Method Article

יצירת מודל מבוסס אורגנואידים בערמונית בעכבר לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן

DOI:

10.3791/69385

⸱

February 27th, 2026

 ,  , 
1Host Pathways in Urinary Tract Infections Group, Institute of Molecular Infection Biology, University of Würzburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את יצירת מודל אורגני מבוסס ערמונית בעכברים שגדל בדו-ממד. הוא כולל דיסוציאציה אורגנואידית, זריעת תאים, התמיינות, הערכת שלמות אפיתל וזיהום חוץ-גופי עם אשריכיה קולי אורופתוגנית. המודל מספק נגישות אפיקלית ומתאים לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן, תוך התגברות על מגבלות של מערכות אורגניות תלת-ממדיות מסורתיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גברים מזדקנים מושפעים מאוד ממחלות ערמונית, כגון היפרפלזיה שפירה של הערמונית, דלקת ערמונית, וסרטן הערמונית. יחד, מצבים אלו תורמים משמעותית לנטל הבריאות העולמי ומהווים גורם מוביל למחלות בגברים. מודלים אורגנואידיים שינו את מידול המחלות בכך שאפשרו שכפול של תכונות מרכזיות של מבנה ותפקוד אפיתל במבחנה. עם זאת, מבנה הלומן הסגור של אורגנואידים מגביל את הגישה הניסיונית לפני השטח האפיקליים, ומקשה על מחקרים של אינטראקציות בין מארח לפתוגן. כדי להתגבר על אתגרים אלו, יצרנו מערכת תרבית פיזיולוגית רלוונטית שבה תאים שמקורם באורגנואידים של ערמונית העכבר מוזרעים כמודל דו-ממדי (דו-ממדי). גישה זו שומרת על תכונות אפיתל חיוניות תוך מתן גישה ישירה למשטח האפיקלי. פרוטוקול שלב אחר שלב זה מתאר את הפרידה של אורגנידים של ערמונית בעכברים בוגרים ותנאי זריעה מיטביים לתמיכה בהתקשרות, התרבות והבדלנות של תאים. מיקרוסקופ אימונופלואורסצנציה אישר את ביטוי הסמנים הספציפיים לערמונית במודל המבוסס אורגנואידים והדגים ייצוג מדויק של ארגון התאים של רקמת הערמונית. מדידות TEER, יחד עם F-actin וצביעת חיבור צמודה, אישרו עוד יותר התמיינות תאית ויצירת מחסום. זיהום המודל ב-Escherichia coli האורופתוגנית (UPEC) הוכיח את תועלתו בחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן. מודל זה מספק פלטפורמה חשובה לחקר ביולוגיית אפיתל הערמונית ומנגנוני מחלה, והוא מתאים במיוחד לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן ולהערכת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלוטת הערמונית היא איבר קטן הממוקם מתחת לשלפוחית השתן, ומקיף את השופכה. זהו איבר חיוני במערכת הרבייה הגברית, ותפקידו העיקרי הוא לייצר את נוזל הערמונית. נוזל זה מהווה עד 30% מהפלזמה הזרעית, והוא חיוני להזנה והגנה על הזרע במהלך מסעו דרך מערכת הרבייה הנשית. מחלות ערמונית, כגון דלקת ערמונית, היפרפלזיה שפירה של הערמונית וסרטן הערמונית, נפוצות מאוד ומהוות נטל משמעותי על מערכת הבריאות ברחבי העולם 2,3,4,5. בעוד שהיפרפלזיה שפירה של הערמונית וסרטן הערמונית נחקרים בהרחבה, דלקת הערמונית, ובמיוחד דלקת הערמונית החיידקית, עדיין נחקרים במעט יחסית. דלקת הערמונית משפיעה על עד 16% מהגברים ברחבי העולם, כאשר זיהומים חיידקיים מהווים כ-10% מהמקרים. למרות שכיחותה, דלקת ערמונה חיידקית עדיין אינה מובנת היטב. זני Escherichia coli (E. coli), ובמיוחד E. coli אורופתוגני (UPEC), הם הגורם המוביל לדלקת ערמונית-חיידקית 8,9.

המחקר על המנגנונים המולקולריים של זיהום הערמונית נותר מוגבל בשל היעדר מודלים פיזיולוגיים רלוונטיים במבחנה. רוב המחקרים על מחלת הערמונית הסתמכו מסורתית על קווי תאים או מודלים של בעלי חיים. במיוחד, קווי תאים סרטניים או שעברו שינוי כמו LNCaP או RWPE-1 שימשו רבות למידול מחלת הערמונית ותגובה לטיפול 10,11,12,13. עם זאת, מודלים אלו חסרים הרכב תאים ומורכבות אפיתל ערמונית בריא או סרטני. יתרה מזאת, מחקרים רבים אחרים השתמשו במודלים של בעלי חיים (בעיקר מודלים של עכברים) כדי לחקור השערות שונות לגבי זיהום בערמונית, תגובה חיסונית, גדילה בגידול הערמונית וגרורות 14,15,16,17. למרות שמודלים אלו היו המתקדמים והאינפורמטיביים ביותר עד כה, הם בדרך כלל מעלים חששות אתיים, דורשים זמן ומשאבים משמעותיים, ויכולים להיות יקרים. חלופה נוספת היא שתיבות אקס ויבו ותרביות תאים ראשוניות שימשו גם למחקרים קצרים טווח של תגובות רקמה לתרופות או להתפתחות סרטן 18,19,20. עם זאת, למודלים אלו יש תוחלת חיים מוגבלת, וזמינות רקמות אנושיות טריות מוגבלת לעיתים קרובות.

תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) שמקורן בתאי גזע בוגרים הפכו לחלופה מבטיחה למידול רקמות אפיתל במבחנה. בניגוד לקווי תאים קונבנציונליים, אורגנואידים שומרים על תכונות מרכזיות של האפיתל המקורי, כגון הטרוגניות תאית, ארכיטקטורה ספציפית לרקמה ותכונות פונקציונליות 21,22,23. בניגוד לתרביות התאים הראשוניות או לשתלות אקס ויבו, תרביות אורגנואידיות יכולות להתרחב ולעבור לאורך זמן רב מבלי להפוך להזדקנות. תכונות אלו הופכות מערכות אורגנואידיות למתאימות במיוחד לחקר מחלות ואינטראקציות בין מארח-פתוגן בהקשר פיזיולוגי רלוונטי. אורגנואידים של הערמונית נוצרו מרקמות אנושיות בריאות וסרטניות, וכן ממודלים של עכברים, ושימשו בעיקר במחקר סרטן הערמונית 24,25,26. עם זאת, במחקרי זיהום, המבנה התלת-ממדי של אורגנואידים מהווה אתגר משמעותי, בעיקר בשל הגישה המוגבלת לפני השטח של התא הלומינלי. מסורתית, אורגנואידים תלת-ממדיים שלמים נדבקו או על ידי הזרקת מיקרו לסוכן הפתוגי, או על ידי פירוק האורגנואיד לחלקים או לתאים בודדים לפני הדגירה עם הפתוגן23. כאן, שונות בגודל ובמבנה התלת-ממדי יכולה להשפיע על השחזוריות וקצב התפוקה. כחלופה, אורגנואידים עם אפיקל-אאוט מספקים דרך להתגבר על מגבלות חוסר הגישה ללומן. תרבית אורגנואידים בתלייה, בין אם בלוחות תרבית רקמה עם חיבור נמוך במיוחד או על משטחים מצופים בחומרים לא דביקים סורפקטים, גורמת להיפוך של קוטביות אורגנואידית. כתוצאה מכך, פני השטח האפיקליים פונים החוצה, ומאפשרים גישה ישירה למחקרי זיהום פתוגן27,28. עם זאת, תרביות אלו אינן ניתנות לשימור ארוך טווח, והשונות בגודל האורגנואיד ובמספר התאים מסבכת את קביעת ריבוי ההדבקה (MOI). בנוסף, המנגנונים שמאחורי היפוך הקוטביות והשפעותיה על תאי האורגנואיד עדיין אינם מובנים במלואם. כדי להתגבר על המגבלות של אורגנואידים כמודלים של זיהום חוץ-גופית, פותחו מודלים מבוססי אורגנואידים נגישים בקצה באמצעות אורגנידים מאיברים כמו הקיבה, המעי או הריאות 29,30,31. מערכות אלו שומרות על תכונות אפיתל עיקריות ומאפשרות מניפולציה, דימות וחשיפה מבוקרת קלה יותר לפתוגנים ו/או תרופות. עם זאת, תנאי התרבית שמאפשרים התמיינות תאית אינם תמיד מתורגמים מהתרביות האורגנואידיות למודלים של תרבית דו-ממדית31,32.

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מודל אפיתל פרוסטטי נגיש אפיקלית באמצעות אורגנואידים של ערמונית לעכבר. מודל זה פותח ואומת בעבר במעבדתנו, שם הראינו את הדמיון החזק שלו לרקמת הערמונית המקומית ואת הרלוונטיות שלו למחקרי ביולוגיה של זיהום בנושא UPEC32. המערכת מחקה במידה רבה את הרכב התאים והקוטביות של אפיתל הערמונית, תוך מתן נגישות משופרת למניפולציה ניסיונית. יתרה מזאת, אנו מראים את יישומו לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן בערמונית, ומספקים אלטרנטיבה נוחה יותר למודלים in vivo ומערכת פיזיולוגית רלוונטית יותר מאשר קווי תאים קונבנציונליים או מודלים תלת-ממדיים אורגנואידיים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרה אתית: כל נהלי בעלי החיים עמדו בהנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וירצבורג ואושרו תחת התקנות המוסדיות והממשלתיות הרלוונטיות. רק עכברי WT שהושמתו במכון שלנו על ידי קבוצות מחקר אחרות למטרות עצמאיות שימשו במחקר זה. לא הוקרבו חיות במיוחד לעבודה זו, בהתאם לעקרונות 3R (החלפה, הפחתה וזיקוק).

הערה: הפרוטוקול המוצג כאן מבוסס על מחקר קודם שפורסם על ידי המחברים32. כל השלבים המתוארים כאן חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית סטרילי, תוך שימוש בטכניקות אספטיות מתאימות ובציוד מגן אישי מתאים. אורגנואידים של הערמונית של עכברים נוצרו מעכברי C57BL/6 ונשמרו בתרבות תלת-ממדית, כפי שתואר קודם25,26. בהתאם לעקרונות 3R, הערמונית של העכברים נתרמה על ידי מתקן בעלי החיים מעכברי WT תמימים שלא טופלו (לפחות בני 6 חודשים) שהוקרבו מסיבות אחרות. בקצרה, הערמונית של העכבר נחתכה ועוכלה בשני שלבים באמצעות קולגנאז ואנזים TrypLE Express. לאחר מכן זרעו תאים בטיפות של מטריצה חוץ-תאית (ECM) ליצירת האורגנואידים התלת-ממדיים. מדיום התרבות נוסף לתרבות והתחדש כל 3 ימים. תרביות אורגנואיד תלת-ממדיות עברו פעם בשבוע ושימשו לזריעה דו-ממדית מהקטע השלישי ואילך. אורגנואידים של ערמונית עכבר בן שבוע שימשו לזרעת המודל המבוסס על אורגנואידים על משטח דו-ממדי בהתאם לפרוטוקול הנוכחי. ציפוי לוחות תרבית רקמה בחלבוני ECM אינו נדרש לפרוטוקול זה.

1. יצירת המודל המבוסס על אורגנואידים של ערמונית

  1. בידוד אורגנואידי תלת-ממדי
    1. שאפו את המדיום ממספר הבארות הרצוי של אורגנואידים תלת-ממדיים מתוך לוח של 24 בארות. החליפו ב-500 מיקרוליטר adDMEM/F12+/+ לכל באר (ראו טבלת חומרים).
    2. השתמש בפיפטה P1000 כדי לשבש מכנית את הנפילה של ה-ECM. אסוף את המתלים בצינור קוני של 15 מ"ל. אספו מקסימום שני בארות לכל צינור.
    3. טעין עם adDMEM/F12+/+ עד 10 מ"ל. בעדינות, הפוך את הצינור 3-4 פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הפרעה תלת-ממדית של אורגנואיד לתאים בודדים
    1. שאפו את הסופרנטנט. החזירו את הכדור ל-2 מ"ל של אנזים TrypLE Express מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) בתוספת 10 מיקרומול RHOKi.
    2. דגרו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השתמש בפיפטה P1000 כדי לערבב את מתלי התא כל 5 דקות.
      הערה: בדוק את תליית התא תחת מיקרוסקופ הפוך באמצעות 4x אובייקטיב כדי לוודא שהתאים ברובם יחידים. גושים קטנים של 2-3 תאים מקובלים. בדרך כלל, 15 דקות של דגירה מספיקות, אך ניתן להאריך זאת במידת הצורך.
    3. תמלא 10 מ"ל של adDMEM/F12+/+. בעדינות, הפוך את הצינור 3-4 פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. ציפוי מתלה חד-תאי
    1. שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. החזירו את פלט התא למדיום תרבית בתוספת 10 מיקרומול RHOKi (300 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר של אורגנידים תלת-ממדיים ששימשו בשלב 1.1.1).
      הערה: מדיום הגידול מורכב מ: Modified Eagle Medium / F12 של Advance Dulbecco, 10 mmol L−1 HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-אצטילציסטאין, 10% מדיום מותאם לנוגין, 10% R-ספונדין 1 מדיום מותנה, 50 ng·mL-1 EGF, 1 ננומטר 5α-דיהידרוטסטוסטרון (DHT), 0.2 מיקרומום TGFβi, ו-100 ng·mL-1 פרימוצין (ראו טבלת חומרים). לניסויים בזיהום, השתמשו במדיום תרבית ללא פרימוסין.
    2. ספירת מספר התאים במתלה באמצעות תא ספירה נויבאואר.
    3. דילל את תלות התא במדיום תרבית עם תוספת של 10 מיקרומום RHOKi לריכוז של 62,500 תאים·מ"ל-1. השתמש ב-200 מיקרוליטר של תליית התא בכל באר לזריעה על לוחות 48 בארות (תרבית רקמה מטופלת מהיצרן, ראו טבלת חומרים) או 300 מיקרוליטר לבאר על מחסניות μ תאיות (ראו טבלת חומרים). הנח את הפלטה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.
      הערה: כל באר של אורגנואידים תלת-ממדיים, בשימוש בשלב 1.1.1. בדרך כלל מניב כ-200,000 תאים.
    4. לאחר יום אחד, רוב התאים הבודדים מחוברים למשטח הדו-ממדי. שנה את מדיום התרבות כל 2-3 ימים. המפגש מושג תוך 7 ימים.
      הערה: ודא ש-RHOKi מתווסף רק לזריעה ראשונית ולא לשינויים במדיום הבאים.
  4. הבחנה בין המודל המבוסס אורגנואידים.
    הערה: עקבו אחר השלבים הבאים לקבלת מודל אורגני ממויין המעשיר בתאי לומינל.
    1. הוסף 10 ננומטר DHT למתלה התא (שלב 1.3.3). השתמשו במדיום תרבית עם תוספת DHT של 10 ננומטר לשינויים במדיום (כל 2-3 ימים).
      הערה: אם לא מוסיפים DHT לתליית התא (ושינויים בתווך לאחר מכן), המודל המבוסס אורגנואידים יועשר בתאי בסיס.

2. מדידות התנגדות חשמלית טרנסאפיתלית (TEER)

  1. זרעו את תליית התא האורגנואידי בריכוז של 62,500 תאים·מ"ל-1, באמצעות 300 מיקרוליטר (שהושגו בשלב 1.3.3.) על סלייד μ PET עם 8 בארות עם 40 אלקטרודות בכל באר (ראו טבלת חומרים). הוסיפו 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית, המתואר ב-1.3.1 לאחת הבארות ללא תאים.
    הערה: באר ללא תאים משמשת כחלל ריק למדידות.
  2. חבר את מחסנית ה-μ למערכת ניתוח התאים מבוססת התנגדות (ראו טבלת חומרים) עם תחנת 16 בארות הממוקמת בתוך אינקובטור תרבית רקמה. מדד את ה-TEER ב-400 הרץ למשך 7 ימים. שנה את מדיום התרבות כל 2-3 ימים.

3. צביעת אימונופלואורסצנציה

הערה: בשיטה זו, ודאו שהתאים מוזרעים ב-μ שקופיות (ראו טבלת חומרים), התואמים ליישומי מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

  1. בנקודת הזמן שנבחרה, הסר את המדיום ושוטף את התאים 3 פעמים עם 1x PBS. תקבע את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (הימנע מחשיפה לאור).
    אזהרה: 4% פאראפורמלדהיד עלול לגרום לתגובה אלרגית לעור, נזק חמור לעיניים, וחשוד כגורם לסרטן. תמיד השתמשו בציוד מגן אישי (PPE) מתאים. הימנעו משאיפת אבק, אדים, גזים, ערפלים, אדים או תרסיסים. לבשו כפפות מגן וודאו שהבגדים המזוהמים נשארים במעבדה עד לניקוי נכון. להשליך תכולה ומכלים דרך מתקן פינוי פסולת מאושר.
  2. אחרי הקיבע, שטוף את התאים 3 פעמים עם 1x PBS (5 דקות כל אחד). חדירה לתאים עם 0.5% טריטון X-100 (ראו טבלת חומרים) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    אזהרה: טריטון X-100 גורם לגירוי בעור ולנזק חמור לעיניים. הוא רעיל מאוד לחיים ימיים עם השפעות ארוכות טווח ועלול לגרום להפרעות אנדוקריניות בסביבה. בעת הטיפול, יש ללבש כפפות מגן, הגנה על העיניים והפנים. להשליך תכולה ומכלים דרך מתקן פינוי פסולת מאושר. הימנע משחרור לסביבה.
  3. שטוף את התאים פעמיים עם פעם אחת של PBS (5 דקות כל אחד). חסמו את התאים עם בופר חסימה (1% BSA ב-PBS, ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מדלל את הנוגדנים העיקריים בבופר חוסם (1% BSA ב-1x PBS) ודגור עם התאים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על פלטפורמת נדנדה. ביום הבא, דגרו שעה אחת בטמפרטורת החדר. (ראו טבלת חומרים לדילול נוגדנים).
    הערה: לגבי צביעת F-actin בפאלואידין או ממברנת פלזמה באמצעות CellMask (ראו טבלת חומרים), דלג על שלב 3.4.
  5. שטוף את התאים 3 פעמים עם 1x PBS (5 דקות כל אחד). מדלל את הנוגדנים המשניים, פאלואידין או CellMask (ראו טבלת חומרים) בבופר חסימה (1% BSA ב-1x PBS) ודגור עם התאים שעה בטמפרטורת החדר.
  6. שטוף את התאים 3 פעמים עם 1x PBS (5 דקות כל אחד). דגרו את התאים 15 דקות בטמפרטורת החדר עם Hoechst (ראו טבלת חומרים) מדולל ב-1x PBS כדי לצבוע את הגרעינים.
  7. שטוף את התאים 3 פעמים עם 1x PBS (5 דקות כל אחד) והשאיר את התאים עם 1x PBS. אחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. דמיינו את שקופיות ה-μ המחוברות (ראו טבלת חומרים) במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר או מיקרוסקופ פלואורסצנציה.
    הערה: ניתן לצלם תמונות סקירה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בגודל 20x כדי להעריך את יעילות ההדבקה והתפוצה הכוללת. תמונות ברזולוציה גבוהה יותר הושגו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרה של טבילה במים פי 40, כדי לדמיין חיידקים בודדים המחוברים או מופנמים בתוך תאי האפיתל. הפלואורופורים הוערו באמצעות קווי לייזר בתדרים 405, 499, 590 ו-653 ננומטר, בהתאם לפלואורופורים שבהם השתמשו. הפליטה זוהתה כאשר חלונות הפליטה מוגדרים ל-415 עד 516 ננומטר עבור Hoechst, 509 עד 573 ננומטר ל-GFP או Alexa 488, 600 עד 651 ננומטר ל-mcherry או Alexa 594, ו-663 עד 720 ננומטר עבור Alexa 647. ערימות Z נרכשו בגודל שלב של 0.5 מיקרון וכיסו את כל עובי שכבת האפיתל המלאה. התמונות צולמו ברזולוציה של 1024 על 1024 פיקסלים, בתדר סריקה של 400 הרץ וממוצע פריימים מוגדר ל-4, מה שמספק איכות תמונה טובה. עוצמת הלייזר ורווח הגלאי נשמרו קבועים בכל התנאים באותו ניסוי. כל פרמטרי ההדמיה, כולל עוצמת הלייזר, רווח הגלאי, מהירות סריקה וממוצע, צריכים להיות מותאמים ומותאמים לפי הצורך בהתאם למיקרוסקופ הקונפוקלי שבו משתמשים.

4. זיהום חיידקי ב-E. coli אורופתוגני (UPEC)

הערה: ודאו שאתם משתמשים במודל מבוסס אורגנואידים המתוחזק במשך 7 ימים ללא פרימוסין (ראו טבלת חומרים) לצעדים הבאים.

הזן האורופתוגני של E. coli UTI89, שמבטא באופן מהותי חלבון mCherry מהפלסמיד pFPV-mCherry (עמיד לאמפיצילין), שימש במחקר זה.

אזהרה: בעת טיפול בפתוגנים זיהומיים (רמת בטיחות ביולוגית 2), לבש כפפות והגנה מתאימה על העיניים והפנים. תמיד תלבש חלוק מעבדה עם כפתורים מלאים. בצע את כל ההליכים בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך. ניקו משטחי עבודה ושוטפים ידיים היטב לאחר טיפול בחומרים ביולוגיים. איסוף פסולת BSL-2 במיכלים מסוכנים לביו-סיכון המתאימים לאוטוקלב. ניקו חומרי פסולת לפני ההשלכה באמצעות אוטוקלבינג או שיטת דה-קונטמינציה מתאימה אחרת.

  1. שלושה ימים לפני ניסוי ההדבקה, יש להוציא את זן UPEC על פלטת אגר LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה (אמפיצילין 100 מיקרוגם·מ"ל-1 שימש בפרוטוקול זה) ולדוגר 16-24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    אזהרה: חלק מהאנטיביוטיקות עלולות לגרום לתגובות אלרגיות או גירוי במגע ולתרום לעמידות לאנטימיקרוביאלים אם מושלכים אותן לא כראוי. תמיד יש להכין ולהוסיף אנטיביוטיקה בארון בטיחות ביולוגית תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (כפפות והגנה על העיניים). השלכת תמיסות המכילות אנטיביוטיקה כפסולת כימית דרך מתקן סילוק פסולת מאושר.
  2. יומיים לפני ניסוי הזיהום, הסנן 3 מ"ל של ציר LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה (אמפיצילין 100 מיקרוגרם·מ"ל-1) באמצעות מושבה UPEC אחת מלוח האגר (שלב 4.1). דגרו סטטית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
  3. יום לפני ניסוי ההדבקה, בצע וורטקס את תרבית החיידקים משלב 4.2 ומדד אתה-OD 600. חשב את נפח התרבית הנדרש לחיסון 3 מ"ל של ציר LB בתוספת אמפיצילין (100 מיקרוגרם·מ"ל-1) ל-ODהתחלתי של 0.05 באמצעות הנוסחה הבאה: נפח (μL) = (0.05 * 3,000 μL) / ODנמדד 600. הוסף את הנפח המחושב של התרבות משלב 4.2. למרק LB הטרי ודגירה סטטית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    הערה:ה-OD 600 של תרבות הלילה משלב 4.2 צריך להיות בין 1.7 ל-2.2.
  4. ביום ההדבקה, יש לבצע מערבולת את תרבית החיידקים משלב 4.3 ולמדוד את מנת החמצון600. קצורOD 600 1 מהתרבית, ואז צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט.
  5. תשתה מחדש ב-1 מ"ל של תרבית אורגנואיד ללא פרימוזין ללא DHT. מדלל ל-MOI של 100.
    הערה: כל באר בלוח של 48 בארות נחשבת למכילה כ-150,000 תאים ביום השביעי. הערכה זו הושגה על ידי ספירת תאים בתקופה שלפני ההדבקה במספר ניסויים. כדי לכוון במדויק את ה-MOI, מומלץ לזרוע באר נוספת לספירת תאים לפני ההדבקה. כדי לקבוע את נפח ההשעיה החיידקית (שלב 4.4) הנדרש, מכפילים את מספר התאים בכל באר ב-MOI כדי לקבל את סך כל החיידקים הנדרשים בכל באר, ואז מחלקים מספר זה בריכוז החיידקים (8 × 10⁵ חיידקים/מיקרוליטר) כדי לקבל את הנפח במיקרוליטר.
  6. החלף את מדיום התרבית של המודל האורגני במדיום תרבית המכיל חיידקים. כוון את הנפח בהתאם למשטח התרבית: השתמש ב-200 מיקרוליטר לבאר עבור לוחות עם 48 בארות ו-300 מיקרוליטר לבאר עבור מחסניות μ. דגרו במשך שעה אחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.
  7. לאחר תקופת הדגירה, יש לשאוף את התווך המכיל חיידקים מהמודל המבוסס אורגנואידים. שטוף את הבאר 3 פעמים עם adDMEM/F12+/+ כדי להסיר חיידקים חוץ-תאיים.
  8. הוסף מדיום תרבית המכיל 50 מיקרוגם·מ"ל-1 גנטמצין כדי להרוג חיידקים חוץ-תאיים. תדגור אותה ל-30 דקות.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז הגנטמיצין בהתאם לזן החיידקי שבו משתמשים. אם משתמשים בריכוז גבוה מ-50 מיקרוג·מ״לטר-1, מומלץ לבדוק ציטוטוקסיות תאית.
  9. הסירו את המדיום והחליפו במדיום טרי עם תוספת של 10 מיקרוגרם·מ"ל-1 גנטמצין למשך זמן ההדבקה.
    עבד את התאים הנגועים לצביעה פלואורסצנטית, לפי סעיף 3, או לכימות באמצעות ציטומטריית זרימה, בהתאם לסעיף 5.

5. כימות זיהום באמצעות ציטומטריית זרימה

  1. שאף את מדיום התרבית ושוטף את התאים 3 פעמים עם 1x PBS. השתמש ב-100 מיקרוליטר של אנזים TrypLE Express כדי לנתק את התאים. דגרו 5-10 דקות עד שכל התאים מתנתקים.
    הערה: באר מלוח של 48 בארות מספיקה לכל תנאי.
  2. אסוף את תליית התא והעבר אותו לבאר של לוח בעל 96 בארות (תחתית חרוטית). הוסף 100 מיקרוליטר של בופר ציטומטר זרימה (1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA) למעלה כדי לנטרל את אנזים TrypLE Express.
  3. צנטריפוגה את לוח 96 הבארים ב-450 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדור לתלייה ב-150 מיקרוליטר של בופר ציטומטר זרימה.
  4. רכישת וכמת תאים נגועים באמצעות ציטומטר הזרימה (ראו טבלת חומרים).
    הערה: ציטומטריית זרימה בוצעה באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר ומסנן פליטה 615/20 ננומטר לזיהוי תאים חיוביים ל-mCherry. הנתונים נאספו בקצב זרימה גבוה (66 מיקרוליטר·דקה⁻¹), שאספו לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה וכללו רק אירועים עם ערכי פיזור קדמי גבוהים מ-80,000. תאים נגועים זוהו על בסיס פלואורסצנציה של mCherry בהשוואה לביקורת לא נגועה (נאיבית), לאחר הוצאת פסולת וכפולות. סמן קיום (למשל, פרופידיום יודיד או כתמים חיים/מתים אחרים) יכול להיכלל באסטרטגיית השער להערכת כחיות התא. זה עשוי להיות שימושי במיוחד בעבודה ראשונית עם המודל כדי להבטיח שפירוק התאים לא יפגע בתאים.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר יצירת מודל מבוסס אורגנואיד של אפיתליום הערמונית בעכבר, שמסכם את סוג התא והביטוי השעתוק של תא האפיתל של הרקמה המקומית. מודל זה נוצר באמצעות אורגנואידים תלת-ממדיים של תאי גזע בוגרים שנוצרו מרקמת ערמונית בעכבר בוגר. תרביות אורגנואידיות אלו נשמרות בתרבות ומועברות מדי שבוע. במודל המבוסס אורגנואידים, השלב הראשון בזרימת העבודה (איור 1A) מתחיל בשימוש באורגנואידים תלת-ממדיים בני 7 ימים. תקופה זו נחוצה כדי להגיע לגודל וצפיפות תאים מתאימים לזריעה נוספת על פני שטח דו-ממדי. לאחר המעבר, קטעים קטנים של אורגנואידים (איור 1B, יום 0) נזרעו ב-ECM ואפשרו להם לגדול. עם הזמן, הם גדלים למבנים כדוריים גדולים עם לומן פנימי מוגדר עד יום 7 (איור 1B). לאחר פירוק האורגנואידים בני 7 ימים לתאים בודדים, התאים הוזרעו על צלחת מטופלת בתרבות רקמה (איור 1C, יום 0) תוך שימוש באותו מדיום תרבית כמו תרביות האורגנואידים התלת-ממדיות (1nM DHT) ליצירת שכבה אחת. ביום הראשון, התאים הדביקים החלו להתרבה. בימים הבאים, השכבה המונוליירית התרחבה והגיעה למפגש בין יום 3 ליום 5, כפי שנצפה במיקרוסקופיית שדה בהיר (איור 1C). כדי לאפיין את השינויים המורפולוגיים לאורך זמן ולנטר את הזמן שבו המודל האורגני מגיע למפגש, צבענו את ממברנת הפלזמה ב-CellMask וביצענו הדמיה פלואורסצנטית בנקודות זמן מרובות (איור 1D).

מכיוון שאיתות קולטני אנדרוגן (AR) הוא רגולטור מרכזי של התמיינות תאים בערמונית, ווויסות ריכוז הטסטוסטרון (DHT) בתווך התרבית האורגנואידי הוכח ככיוון התמיינות של תאי גזע לתאים בסיסיים או לומינליים32, התאמנו את רמות ה-DHT במדיום התרבית כדי לעודד העשרה של תאי לומינל (DHT 10 ננומטר) או תאי בסיס (ללא DHT, בקרה; שיטה1, איור 2א). כפי שמוצג באיור 2 (B-F), לא נצפו הבדלים משמעותיים בצמיחת התאים או בהתנגשותם. כצפוי, במצב הביקורת (מדיום תרבית אורגנואידי ללא DHT), רוב התאים הביעו ציטוקרטין 5 (KRT5), סמן של תאי גזע בסיסיים של ערמונית (איור 2B,E). לעומת זאת, רק כמה תאים הביעו רמות נמוכות של CD24a, סמן של תאי ערמונית לומינליים (איור 2B,F).

תוספת של 1 ננומטר DHT, כפי שתיארנוקודם 32, הובילה לאוכלוסייה מעורבת שכללה גם תאים בסיסיים וגם תאי לומינל. עם זאת, ביטוי CD24a נותר נמוך, מה שמעיד על התמיינות לא שלמה לתאים לומינליים (איור 2C,F 32). הגדלת DHT ל-10 ננומטר קידמה התמיינות מלאה של תאי לומינל תוך שמירה על חלק מהתאים הבסיסיים לאחר 7 ימי תרבית (איור 2D-F). ניתן גם להעריך את ההבדלה של המודלים המבוססים על אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. למרות שההבדלים בין התנאים אינם ברורים במיוחד כאשר התאים דלילים (ימים 0-5, איור 1C, איור 1A משלים), מורפולוגיית התאים ומראה התאים הופכים מובחנים ובולטים בין שלושת תנאי התרבית במיקרוסקופיית ברייטפילד ביום 7 (איור 1C, איור משלים 1A,B). בהיעדר DHT, התאים נראו שטוחים ובלתי סדירים יותר בצורתם, בעוד שב-10 ננומטר DHT, התאים היו דחוסים בסידור פוליגונלי, המזכיר מורפולוגיה של אבנים (איור משלים 1B).

ראוי לציין כי תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות עברו גם שינויים מורפולוגיים כאשר תרבדו בריכוזים שונים של DHT. באופן ספציפי, נצפתה עלייה ברורה בגודל האורגנואידים התלויה במינון, כאשר האורגנואידים הגדולים ביותר נוצרו בנוכחות DHT של 10 ננומטר (איור 1B, איור משלים 2A,B). תוצאות אלו מצביעות על כך שמסלול ה-AR קריטי לא רק להתמיינות תאים אלא גם לוויסות דינמיקת הגדילה של אורגנואידים בערמונית בעכברים.

כדי להעריך את שלמות האפיתל והקיטוב של המודלים, ביצענו מדידות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER) במודל המבוסס אורגנואידים שגדל ללא DHT או עם 10 ננומטר. ערכי TEER עלו עם הזמן בשני המצבים אך היו גבוהים משמעותית בנוכחות DHT של 10 ננומטר (איור 3A), מה שמעיד על שיפור בתפקוד מחסום האפיתליאלי. תוצאות אלו נתמכו על ידי צביעת פאלואידין של סיבי אקטין, אשר בדרך כלל מאורגנים בטבעת אפיקלית במפגשי התא-תא בתאי האפיתל הלומינליים של הערמונית. במצב DHT של 10 ננומטר, טבעת האקטין נראתה מוגדרת יותר בהשוואה למצב הביקורת, בהתאם לעלייה בקוטביות התא ובארגון אפיתל (איור 3B). בנוסף, צביעה חיסונית לזונולה אוקלודנס 1 (ZO-1) חשפה עלייה בצמתים הדוקים במצב DHT של 10 ננומטר (איור 3C), מה שתומך עוד יותר בשלמות מחסום אפיתל ובהתמיינות לכיוון פנוטיפ לומינלי. הקרנות אורתוגונליות מגלות כי אורגנואידים שגודלו עם DHT של 10 ננומטר מציגים קוטביות אפיתלית מוגדרת היטב (איור משלים 3A). תאי KRT5⁺ בסיסיים ממוקמים בתחתית, ותאי CD24a⁺ הלומינליים מפוזרים לאורך שכבת האפיתל, ומראים עוצמת צביעה חזקה יותר לכיוון הצד האפיקלי. ארכיטקטורה זו דומה לזו שנצפתה ברקמת הערמונית של העכבר (איור משלים 3B). ראוי לציון, נתונים מאטלס החלבונים האנושיים מראים שלסמנים אלו יש מיקום דומה ברקמת הערמונית האנושית, כאשר תאי בסיס KRT5⁺ נמצאים מתחת לשכבת לומינלית CD24a⁺ (איור משלים 3C)33. לעומת זאת, תאים שהתרבדו תחת שליטה או תנאי DHT של 1 ננומטר אינם מראים הפרדה מרחבית ברורה בין סמנים בסיסיים ללומינליים, וגובה התא היה נמוך בהרבה מאשר בתנאי 10 ננומטר (איור משלים 3A). דבר זה מצביע על כך שתוספי DHT של 10 ננומטר מקדמים התמיינות וקיטוב אפיתל במודל הדו-ממדי באופן שניתן להשוות לאפיתל המקומי של הערמונית. מכיוון שהמודל המבוסס על אורגנואידים שגדל עם DHT של 10 ננומטר דומה מאוד לאפיתל הערמונית הטבעי של העכבר (איור 2D, איור משלים 3A,B), הוא משמש פלטפורמה רלוונטית לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן. כדי להדגים את היישום של המודל, השתמשנו בזיהומים ב-UPEC, ובפרט בזן UTI89, אחד הזנים הנפוצים ביותר בשדה דרכי השתן הגניטרינרית, כדוגמה. כפי שמוצג באיור 4A, חיידקים גודלו במרק LB במשך 24 שעות (כפי שמתואר בשיטה 4) ודגרו יחד עם התאים במשך שעה. חיידקים חוץ-תאיים נהרגו לאחר מכן באמצעות גנטמצין כדי לכמת את הפלישה והשכפול התוך-תאי. עם הדבקה במודל המבוסס אורגנואידים, UPEC דבקה בתאי האפיתל במספרים גבוהים (0 hpi; איור 4B, לוח שמאל; איור 4C). לאחר מכן, ולאחר טיפול הגנטמיצין (1 hpi), מספר התאים החיוביים ל-UPEC ירד משמעותית, בשל מוות החיידקים החוץ-תאיים (איור 4B, לוח אמצעי; איור 4C). ב-24 hpi, מספר התאים הנגועים נותר ללא שינוי (איור 4C), אך הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית הראתה כי חיידקים תוך-תאיים ממשיכים לשכפל, וליצור מבנים דמויי קהילה, בדומה לאלה שתוארו קודם באפיתל שלפוחית השתן (איור 4B, לוח ימין). תאים נגועים זוהו באמצעות פלואורסצנציה של mCherry באמצעות בקרות לא נגועות (נאיביות) כהפניה, לאחר הוצאת פסולת ודאבלטים (איור משלים 4).

figure-results-1
איור 1: סקירה של זרימת העבודה וההתפתחות המורפולוגית של אורגנואידים של הערמונית והמודלים המבוססים על אורגנואידים לאורך זמן. (א) ייצוג סכמטי של תהליך הניסוי (שיטה 1). (B) תמונות ברייטפילד המציגות את ההתפתחות המורפולוגית של אורגנואידים בערמונית, בתוספת DHT של 1 ננומטר, שצולמו בימים 0, 1, 3, 5 ו-7 (משמאל לימין). פס קנה מידה: 200 מיקרומטר (n = 3). (C) תמונות Brightfield של המודל המבוסס אורגנואידים בתוספת DHT של 1 ננומטר, שצולמו בימים 0, 1, 3, 5 ו-7 (משמאל לימין). פס קנה מידה: 200 מיקרומטר (n = 3). (D) תמונות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנציה מייצגות של המודל המבוסס אורגנואידים, בתוספת DHT של 1 ננומטר וצובעו ב-CellMask (אדום), בימים 1, 3, 5 ו-7 (משמאל לימין). הגרעינים צובעו נגד באמצעות Hoechst 33342 (כחול). פס קנה מידה: 50 מיקרון. (n = 3) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של התמונה הזו.

figure-results-2
איור 2: DHT מווסת את הבדלת השושלת במודל המבוסס אורגנואידים. (א) ייצוג סכמטי של התנאים השונים המשמשים לדיפרנציאציה. (B-D) תמונות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנציה מייצגות של המודל האורגני שגדל במשך 7 ימים בהיעדר (B) (Ctrl) או בנוכחות (C) 1 ננומטר או (D) 10 ננומטר DHT. התמונות צולמו בימים 1, 3, 5 ו-7 (משמאל לימין). המודלים המבוססים על אורגנואידים צוברו ל-CD24a (סמן תא לומינלי, ירוק) ו-KRT5 (סמן תאי בסיס, מג'נטה). הגרעינים צובעו נגד באמצעות Hoechst 33342 (כחול). פס קנה מידה: 50 מיקרון (n = 4). (E,F) כימות תמונה של תאי (E) KRT5+ ו-(F) CD24a+ במודל המבוסס אורגנואידים שגדלו ללא DHT (Ctrl), 1nM או 10nM. הנתונים מוצגים כאחוז התאים החיוביים לכל שדה ראייה. מבחן סטטיסטי: ANOVA חד-כיווני עם מבחן הפוסט-הוק של טוקי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: המודל המבוסס אורגנואידים המבדילים עם DHT של 10 ננומטר מראה קיטוב תאים גבוה יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת. (א) ניתוח TEER של המודל המבוסס אורגנואידים שגודל במשך 7 ימים בהיעדר (Ctrl; ורוד) ובנוכחות DHT (10 ננומטר; ירוק). פסי השגיאה מייצגים SD (n = 3). מבחן סטטיסטי: ANOVA חד-כיווני עם מבחן הפוסט-הוק של טוקי. (B,C) תמונות מיקרוסקופיות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של המודל המבוסס אורגנואידים שגדל במשך 7 ימים ללא (Ctrl; למעלה) או עם DHT של 10 ננומטר (למטה) וצבוע עבור (B) F-actin (אדום) ו-(C) ZO-1 (אדום). הגרעינים צובעו נגד באמצעות Hoechst 33342 (כחול). פס קנה מידה: 50 מיקרון. (n = 3) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של התמונה הזו.

figure-results-4
איור 4: ניתוח דינמיקת הזיהומים במודל המבוסס אורגנואידים. (א) ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזיהום (סעיף 4). (B) תמונות מיקרוסקופיות אימונופלואורסצנציה מייצגות המציגות את המודל האורגני הנגוע ב-0, 1 ו-24 שעות לאחר ההדבקה (hpi; משמאל לימין). UPEC מוצגים באדום. הגרעינים צובעו נגד באמצעות Hoechst 33342 (כחול). פס קנה מידה: 50 מיקרון. (n = 3). (C) ניתוח ציטומטריית זרימה של תאים חיוביים ל-UPEC (mCherry חיובי, תאים נגועים) בעוצמה 0, 1 ו-24 hpi. אסטרטגיית השער מוצגת באיור המשלים 4. פסי השגיאה מייצגים SEM (n = 3). מבחן סטטיסטי: ANOVA חד-כיווני עם מבחן הפוסט-הוק של טוקי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: אבולוציה מורפולוגית של המודל המבוסס אורגנואידים לאורך זמן. (א,ב) תמונות Brightfield של מודל מבוסס אורגנואידים בהיעדר (A) (Ctrl) ו-(B) נוכחות של 10 ננומטר DHT, שצולמו בימים 0, 1, 3, 5 ו-7 (משמאל לימין). פס קנה מידה: 200 מיקרון. (n = 3) אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: ריכוז DHT משפיע על גדילה תלת-ממדית של הערמונית. (A) תמונות Brightfield של מודל מבוסס אורגנואידים בהיעדר (Ctrl; למעלה) ובנוכחות של 10 ננומטר DHT (תחתית), שצולמו בימים 0, 1, 3, 5 ו-7 (משמאל לימין). פס קנה מידה: 200 מיקרומטר (n = 3). (ב) כימות גודל האורגניד התלת-ממדי ביום השביעי שגדל תחת שלוש תנאים שונים: ללא DHT (Ctrl; ורוד), 1 ננומטר DHT (סגול), ו-10 ננומטר DHT (ירוק). מבחן סטטיסטי: ANOVA חד-כיווני עם מבחן פוסט-הוק של טוקי (n = 3). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: אפיון של מורפולוגיית הערמונית-אורגנית וקוטביות אפיתליאלית. (א) הקרנות אורתוגונליות של ערימות z קונפוקליות הממחישות ארגון אפיתל וקוטביות אפיקלית-בסיסית תחת ריכוזי DHT שונים (Ctrl, 1 ננומטר, ו-10 ננומטר DHT). תאי בסיס צובעו ל-KRT5 (מג'נטה) ותאי לומינל עבור CD24a (ירוק). פס קשקש: 50 מיקרומטר. (B) צביעת אימונופלואורסצנציה של רקמת הערמונית המוטמעת ב-OCT, המראה סמנים אפיתליים בסיסיים (KRT5, מג'נטה) ולומינליים (CD24a, ירוק). הגרעינים מוצבעים ב-DAPI (כחול). פס סולם: 50 מיקרון. בקצרה, חלקי רקמת העכבר תוקנו עם 4% PFA, התייבשו במהלך הלילה עם 30% סוכרוז,ו-OCT הוטמע 32. המגלשות הושארו מחדש ב-PBS למשך 10 דקות וצבעו חיסון לפי סעיף 3. (ג) ניתוח אימונוהיסטוכימיה של ביטוי חלבוני CD24a ו-KRT5 ברקמת הערמונית האנושית (פאנל C נלקח ממאגר אטלס החלבונים האנושיים (גרסה 25.0; אטלס חלבון אנושי proteinatlas.org), Uhlén, M. ואחרים (2015)33, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 4: אסטרטגיית שער ציטומטריית זרימה לזיהוי תאים נגועים. התאים הוגדרו תחילה על בסיס גובה פיזור צד (SSC-H) לעומת גובה פיזור קדמי (FSC-H) כדי להוציא פסולת, ולאחר מכן הוחלפו שערים על SSC-H לעומת אזור פיזור צד (SSC-A) לבחירת תאים בודדים. לאחר מכן זוהו תאים חיוביים ל-mCherry (נגועים) באמצעות ספירות לעומת פלואורסצנציה של PE-Texas Red-H (היסטוגרמה). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגוון מחלות יכולות להשפיע על הערמונית, כולל היפרפלזיה שפירה של הערמונית, דלקת ערמונית, וסרטן הערמונית. מחלות אלו נפוצות מאוד ומשפיעות משמעותית על איכות החיים שלמטופלים 2. למרות השפעתן המשמעותית על מערכת הבריאות, ההבנה שלנו לגבי מחלות אלו, במיוחד את המנגנונים הבסיסיים והתגובות של המארחים במצבים שאינם סרטניים, נותרה מוגבלת. הדבר נובע בעיקר מהיעדר מודלים ניסיוניים רלוונטיים פיזיולוגית. מצד אחד, קווי תאים מונצחים אינם תופסים את המורכבות או מצב ההבחנה של אפיתל ערמונית תקין. מצד שני, מודלים של בעלי חיים, בעיקר מכרסמים, מעלים חששות אתיים ואינם משתלמים. גישה חלופית היא שימוש בתאים ראשוניים אנושיים או בתאי רקמה שמקורם במטופל. עם זאת, הזמינות המוגבלת של רקמת הערמונית הטרייה מגבילה את השימוש הנרחב שלהן. מגבלות אלו מדגישות את הצורך במערכות in-vitro נוספות שהן רלוונטיות פיזיולוגית, קלות לשימוש וניתנות לניהול ניסיוני. בהקשר זה, טכנולוגיית תאי גזע אורגניים בוגרים שינתה את מודל המחלות. תרביות תלת-ממדיות אלו מסוגלות לארגן את עצמן, לשמר זהות אפיתל וגיוון תאי אפיתל 23,34,35,36,37,38. בעוד שהארכיטקטורה התלת-ממדית שלהם אפשרה יישומים במחקר סרטן, בדיקות תרופות ורפואה רגנרטיבית 23,34,35,36,37,38,39,40,41, המבנה הסגור שלהם, עם פני השטח האפיקליים הפונים פנימה, מציב אתגרים מעשיים לגישה לניסוי, במיוחד במבחנה מודלים של זיהום. אורגנואידים אפיקל-אאוט מתמודדים עם מגבלה זו על ידי הפיכת הקוטביות האפיתלית, וחשיפת פני השטח האפיקליים למחקרי זיהום ישירים27,28. עם זאת, יעילותם כמודל זיהום עשויה להיות מוגבלת על ידי שונות בגודלם, חשיפה לא שוויונית לפתוגנים ושבריריות במהלך הדבקה ארוכת טווח.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל מבוסס אורגנואידים של הערמונית העכבר, שמסכם את הרכב תאי האפיתל ואת הפרופיל השעתוק של אפיתל העכברים המקומיים, תוך מתן גישה נוחה למשטח האפיקלי. מודל זה, שעובר אופטימיזציה בעבודתנו הקודמת32, מאפשר שליטה מדויקת על משתנים ניסיוניים מרכזיים, כולל צפיפות זריעה, חשיפה אחידה לגירויים, יחס מוגדרים בין חיידקים לתאים (MOI), ופרמטרי הדמיה בעלי תפוקה גבוהה שלעיתים קשה לתקן אותם במערכות אורגניות תלת-ממדיות קונבנציונליות.

בהתאם לעקרון 3Rs (החלפה, הפחתה, זיקוק) לניסויים בבעלי חיים42, האורגנידים המשמשים כמקור לתאים ראשוניים במודל זה נגזרים מעכברים תמימים מסוג בר שהוקרבו למטרות לא קשורות, כמו רבייה. הערמונית מושגת באמצעות תרומות ממתקני בעלי חיים סמוכים, ובכך מפחית את הצורך להקריב בעלי חיים נוספים במיוחד לפרוטוקול זה.

הבחנה חזקה ואמינה בין אורגנידים למודלים מבוססי אורגנואידים היא קריטית לשכפול נאמן של הרכב התאים והמאפיינים התפקודיים של הרקמות המקומיות, תוך הבטחת רלוונטיותם כמודלים במבחנה. התמיינות תאים בתוך אורגנידים מושפעת מאוד מההרכב הספציפי של מדיום התרבית, כולל הריכוזים המדויקים של גורמי גדילה וסוכנים פרמקולוגיים (כלומר מעכבי תרופות). מניפולציה של גורמים אלו מאפשרת התמיינות ישירה לעבר קווי תאים מסוימים, כפי שמודגם במערכות אורגנואידיות שונות. לדוגמה, באורגנידים במעי, הסרת WNT מעודדת התמיינות של אנטרוציטים, שניתן להחמיר עוד יותר באמצעות אינטרפרון גמא (נבדקב-38). התמיינות לתאי גביע יכולה להתבצע על ידי הסרת מעכב p38 וניקוטינאמיד או על ידי עיכוב נוץ' באמצעות DAPT/DBZ (נבדקב-38). IGF-1 ו-FGF-2 הוכחו גם כתומכים בהרחבה ארוכת טווח של תרביות מועשירות בתאי הפרשה43. יתרה מזאת, IL-22 משפר את התמיינות תאי פנת', ותאי אנטרואנדוקריניים נוצרים באמצעות עיכוב מסלולים כולל Notch ו-BMP38. באופן דומה, אורגנואידים קיבתיים ומונולייירים מבוססי אורגנואידים מראים התמיינות כלפי תאי בור כאשר ה-WNT נמשך מהמדיום, בעוד שהוספת ניקוטינמיד למדיום מכוונת את התאים לפנוטיפ בלוטה (צוואר ותאי ראשי) 31,44,45.

בערמונית, קולטן האנדרוגן (AR) ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס רקמתי 46,47,48,49. טסטוסטרון, המיוצר על ידי תאי ליידיג באשכים, מומר ל-DHT בתאי האפיתל של הערמונית על ידי 5α-רדוקטאז. DHT מפעיל AR, שמדהם, עובר לגרעין ונקשר לאלמנטים תגובתיים אנדרוגנים כדי לווסת גנים המעורבים בהבדלת תאים ובהומאוסטזיס50. מחקרים קודמים הראו כי תוספת של 1 ננומטר באורגנידים תלת-ממדיים של הערמונית של העכברים מספיקה להשגת התמיינות תאים לתאי לומינל51. אחרים גם הראו שתוסף ויטמין D (במיוחד 1,25-דיהידרוקסיויטמין D) קידם גדילה אורגאנואידית ערמונית אנושית והאיץ התמיינות על ידי עיכוב פעילות קנונית של WNT ודיכוי בן משפחת WNT DKK352. עם זאת, במחקרים אלו נעשה שימוש רק באורגנואידים תלת-ממדיים. המחקרים הקודמים שלנו32 ואחרים53 הראו שתוסף DHT של 10 ננומטר באורגנואידים תלת-ממדיים אינו מספיק להשגת התמיינות מלאה. לעומת זאת, שימוש במודל הדו-ממדי המתואר כאן, כלומר זריעת DHT של 10 ננומטר לתאים ב-2D, מספיק כדי להבדיל את המודל למצב דומה לרקמה הטבעית32. כדי להבין את ההבדל בין המודלים התלת-ממדיים לדו-ממדיים, יהיה צורך בעבודה נוספת, אך ניתן להסביר זאת על ידי הרמזים המכנו-פיזיקליים השונים בין המערכות או על ידי נוכחות גורמי גדילה המכילים ECM במודל התלת-ממדי.

שלושה סוגי תאי אפיתל עיקריים נמצאים ברקמת הערמונית הבוגרת: תאים לומינליים, בסיסיים ונוירואנדוקריניים. מתוכם, רק תאים לומינליים ובסיסיים קיימים בכל המודלים האורגניים שפורסמו עד כה. היעדר התאים הנוירואנדוקריניים הנדירים מרמז כי ייתכן שפרוטוקולי האורגנואידים הנוכחיים אינם מותאמים במלואם. בין תאים לומינליים לבסיסיים, אוכלוסיית תאי ביניים ערמונית תוארה גם כמצב מעבר המבטא גם את הסמנים הלומינליים (כלומר CD24a) וגם את הסמנים הבסיסיים (כלומר SCA-1)18,51. תת-אוכלוסייה זו נמצאת לעיתים קרובות באזור הערמונית הפריתרלית, ולכן הם מכונים לעיתים קרובות תאי לומינל פריתרליים54. למרות שדווח על כך בחלק ממערכות אורגנואיד תלת-ממדיות בתנאי התמיינות או איתות ספציפיים53,55, איננו רואים הפרדה ברורה בין תאים לומינליים לתאים ביניים במערכת שלנו32. הסבר אפשרי אחד הוא שבמהלך יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים, איננו מבחינים בין אזורים שונים של הערמונית, וכדי למנוע זיהום בתאי שופכה, אנו מסירים את הרקמה הסמוכה ישירות לחיבור הערמונית לשופכה. לכן, תרביות אורגנואידיות שמקורן באזורים פרוקסימליים או סמוכים לשופכה סביר להניח שמסוגלות לייצר תאים ביניים.

שלמות המחסום נחשבת לסימן ההיכר של אפיתל בוגר ומובחן, המספק מחסום מגן מפני רעלים ומיקרובים המגיעים לרקמה התחתונה. מחברים הדוקים (עשירים בחלבוני ZO-156) ממלאים תפקיד חיוני בוויסות החדירות הפרתאלית ובשמירה על שלמות מחסום האפיתל57. כאשר תאי האפיתל מתמיינים, הבשלת החיבורים הבין-תאיים הללו מחזקת את המחסום58. לכן, הערכת שלמות המחסום היא קריאה חשובה למודל אפיתל במבחנה . בפרוטוקול זה אנו מציגים שלוש שיטות משלימות להערכת שלמות המחסום: מדידת TEER, צביעת חיסון ב-ZO-1, וצביעה ב-F-actin. בעוד שכל שלוש השיטות מעריכות ביעילות את שלמות המחסום, הן שונות משמעותית בציוד ובמשאבים הנדרשים. מדידות TEER מספקות ערך כמותי שניתן לעקוב אחריו לאורך זמן, ומציעות תובנה דינמית לגבי פונקציית המחסום; עם זאת, טכניקה זו דורשת חומרה ותוכנה ייעודיים שעשויים שלא להיות זמינים בכל מעבדה. לעומת זאת, צביעה בנוגדנים אנטי-ZO-1 או פאלואידין היא הרבה יותר נוחה מבחינת זמן ועלות (למשל, צביעת פאלואידין יכולה להיעשות בכ-3 שעות עד סעיף 3).

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש באורגנידים תלת-ממדיים של הערמונית בעכבר ליצירת מודל דו-ממדי נגיש אפיקלית. מספר סקירות פירטו את היתרונות והחסרונות של אורגנואידים ומערכות מבוססות אורגנואידים בחקר אינטראקציות בין מארח-פתוגן 23,36,59. במחקרי זיהום, חשוב לשקול את האתר הטבעי של האינטראקציה בין הפתוגנים לאפיתל המארח. בערמונית, תאי לומינל הם בדרך כלל נקודת המגע הראשונה, ולכן הגישה למשטח האפיקלי חיונית למידול מדויק של דינמיקת זיהום. באורגנידים תלת-ממדיים קונבנציונליים של ערמונית, פני השטח האפיקליים פונים אל הלומן האורגנואידי ואינו נגיש ישירות. באתרים אלה, ניתן להשיג חשיפה לפתוגן באמצעות מיקרוהזרקה, שהיא בעלת תפוקה נמוכה ומאתגרת מבחינה טכנית, או על ידי שיבוש האורגנואידים, מה שפוגע בקוטביות האפיתל וגורם לאינטראקציה לא פיזיולוגיתבאתרים 23. לעומת זאת, המודל הדו-ממדי הנגיש בפרוטוקול זה מציע גישה ישירה למשטח הלומינלי. דבר זה מאפשר חשיפה מבוקרת ופיזיולוגית רלוונטית לפתוגנים, ויסות מדויק של ה-MOI, ותאימות לפלטפורמות הדמיה בעלות תפוקה גבוהה, רזולוציה גבוהה או תאים חיים. כאן, אנו מציגים את השימוש במודל זה כמערכת זיהום חוץ-גופית באמצעות זן הייחוס UPEC UTI89, ייחוס נפוץ המייצג את מין החיידקים העיקרי האחראי לדלקת ערמונית-9. עם זאת, מודל זה ניתן להתאמה בקלות לחקר פתוגנים אחרים של הערמונית כמו Enterococcus faecalis או Pseudomonas aeruginosa, מה שהופך אותו לפלטפורמה רב-שימושית לביולוגיית זיהום בערמונית.

הפרדה של אורגנואידים תלת-ממדיים היא שלב קריטי להקמת המודל המבוסס על אורגנואידים בהצלחה. כישלון בהפרדה מלאה של האורגנואידים התלת-ממדיים, שמוביל לשברים גדולים, עלול לפגוע בהיצמדות התא לפני השטח של התרבית, בעוד חשיפה ממושכת למגיב הדיסוציאציה למשך יותר מ-30 דקות מפחיתה את חיוניות התא. יתרה מזאת, שמירה על מרווח מעבר עקבי של כ-7 ימים לפני הדיסוציאציה והזריעה היא חיונית, שכן המצב הפיזיולוגי של האורגנואידים משפיע מאוד על יכולתם להיצמד ולהבדיל. משתנה קריטי נוסף המשפיע על פיתוח מוצלח של המודל המבוסס על אורגנואידים של הערמונית הוא צפיפות הזריעה. ריכוז הזריעה ששימש כאן היה מותאם להבדלה במשך 7 ימים. העלאה או הקטנה של ריכוז זה כנראה יובילו לזמני התמיינות שונים. יתרה מזאת, השעיה לא מספקת של התאים לפני הציפוי עלולה להוביל להתפלגות לא אחידה של התאים בין הבארות, מה שמוביל לצפיפויות תאים משתנות שמשפיעות הן על השפעות והן על התמיינות. בנוסף, כמו במודלים אורגניים אחרים, קבוצות שונות של ECM או גורמי גדילה יכולות להשפיע על הגדילה ויכולת ההתמיינות. לכן, חשוב לוודא שהמודל המבוסס אורגנואידים שומר על פנוטיפ עקבי לאחר כל שינוי במספר אצווה או אצווה של גורמי גדילה או אצולה.

לאחר שהמודל המבוסס אורגנואידים נקבע, יש גם לאופטימיזציה מדויקת את פרמטרי ההדבקה. לעיתים נדרשים MOI שונים כדי להגיע לרמות זיהום חזקות וניתנות לשחזור, בהתאם לזן החיידקי ולקריאה שנבחרה. לזן UPEC UPEC UTI89 (ששימש כאןוב-32) ולמספר מבודדיםשל דלקת ערמונית, MOI של 100 הספיק לקבלת מספר אמין של תאים נגועים בנקודות זמן היצמדות, פלישה ושכפול. עם זאת, אם יש להאריך את הדגירה של תאים עם חיידקים מעבר לשעה, יש להשתמש ב-MOI נמוך יותר כדי למנוע צמיחה יתר חוץ-תאית של UPEC בתווך ורעילות לתאים. בפרוטוקול זה, ההדבקה הוערכה באמצעות שתי שיטות: I) ציטומטריית זרימה לכימות את שיעור התאים הנגועים, ו-II) מיקרוסקופיה קונפוקלית להערכת מיקום חיידקים. עם זאת, ניתן להשתמש בכמה גישות נוספות, כגון בדיקות יחידת יצירת מושבות למדידת חיידקים32, צביעה חיסונית לזיהוי סמנים של מארח או חיידקים32, או ניתוחים טרנסקריפטומיים לפרופיל תגובות של המארח.

בעוד שמודל המבוסס על אורגנואיד ערמונית מספק מערכת פיזיולוגית רלוונטית, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות בעת יישמו במחקר זיהומים. מגבלה מרכזית במודל זה היא היעדר תאי חיסון תושבים או פריפריים, מה שמגביל את יכולתו ללכוד במלואו את תגובת המארח לזיהום (למשל, גיוס תאי חיסון או ניקוי חיסוני). רכיבים חיוניים נוספים החסרים במודל כוללים כלי דם, סטרומה ועצבים, שכולם עשויים להשפיע על אינטראקציות בין המארח לפתוגנים. שילוב סוגי תאים נוספים, כגון פיברובלסטים סטרומליים, תאי חיסון ותאי אנדותל, יסייע לשחזר מיקרוסביבה רקמתית שלמה יותר. מערכות קו-קולטור מתקדמות או פלטפורמות מיקרופלואידיות של איבר על שבב יכולות לתמוך עוד יותר באינטראקציות תאיות מורכבות ולאפשר מחקרים דינמיים של זיהום. בנוסף, כאשר משתמשים באורגנואידים שמקורם במודלים של בעלי חיים, יש לקחת בחשבון הבדלים ספציפיים למין, במיוחד בעת חקר פתוגנים ספציפיים לאדם. למרות שעבודתנוהקודמת 32 הראתה כי ממצאים מהמודל המבוסס על אורגנואידים בערמונית של עכברים יכולים להיות משוכפלים ברקמות אנושיות, שונות בין-מינים בוויסות גנים, ביטוי קולטנים או תגובות הורמונליות עדיין עלולות להגביל את הרלוונטיות הישירה של המודל לפיזיולוגיה האנושית. שילוב אורגנואידים שמקורם בבני אדם, כאשר אפשרי, יגביר את הערך התרגומי על ידי מתן חקר אינטראקציות ותגובות פתוגנים ספציפיות לאדם. בעוד שתוספות אלו עשויות לחזק מודלים מבוססי אורגנואידים ככלים רבי עוצמה לחקר ביולוגיית הערמונית, פתוגנזה של זיהומים והתפתחות טיפולית, המודל האפיתל הטהור שאנו מציגים מציע מערכת מפושטת ומפוזרת. דבר זה מאפשר חקירה ממוקדת של אינטראקציות ספציפיות בין מארח לפתוגן באפיתל ללא הפרעה מרכיבים רקמתיים אחרים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי BMFTR (FiRe-UPec, 01KI2107 to C.A.), ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG GRK 2157; מודלים תלת-ממדיים לרקמה לחקר זיהומים מיקרוביאליים על ידי פתוגנים אנושיים, פרויקט 11, עד C.A.). אנו מודים לנטלי בורקרד ולניקולא שלגל (בית החולים האוניברסיטאי וירצבורג) על התמיכה בציוד ECIS1600R. סכמות נוצרו עם BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
48 לוחות בארסארסטדט83.3923צורת תחתית: שטוח
5&אלפא;-אנדרוסטן-17&בטא;-אול-3-אחד דיהידרוטסטוסטרוןסיגמא-אלדריץ'A8380הוא סומן כ-DHT. תמיסה סטנדרטית 10μ M ב-100% אתנול
סלייד PET עם 8 בארים עם 40 אלקטרודות לכל באר ביופיזיקה יישומית8W10E+שקופיות המשמשות למדידות TEER
96 לוחות בארסארסטדט82.1583הצורה התחתונה: קונית
אדוונס דולבקו' Eagle בינונית/F12 תרמו פישר סיינטיפיק12634028הוא סומן כ-adDMEM/F12+/+ כאשר הושלמה עם 10 mmol L&Minus; 1 HEPES ו-1x GlutaMAX
אמפיציליןרות'K029.2 מאגר ריכוז 100 מ"ג/מ"ל
נוגדן אנטי-CD24aפרויטנטק10600-1-APנוגדן ראשוני; דילול 1:100 ב-1x PBS 1% BSA
אנטי-ציטוקרטין 5 אלקסה פלואור 647 נוגדן אבקאם ab193895נוגדן ראשוני; דילול 1:100 ב-1x PBS 1% BSA
אנטי-ארנב IgG אלקסה פלואר 488  נוגדןInvitrogenA21441נוגדן משני; דילול 1:500 ב-1x PBS 1% BSA
נוגדן פוליקלונלי אנטי-ZO-1פרויטנטק21773-1-APנוגדן ראשוני; דילול 1:750 ב-1x PBS 1% BSA
B27, 50xתרמו פישר סיינטיפיק12587010
בובינס סרומאלבומין (BSA) פרקטיון V, ניו זילנד-אוריג'יןרות'8076.3רכיב של מאגר חסימה המשמש ב-1% ב-1x PBS
בארות עם תאים &מיקרו;-שקופית 8איבידי80806שינוי משטח: ibiTreat
צינור קוני (15 מ"ל)סיגמא אולדריץ'T1943התחתית השטוחה טובה יותר לכדורים קטנים.
דיסודיום אתילנדיאמינטטרה-אצטט 2H2O (EDTA)רות' 8043.2תוצרת בית: 93.0 גרם ב-400 מ"ל H2O, כוונון pH ל-8.0, בדיוק הנפח עם H2O עד 500 מ"ל; 0.5 מיליון EDTA; רכיב של בופר ציטומטר זרימה
תמיסת המלח המאוזנת של דולבקו (DPBS)גיבקו14190-144PBS
מיקרוסקופ ECHO Revolve הד
ECIS  Z-Theta -  מערכת ניתוח תאים מבוססת התנגדותביופיזיקה יישומיתECIS  Z-Thetaהמערכת כוללת: תחנות באר 16 ו/או 96; מודול בקרה חיצוני; מחשב נייד; תוכנות בקרה, רכישה ותצוגה של ECIS; מודול שדה מוגבה להגירה אוטומטית של תאים ואלקטרופורציה 
סרום בקר עוברי (FBS) סופריורסיגמא אולדריץ'S0615רכיב של בופר ציטומטר זרימה; רכיב של מדיום תרבית של קו תאים 293T; רכיב של מדיום תרבית HEK293T קו התאים
פלאש פאלואידין אדום 594ביולג'נד424203דילול 1:250 ב-1x PBS 1% BSA
בופר ציטומטר זרימה1x PBS, 10% ב-FBS, 5 mM EDTA
Gentamicin סיגמא אולדריץ'G1272
GlutaMAX תרמו פישר סיינטיפיק35050-038דיפפטיד L-אלניל-L-גלוטמין, רכיב ב-adDMEM/F12+/+ 
מד צפיפות תאים של Harvard Biochrom Ultrospec 10פישר סיינטיפיק10704417
HCS CellMask כתם אדום עמוקטכנולוגיות חייםH32721דילול 1:1,000 ב-1x PBS 1% BSA
קו התאים HEK293T שהועבר באמצעות וקטור ביטוי Noggin-Fc של העכברקו תאים מפרופ' ד"ר קלברסשימש לייצור נוגין; מדיום גידול: 500 מ"ל DMEM, סוכר גבוה, GlutaMAX, פירובט (Gibco Life Technologies, 31966)+ 50 מ"ל FBS; פארין ואח' גסטרואנטרולוגיה 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES תרמו פישר סיינטיפיק15630056רכיב של adDMEM/F12+/+ 
Hoechst 33342 טכנולוגיות חייםH3570דילול 1:5,000 ב-1x PBS
גורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF) פפרוטקAF-100-15מלאי ריכוז 500 ומיקרו; g/mL
לולאות חיסוןסארסטדט86.1567.010
צינורות חיסוןסארסטדט62.515.006
Leica Stellaris 5 מיקרוסקופ קונפוקלילייקה
מרק לוריה ברטאני (מרק LB)רות' X968.1
מטריג'לקורנינג356231מטריצה חוץ-תאית (ECM)
N-אצטילציסטאין  סיגמא-אלדריץ'A9165-25Gריכוז 500 מ"מ
נוגין CM
NovoCyte Quanteon אג'ילנטציטומטר זרימה
פאראפורמלדהיד (PFA)סיגמא אולדריץ'P6148בשימוש ב-4% ב-1x PBS, 4% סוכרוז
פרימוסיןאינויווגןאנט-PM-1
Q-VETTES חצי-מיקרוRatiolab2712120
רוקי (Y-27632)אבמולM1817מעכב RhoA/ROCK; מאגר ריכוז 10 מ"מ
R-ספודין1 CM
R-Spondin1 מבטא קו תאים 293Tסיגמא אולדריץ'SCC111משמש לייצור R-spo1 CM; מדיום גידול: 500 מ"ל DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAX, פירובט (Gibco Life Technologies, 31966)+ 60 מ"ל FBS 
TGFβ i (A-83-01)טוקריס2939מעכב ALK4/5/7; מלאי ריכוז 5 מילימטרים;
טריטון X-100 סיגמא אולדריץ'T9284משומש 0.5% מדולל ב-PBS 1x
TrypLE Express Enzyme גיבקו12605028סוכן ניתוק תאי אנזימה לעיכול אורגני ערמונית תלת-ממדיים בעכברים
אורופאתוגן Escherichia coli זן UTI89זן WT מפרופ' ד"ר דוברינדטהומר באמצעות pFPV-mCherry (addgene #20956)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Samanta, L., Parida, R., Dias, T. R., Agarwal, A. The enigmatic seminal plasma: A proteomics insight from ejaculation to fertilization. Reprod Biol Endocrinol. 16 (1), 1-11 (2018).
  2. Ma, C., Su, H., Li, H. Global Research Trends on Prostate Diseases and Erectile Dysfunction: A Bibliometric and Visualized Study. Front Oncol. 10, 627891(2021).
  3. Roehrborn, C. G. Benign prostatic hyperplasia: an overview. RIU. 7 (Suppl 9), S3-S14 (2005).
  4. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Arch Intern Med. 164 (11), 1231-1236 (2004).
  5. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  6. Krieger, J. N., Nyberg, L., Nickel, J. C. NIH consensus definition and classification of prostatitis [5]. JAMA. 282 (3), 236-237 (1999).
  7. Khan, F. U., et al. Comprehensive overview of prostatitis. Biomed Pharmacother. 94, 1064-1076 (2017).
  8. Lipsky, B. A., Byren, I., Hoey, C. T. Treatment of bacterial prostatitis. Clin Infect Dis. 50 (12), 1641-1652 (2010).
  9. Krieger, J. N., Thumbikat, P. Bacterial Prostatitis: Bacterial Virulence, Clinical Outcomes, and New Directions. Microbiol Spectr. 4 (1), (2016).
  10. Mizokami, A., Gotoh, A., Yamada, H., Keller, E. T., Matsumoto, T. Tumor necrosis factor-alpha represses androgen sensitivity in the LNCaP prostate cancer cell line. J Urol. 164 (3 Pt 1), 800-805 (2000).
  11. Lin, H. P., et al. Difference in protein expression profile and chemotherapy drugs response of different progression stages of LNCaP sublines and other human prostate cancer cells. PLoS ONE. 8 (12), e82625(2013).
  12. Conte, M. P., et al. The adherent/invasive escherichia coli strain lf82 invades and persists in human prostate cell line rwpe-1, activating a strong inflammatory response. IAI. 84 (11), 3105-3113 (2016).
  13. Pennanen, P., et al. The effects of metformin and simvastatin on the growth of LNCaP and RWPE-1 prostate epithelial cell lines. Eur J Pharmacol. 788, 160-167 (2016).
  14. Abate-Shen, C., Shen, M. M. Mouse models of prostate carcinogenesis. Trends Genet. 18 (5), S1-S5 (2002).
  15. Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. IAI. 79 (2), 628-635 (2011).
  16. Irshad, S., Abate-Shen, C. Modeling prostate cancer in mice: Something old, something new, something premalignant, something metastatic. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 109-122 (2013).
  17. Lupo, F., Rousseau, M., Canton, T., Ingersoll, M. A. The Immune System Fails to Mount a Protective Response to Gram-Positive or Gram-Negative Bacterial Prostatitis. J Immunol. 205 (10), 2763-2777 (2020).
  18. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocr Relat Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. McClurg, U. L., et al. Human ex vivo prostate tissue model system identifies ING3 as an oncoprotein. Br J of Cancer. 118 (5), 713-726 (2018).
  21. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesisin a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Sci. 345 (6194), 1247125(2014).
  22. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  23. Aguilar, C., Alves da Silva, M., Saraiva, M., Neyazi, M., Olsson, I. A. S., Bartfeld, S. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Exp and Mol Med. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  24. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  25. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  26. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Prot. 11 (2), 347-358 (2016).
  27. Co, J. Y., et al. et al Controlling Epithelial Polarity: A Human Enteroid Model for Host-Pathogen Interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520.e4 (2019).
  28. Stroulios, G., et al. Apical-out airway organoids as a platform for studying viral infections and screening for antiviral drugs. Sci Rep. 12 (1), 7673(2022).
  29. Mayorgas, A., et al. A Novel Strategy to Study the Invasive Capability of Adherent-Invasive Escherichia coli by Using Human Primary Organoid-Derived Epithelial Monolayers. Front Immunol. 12, 646906(2021).
  30. Tindle, C., et al. Adult stem cell-derived complete lung organoid models emulate lung disease in COVID-19. eLife. 10, e66417(2021).
  31. Aguilar, C., et al. Helicobacter pylori shows tropism to gastric differentiated pit cells dependent on urea chemotaxis. Nat Commun. 13 (1), 5878(2022).
  32. Guedes, M., et al. Uropathogenic Escherichia coli invade luminal prostate cells via FimH-PPAP receptor binding. Nat Microbiol. , 1-16 (2026).
  33. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  34. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 20 (5), 279-293 (2020).
  35. Bose, S., Clevers, H., Shen, X. Promises and challenges of organoid-guided precision medicine. Med. 2 (9), 1011-1026 (2021).
  36. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  37. van der Vaart, J., Clevers, H. Airway organoids as models of human disease. J Intern Med. 289 (5), 604-613 (2021).
  38. Paužuolis, M., Samperio Ventayol, P., Neyazi, M., Bartfeld, S. Organoids as a tool to study the impact of heterogeneity in gastrointestinal epithelium on host-pathogen interactions. Clin Exp Immunol. 218 (1), 16-27 (2024).
  39. Kondo, J., Inoue, M. Application of cancer organoid model for drug screening and personalized therapy. Cells. 8 (5), 470(2019).
  40. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on Three Dimensional Organoid Studies for Stem Cell Therapy in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  41. Peng, Z., Lv, X., Sun, H., Zhao, L., Huang, S. 3D tumor cultures for drug resistance and screening development in clinical applications. Mol Cancer. 24 (1), 93(2025).
  42. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. J Exp Biol. 220 (17), 3007-3016 (2017).
  43. Fujii, M., et al. Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793.e6 (2018).
  44. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136.e6 (2015).
  45. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  46. Tan, M. E., Li, J., Xu, H. E., Melcher, K., Yong, E. Androgen receptor: structure, role in prostate cancer and drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 36 (1), 3-23 (2015).
  47. Zhou, Y., Bolton, E. C., Jones, J. O. Androgens and androgen receptor signaling in prostate tumorigenesis. J Mol Endocrinol. 54 (1), R15-R29 (2015).
  48. Xie, Q., Liu, Y., Cai, T., Horton, C., Stefanson, J., Wang, Z. A. Dissecting cell-type-specific roles of androgen receptor in prostate homeostasis and regeneration through lineage tracing. Nat Commun. 8 (1), 14284(2017).
  49. Vickman, R. E., et al. The role of the androgen receptor in prostate development and benign prostatic hyperplasia: A review. Asian J Urol. 7 (3), 191-202 (2020).
  50. Likos, E., Bhattarai, A., Weyman, C. M., Shukla, G. C. The androgen receptor messenger RNA: what do we know. RNA Biol. 19 (1), 819-828 (2022).
  51. Karthaus, W. R., et al. Regenerative potential of prostate luminal cells revealed by single-cell analysis. Science. 368 (6490), 497-505 (2020).
  52. McCray, T., et al. Vitamin D sufficiency enhances differentiation of patient-derived prostate epithelial organoids. iScience. 24 (1), 101974(2021).
  53. De Felice, D., et al. Rarγ-Foxa1 signaling promotes luminal identity in prostate progenitors and is disrupted in prostate cancer. EMBO Rep. 2024 (2), 443-469 (2024).
  54. Crowley, L., et al. A single-cell atlas of the mouse and human prostate reveals heterogeneity and conservation of epithelial progenitors. eLife. 9, 1-24 (2020).
  55. Cambuli, F., et al. Intra-epithelial non-canonical Activin A signaling safeguards prostate progenitor quiescence. EMBO Rep. 23 (5), e54049(2022).
  56. Kuo, W. T., Odenwald, M. A., Turner, J. R., Zuo, L. Tight junction proteins occludin and ZO-1 as regulators of epithelial proliferation and survival. Ann N Y Acad Sci. 1514 (1), 21-33 (2022).
  57. Yazici, D., et al. The epithelial barrier: The gateway to allergic, autoimmune, and metabolic diseases and chronic neuropsychiatric conditions. Semin. Immunol. 70, 101846(2023).
  58. Zeyneloglu, C., et al. The epithelial barrier theory proposes a comprehensive explanation for the origins of allergic and other chronic noncommunicable diseases. FEBS Lett. 599 (22), 3208-3243 (2025).
  59. Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoid Models for Infectious Disease. Annu Rev Med. 73 (1), 167-182 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prostate Organoid ModelHost Pathogen InteractionsMouse Prostate OrganoidsEpithelial DifferentiationUropathogenic Escherichia ColiImmunofluorescence MicroscopyTwo Dimensional CultureCell AttachmentGentamycin Protection AssayConfocal Microscopy

Related Articles