מאמר שיטה

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

DOI:

10.3791/69400

⸱

28 באוקטובר 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רכיבי ליבה של רגולציה ציס, הידועים כמשפרים, ממלאים תפקיד מרכזי במתן אפשרות לוויסות שעתוק מדויק של גני מטרה השולטים בתפקודים תאיים מגוונים ובתהליכי התפתחות. משפרים אלה מתועתקים לעתים קרובות לשני הכיוונים, ומייצרים תעתיקים ארוכים שאינם מקודדים המכונים RNA משפרים (eRNAs). הביטוי של eRNAs קשור קשר הדוק לתכונות כרומטין פעילות, כגון H3K27ac וגיוס מפעיל משותף, ותורם מבחינה תפקודית להפעלת השעתוק של גני המטרה. עם זאת, הזיהוי והכימות של eRNAs נותרו מאתגרים, במיוחד כאשר הם חופפים לשעתוק גן מארח. כדי לטפל בכך, אנו מציגים זרימת עבודה חישובית סטנדרטית וידידותית למשתמש לניתוח שעתוק משפר מנתוני ריצוף RNA מתהווים. הפרוטוקול מנחה את המשתמשים באמצעות עיבוד מקדים של נתונים, מיפוי קריאה ובקרת איכות, ולאחר מכן כימות ספציפי לגדיל של שעתוק הקשור למשפר, עם נהלים ייעודיים למשפרים תוך-גניים שבהם הקצאת האותות מורכבת. מודולי הדמיה מאפשרים בדיקה ברורה של פעילות המשפר בהקשרים גנומיים, ואפשרויות מובנות תומכות בניתוחים של משפרים בין-גניים ותוך-גניים כאחד. זרימת עבודה זו, המיועדת לחוקרים בעלי מומחיות מוגבלת בביואינפורמטיקה, מספקת מסגרת מעשית למחקרים עקביים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה של שעתוק משפר, מה שמקל על יישום רחב יותר של ביולוגיה משפרת על פני מערכות מגוונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפרים הם רכיבי DNA מווסתים של ציס השולטים בשעתוק גן המטרה על ידי ארגון לולאות כרומטין וגיוס מנגנון השעתוק 1,2,3. פעילותם הספציפית לרקמה מאפשרת ויסות מדויק במהלך ההתפתחות ומחויבות לשושלת 4,5,6,7,8. משפרים פעילים מראים תכונות כרומטין אופייניות כגון H3K4me1 (היסטון H3 ליזין 4 מונו-מתילציה) ו-H3K27ac (אצטילציה של היסטון H3 ליזין 27) ונמצאים בדרך כלל באזורים רגישים יתר של DNase I המסמנים כרומטין פתוח 9,10,11,12. תכונות אלו מאפשרות לגורמי שעתוק ו-RNA פולימראז II לגשת ל-DNA, וליזום שעתוק מתהווה במיקומי משפר 13,14,15,16.

תהליך ביולוגי רציף זה מייצר תעתיקים שמקורם במשפר, הנקראים eRNAs, שהם RNA דו-כיווני, לא מקודד ובדרך כלל לא פוליאדניל 13,14,15,16. eRNAs משמשים כסמנים של פעילות משפרת ומתפקדים כאפקטורים בפני עצמם 16,17,18,19,20,21,22,23,24. הם מקדמים התארכות פרודוקטיבית על ידי שחרור גורם התארכות שלילי (NELF) מ-RNA פולימראז II מושהה16,19, ועוזרים לייצב לולאות משפר-מקדם 17,18,20. הם גם תומכים בהיווצרות עיבוי שעתוק, פוטנציאלית באמצעות שינוי m6A (N 6-Methyladenosine) 21,22,23.

ובכל זאת, הפונקציה של שעתוק משפר תוך-גני, שנוצר מאלמנטים רגולטוריים בתוך גופי גנים, נותרה שנויה במחלוקת. מחקרים מסוימים מדווחים כי eRNAs ממשפרים תוך-גניים מגבירים את ביטוי הגנים המארח25, פוטנציאלית על ידי קידום שחרור NELF והתארכות פרודוקטיבית תלויה בגירוי 26,27. לעומת זאת, עבודות אחרות מצביעות על כך שעתוק זה יכול לעכב גנים מארחים באמצעות התנגשויות RNA פולימראז II או הפרעות שעתוק, מה שמוביל להנחתה או סיום מוקדם28,29. תצפיות סותרות אלה, יחד עם התפקיד הכפול של eRNAs כסמנים ומווסתים, מדגישים את הצורך בכימות זהיר ודיסקציה פונקציונלית. עם זאת, מדידת eRNAs תוך-גניים היא קשה מכיוון שלעתים קרובות הם חופפים תעתיקי מארח גדילי חישה 13,25,26,30. האתגר מוגבר כאשר משפרים שוכנים באזורים עם גנים מקוננים או שעתוק חופף בשני הגדילים, מה שמטשטש אותות ספציפיים למשפר.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו צינור ביואינפורמטיקה לזיהוי, כימות והדמיה של תעתיקים הקשורים למשפר, עם דגש מיוחד על אזורים תוך-גניים. הצינור משלב את הבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq), ריצוף כרומטין אימונו-משקעים (ChIP-seq), ריצוף ריצה גלובלי (GRO-seq) והערות גנומיות כדי להשיג רזולוציה ברמת משפר גם בהקשרים גנומיים מורכבים.

הצינור כולל ארבעה שלבים עיקריים: (i) עיבוד מקדים, יישור, שיחות שיא ויצירת אותות31; (ii) זיהוי משפר באמצעות תכונות כרומטין; (iii) הקצאת אוריינטציה של גדילים, במיוחד בתוך גופי גנים; ו-(iv) כימות והדמיה של תעתיקי משפרים מתהווים. מסגרת זו שימושית במיוחד עבור מערכות עם נתוני ריצוף ברזולוציה גבוהה, כגון תאי גזע עובריים של עכבר שנותחו במחקר זה, וניתן להרחיב אותה לאורגניזמים אחרים כאשר מערכי נתונים מתאימים זמינים. על ידי מתן אפשרות לכימות ספציפי למשפר היכן שהצינורות הקיימים נופלים, זרימת עבודה זו מציעה כלי מעשי להשוואת ביצועים ולימוד של שעתוק eRNA תוך-גני בהקשרים גנומיים מגוונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל ערכות הנתונים הגולמיות המשמשות בזרימת העבודה מפורטות בטבלה 1. פרטים על כלים ביואינפורמטיים מסופקים בטבלת החומרים. ניתן לכוונן את מספר הליכי המשנה המשמשים בקו צינור זה על ידי שינוי המשתנה THREADS המוגדר בחלק העליון של כל קובץ Script. משתמשים עשויים להגדיל את המספר כדי להאיץ את הניתוח בהתאם למשאבי המעבד של המשתמש.
לאחר כל שלב, נוצר קובץ יומן רישום. לבדיקות כשל מהירות, השתמש בפקודות כמו cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt & echo "ERROR found. תקן לפני השלב הבא." || echo "אישור: אין סמני שגיאה". אם מופיעה שגיאה כלשהי, התייחס לשלב כאל נכשל ופתור אותו תחילה.

1. הורדת צינור ניתוח מלא ממאגר GitHub

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. הפעל את ממשק שורת הפקודה (CLI) המתאים למערכת ההפעלה שבה נעשה שימוש.
    1. Windows: הגדר סביבת Linux באמצעות מערכת המשנה של Windows עבור Linux (WSL). עקוב אחר ההוראות הרשמיות כדי להתקין ולהגדיר את WSL לפני שתמשיך32.
    2. macOS: המשיכו ללא הגדרות נוספות, מכיוון ש-macOS מבוססת על Unix. עיין במדריך הרשמי לפתיחת טרמינל33.
    3. משתמשי לינוקס, במיוחד אלה המשתמשים באובונטו: פתח מסוף כמתואר בהוראותהמוזכרות 34.
  2. הפעל את wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   בטרמינל כדי להוריד צינור לזיהוי משפר וכימות RNA משפר.
  3. הקלד unzip ~/pipeline.zip -d ~/ במסוף. פעולה זו תחלץ את כל הקבצים הדרושים לספריית הבית.
  4. הפעל rm ~/pipeline.zip והקלד mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization כדי להסיר ארכיון ולשנות את שם התיקיה שחולצה.
  5. הקלד cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/, והפעל סקריפטים של chmod +x /* כדי להפוך את כל הסקריפטים בספריית "scripts/" לניתנים להפעלה.

2. הגדרת סביבת ממבה/קונדה לצינור ניתוח

  1. הקלד bash scripts/Step1_conda_environment_formation.sh כדי ליצור ולהפעיל סביבה וירטואלית של mamba. אם תתבקש לעשות זאת במהלך הביצוע, הקלד Y והקש Enter כדי לאשר את התקנות החבילה. עבור macOS, בצע את שלב 2.1.1; עבור מערכות שכבר מותקנות בהן Mamba או Conda, בצע את שלב 2.1.2.
    1. MacOS: פתח את הסקריפט והחלף את קישור ההורדה של miniconda בגרסת macOS:
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      לאחר מכן, בצע את שלב 2.1.
    2. ברגע שמופיע (enhancer-env) בהנחיה, הקלד bash scripts/Step2_package_installation.sh כדי להתקין חבילות נדרשות לניתוחים במורד הזרם. הקלד Y והקש Enter אם תתבקש לעשות זאת במהלך ההתקנה.
    3. לאחר הפעלת שלב 2.2, בדוק את פלט המסוף לאיתור הודעות שגיאה. לפתור כל בעיה; לאחר מכן הפעל מחדש את שלב 2.2.
    4. (אופציונלי) הפעל את רשימת mamba כדי לוודא שכל החבילות המנוהלות על-ידי mamba בטבלת החומרים מותקנות. HOMER מותקן באופן ידני ולא יופיע ברשימת הממבה. אמת את HOMER על ידי בדיקה שקיימת ספריית "~/homer/".

3. הורד מערכי נתונים של ChIP-seq, ATAC-seq ו-GRO-seq הזמינים לציבור מ-SRA (ארכיון קריאת רצף)

  1. הפעל סקריפטים cp/Step{3..12}_*.sh ./ כדי להעתיק סקריפטים נחוצים לעיבוד קריאה גולמי.
  2. הקלד bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1 ולחץ על מקש Enter כדי להוריד ולעבד נתוני רצף גולמיים מ-SRA.
    הערה: קובץ Script זה הופך את ההורדה וההכנה של נתוני רצף ציבוריים לאוטומטיים לניתוח. הוא יוצר מבנה תיקיות סטנדרטי תחת "MATERIAL/", המאורגן לפי סוג הבדיקה ושכפול (ביולוגי: rep1/rep2; טכני: trep1/trep2). רשימה מובנית של מספרי כניסה ל-SRA מניעה אחזור עם שליפה מראש (v3.2.0), המרה ל-FASTQ עם fasterq-dump (v3.2.0) (קצה מזווג: --split-files), ודחיסה עם pigz (v2.8) כדי להפחית את האחסון. העיבוד עוקב אחר prefetch, fasterq-dump, pigz, עם פלטים שנכתבו לספריות "00.Rawdata/" מתאימות.

4. בצע בקרת איכות וקיצוץ של קריאות גולמיות

  1. הקלד bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2> ו-1 כדי לבצע חיתוך קריאה ובקרת איכות של קובצי FASTQ גולמיים.
    הערה: קובץ Script זה מעבד קובצי FASTQ גולמיים מ-GRO-seq, ATAC-seq ו-ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) עם פקדי קלט מתאימים. הוא מריץ את FastQC (v0.12.1)35 בקריאות גולמיות, ואז חותך מתאמים עם Trim Galore (v0.6.10)36 באמצעות פרמטרים ספציפיים לבדיקה. עבור GRO-seq, הוא מסיר תחילה את זנבות NextSeq G וקריאות קצרות מאוד (--nextseq 20, --אורך 20), ולאחר מכן משתמש ב-Cutadapt (v5.1)37 כדי להפשיט מסלולים ארוכים של poly-A תוך שמירה על קריאות ארוכות יותר מ-20 נוקלאוטידים ( -a A{15}, -m 20). עבור ATAC-seq, הוא מעבד ספריות קצה מזווג ומכוון למתאמי Tn5/Nextera (--מזווג, --nextera). עבור H3K27ac וקלט מתאים, הוא מטפל בספריות ChIP-seq מזווגות (--מזווגות). עבור H3K4me1 והקלט שלו, הוא מבצע חיתוך קצה יחיד סטנדרטי (ברירת מחדל). FastQC מופעל שוב בקריאות חתוכות. הפלטים נכתבים בספריית "01.Clean/" של כל בדיקה, וקבצים בינוניים שנחתכו על ידי מתאם GRO-seq מוסרים.

5. הכן אינדקס ייחוס Bowtie2

  1. בחר אחת משתי האפשרויות שלהלן כדי להכין אינדקס גנום Bowtie2 (v2.5.4)38 עבור גנום ייחוס mm10 (Mus musculus).
    1. הפעל את bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2> ו-1 כדי להשתמש באינדקס Bowtie2 שנבנה מראש שסופק על ידי מפתחים.
    2. רץ bash Step5_2_download_reference_make_index_with_
      bowtie2.sh > Step5_2_log.txt 2>&1       להורדת רצף גנום MM10 גולמי ובניית אינדקס באופן ידני.
      הערה: שתי הגישות יוצרות קובץ אינדקס לספריה "reference_index/" והן שוות ערך מבחינה פונקציונלית ליישור רגיל.

6. יישר קריאות גזומות לגנום הייחוס mm10

  1. הקלד bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1 כדי ליישר את הקריאות של כל בדיקה כדי להפנות לקובצי BAM וליצור אותם.
    הערה: שלב זה ממפה את הקריאות של כל בדיקה להפניה ל-mm10 שהייתה מאונדקסת בעבר. H3K27ac ChIP-seq והקלט המתאים משתמשים במיפוי קצה מזווג לדיוק מאוזן (-1, -2) עם רגישות ברירת מחדל. H3K4me1 ChIP-seq והקלט המתאים משתמשים במיפוי קצה יחיד תחת הגדרות ברירת המחדל (-U). ATAC-seq משתמש במיפוי רגישות גבוהה כדי להכיל שברים משתנים וארוכים שמקורם ב-Tn5 (--רגיש מאוד, -X 2000) עם קלט קצה מזווג (-1, -2). GRO-seq משתמש במיפוי ברגישות גבוהה כדי למקם טוב יותר קריאות קצרות וחתוכות (--רגישות מאוד) עם קלט קצה יחיד (-U). קבצי SAM מומרים ל-BAM ומסוננים עם תצוגת samtools (v1.22.1)39 , תוך שימוש ב-MAPQ מתון עבור ChIP/קלט (-b, -q 10) וסף מחמיר יותר עבור ATAC-seq ו-GRO-seq (-b, -q 30); קבצי BAM סופיים נכתבים בספריית "02.Align/" של כל מערך נתונים.

7. מיזוג שכפולים טכניים של נתוני H3K27ac ChIP-seq

  1. הפעל את bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1 כדי למזג שכפולים טכניים של H3K27ac ChIP-seq וקבצי BAM קלט מתאימים.
    הערה: קובץ Script זה ממיין קבצי BAM עבור שכפולים טכניים עם מיון sambamba (v1.0.1)40 ולאחר מכן ממזג את H3K27ac ChIP-seq ושכפולי קלט מתאימים לתוך BAMs מאוחדים עם מיזוג sambamba. אם ערכת הנתונים של המשתמש אינה מכילה שכפולים טכניים, דלג על שלב זה והמשך עם קבצי BAM בודדים.

8. הסר כפילויות וכרומוזומים לא חיוניים

  1. הסר כפילויות ומיין קריאות ממופות עבור ChIP-seq ו-GRO-seq.
    1. הקלד bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2> ו-1 כדי להסיר כפילויות ממערכי הנתונים של Histone ChIP-seq ולמיין הן את ה-BAM של פלט ChIP-seq והן את ה-GRO-seq.
      הערה: קובץ Script זה מסיר כפילויות PCR עם סימון סמבמבה (-r) וממיין קואורדינטות עם מיון סמבמבה. עבור H3K27ac, העיבוד מכוון ל-BAMs משכפולים טכניים ממוזגים, ומטפל ב-ChIP ובקלט בנפרד. עבור H3K4me1, כל שכפול וקלט תואם מעובדים בנפרד. עבור GRO-seq, מדלגים על הסרת כפילויות ורק מיון קואורדינטות מוחל. הפלטים נשמרים בספריית "02.Align/" של כל מערך נתונים.
  2. הסר כפילויות וסנן קריאות ממופות כרומוזומים מיטוכונדריאליות מ-ATAC-seq.
    1. הקלד bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2> ו-1 כדי להסיר כפילויות PCR, לסנן קריאות מיטוכונדריאליות (chrM) ולמיין BAMs של ATAC-seq.
      הערה: קובץ Script זה מפנה להמלצות קו צינור ENCODE עבור עיבוד נתונים ATAC-seq. זה מתחיל בביצוע מיון שמות עם מיון סמבמבה (-n), ותיקון מידע על זוגות בני זוג באמצעות samtools fixmate (-m). שלב זה מבטיח שמידע על בני זוג מוקצה כראוי לפני סימון כפילויות. לאחר מכן, כפילויות PCR מוסרות באמצעות סימון סמבמבה (-r). קריאות מיטוכונדריאליות מוסרות על ידי יצירת רשימת שמירה מ-samtools idxstats (לא כולל chrM ו-*) ושמירה רק על הפניות רשומות עם תצוגת samtools (-b). מיון הקואורדינטות הסופי מתבצע במיון סמבמבה. BAMs מנוקים נכתבים בספריית "02.Align/" של כל משכפל.

9. בצע שיחות שיא עבור כל מערך נתונים

  1. הפעל את קובץ ה- Script של שלב 9 על-ידי הקלדת bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 כדי לבצע שיחות שיא עבור נתוני ChIP-seq ו- ATAC-seq.
    הערה: קובץ Script זה מבצע שיחות שיא עם MACS3 (v3.0.3)41 עבור ATAC-seq ו-ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1). ATAC-seq מייצר שיאים על ידי אספקת כל ה-BAMs המשוכפלים כאות במצב ללא מודל עם הזזה/הרחבה (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01). H3K27ac קורא לשיאים רחבים משכפולים טכניים ממוזגים עם קלט תואם (-f BAMPE, --רחב). H3K4me1 מעבד כל שכפול בנפרד עם הקלט התואם שלו במצב רחב קצה יחיד (-f BAM, --רחב), ופסגות חופפות מתקבלות עם כלי מיטה (v2.31.1)42 מצטלבים. הפלטים נכתבים בספריית "peak_calling/" של כל מערך נתונים, עם שיאי H3K4me1 ברמת ביטחון גבוהה תחת "peak_calling/overlapped_peak/".

10. מיזוג שכפולים ביולוגיים של קבצי BAM ChIP-seq ו-ATAC-seq לניתוח אותות במורד הזרם

  1. הפעל את bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1 כדי למזג קבצי BAM משכפולים ביולוגיים של ATAC-seq ו-H3K4me1 ChIP-seq.
    הערה: סקריפט זה משלב BAMs משוכפלים עם מיזוג סמבמבה עבור ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq וקלט H3K4me1 תואם. BAMs ממוזגים תומכים בניתוחים במורד הזרם (למשל, יצירת אותות bigWig, נורמליזציה). פלט BAMs נשמרים בספריות "merge/02.Align/" מתחת לכל נתיב לדוגמה.

11. צור ספריות תגים ואותת על קבצי bigWig מקריאות ממופות

  1. הפעל את bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1 כדי ליצור ספריות תגים וליצור קבצי אות bigWig לקריאות ממופות של כל מערך נתונים.
    הערה: סקריפט זה בונה ספריות תגיות HOMER עם makeTagDirectory ולאחר מכן מייצר רצועות אות bigWig עם הפקודה makeUCSCfile באמצעות חבילות HOMER (v5.1)43 ו-ucsc-bedgraphtobigwig (v482)44 . כל מסלולי האותות נוצרים באמצעות קבצי גודל כרומוזום מדפדפן הגנום של UCSC (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/). GRO-seq מייצר מסלולי איתות ספציפיים לגדיל (-style rnaseq, -strand + / -, -bigWig). ATAC-seq מייצר רצועות לא מנורמלות מ-BAMs ממוזגות (-bigWig). ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) מייצר רצועות מנורמלות קלט עם ספירת פסאודו-1 (-bigWig, -i, -pseudo 1). הפלטים מאורגנים תחת "03.TagDir/" ו-"04.bigwig/".

12. הכן קבצים לזיהוי משפר

  1. הקלד bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2> ו-1 בטרמינל כדי להכין את הקבצים הדרושים והפניה לזיהוי משפר.
    הערה: שלב זה אוסף את כל הקבצים הדרושים לזיהוי משפר לתוך "01.E_identification/חומר/", המאורגנים בתיקיות "ATAC/", "Histone/" ו-"Annotation/". הוא מעתיק קבצי שיא (ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1) לספריות מתאימות. קובץ ההערות של GENCODE M23 (mm10) מוריד אוטומטית, וקבצי הפניה, כולל ENCODE blacklist45 (mm10-blacklist.v2.bed) וקובץ גודל כרומוזום (mm10.chrom.sizes) מועתקים מנתיב מוגדר מראש.

13. זהה מועמדים למקדם וגופי גנים מהערות

  1. הקלד cd 01.E_identification/ כדי להיכנס לספריית העבודה, ולאחר מכן הפעל את cp .. /scripts/step{13..20}_*.sh ./ כדי להעתיק סקריפטים לזיהוי משפר.
  2. הפעל את bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1 כדי ליצור קבצי BED עבור אזורי מקדם, גופי גנים וגנים מקודדי חלבון (PCG) באמצעות ביאור GENCODE.
    הערה: סקריפט זה מעבד את GENCODE M23 Gene Transfer Format (GTF) שהורדת כדי ליצור קבצי BED עבור מועמדים למקדם, כל גופי הגנים וגופי PCG, תוך שמירת פלטים ל-"material/Annotation/". מקדמים מוגדרים כחלון של 2 קילו-בייט סביב ה-TSS (אתר התחלת התמלול) של כל תמלול עם שיפוע כלי המיטה (-b 2000, -g mm10.chrom.sizes). גופים מקודדי גנים וחלבונים נגזרים מערכי GTF המסומנים כגן, כאשר ערכים מקודדי חלבון מסוננים עוד יותר על ידי "gene_type = protein_coding".

14. שיאי תהליך לזיהוי משפר

  1. הפעל את bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2> ו-1 כדי לעבד מראש קבצי שיא של ATAC-seq ו-Histone ChIP-seq לזיהוי משפר.
    הערה: סקריפט זה מעבד מראש ערכות שיא לקריאת משפר. עבור ATAC-seq, הוא מסיר אזורים חופפים לאזורים ברשימה השחורה עם חיסור כלי מיטה (-A) ולאחר מכן אינו כולל פסגות החופפות מועמדים למקדם עם חיסור כלי מיטה (-A); עבור סימני היסטון (H3K27ac, H3K4me1), הוא מרחיב באופן סימטרי כל פסגה ב-1 קילו-בייט מכל צד עם שיפוע כלי המיטה (-B 1000 -g mm10.chrom.sizes) ואז מסיר חפיפות מקדם עם כלי מיטה.

15. זיהוי וסיווג משפרים

  1. הפעל את bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2> ו-1 כדי להגדיר ולסווג משפרים באמצעות נתוני שיא כרומטין.
    הערה: שלב זה מגדיר ומבאר משפרים באמצעות כלי מיטה. חפיפות בין פסגות ATAC-seq ופסגות H3K4me1 מורחבות בשיפוע מתקבלות עם הצטלבות (-wa, -u), ואזורים החופפים גם לפסגות H3K27ac מאגפות מסווגים כמשפרים פעילים עם הצטלבות (-wa, -u); משפרים לא פעילים נגזרים על ידי הסרת אזורים פעילים מערכת המשפרים המלאה עם חיסור. פסגות ATAC-seq החופפות כל קבוצת משפרים נאספות עם הצטלבות (-u), ואז הפסגות מפוצלות לאינטרגניות ואינטרגניות עם הצטלבות (-v או -u) כנגד גוף הגן. מרווחי משפר מוקצים לבסוף למחלקות בין-גניות/תוך-גניות על סמך הפסגה הקשורה לפסגה עם הצטלבות (-u). כל התוצאות נשמרות ב-"01.E_identification/" תחת "01.allE/", "02.interE/" ו-"03.intraE/".

16. הקצה מידע גדיל זמני למשפרים תוך-גניים

  1. הקלד bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2> ו-1 כדי להקצות מידע גדיל זמני ל-BED המשפר התוך-גני.
    הערה: שלב זה מקצה תוויות גדילי גנים למשפרים תוך-גניים על ידי חפיפה של מרווחי משפרים עם גופי גנים באמצעות הצטלבות כלי מיטה (-wa, -wb). עמודות 1, 2, 3, 4, 5, 16 נשמרות עם awk, ולאחר מכן הרשומות ממוינות ומבטלות כפילויות. הפלט נשמר כ-"03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed".

17. תעדוף הקצאת גדיל עבור משפרים החופפים גנים של שני הגדילים

  1. סוג bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2> ו-1 כדי לפתור את כיוון הגדיל עבור משפרים תוך-גניים החופפים גנים בשני הגדילים.
    הערה: סקריפט זה פותר את אי הבהירות עבור משפרים תוך-גניים החופפים גנים בשני הגדילים על ידי תעדוף חפיפות PCG. משפרים הקיימים בשני הגדילים מבודדים תחילה (קיבוץ awk לפי כרום/התחלה/סוף/id/גדיל), מקרים חופפי PCG באותו גדיל נבחרים עם הצטלבות כלי מיטה (-s, -wa, -u), ומקרים שאינם PCG נשמרים עם הצטלבות כלי מיטה (-v). ערכות שנבחרו ונשמרו משורשרות ומסודרות. פלט: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed".

18. חישוב ערכי קריאות ספציפיות לגדיל לקילו-בסיס למיליון קריאות ממופות (RPKM) עבור גנים החופפים משפרים תוך-גניים לפי עדיפות PCG

  1. הקלד bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2> ו-1 כדי לחשב RPKM ספציפי לגדיל עבור גנים חופפים משפרים באותו גדיל.
    הערה: שלב זה משתמש ב-"ES_E_intragenic_PCG_priority.bed" משלב 17, המכיל משפרים אשר (i) חפפו PCG על גדיל אחד וקיבלו גדיל, (ii) חפפו PCG בשני הגדילים ונותרו מעורפלים, או (iii) לא הייתה חפיפה של PCG ושמרו על שני הגדילים. גנים חופפים מאותו גדיל נבחרים עם כלי מיטה מצטלבים (-s, -wa, -u), מומרים ל-GTF באמצעות awk, ומכומתים מ-GRO-seq עם ספירת תכונות (v2.1.1)46 מצב ספירה ספציפי לגדיל (-s 1, -t gene, -g gene_id, -O, --fraction). סך הקריאות הממופות מתקבלות עם סמבמבה פלאגסטאט, ו-RPKM מחושב מאורך הגנים, הספירה והסכומים. הפלטים נכתבים ל-"03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/".

19. הקצאת גדיל סופית המבוססת על ביטוי גנים (RPKM) של גנים חופפים

  1. הקלד bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2> ו-1 כדי לסיים את הקצאת הגדילים עבור משפרים תוך-גניים.
    הערה: שלב זה מקצה גדילים למשפרים תוך-גניים באמצעות תמיכה בביטוי גנים משלב 18. חפיפות זהות בין משפרים (ES_E_intragenic_PCG_priority.bed) וגנים נמצאות עם שרפרפים מצטלבים (-s, -wa, -wb). ערכי RPKM של גנים מחוברים למרווחי גנים באמצעות awk/מיון/הצטרפות, ומייצרים גן-RPKM BED. עבור כל משפר, נבחר הגן החופף עם הסל"ד הגבוה ביותר, והמשפר יורש את גדיל הגן הזה. התוצאות נשמרות ב-"03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed".

20. הקצה מידע על גדיל למשפרים תוך-גניים ולפסגות משפרים

  1. הקלד bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2> ו-1 כדי להקצות מידע על גדיל שהוחלט לכל המשפרים התוך-גניים ולכל פסגה.
    הערה: שלב זה מסיים את הקצאת הגדילים עבור משפרים תוך-גניים ופסגות תואמות באמצעות כלי מיטה. מרווחי גדיל נגדיים מוסרים עם חיסור (-S), משפרים המיועדים לגדיל מצטלבים עם קבוצות פעילות ולא פעילות באמצעות הצטלבות (-wa, -u), וקבצי פסגה מוסרים מחדש על ידי פסגות חופפות עם משפרים המיועדים לגדיל באמצעות הצטלבות (-wa, -wb) ומקבלים גדיל עם AWK. התוצאות נשמרות ב-"03.intraE/final_strand_IntragenicE/" ובתיקיית המשנה "summit/" שלו.

21. הכן קבצי קלט לאימות משפר, כימות eRNA והדמיה

  1. הקלד cd .. / או cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization כדי לעבור לשורש הצינור, ולאחר מכן הקלד cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ כדי להעתיק את הסקריפט להכנת ניתוח במורד הזרם.
  2. הפעל את bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2> ו-1 כדי להכין את כל הקבצים הדרושים לצבירת משפרים, עיבוד אותות GRO-seq וכימות eRNA.
    הערה: שלב זה מכין קלט files ומבנה ספריות לאימות משפר, כימות eRNA והדמיית אותות תחת "02.E_visualization_quantification/". תיקיות משנה נוצרות עבור קבצי bigWig, BEDs משפרים, BAMs, מטריצות אותות, ספירות ועלילות. תשומות מפתח כגון BEDs פסגה, bigWigs, רשימות משפרים ו-BAMs של GRO-seq מועתקים למיקומים המתאימים.

22. צור עלילות צבירה לאימות משפר

  1. הקלד cd 02.E_visualization_quantification/ כדי להיכנס לספריית העבודה ולאחר מכן הקלד cp .. /scripts/step{22..24}_*.* ./ כדי להעתיק סקריפטים נחוצים לניתוח במורד הזרם.
  2. הפעל את bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2> ו-1 כדי ליצור עלילות צבירה של אותות כרומטין סביב כל סוג של פסגת משפר.
    הערה: שלב זה מדמיין העשרת אות כרומטין ממוצעת המתמקדת בפסגות משפרים באמצעות computeMatrix ו-plotProfile מ-deepTools (v3.5.6)47. עבור כל ערכת משפרים מוגדרת, נקודת ייחוס של computeMatrix (--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero) מחשבת את צפיפות האות בחלון של 10 קילו-בייט סביב פסגות משפרים באמצעות קבצי bigWig עבור ATAC-seq, H3K27ac ו-H3K4me1. מטריצת הפלט מועברת ל-plotProfile, המייצר עקומות צבירת אותות להשוואה בין קבוצות משפרים. עלילות צבירה נשמרות בספרייה "01.Profiling/04_1.aggregation/".

23. כימות והדמיה של ביטוי RNA משפר

  1. הפעל את bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2> ו-1 כדי לכמת את רמות הביטוי של eRNA מ-GRO-seq באמצעות featureCounts.
    הערה: שלב זה מכמת את שעתוק ה-eRNA מאזורי משפרים מוגדרים באופן ספציפי לגדיל באמצעות GRO-seq. משפרים בין-גניים נספרים עם ספירת תכונות במצב לא תקוע (-s 0, -t enhancer, -g gene_id, -O, --fraction), ומשפרים תוך-גניים מכומתים במצב אנטי-סנס (-s 2) כדי לא לכלול אות משעתוק גנים חופף. אזורי BED מומרים ל-GTF עם awk לפני הספירה. סך הקריאות הממופות מגיעות מ-sambamba flagstat, והספירה מנורמלת ל-RPKM באמצעות אורך משפר, ספירת קריאה וסך כל הקריאות הממופות. הפלטים מאורגנים תחת "02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/" על ידי "inter/" ו-"intra/".
  2. הפעל את Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript. R > Step24_log.txt 2> ו-1 כדי להמחיש ולהשוות רמות ביטוי eRNA בין קבוצות משפרים באמצעות R.
    הערה: סקריפט R משתמש בחבילות ggplot2 (v3.5.2)48 ו-cowplot (v1.2.0)49 כדי ליצור עלילות כינור ותיבה המשווה ביטוי משפר פעיל ולא פעיל על סמך ערכי RPKM. לצורך הדמיה ובדיקות סטטיסטיות, ערכי RPKM הופכים ל-log2 (RPKM + 1). מובהקות סטטיסטית מוערכת באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum. גם עלילות סיכום וגם טבלת ערך p נשמרות ב-"03.eRNA_visualization/" לפרשנות במורד הזרם.
    הערה: אם שלב כלשהו בקו צינור זה נכשל ונמשך גם לאחר הפעלה מחדש, דווח על הבעיה בתצוגה חזותית/בעיות https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to. ציון ברור של השלב שנכשל וצירוף קובץ היומן מבטיח תמיכה מדויקת בפתרון בעיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת עבודה סכמטית לצינור כימות תעתיק משפר
מערכי נתונים ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq ו-GRO-seq הזמינים לציבור (טבלה 1) עובדו עם צינור סטנדרטי שתוכנן בעיקר לאימות. חיתוך המתאם וסינון האיכות בוצעו עם Trim Galore ו-Cutadapt, ולאחר מכן יישור לגנום הייחוס mm10 באמצעות Bowtie2 (מפורט בפרוטוקול שלב 6). עבור ChIP-seq ו-ATAC-seq, זוהו שיאים עם MACS3, ומסלולי עוצמת אות (קבצי bigWig) נוצרו באמצעות HOMER ו-ucsc-bedgraphtobigwig להדמיה במורד הזרם וניתוח כמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות גילוי תעתיקים שמקורם במשפר 13,14,15, כימות מדויק של eRNAs נותר אתגר גדול, במיוחד בהקשרים תוך-גניים שבהם eRNAs חופפים לעתים קרובות עם תעתיקי גנים מארחים. חפיפה זו מסבכת את הקצאת הגדילים וייחוס האותות, ומקשה על ההבחנה בין שעתוק משפר אמיתי לבין ביטוי גנים ברקע 13,25,26,30.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר של האוניברסיטה הלאומית של צ'ונגנאם [2022-0582-01 (S.-K.K.) ו-2023-0545-01 (S.-K.K.)], דרום קוריאה. איור 1 נוצר באמצעות BioRender (https://biorender.com/).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כלי מיטהמעבדת קווינלן, אוניברסיטת יוטה  v2.31.1כלים לעריכת קבצי BED
פבוט טי2מעבדת לנגמיד, אוניברסיטת ג'ונס הופקינסv2.5.4מיישר רב-תהליכי למיפוי קוראים לגנום ייחוס
קו-פלאטמעבדת וילקה, אוניברסיטת טקססv1.2.0כלים לשילוב ויישור של דמויות מבוססות ggplot2
Cutadaptמעבדת מדע לחיים, אוניברסיטת סטוקהולםגרסה 5.1מתאם וגוזם זנב פולי-A/G
Deeptoolsמתקן ביואינפורמטיקה, מכון מקס פלאנקv3.5.6כלי קריאה לספירה לכימות קריאות באזורים גנומיים מוגדרים
fastqcביואינפורמטיקה בברהם, מכון בברהםv0.12.1בקרת איכות לקריאות רצף
featureCounts (קריאת משנה)מעבדת שי, אוניברסיטת מונאשv2.1.1כלי ספירת קריאה גולמיים לאזורים גנומיים מסוימים
הומרוסמעבדת בנר, אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו (UCSD)גרסה 5.1ערכת כלים לניתוח ChIP-seq, ATAC-seq וניתוח RNA מתהווה; כולל יצירת תיקיות תגיות ופרופיל אותות
macs3יוזמת צ'אן צוקרברגv3.0.3קריאת שיא עבור מערכי נתונים של ChIP-seq ו-ATAC-seq
pigz.v2.8כלי דחיסה רב-תהליכי ליצירת קבצים דחוסים ב-gzip
סמבמבהאוניברסיטת מדינת פטרסבורגv1.0.1ערכת כלים לעיבוד קבצים מרובה תהליכי SAM/BAM
SAMTOOLSמכון סנגר של קרן וולקוםv1.22.1כלים לעיבוד ומניפולציה של קבצי SAM/BAM
SRA-toolsהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI)v3.2.0להורדת קבצי SRR ממסד הנתונים של NCBI SRA
tidyversePosit PBCv2.0.0איסוף חבילות R למניפולציה והמחשה של נתונים
טרימ-פלורמעבדות אלטוס, מכון קיימברידג' למדעיםv0.6.10מתאם וחיתוך בסיסי באיכות נמוכה באמצעות ריבוי הברגות
אובונטו 20.04פיתוח ובדיקת הצינור
UCSC-bedgraphtobigwig מעבדת קנט, אוניברסיטת קליפורניה סנטה קרוזv482כלים ליצירת מסלולי אות של bigWig

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  3. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  4. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  5. Plank, J. L., Dean, A. Enhancer function: mechanistic and genome-wide insights come together. Mol Cell. 55 (1), 5-14 (2014).
  6. Alexander, J. M., et al. Brg1 modulates enhancer activation in mesoderm lineage commitment. Development. 142 (8), 1418-1430 (2015).
  7. Huang, J., et al. Dynamic control of enhancer repertoires drives lineage and stage-specific transcription during hematopoiesis. Dev Cell. 36 (1), 9-23 (2016).
  8. Xiong, L., et al. Genome-wide identification and characterization of enhancers across 10 human tissues. Int J Biol Sci. 14 (10), 1321-1332 (2018).
  9. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  10. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  11. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  12. Barakat, T. S., et al. Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 23 (2), 276-288 (2018).
  13. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  14. Melgar, M. F., Collins, F. S., Sethupathy, P. Discovery of active enhancers through bidirectional expression of short transcripts. Genome Biol. 12 (11), R113(2011).
  15. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  16. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  17. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  18. Hsieh, C. -L., et al. Enhancer RNAs participate in androgen receptor-driven looping that selectively enhances gene activation. Proc Natl Acad Sci. 111 (20), 7319-7324 (2014).
  19. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  20. Pnueli, L., Rudnizky, S., Yosefzon, Y., Melamed, P. RNA transcribed from a distal enhancer is required for activating the chromatin at the promoter of the gonadotropin α-subunit gene. Proc Natl Acad Sci. 112 (14), 4369-4374 (2015).
  21. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958(2018).
  22. Nair, S. J., et al. Phase separation of ligand-activated enhancers licenses cooperative chromosomal enhancer assembly. Nat Struct Mol Biol. 26 (3), 193-203 (2019).
  23. Lee, J. -H., et al. Enhancer RNA m6A methylation facilitates transcriptional condensate formation and gene activation. Mol Cell. 81 (16), 3368-3385 (2021).
  24. Chen, Q., et al. Enhancer RNAs in transcriptional regulation: recent insights. Front Cell Dev Biol. 11, 1205540(2023).
  25. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 245, 470(2025).
  26. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. Elife. 10, e65161(2021).
  27. Cheng, F., et al. Intronic enhancers of the human SNCA gene predominantly regulate its expression in brain in vivo. Sci Adv. 8 (47), eabq6324(2022).
  28. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  29. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117 (2017).
  30. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  31. Lee, J., et al. Introductory analysis and validation of CUT&RUN sequencing data. J Vis Exp. (214), e67359(2024).
  32. How to install Linux on Windows with WSL. , Microsoft. https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install (2025).
  33. Terminal user guide. , Apple. https://support.apple.com/guide/terminal/welcome/mac (2025).
  34. How to open terminal in Linux. , GeeksforGeeks. https://www.geeksforgeeks.org/linux-unix/how-to-open-terminal-in-linux/ (2025).
  35. Simon, A. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Version 0.10.1, (2010).
  36. Krueger, F. Trim Galore!: a wrapper around Cutadapt and FastQC to consistently apply adapter and quality trimming to FastQ files, with extra functionality for RRBS data. Babraham Inst. , (2015).
  37. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 3(2011).
  38. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  39. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  40. Tarasov, A., Vilella, A. J., Cuppen, E., Nijman, I. J., Prins, P. Sambamba: fast processing of NGS alignment formats. Bioinformatics. 31 (12), 2032-2034 (2015).
  41. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  42. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  43. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  44. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  45. Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. The ENCODE blacklist: identification of problematic regions of the genome. Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).
  46. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  47. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160(2016).
  48. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. 189-201 (2016).
  49. Wilke, C. O. cowplot: streamlined plot theme and plot annotations for ggplot2. CRAN Contrib. Packages. , (2015).
  50. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  51. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  52. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  53. Blinka, S., Reimer, M. H., Pulakanti, K., Rao, S. Super-enhancers at the Nanog locus differentially regulate neighboring pluripotency-associated genes. Cell Rep. 17 (1), 19-28 (2016).
  54. Zhao, S., Ye, Z., Stanton, R. Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols. RNA. 26 (8), 903-909 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GRO seqATAC seqH3K27

מאמרים קשורים