Method Article

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

DOI:

10.3791/69400

⸱

October 28th, 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רכיבי ליבה של רגולציה ציס, הידועים כמשפרים, ממלאים תפקיד מרכזי במתן אפשרות לוויסות שעתוק מדויק של גני מטרה השולטים בתפקודים תאיים מגוונים ובתהליכי התפתחות. משפרים אלה מתועתקים לעתים קרובות לשני הכיוונים, ומייצרים תעתיקים ארוכים שאינם מקודדים המכונים RNA משפרים (eRNAs). הביטוי של eRNAs קשור קשר הדוק לתכונות כרומטין פעילות, כגון H3K27ac וגיוס מפעיל משותף, ותורם מבחינה תפקודית להפעלת השעתוק של גני המטרה. עם זאת, הזיהוי והכימות של eRNAs נותרו מאתגרים, במיוחד כאשר הם חופפים לשעתוק גן מארח. כדי לטפל בכך, אנו מציגים זרימת עבודה חישובית סטנדרטית וידידותית למשתמש לניתוח שעתוק משפר מנתוני ריצוף RNA מתהווים. הפרוטוקול מנחה את המשתמשים באמצעות עיבוד מקדים של נתונים, מיפוי קריאה ובקרת איכות, ולאחר מכן כימות ספציפי לגדיל של שעתוק הקשור למשפר, עם נהלים ייעודיים למשפרים תוך-גניים שבהם הקצאת האותות מורכבת. מודולי הדמיה מאפשרים בדיקה ברורה של פעילות המשפר בהקשרים גנומיים, ואפשרויות מובנות תומכות בניתוחים של משפרים בין-גניים ותוך-גניים כאחד. זרימת עבודה זו, המיועדת לחוקרים בעלי מומחיות מוגבלת בביואינפורמטיקה, מספקת מסגרת מעשית למחקרים עקביים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה של שעתוק משפר, מה שמקל על יישום רחב יותר של ביולוגיה משפרת על פני מערכות מגוונות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפרים הם רכיבי DNA מווסתים של ציס השולטים בשעתוק גן המטרה על ידי ארגון לולאות כרומטין וגיוס מנגנון השעתוק 1,2,3. פעילותם הספציפית לרקמה מאפשרת ויסות מדויק במהלך ההתפתחות ומחויבות לשושלת 4,5,6,7,8. משפרים פעילים מראים תכונות כרומטין אופייניות כגון H3K4me1 (היסטון H3 ליזין 4 מונו-מתילציה) ו-H3K27ac (אצטילציה של היסטון H3 ליזין 27) ונמצאים בדרך כלל באזורים רגישים יתר של DNase I המסמ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל ערכות הנתונים הגולמיות המשמשות בזרימת העבודה מפורטות בטבלה 1. פרטים על כלים ביואינפורמטיים מסופקים בטבלת החומרים. ניתן לכוונן את מספר הליכי המשנה המשמשים בקו צינור זה על ידי שינוי המשתנה THREADS המוגדר בחלק העליון של כל קובץ Script. משתמשים עשויים להגדיל את המספר כדי להאיץ את הניתוח בהתאם למשאבי המעבד של המשתמש.
לאחר כל שלב, נוצר קובץ יומן רישום. לבדיקות כשל מהירות, השתמש בפקודות כמו cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt & echo "ERROR found. תקן לפני השלב הבא." || echo "אישור: אין סמני שגיאה". אם מופיעה שגיאה כלשהי, התייחס לשלב כאל נכשל ופתור אותו תח....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת עבודה סכמטית לצינור כימות תעתיק משפר
מערכי נתונים ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq ו-GRO-seq הזמינים לציבור (טבלה 1) עובדו עם צינור סטנדרטי שתוכנן בעיקר לאימות. חיתוך המתאם וסינון האיכות בוצעו עם Trim Galore ו-Cutadapt, ולאחר מכן יישור לגנום הייחוס mm10 באמצעות Bowtie2 (מפורט בפרוטוקול שלב 6). עבור ChIP-seq ו-ATAC-seq, זוהו שיאים עם MACS3, ומסלולי עוצמת אות (קבצי bigWig) נוצרו באמצעות HOMER ו-ucsc-bedgraphto.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות גילוי תעתיקים שמקורם במשפר 13,14,15, כימות מדויק של eRNAs נותר אתגר גדול, במיוחד בהקשרים תוך-גניים שבהם eRNAs חופפים לעתים קרובות עם תעתיקי גנים מארחים. חפיפה זו מסבכת את הקצאת הגדילים וייחוס האותות, ומקשה על ההבחנה בין שעתוק משפר אמיתי לבין ביטוי גנים ברקע 13,25,26,30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר של האוניברסיטה הלאומית של צ'ונגנאם [2022-0582-01 (S.-K.K.) ו-2023-0545-01 (S.-K.K.)], דרום קוריאה. איור 1 נוצר באמצעות BioRender (https://biorender.com/).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
כלי מיטהמעבדת קווינלן, אוניברסיטת יוטה  v2.31.1כלים לעריכת קבצי BED
פבוט טי2מעבדת לנגמיד, אוניברסיטת ג'ונס הופקינסv2.5.4מיישר רב-תהליכי למיפוי קוראים לגנום ייחוס
קו-פלאטמעבדת וילקה, אוניברסיטת טקססv1.2.0כלים לשילוב ויישור של דמויות מבוססות ggplot2
Cutadaptמעבדת מדע לחיים, אוניברסיטת סטוקהולםגרסה 5.1מתאם וגוזם זנב פולי-A/G
Deeptoolsמתקן ביואינפורמטיקה, מכון מקס פלאנקv3.5.6כלי קריאה לספירה לכימות קריאות באזורים גנומיים מוגדרים
fastqcביואינפורמטיקה בברהם, מכון בברהםv0.12.1בקרת איכות לקריאות רצף
featureCounts (קריאת משנה)מעבדת שי, אוניברסיטת מונאשv2.1.1כלי ספירת קריאה גולמיים לאזורים גנומיים מסוימים
הומרוסמעבדת בנר, אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו (UCSD)גרסה 5.1ערכת כלים לניתוח ChIP-seq, ATAC-seq וניתוח RNA מתהווה; כולל יצירת תיקיות תגיות ופרופיל אותות
macs3יוזמת צ'אן צוקרברגv3.0.3קריאת שיא עבור מערכי נתונים של ChIP-seq ו-ATAC-seq
pigz.v2.8כלי דחיסה רב-תהליכי ליצירת קבצים דחוסים ב-gzip
סמבמבהאוניברסיטת מדינת פטרסבורגv1.0.1ערכת כלים לעיבוד קבצים מרובה תהליכי SAM/BAM
SAMTOOLSמכון סנגר של קרן וולקוםv1.22.1כלים לעיבוד ומניפולציה של קבצי SAM/BAM
SRA-toolsהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI)v3.2.0להורדת קבצי SRR ממסד הנתונים של NCBI SRA
tidyversePosit PBCv2.0.0איסוף חבילות R למניפולציה והמחשה של נתונים
טרימ-פלורמעבדות אלטוס, מכון קיימברידג' למדעיםv0.6.10מתאם וחיתוך בסיסי באיכות נמוכה באמצעות ריבוי הברגות
אובונטו 20.04פיתוח ובדיקת הצינור
UCSC-bedgraphtobigwig מעבדת קנט, אוניברסיטת קליפורניה סנטה קרוזv482כלים ליצירת מסלולי אות של bigWig

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  3. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhancer RNA QuantificationMouse Embryonic Stem CellsIntergenic EnhancersIntragenic EnhancersGRO seq AnalysisATAC seq DataH3K27 AcetylationChromatin Peak DataStrand Specific QuantificationAggregation Plots

Related Articles