פרוטוקול קליני זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים העממי הנגשווי (אישור מס' 2019-2-013). כל המשתתפים או האפוטרופוסים החוקיים שלהם נתנו הסכמה מדעת בכתב לפני הכללה. המחקר דבק בהצהרת הלסינקי ובהנחיות מוסדיות לאתיקה במחקר אנושי.
הכנת ננו-קומפוזיט כסף-פחמן (Ag-C)
לסינתזת הננו-קומפוזיט Ag-C, נשקלו בדיוק 3.0 גרם טארטרט אשלגן נתרן והונחו בכור קוורץ בנפח 50 מ"ל בתוך תנור צינור. הדגימה חוממה ל-400 מעלות צלזיוס בקצב של 15 מעלות צלזיוס לדקה ונשמרה במשך 6 שעות, ואז אפשרה לה להתקרר לטמפרטורת החדר (~25 מעלות צלזיוס). המוצר הועבר לכוס זכוכית בנפח 250 מ"ל ופיזר ב-80 מ"ל מים דה-יוניים (התנגדות ≥18 MΩ·cm) באמצעות ערבוב מגנטי ב-400 סל"ד למשך 10 דקות. המתלה צנטריפוגה ב-10,000 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ונאסף הסופרנטנט החום המכיל נקודות קוונטיות פחמן (CQD). הסופרנטנט רוכז ל-20 מ"ל בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס תחת ערבוב, ולאחר מכן נוספו 60 מ"ל אצטון ומיקס מערבולת למשך דקה. לאחר צנטריפוגה בעוצמה של 9,500 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, נאסף הסופרנטנט הצהוב-בהיר כפתרון מלאי CQD. להכנת תגובת טולנס, 1 מ״ל של 0.5 מ״ל AgNO3 מעורבב עם 1.04 מ״ל מי אמוניה ו-0.65 מ״ל של 3 מ״ל NaOH, ואחר כך נוספו 17.3 מ״ל מים דה-יוננים תחת ערבוב רציף. בבקבוק תלת-צוואר עטוף בנייר אלומיניום, שולבו וערבבו 25 מ"ל תמיסת CQD ו-75 מ"ל מים דה-יוניים במהירות 500 סל"ד למשך 5 דקות. ה-pH הותאם לכ-7.0 עם מי אמוניה מרוכזים, ולאחר מכן נוסף 1 מ"ל של תגובת טולנס. התערובת חוממה ל-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בתנאים חשוכים. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, התקבל תמיסת Ag-C צהובה ונשמרה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
זהירות: NaOH ומי אמוניה הם קורוזיביים ומשחררים אדים מגרים. לטפל בכל התגובות במכסה אדים כימי תוך כדי לבישת כפפות, משקפי מגן וחלוק מעבדה. אין לאטום מיכלים מחוממים היטב כדי למנוע הצטברות לחץ.
הכנת תחבושות אנטיבקטריאליות ננו-כסף (NSAD)
להכנת תערובת הממסים, 15 מ"ל מים דה-יוניים מעורבבים עם 200 מיקרו-ליטר של חומצה אצטית קרחונית, בכוס זכוכית בנפח 100 מ"ל. לכך נוספו 0.1 מ"ל מתמיסת Ag-C המוכנה (22 מ"ג/ליטר), 0.2 מ"ל גליצרול ו-60 מ"ג פולוקסאמר והוססו לחלוטין בטמפרטורה של 50°C עם ערבוב מגנטי. לאחר מכן, 0.6 גרם אבקת צ'יטוזאן הוכנס בהדרגה למניעת גושים וערבבו ברציפות במשך 30 דקות עד לאחידות. לאחר מכן, נוספו 2 מ"ל של 1 מטר NaHCO3 בטיפה תוך כדי ערבוב כדי לגרום לקצף קל, ואחריו עוד 10 דקות של ערבוב. הנפח הכולל הותאם ל-20 מ"ל עם מים דה-יוניים, והתמיסה פוקדה באולטרסאונד למשך 5 דקות. התמיסה ההומוגנית נשפכה לתבנית מלבנית (14 ס"מ x 8 ס"מ x 0.5 ס"מ), נאטמה בניילון נצמד, והושארה לג'ל במשך 48-72 שעות בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס). לאחר הג'לציה, הסרט הוסר ויובש בתנור אוויר כפוי בטמפרטורה של 40°C למשך 12-18 שעות, מה שהניב סרטי NSAD בעובי של כ-1 מ"מ. יש לתעד טמפרטורת סביבה ולחות במהלך הג'לציה, שכן הן משפיעות על אחידות הסרט וחוזק המתיחה. השליכו כל סרט שמכיל סדקים או בועות גלויים.
אפיון ננו-מרוכב Ag-C
טיפה של תמיסת Ag-C מדוללת הונחה על רשת מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת נחושת מצופה פחמן (TEM) ויובשה באור אינפרא-אדום למשך 10 דקות. הדגימות צולמו בעוצמה של 100 קילו-וולט תחת TEM. גודל החלקיקים נותח באמצעות תוכנת ImageJ על ידי מדידת לפחות 200 חלקיקים שנבחרו באקראי, והנתונים הוצגו כממוצע ± SD.
הערכת פעילות אנטיבקטריאלית
Staphylococcus aureus (ATCC 29213) ו-Escherichia coli (ATCC 25922) גודלו במרק טריפטון סויה (TSB) במשך הלילה בטמפרטורה של 37°C. ההשעיה החיידנית הותאמה לצפיפות אופטית של OD600 = 0.1 (~1 x 107 CFU/mL). הדגימות חולקו לשלוש קבוצות: קבוצת ביקורת מטופלת במים דה-יוניזצילית, קבוצת ביקורת חיובית שטופלה באמוקסיצילין (10 מיקרוגרם/מ"ל), וקבוצות בדיקה שטופלו בננו-קומפוזיט Ag-C (10 מיקרוגרם/מ"ל שווה ערך לחקלאות). התרביות דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וננערו במהירות 150 סל"ד במשך 7 ימים. בכל יום, נאספו 100 מיקרוליטר דגימות – דוללו סדרתית, צויפו על אגר TSB ודגרו במשך 24 שעות. יחידות יצירת מושבות (CFUs) נספרו, ושיעורי העיכוב (%) חושבו כ-[(N0− Nt)/N0] x 100. כל ניסוי בוצע בשלושה עותקים, והתוצאות דווחו כממוצע ± SD.
זהירות: טפל בכל תרביות החיידקים בארון בטיחות ביולוגית רמה II. אוטוקלב לכל הפסולת בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני ההשלכה.
התנהגות גוברת של ה-NSAD
דגימות NSAD מרובעות (1 ס"מ x 1 ס"מ) נשקלו כדי לקבל את המשקל היבש (W0). כל דגימה הוטבלה ב-10 מ"ל של מלח פיזיולוגי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בשעה אחת, 6 שעות, 12 שעות ו-24 שעות, הוסרו דגימות בנייר סינון ונשקלו (משקל). יחס הנפיחות (%) חושב כ-[(משקל − W0)/W0] x 100. כל המדידות בוצעו בשלוש פעמים, והתוצאות דווחו כממוצע ± SD.
הרכבה ויישום VAC בשילוב עם NSAD
סרט ה-NSAD המוכן נחתך כך שיתאים לגודל הפצע באמצעות מספריים סטריליים והונח ישירות על מיטת הפצע. שני צינורות ניקוז סיליקון סטריליים (עובי דופן 1 מ"מ, מיקרונקבוביות 0.4-0.5 מ"מ) הוכנסו מתחת ל-NSAD. כל הפצע ו-2-3 ס"מ של עור שלם סביבו נאטמו בשכבת פוליאוריתן שקופה כדי להבטיח כיסוי אטום. צינורות הניקוז היו מחוברים למקור לחץ שלילי רציף שנשמר בין -60 kPa ל--80 kPa למשך 72 שעות. החותם נבדק מדי יום, וההפרשה שנאספה נרשמה מבחינת צבע ונפח. התחבושות הוחלפו כל 3-5 ימים או מוקדם יותר אם הייתה דליפה. הטיפול ב-VAC הופסק לאחר שרקמת הגרנולציה כיסתה את הפצע במלואו. אשר המיסטזיס מלא לפני סגירת הפצע. אם מתרחש דימום פעיל, יש להוריד זמנית את הלחץ השלילי ל-40 קילופסקל. עקבו אחר אי נוחות למטופל, כאב מופרז או תקלה במכשיר.
ניהול פסולת
כל שאריות הכסף והאלקליניות נאספו במיכלים מסומנים לפסולת מסומנת לצורך סילוק פסולת מסוכנת. תמיסות אלקליות נוטרלו ל-pH 7 לפני הפריקה. הפסולת הביולוגית עוברה חיטוי באמצעות אוטוקלאב והושלקה בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית של בתי חולים.
מטופלים ועיצוב המחקר
בסך הכול גויסו למחלקה לאורתופדיה טראומטית בבית החולים העממי הנגשווי בין נובמבר 2019 לנובמבר 2022 שאובחנו עם שברים פתוחים של גוסטילו סוג I או II. המטופלים נבדקו לפי קריטריוני הכללה והחרגה מוגדרים מראש. קריטריוני ההכללה היו: (1) גיל בין 18 ל-70; (2) שבר גוסטילו סוג I או II אושר בהתבסס על הערכה קלינית ורדיולוגית; (3) היעדר פגיעה וסקולרית או עצבית משמעותית; ו-(4) היכולת לספק הסכמה מדעת ולעמוד במעקב לאחר הניתוח. קריטריוני ההוצאה כללו: (1) שברים מסוג גוסטילו III; (2) מחלות נלוות חמורות כגון סוכרת לא מבוקרת, מחלות כלי דם היקפיות, זיהום כרוני או חוסר חיסוני; (3) שברים פתולוגיים; ו-(4) הפרעות הריון או קרישה. האקראיות בוצעה באמצעות רצף ממוחשב עם אקראיות בלוקים (גודל בלוק = 6). הסתרת ההקצאה הובטחה באמצעות מעטפות אטומות שהוכנו על ידי סטטיסטיקאי עצמאי. המטופלים חולקו באופן שווה לשלוש קבוצות (n = 100 כל אחת): קבוצה 1 קיבלה הקטנה סגורה וקיבוע תוך-מדולרי (CRINF) בטיפול פצעים קונבנציונלי; קבוצה 2 קיבלה CRINF בשילוב עם סגירה בסיוע ואקום (VAC); וקבוצה 3 קיבלה CRINF עם תחבושת ננו-כסף אנטיבקטריאלית (NSAD) ו-VAC. כל ההליכים בוצעו על ידי אותו צוות כירורגי כדי למזער הטיית מפעיל. מעריכי התוצאות היו עיוורים להקצאת הטיפול בעת הערכת ריפוי הפצע, זיהום וציוני כאב. כל המטופלים נעקבו במשך 9 חודשים לאחר הניתוח להערכת החלמת השברים וההחלמה התפקודית.
תוכנית טיפול ל-OTF מסוג גוסטילו סוג I ו-II
המטופלים עברו הרדמה (כללית, עמוד שדרה או מקומית) בהתאם לחומרת הפציעה ולמצב הרפואי. לאחר ניקוי ראשוני, הפצעים הושקו היטב בתמי מלח סטריליים ומי חמצן; הרקמה שהוחלשה נחתכה, וקצוות הרקמות הרכות נתפרו זמנית לפי הצורך. ייצוב השבר הושג באמצעות הקטנה סגורה וקיבוע תוך-מדולרי של ציפורניים לפי פרוצדורות אורתופדיות סטנדרטיות17. לקבוצה 3, נחתכה סרט NSAD סטרילי כדי להתאים לממדי הפצע והוחל על מיטת הפצע; שני ניקוזים מסיליקון הוצבו מתחת לריבוץ. שכבת פוליאוריתן חצי-חדירה אטמה את הפצע יחד עם 2-3 ס"מ של עור שלם מסביב. אטום האוויר וההמוסטזיס אושרו לפני השאיבה; מסלולי סיכה (אם קיימים) כוסו בגזה סטרילית. לחץ שלילי רציף הוחל ב-60- עד -80- קילופסקל והותאם בהתאם לגודל ועומק הפצע, עם החלפת תחבושת כל 3-5 ימים או מוקדם יותר במקרה של דליפה/רוויה. בקבוצות 1 ו-2, הפצעים כוסו בגזה פטרולטום סטרילית והוחלפו כל 48-72 שעות. הטיפול לאחר הניתוח כלל אנטיביוטיקה מונעת רחבת טווח למשך 3-5 ימים (צפלוספורינים או פלואורוקווינולונים), כיסוי אנאירובי עם מטרונידאזול בעת הצורך18, טיפול נוגד דלקת ומשכך כאבים, שליטה בבצקת, אמצעים לקידום זרימת דם ותמיכה תזונתית (כולל תוספי חלבון). מטופלים עם מעורבות נוירווסקולרית קיבלו תרופות נוירוטרופיות ואנטי-אדמטיות/אנטי-ספאזמודיות כאשר הדבר מתאים. מעקב מעבדה (ספירת דם מלאה, קצב השקיעה של האריתרוציטים, חלבון C-ריאקטיביבי) בוצע בביקורים מתוזמנים לאחר הניתוח כדי לעקוב אחרי זיהום. השיקום החל עם התכווצויות איזומטריות ותנועות מפרקים עדינות מהיום השלישי, והתקדם לטווח תנועה פעיל לאחר ~1 שבוע כפי שנסבל. מעקב רדיוגרפי בוצע בסביבות חודש אחד, 3 חודשים, 6 חודשים ו-9 חודשים; נשיאת משקל הדרגתית החלה לאחר שגישור בין יבלת והמשכיות עם קליפת השוק נראו בצילום רנטגן וכאב קליני אפשר.
מדדי תצפית
מדדי התוצאה העיקריים כללו את זמן החלמת הפצעים, זמן החלמת השברים, קצב ההחלמה וקצב ההחלמה של השברים. תוצאות משניות כללו שכיחות סיבוכים לאחר הניתוח (זיהום שטחי, זיהום עמוק, עיכוב באיחוד, תסחיף שומן, זיהום בדרכי המחט ואי-איחוד מזוהם), משך האשפוז, עלויות רפואיות כוללות ועוצמת כאב לאחר הניתוח. עוצמת הכאב הוערכה באמצעות סולם דירוג מספרי (NRS) מ-0 (ללא כאב) ועד 10 (הכאב החמור ביותר שניתן לדמיין). ריפוי פצעים הוגדר כאפיתליאליזציה מלאה ללא הפרשה, בעוד שריפוי השברים אושר ברדיוגרפיה על ידי גישור יבלת על פני לפחות שלושה קורקטיסים. הערכות מעקב בוצעו חודש, 3 חודשים, 6 חודשים ו-9 חודשים לאחר הניתוח, כולל הערכה קלינית ורנטגן.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות גרסה 20.0 של SPSS. משתנים רציפים נבדקו לנורמליות והובאו לידי ביטוי כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ההבדלים בין שלוש הקבוצות נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי להשוואות מרובות. נתונים שאינם מבוזרים נורמלית נותחו באמצעות מבחן Kruskal-Wallis. משתנים קטגוריים הובעו כספירות ואחוזים ונותחו באמצעות מבחן כי-ריבוע (χ²) או מבחן פישר המדויק כאשר זה מתאים. מרווחי האמון של 95% (CIs) חושבו עבור פרמטרים מרכזיים. המובהקות הסטטיסטית נקבעה על p < 0.05. כל הניתוחים בוצעו על ידי ביוסטטיסטיקאי עצמאי שהיה עיוור להקצאת קבוצות.