקבוק לתרבית תאים, 50 מ"ל, 25 ס"מ2, PS, מכסה הברגה עם פילטר אדום, שקוף, CELLSTAR, TC, סטריליGreiner Bio-One690175
מיקרופלטה לתרבית תאים, 24 בארות, PS, תחתית שטוחה (F-bottom), (בארת עם דופן גבוהה/Chimney well), שקופה, CELLSTAR, TC, מכסה עם טבעות קונדנסציה, סטריליתGreiner Bio-One662160
פלטת מיקרו לתרבית תאים, 96 בארות, PS, תחתית שטוחה (F-bottom), (בארת עם דופן גבוהה/Chimney well), µשקוף, שחור, CELLSTAR, TC, מכסה עם טבעי עיבוי, סטריליGreiner Bio-One655090
פלטת מיקרו לתרבית תאים, 96 בארות, PS, תחתית שטוחה (F-bottom), (בארה עם דופן גבוהה/Chimney), שקופה, CELLSTAR, TC, מכסה עם טבעות קונדנסציה, סטריליGreiner Bio-One655180
פלטת מיקרו לתרבית תאים, 96 בארות, PS, תחתית בצורת V, שקופהGreiner Bio-One651101
מגרדת תאיםVWR734-2602
בדיקת CellTiter-Glo למדידת חיוניות תאים באמצעות לומניסנציהPromegaG7573
קורא רב-מצבים לדימות תאים Cytation 5Biotek
קוביות מסנן DAPI 1225100Biotekעירור 377/50 ננומטר; פליטה 447/60 ננומטר
מצע דולבקו modified eagle's medium (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
סרום עוברי של בקרFisher Scientific11550356
מעכב הפורין MI-1130מחקר זה
מעכב הפורין MI-1131מחקר זה
מעכב פורין MI-1148.Hardes et al 2015  נראה שסיפקת קישור למאמר מדעי (DOI), אך לא צירפת את הטקסט המקור לתרגום. כדי שאוכל לבצע תרגום מקצועי, מדויק ו faithful עבור JoVE, אנא העלה את תוכן הטקסט (כותרות, תקציר, פרוטוקול, מילות מפתח וכו') שברצונך לתרגם לעברית. 
תוכנת Gen5 PrimeBiotek
מלח סידן של איונומייסין, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
מדיום L-15 של לייבוביץ' (Leibovitz's L-15 Medium), תוסף GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
ריאגנט טרנספקציה Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
חומצות אמינו שאינן חיוניות ל-MEM (פי 100)Thermo Fisher Scientific11140050
מיקרופלייט, PS, 96 בארות, תחתית F (באר עם צווארון), שחור, Fluotrac, קישור בינוניGreiner Bio-One655076
ריאגנט NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryפרופ' ד"ר אנדרס מריטס (אוניברסיטת טרטו, אסטוניה) ופרופ' ד"ר אנדראס פיכלמאייר (האוניברסיטה הטכנית של מינכן, גרמניה)
קובית מסננים Texas Red 1225102 Biotekעירור: 586/15 נ"מ; פליטה: 647/57 נ"מ
ציר טריפטוז פוספט Thermo Fisher Scientific18050039
תאי U4.4מכון פרידריך-לופלר, המכון הפדרלי למחקר בריאות בעלי חיים, גרייפסוולד, גרמניה
Viewseal Sealer, ClearGreiner Bio-One676070

מקורות

  1. Powers, A. M. Togaviruses: Alphaviruses. eLS. , (2014).
  2. Shaw, A. R., Feinberg, M. B. Vaccines. Clinical Immunology. , Elsevier. (2008).
  3. Gould, E. A., et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Research. 87 (2), 111-124 (2010).
  4. Lim, E. X. Y., Lee, W. S., Madzokere, E. T., Herrero, L. J. Mosquitoes as suitable vectors for alphaviruses. Viruses. 10 (2), (2018).
  5. de Caluwé, L., Ariën, K. K., Bartholomeeusen, K. Host factors and pathways involved in the entry of mosquito-borne alphaviruses. Trends in Microbiology. 29 (7), 634-647 (2021).
  6. Adizie, T., Adebajo, A. O. Travel- and immigration-related problems in rheumatology. Best practice & research. Clinical Rheumatology. 28 (6), 973-985 (2014).
  7. ECDC Chikungunya virus disease worldwide overview: Situation update. , (2025).
  8. Paixão, E. S., et al. Chikungunya chronic disease: a systematic review and meta-analysis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 112 (7), 301-316 (2018).
  9. Atkins, G. J., Sheahan, B. J., Liljeström, P. The molecular pathogenesis of Semliki Forest virus: a model virus made useful. The Journal of General Virology. 80 (Pt 9), 2287-2297 (1999).
  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
  11. Teppor, M., et al. Semliki Forest virus chimeras with functional replicase modules from related alphaviruses survive by adaptive mutations in functionally Important Hot Spots. Journal of Virology. 95 (20), (2021).
  12. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  13. Shan, L., Yang, D., Wang, D., Tian, P. Comparison of cell-based and PCR-based assays as methods for measuring infectivity of Tulane virus. Journal of Virological Methods. 231, 1-7 (2016).
  14. Omokungbe, B., et al. Gene silencing in the aedine cell lines C6/36 and U4.4 using long double-stranded RNA. Parasites & Vectors. 17 (1), 255(2024).
  15. Centurión, A., Omokungbe, B., Stiehler, S., Vilcinskas, A., Hardes, K. Inhibition of Semliki Forest virus replication with long double-stranded RNA in Aedes albopictus cells. Virus Research. 357, 199584(1995).
  16. Weger-Lucarelli, J., et al. Adventitious viruses persistently infect three commonly used mosquito cell lines. Virology. 521, 175-180 (2018).
  17. Attarzadeh-Yazdi, G., et al. Cell-to-cell spread of the RNA interference response suppresses Semliki Forest virus (SFV) infection of mosquito cell cultures and cannot be antagonized by SFV. Journal of Virology. 83 (11), 5735-5748 (2009).
  18. Gahmberg, C. G., Simons, K. Isolation of plasma membrane fragments from BHK21 cells. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B: Microbiology and immunology. 78 (2), 176-182 (1970).
  19. Thomas, G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 3 (10), 753-766 (2002).
  20. Garten, W. Characterization of proprotein convertases and their involvement in virus propagation. Activation of Viruses by Host Proteases. , Springer. Cham. 205-248 (2018).
  21. Becker, G. L., Hardes, K., Steinmetzer, T. New substrate analogue furin inhibitors derived from 4-amidinobenzylamide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (16), 4695-4697 (2011).
  22. Hardes, K., et al. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. ChemMedChem. 10 (7), 1218-1231 (2015).
  23. Hardes, K., et al. Elongated and shortened peptidomimetic inhibitors of the proprotein convertase furin. ChemMedChem. 12 (8), 613-620 (2017).
  24. Pennemann, F. L., et al. Cross-species analysis of viral nucleic acid interacting proteins identifies TAOKs as innate immune regulators. Nature Communications. 12 (1), 7009(2021).
  25. Andersen, L. L., et al. Systematic P2Y receptor survey identifies P2Y11 as modulator of immune responses and virus replication in macrophages. The EMBO Journal. 42 (23), (2023).
  26. Huang, Y., Urban, C., Hubel, P., Stukalov, A., Pichlmair, A. Protein turnover regulation is critical for influenza A virus infection. Cell Systems. 15 (10), 911-929 (2024).
  27. Hardes, K. Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin [Doctoral Dissertation]. , Philipps-Universität Marburg. (2014).
  28. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  29. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  30. Yang, P., et al. Imaging of viral replication in live cells by using split fluorescent protein-tagged reporter flaviviruses. Virology. 603, 110374(2025).
  31. Jose, J., Taylor, A. B., Kuhn, R. J. Spatial and temporal analysis of alphavirus replication and assembly in mammalian and mosquito cells. mBio. 8 (1), (2017).
  32. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PloS One. 9 (5), (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סריקה אנטי-ויראליתמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתניתוח תמונותדינמיקת זיהוםקינטיקה של שכפולהתפשטות מתא לתאסריקה בסריקה רחבה (High-Throughput Screening)תרכובות אנטי-ויראליות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.