מאמר שיטה

צביעת פרוקסיזום בתאי יונקים באמצעות גלאים ספציפיים לפרוקסיזום

DOI:

10.3791/69405

⸱

19 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of Southampton, 2The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, 3Biosciences, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, 4Institute of Bioengineering, Faculty of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 5Biomolecular Screening Facility, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 6Conquest

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גשושי PeroxiSPY משמשים לזיהוי פרוקסיזומים בתאי יונקים. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בגשושים כדי לצבוע פרוקסיזומים בתאים חיים וקבועים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוקסיזומים הם אברונים נפוצים בעלי תפקידים חיוניים בבריאות האדם, ותפקודם הלקוי מוביל למגוון מחלות גנטיות. ההמחשה של פרוקסיזומים היא המפתח לזיהוי תפקוד לקוי של פרוקסיזום; עם זאת, ההתקדמות הוגבלה בשל היעדר גשושים ספציפיים לפרוקסום. על ידי פיתוח PeroxiSPY, גשושים ספציפיים לפרוקסיזום המדמים מטבוליטים טבעיים של פרוקסיזום, אפשרנו זיהוי, מעקב וכימות בזמן אמת של דינמיקת פרוקסיזומים בתאי יונקים חיים. בנוסף, יישומים של טכניקה זו על תאי מטופלים עם הפרעות פרוקסיזום חושפים פנוטיפים פתולוגיים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לזיהוי פרוקסיזומים בתאים יונקים חיים, וכן לזיהוי פרוקסיזומים לאחר צביעה בתאים קבועים. אנו מדגימים כיצד לצבוע פרוקסיזומים בתאים חיים באמצעות גלאים ספציפיים לפרוקסום, תוך התמקדות בהכנת התאים, תזמון ההליך, שחזוריות ופתרון תקלות. גשושים אלו מאפשרות גילוי מהיר, ספציפי ולא רעיל של פרוקסיזומים בתאי חיים חיים, ומציעים שיטה ייחודית וכמותית להערכת תפקוד הפרוקסיזום ותפקודו הלקוי בהפרעות הקשורות לפרוקסיזום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוקסיזום הוא האברון האקריוטי השכיח ביותר, כאשר חלק מהתאים עולים על אלף פרוקסיזומים1. תפקידיהם קריטיים להתפתחות האורגניזמים ולהסתגלות מטבולית 1,2, כפי שניתן לראות במגוון הפרעות פרוקסזום אנושיות, בדרך כלל מצבים נוירודגנרטיביים ונוירומטבוליים חשוכי מרפא בילדים צעירים 3,4. למיטב ידיעתנו, בעבר היו מחסור בשיטות סלקטיביות לסיוג פרוקסיזומים בתאים ורקמות חיים. כלים אלו הם יקרי ערך למחקר וליישומי אבחון, ומאפשרים מדידה ישירה וכמותית של מספר היבטים של היווצרות ותפקוד פרוקסיסטום6. גשושים אלו גמישים מספיק כדי מצד אחד לספק קריאה כמותית של תפקוד פרוקסיזום בתאים, ומצד שני, לשמש בבדיקות יעילות תרגומית או כאבחון להפרעות פרוקסיזום6. צביעת PeroxiSPY היא טכניקה מהירה, ספציפית ולא ציטוטוקסית לזיהוי פרוקסוזום לא פולשני בתאים חיים. כאן אנו מתארים כיצד לצבוע פרוקסיזומים בקווי תאים יונקים באמצעות גשושי פרוקסיזום (הגשושים גם הראו צביעה פרוקסיזומלית ספציפית בעוברי דגי זברה, אך אינם מתאימים לצביעה של פרוקסיזומים בתאי Arabidopsis thaliana בצמח6). ההכתמה יכולה להתבצע בפחות מ-10 דקות. לאחר מכן ניתן לזהות את הגשוש במשך שעות או לתקבע באמצעות פרוטוקול קיבוע פאראפורמלדהיד להמשך צביעת החיסונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צביעת תאים חיים

  1. הכנת תרבית תאים להדמיה של תאים חיים (משך: 24 שעות)
    הערה: המחקר פעל לפי פרוטוקולי גידול תאים סטנדרטיים לכל הניסויים. קווי התאים נשמרו ב-DMEM או DMEM/F12 עבור SH-SY5Y, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. חלק ממערכות ההדמיה רגישות להרכב המדיה. אם המיקרוסקופ מזהה את האות מפנול אדום במדיה, השתמש בחלופות ללא פנולים אדומים. בנוסף, אם המיקרוסקופ אינו מצויד בתא CO2 , החליפו את המדיה במדיה המכילה HEPES (pH 7.4).
    1. יום לפני הניסוי, פיצלו את התאים לפלטת הדמיה עם תחתית זכוכית כדי להגיע למפגש של 30-70% ביום הבא.
      הערה: בפרוטוקול זה השתמשו בלוחות 35 מ"מ עם 4 בארים.
      1. (קריטי) אל תשתמש בתאים רעבים או לחוצים לפיצול לניסוי. ודא שקווי התאים עוברים שינויים חדשים במדיה באופן קבוע (לפחות כל 2-3 ימים) ושהם מפוצלים לפני שהם מגיעים ל-90% מזל. המטרה היא לשמור על קו תאים בריא כדי להבטיח צביעה אחידה.
        הערה: חלק מהתאים, למשל תאי גזע, ידרשו ציפוי זכוכית עם שכבת ציפוי מתאימה, לדוגמה Matrigel, שאינו מפריע לצביעה.
  2. הכנת מערכת ההדמיה (משך: שעה)
    הערה: הדמיית אברונים ודינמיקת האברונים דורשת רזולוציה מרחבית גבוהה. לפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במודול פוטומולטיפלייר GaAsP, תאCO2 ויחידת בקרת טמפרטורה. ההדמיה בוצעה באמצעות מצב סריקה דו-כיווני של גלוונומטר עם מטרה CFI Plan Apo Lambda 60x שמן NA 1.42, ולייזר 561 ננומטר (50 mW) שימש לגשושית 555. השתמש בלייזר 640 ננומטר או מקביל לגלאי 650. פרוקסיזומים הוצגו בקווי תאים אנושיים. זמן הדגירה עם הגשושים עשוי להשתנות בין קווי תאים שונים. מומלץ למקסם את התזמון על ידי הצגת תאים בנקודות זמן שונות לאחר הצביעה (איור 2A).
    1. התחל את מערכת הקונפוקלית. ודאוש-CO2 והטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) יציבים למשך 20 דקות לפני תחילת הצביעה והכנסת התאים למיקרוסקופ.
      הערה: (קריטי) חשוב לוודא שהתאים נשארים בריאים לאורך כל הניסוי באמצעות בדיקה ויזואלית ושה-pH והטמפרטורה של המדיה נשמרים. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש ביחידות בקרה לפרמטרים ובדיקה ויזואלית של צביעת המדיה, אם משתמשים בפנול אדום. לשם כך ניתן להשתמש בבקרי טמפרטורה ו-CO2.
    2. הגדר את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי. הפעל את התוכנה והפעיל את הלייזר 561 ננומטר לצביעת 555 פרוב. כוון את פרמטרי הרכישה והספק הלייזר. פרוטוקול זה משתמש ב-1% הספק לייזר, HV (רווח) של 100, ורזולוציה של 1024-1024 פיקסלים עם 3 זום כדי לצלם את התאים.
  3. צביעת פרוקסיזום (משך: 1-5 דקות)
    1. פיפט עם אליקו של הגשוש לריכוז עבודה סופי של 1 מיקרומון, לדוגמה, עבור 0.5 מ"ל מדיה, פיפטה 0.5 מיקרוליטר של הגשוש.
    2. בחר את הבאר לצביע, ותסמן אותה מבחוץ בעט טוש.
    3. מהבאר שנבחרה, יש להוציא פיפטה את כל (0.5 מ"ל) המדיה ולזרוק אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל את הפרוב אליקו משלב 1.3.1.
      הערה: חשוב להסיר את כל המדיה מהבאר בשלב זה כדי להבטיח צביעה אחידה.
    4. פיפט למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב את המדיה והפרוב. שואף את כל התערובת לתוך הפיפטה.
      הערה: ניתן להשתמש במיקס באמצעות וורטקס במקום פיפטינג.
    5. החזירו את התערובת לבאר שנבחרה טיפה אחר טיפה, כדי לוודא שהפיפטה במגע עם קיר הבאר. לאחר החזרת התערובת לבאר, התחל טיימר של 10 דקות.
    6. סגור את המכסה, הוסיף טיפה של שמן טבילה על המטרה (פרוטוקול זה משתמש ב-60× שמן אובייקטיבי), וממקם את הפלטה על המיקרוסקופ להדמיה.
      הערה: מומלץ למקסם את ריכוז הגלאי לכל קו תאים כדי להבטיח צביעה אחידה. מומלץ לבדוק ב-0.25, 0.5, 1 ו-2 מיקרומטר למשך 5-20 דקות; ריכוזים נמוכים בדרך כלל צובעים עם רקע נמוך יותר (איור 2A). בהתאם לקו התאים ולרגישות הגלאי במיקרוסקופ, ניתן לצלם תאים מוצבעים כבר מ-5 דקות לאחר הוספת הגשוש ועד 24 שעות לאחר ההוספה. במקרים מסוימים, למשל, הדמיית תאי גזע, ניתן לבצע ויזואליזציה של התאים במשך יותר מ-180 דקות לאחר הוספת הגלאי ללא שינוי באות. בכל רגע, ניתן לשנות את המדיה כדי לשטוף את הגלאי. זה יוביל לאובדן הדרגתי של הצביעה תוך כ-30 דקות עבור HEK293T התאים.
  4. הדמיה קונפוקלית של פרוקסיזומים בתאים חיים (משך: 10 דקות-3 שעות)
    1. לאחר שהצלחת ממוקמת על המיקרוסקופ, כוון את המיקוד על התאים בבאר המוכתמת והתחל בהדמיה.
    2. לאחר שהתאים בפוקוס, כוון את הגיין (HV או רגישות הגלאי) ואת הגדרות עוצמת הלייזר באמצעות הנחיות סטנדרטיות להגדרת מיקרוסקופ קונפוקלי.
    3. מצא ומקם (זום-אין) על קבוצת התאים. לאחר המיקוד בתאים, כוון את פרמטרי הרכישה לאיכות התמונה הנדרשת.
      1. הגדר את פרמטרי ההדמיה לרכישת תמונה: 0.5-1% כוח לייזר, 100 HV (רווח) בתוכנת NIS-Elements. בדוק שהתמונה לא רוויה מדי (אם כן, שנו עוצמה ורווח).
      2. בחר את גודל הסריקה. רכוש 1024 תמונות בגודל 1024 פיקסלים, מהירות סריקה (1/2-1/4), ממוצע קו (2), זום (3) המתאים להדמיה המתבצעת.
        הערה: פרוקסיזומים נעים במהלך רכישת התמונה, מה שעלול לגרום ליצירת ארטיפקטים. הפרמטרים המומלצים מותאמים כדי למזער את עקבות התנועה תוך שמירה על איכות מספקת של התמונות לצורך כמות. בעת יצירת טיימ-לפס, ודא שהמרווחים, משך הזמן והלולאות מוגדרים לפני תחילת הווידאו. הגשושים ניתנים לפוטו.
    4. רכוש ושמור את כל התמונות עם תוויות נגישות (כאן, נעשה שימוש בפורמט תוכנה Nikon .nd2 NIS-Elements).

2. צביעת תאים קבועים

  1. הכנת תרבית תאים להדמיה של תאים חיים (משך: 24 שעות)
    הערה: נהלי גידול תאים סטנדרטיים נשמרו בכל הניסויים. תאי Huh7 נשמרו ב-DMEM/F12 עם תוספת של 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2.
    1. יום לפני הניסוי, פצלו את התאים לפלטת עם כיסוי כדי להגיע למפגש של 30-70% ביום הבא.
      הערה: זרעו 50,000 תאים/באר בלוחות עם 12 בארות עם כיסוי 18 מ"מ, או 15,000 תאים/באר בלוחות עם 24 בארות עם כיסוי 13 מ"מ.
  2. צביעת פרוקסיזום (משך: 1-5 דקות)
    1. דילל את הגשוש עם מדיה חדשה לריכוז עבודה סופי של 4 מיקרומום בצינור מיקרוצנטריפוגה רגיש לאור ריק, לדוגמה, עבור 0.5 מ"ל מדיום, פיפטה 2 מיקרוליטר של הגשוש (תמיסה מקורית: 1 מ"מ).
    2. בחר את הבאר לצבוע ותסמן אותה מבחוץ עם עט טוש.
    3. מהבאר שנבחרה, שאפו את כל (0.5 מ"ל) המדיה והחליפו במדיום הגשוש מהשלב 2.2.1. השחרר את מדיום הגשש לתוך הבאר שנבחרה טיפה אחר טיפה, תוך הבטחה שהפיפטה במגע עם קיר הבאר.
    4. לאחר הוספת התערובת חזרה לבאר, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37°C למשך 10-15 דקות.
      הערה: מהרגע הזה, התאים רגישים לאור וצריכים להיות מכוסים בנייר אלומיניום.
  3. קיבוע לאחר צביעה ודימות פרוקסיזומים בתאים קבועים
    1. לאחר הצביעה, הסר בזהירות את המדיום ושוטף את התאים פעמיים עם מלח מפוזר פוספט (PBS).
    2. מרחו תמיסת פאראפורמלדהיד (PFA) של 4% ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    3. הסר בזהירות את ה-PFA למיכל פסולת ייעודי למים. שטוף תאים פעם אחת עם PBS.
      אזהרה: PFA הוא רעיל ויש להיפטר ממנו לפי תקנות מוסדיות.
    4. כדי להמשיך באימונופלואורסצנציה, עקוב אחר השלבים הבאים
      1. הוסף 0.5% טריטון-X (מדולל ב-PBS) כדי לחדיר את התאים. להשאיר ל-2.5 דקות.
      2. הסר בזהירות את טריטון-X. שטוף תאים פעמיים, למשך 10 דקות עם PBS.
      3. חסימו עם תמיסת אלבומין סרום בקר (BSA) של 5% ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר או ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      4. המשך בהליך האימונופלואורסצנציה הסטנדרטי.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גשושי PeroxiSPY מהונדסים לחקות מצעים טבעיים של פרוקסיזומים - חומצות שומן מסועפות וארוכות שרשרתמאוד 5. לכן, הצביעה תגרום לייבוא תלויה באדנוזין טריפוספט (ATP) בתת-משפחת קסטות קשירה D (ABCD) של הגלאיים מהציטופלזמה לפרוקסיזומים 5,6,7. בהתאם למצב המטבולי של התא, העברת ABCD התלויה ב-ATP עשויה לייבא את הגשושים ביעילות ובמהירות, מה שיוביל ליחס פרוקסיזום לציטופלזמה בעוצמת פלואורסצנציה גבוהה (איור 1A). צעדים קריטיים להבטחת יחס גבוה כוללים מניעת רעב תאים על ידי החלפה סדירה של מדיום התאים ואי-גדילה של תאים בקצב גבוה.

כדי לאמת את הספציפיות של צביעת פרוקסיזום, מומלץ לכלול מספר בקרות (איור 1B,C). ניתוח קו-לוקליזציה עם סמן פרוקסיזומלי ייחוס, לדוגמה, סמן ייבוא חלבון - GFP-SKL (איור 1B,C). בנוסף, אם קיימים קווי תאים חסרי פרוקסום, לדוגמה PEX19 KO, הצביעה לא תהיה קיימת בתאים אלה (איור 1B)5,8.

גשושי פרוקסיזום יכולים לשמש למדידת צפיפות פרוקסיזום (איור 1C)5,9, והם מפותחים להערכת ייבוא הסובסטרטים, דינמיקת פרוקסיזום ואינטראקציות. בהדמיה כמותית, חשוב לאחד את תהליך הצביעה, את תזמון רכישת התמונה (למשל, 10-20 דקות לאחר הצביעה), את הכנת קו התאים ואת פרמטרי הרכישה. חלק מקווי התאים דורשים אופטימיזציה של ריכוז הגשוש וכן של התזמון כדי לשפר את עוצמת האות של הפרוקסיזומים ביחס לרקע הציטוזולי, לדוגמה, 250 ננומטר ו-20 דקות עובדים טוב יותר לתאי COS-7 (איור 2A). התאים מטבוליזם את הגשושים, מה שמוביל להפחתה הדרגתית של צביעת פרוקסיזום לאורך זמן; עם זאת, היחס בין פרוקסיזום לציטופלזמה יכול להשתפר במשך 24 שעות (איור 2B). בנוסף, פיתחנו הליך קיבוע שמאפשר צביעה משותפת עם נוגדנים והמחשה של פרוקסיזומים במועד מאוחר יותר (איור 2C,D).

figure-results-1
איור 1: הדמיית תאים חיים של פרוקסוזומים. (א) סכמטיקה של צביעה. (ב) מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאי WT ו-PEX19 KO HEK293T הביטוי יתר על המידה של GFP-SKL וצבוע בגלאי פרוקסיזום אדום (1 מיקרומום למשך 10 דקות). מוטות סולם - 1 מיקרון ו-10 מיקרון. פרופיל העוצמה המייצג מוצג במיוחד. (ג) מיקרוסקופיה קונפוקלית של פיברובלסטים אנושיים המבטאים יתר על המידה GFP-SKL וצבועים ב-PeroxiSPY (1 מיקרומום למשך 10 דקות). מוטות סולם - 1 מיקרון ו-10 מיקרון. פרופיל העוצמה המייצג מוצג במיוחד. (D) מיקרוסקופיה קונפוקלית של SW13 (קורטקס יותרת הכליה), SH-SY5Y (נוירובלסטים), CCL-136 (מיוציטים), HaCat (קרטינוציטים), U2OS (אוסטאובלסטים) ותאי HEK293T (כליות עובריות אנושיות) שנצבעו בגלאי פרוקסיזום אדום (1 מיקרומום למשך 10 דקות). מוטות קנה מידה - 2 מיקרון ו-10 מיקרון. הכימות בוצע באמצעות פיג'י כפי שתוארקודם 9 ומראה את מספר הפרוקסיזומים למיקרון ריבוע, ממוצע ± SEM, N = 100 תאים מאוגדים מ-3 חזרות ביולוגיות, *** - p < 0.001, **** - p < 0.0001, בדיקת Kruskal-Wallis. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אופטימיזציה של הדמיית פרוקסיזום וצביעה של תאים קבועים. (א) מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאי COS-7 (כליית קוף ירוק אפריקאי) שצובעו בחישוש פרוקסיזום אדום בהתאם לפרוטוקול (1 מיקרומום ל-10 דקות; לפני אופטימיזציה) ובתנאים אופטימליים (250 ננומטר ל-20 דקות; לאחר אופטימיזציה). מוט קנה מידה - 10 מיקרון. עוצמת הפיקסל הממוצעת של פרוקסיזומים וציטוזול נמדדה באמצעות פיג'י והובעה כיחס. N = 7 תאים (לפני אופטימיזציה) ו-21 תאים (לאחר אופטימיזציה). ממוצע ± SEM, *** - p < 0.001, **** - p < 0.0001, בדיקת Shapiro-Wilks. (B) מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים HEK293T שצובעו בגלאי פרוקסיזום אדום (1 מיקרומון) למשך 15 דקות ו-24 שעות. כימות מראה עוצמת פלואורסצנציה של פרוקסיזומים וציטופלזמה, וכן יחס פרוקסיזום לציטופלזמה, ממוצע ±SEM, N = 680 פרוקסיזומים שאוגד מ-3 חזרות ביולוגיות, **** - p < 0.0001, בדיקת שפירו-וילקס. (ג) מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאי Huh7 שנצבעו בגשושי פרוקסיזום באמצעות פרוטוקול קיבוע (fixation). פרוקסיזומים צובעו יחד עם נוגדן ראשוני אנטי-PEX14 (1:100 בתמיסת חסימה, חד-פעמי דגירה ב-RT) ונוגדן משני (1:1000 בתמיסת חסימה, Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488, דגירה של שעה ב-RT). מוצגות תמונות קונפוקליות מייצגות. פסי סולם - 10 מיקרומטר. (D) כימות מראה את השינויים בעוצמת הפלואורסצנציה של פרוקסיזום במהלך קיבוע וחדירות שבוצעו על תאי HEK293T בהתאם לפרוטוקול, ממוצע ± SEM, N = 100 תאים שנאספו משלושה חזרות ביולוגיות, **** - p < 0.0001, בדיקת שפירו-וילקס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי פרוקסיזום פשוט זה יכול להתבצע בפחות מ-10 דקות בתאי בעלי חיים. צביעת PeroxiSPY מאפשרת ויזואליזציה, כימות ומעקב אחרי פרוקסיזומים בתאים חיים, וזמינה כאדום (טבלת חומרים) ו-probe5 (טבלת חומרים). הצביעה מספקת המחשה דומה לפרוקסיזום לצביעה קלאסית מבוססת אות פרוקסיזום (PTS1)l10 (איור 1B) ללא צורך בהבעה יתר. הפלואורופורים עמידים לפוטוציה ויכולים לשמש להדמיה סופר-רזולוציה ולרכישת דינמיקת פרוקסיזומים לטווח ארוך בתנאים ניסיוניים שונים 5,9,11. בנוסף, הגשושים רגישים לתפקוד פרוקסוזום; לכן ניתן להשתמש בהם לזיהוי וכימות של פתולוגיית פרוקסיזום5 למחקר וליישומי אבחון. צביעת פרוקסיזום תלויה במטבוליזם של פרוקסיזומים וביכולת של פרוקסיזומים לייבא ולחמצן חומצות שומן. לכן, חשוב למקסם את הריכוז והתזמון של קווי התאים בהם משתמשים. כאן אנו מציגים פרוצדורה סטנדרטית שעובדת עבור קווי התאים שבדקנו; עם זאת, ניתן להאריך את זמן הצביעה ל-24 שעות ללא אובדן יחס עוצמת הפלואורסצנציה בין פרוקסיזום לציטופלזמה (איור 2B).

הגשושים נבדקו בקווי תאים יונקים רבים (איור 1 ואיור 2) ובדגי זברה תאי Danio rerio ועוברים5, והראו ספציפיות לפרוקסומים וקלות שימוש. הגשושים הללו לא נבדקו בקווי תאים בעלי חיים אחרים, והתנאים וריכוזי הגשושים יצטרכו להיות מותאמים עבורם. הגשושים אינם צובעים פרוקסיזומים בתאי ארבידופסיס תליאנה צמחיים5.

חלק מהבעיות והפתרונות שלהן לפתרון תקלות נדונות כאן. אם היחס בין פרוקסיזום לציטופלזמה נמוך מדי (צביעת פרוקסיזום נמוכה), ודא שהתאים מפוצלים טרי ואז מפצל אותם שוב לצביעה. השתמש ב-30-70% קונפלונצ'י לצביעה. אופטימיזציה של ריכוז הגשוש (ריכוז גבוה מדי יגרום לחריגה מיכולת הפרוקסיזום לספוג את הגשושים) ואת התזמון (לדוגמה, ראו איור 2A). השתמש בצלחת זכוכית בגודל 35 מ"מ (צביעה בלוחות עם 96 בארות היא מאתגרת יותר בגלל ערבוב בנפח קטן). ודאו שהגלאים מוסיפים לצינור המיקרוצנטריפוגה ומעורבבים היטב עם המדיה לפני ההוספה לתאים. קווי תאים שונים ותנאים משתנים ישפיעו על הצביעה. לבסוף, שטיפת הגשושית תקטין את הרקע; עם זאת, האות יאבד בהדרגה, מה שיקצר את זמן ההדמיה ביעילות.

אם אין פרוקסיזומים נראים לעין, ודאו שהגשושית עורבבה עם המדיה. הגדילו את ריכוז הגשוש (למשל, ל-2 מיקרומון). הכנס סמן פרוקסיזומלי נוסף כדי להבטיח שניתן לראות פרוקסיזומים להיראות. אם יש שונות בין תאים בצביעה, חשוב להסיר את כל המדיה ולערבב אותה היטב עם האליקווט לפני החזרתה לתאים. זה מבטיח כתמים אחידים. אם עדיין קיימת שונות, ייתכן שאוכלוסיית התאים היא הטרוגנית ביכולת הייבוא של סובסטרט פרוקסיזום. סנכרון תאים באמצעות פיצול סדיר מסייע בצביעה אחידה. אם לא מתגלה אות, בדוק שהגדרות הלייזר במיקרוסקופים תואמות לפרמטרי הגירור/פליטה של הגלאי. אם הרקע מחוץ לתא בהיר מדי, שטוף את הגשושים כדי להסיר את הרקע הזה; עם זאת, האות יאבד בהדרגה, מה שמקצר את חלון הזמן שבו ניתן לבצע הדמיה ביעילות. בנוסף, ניתן להשתמש בקיבוע כדי להפחית את הרקע. אם האות לאחר הקיבוע חלש מאוד, בדוק אם האות אובד לאחר הוספת Triton-X 100. שלב זה יכול להיות מותאם או מוסר בהתאם ליישום במורד הזרם. הפחת את שלבי הכביסה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LR מחזיקה במניות של Spirochrome AG. לכל שאר הסופרים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למרכז הדמיה ומיקרוסקופיה של בית הספר למדעי החיים (IMC) על מתן גישה לציוד חיוני. TA מומן על ידי מלגת HFSP לטווח ארוך (LT000559/2021-L), אוניברסיטת סאות'המפטון, מענק החדשנות למחקר רפואי של וסקס, והאגודה האירופית ללוקודיסטרופיה (ELA). התואר השני נתמך על ידי תוכנית ELISIR של בית הספר למדעי החיים של EPFL, קרן ברין טרנר-סמואלס, וקרן ביוגרפיה לצורך מחקר. CH מומן על ידי מלגת הסטודנט הקיץ של החברה המלכותית למיקרוסקופ. REC נתמכת על ידי מלגת גילוי של מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי החיים (BB/Z514767/1). MSvA נתמך על ידי מלגת חופשת קיץ של אגודת הביוכימיה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן אנטי-PEX14פרויטנטק10594-1-AP
מיקרוסקופ קונפוקליניקוןA1rכל מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרת NA גבוהה, למשל 60x שמן NA1.4
DMEMפאן ביוטק  P04-03590מדיה לתרבות תאים
לוחות הדמיה עם תחתית זכוכיתסלביסD35C4-20-1.5-N
עזים נגד ארנב אלקסה פלואר 488 ABCAMab150081
HEK293TATCCCRL-3216 
PeroxiSPY555ספירוכרוםhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650ספירוכרוםhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kassmann, C. M. Myelin peroxisomes - essential organelles for the maintenance of white matter in the nervous system. Biochimie. 98, 111-118 (2014).
  2. van den Bosch, H., Schutgens, R. B., Wanders, R. J., Tager, J. M. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem. 61, 157-197 (1992).
  3. Aubourg, P., Wanders, R. Peroxisomal disorders. Handb Clin Neurol. 113, 1593-1609 (2013).
  4. Honsho, M., Okumoto, K., Tamura, S., Fujiki, Y. Peroxisome biogenesis disorders. Adv Exp Med Biol. 1299, 45-54 (2020).
  5. Korotkova, D., et al. Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes. Nat Commun. 15, 4314(2024).
  6. Bezman, L., Moser, H. W. Incidence of X-linked adrenoleukodystrophy and the relative frequency of its phenotypes. Am J Med Genet. 76 (5), 415-419 (1998).
  7. Visser, W. F., van Roermund, C. W., Ijlst, L., Waterham, H. R., Wanders, R. J. Metabolite transport across the peroxisomal membrane. Biochem J. 401 (2), 365-375 (2007).
  8. Matsuzono, Y., et al. Human PEX19: cDNA cloning by functional complementation, mutation analysis in a patient with Zellweger syndrome, and potential role in peroxisomal membrane assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2116-2121 (1999).
  9. Borisyuk, A., Howman, C., Pattabiraman, S., Kaganovich, D., Amen, T. Protein Kinase C promotes peroxisome biogenesis and peroxisome-endoplasmic reticulum interaction. J Cell Biol. 224 (9), e202505040(2025).
  10. Gould, S. G., Keller, G. A., Subramani, S. Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase. J Cell Biol. 105 (6 Pt 2), 2923-2931 (1987).
  11. Lukinavicius, G., et al. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem. 5 (2), 132-139 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים