הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מידול מקרופאגים הקשורים לגידול במבחנה: תפקיד הגורמים המופרשים בדינמיקת מיקרו-סביבה של הגידול

446 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69406

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול חוץ-גופי ליצירת תאים דמויי מקרופאג' הקשורים לגידול, על ידי חשיפת מונוציטים אנושיים למדיה מותנית מקווי תאי הגידול.

תקציר

המאקרופאגים מפגינים פלסטיות יוצאת דופן, המאפשרת להם לרכוש מצבים פונקציונליים מובחנים בתגובה למגוון רמזים סביבתיים. בגידולים מוצקים, הם מהווים לעיתים קרובות את אוכלוסיית תאי החיסון הנפוצים ביותר במיקרו-סביבת הגידול, שם הם מכונים מקרופאגים קשורים לגידול (TAMs). TAMs מתקשרים באופן הדוק עם תאים ממאירים, ומקדמים באופן פעיל התקדמות גידול, אנגיוגנזה והתחמקות חיסונית. תאי גידול יכולים לתכנת מחדש מקרופאגים דרך מגע ישיר עם תאים ומגוון רחב של גורמים מופרשים, ולעצב את הקיטוב שלהם לכיוון פנוטיפים פרו-גידוליים. כדי לחקור את מנגנוני הקיטוב של TAM במבחנה, אנו מציעים שיטה החושפת מונוציטים אנושיים לגורמים מסיסים הנמצאים במדיה מותאמת לקו תאי הגידול. פרוטוקול זה מאפשר יצירת מקרופאגים דמויי TAM בתנאים מבוקרים, ומקל על ניתוח שינויים פנוטיפיים ותפקודיים הנגרמים על ידי אותות שמקורם בגידול. הגישה שלנו מציעה מודל שחזורי ורלוונטי פיזיולוגית לחקר אינטראקציות בין גידול למאקרופאג', מעמיקה את ההבנה שלנו בתכנות מחדש של מקרופאגים, ותומכת במחקר באסטרטגיות טיפוליות חדשות באימונולוגיה של סרטן ואימונותרפיה.

מבוא

מקרופאגים הם תאי חיסון מולדים רב-תכליתיים שהפלסטיות המרשימה שלהם מאפשרת להם לאמץ פנוטיפים מגוונים בתגובה לסימניםסביבתיים 1. בתוך גידולים מוצקים, המאקרופאגים הופכים לעיתים קרובות לאוכלוסיית תאי החיסון הנפוצים ביותר ומתמיינים למאקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs)2. תאים אלו מתוכנתים מחדש באופן פעיל על ידי מיקרו-סביבת הגידול כדי לתמוך בצמיחת הגידול, לקדם אנגיוגנזה, להקל על גרורות ולדכא תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות יעילות. תאי הגידול מניעים קיטוב זה הן באמצעות אינטראקציות ישירות בין תאים והן באמצעות רפרטואר מורכב של גורמים מופרשים, כולל ציטוקינים, כימוקינים וגורמי גדילה, המעצבים מחדש תוכניות שעתוק ופונקציונליות של מקרופאגים3. אינטראקציה דינמית זו מהווה את הבסיס לתפקיד המרכזי של TAMs בביולוגיה של הסרטן ומדגישה את הפלסטיות של המקרופאגים כאתגר והזדמנות להתערבות טיפולית2.

הרלוונטיות הקלינית של TAM מוכרת יותר ויותר: שפע הגידולים שלהם לעיתים קרובות קשור לתחזית לקויה ועמידות לטיפולים 4,5. כתוצאה מכך, TAMs6 הפכו למטרות טיפוליות אטרקטיביות. אסטרטגיות שמטרתן לחסום את גיוסם, לעכב את הישרדותם, או לתכנת אותם מחדש לכיוון פנוטיפים דלקתיים וגידוליים נמצאות כעת בבדיקה6. הבנת המנגנונים שבאמצעותם גורמים שמקורם בגידול מקטבים את המאקרופאגים ל-TAMs היא חיונית לפיתוח אימונותרפיות יעילות. בעוד שחסימת נקודות ביקורת חיסונית הראתה הצלחה רבה בסרטן רבים, יעילותו מוגבלת באחרים7. שילוב טיפולים ממוקדים בתאי T, כגון נוגדנים נגד חלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD-1) או אנטי-מתוכנת ליגנד מוות תאי 1 (PDL-1), עם אסטרטגיות תכנות מחדש של מקרופאגים, עשוי לשפר את התגובה החיסונית הכוללת לאנטי-גידול.

מודלים ניסיוניים מסורתיים לחקר ביולוגיית TAM כללו מודלים של סרטן עכברים ב-vivo, המציעים סביבה מורכבת ופיזיולוגית רלוונטית8. מודלים אלו סיפקו תובנות יסודיות לגבי גיוס ותפקוד TAM. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין מינים באיתות חיסוני, ביולוגיה של גידול ואונטוגניה של המאקרופאגים יכולים להגביל תרגום ישיר למחלה אנושית 9,10. יתרה מזאת, המורכבות של מערכות in vivo מקשה על בידוד ומחקר מסלולי איתות ספציפיים או אירועים מולקולריים שמניעים קיטוב של מקרופאגים.

לעומת זאת, מודלים במבחנה מציעים תנאים פשוטים ומבוקרים יותר לניתוח מנגנונים אלו. הגישה הנפוצה ביותר כוללת קיטוב של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים עם גירויים מוגדרים: אינטרפרון גמא (IFN) וליפופוליסכריד חיידקי (LPS) ליצירת מקרופאגים פרו-דלקתיים (M1), או אינטרלוקין 4 (IL-4) ואינטרלוקין 10 (IL-10), או דקסמתזון להשגת תת-סוגים שונים של מקרופאגים אנטי-דלקתיים (M2) 11,12,13,14 . מודלים אלו סייעו לזהות סמנים מולקולריים ותוכניות שעתוק הקשורות למצבי קיטוב מקרופאגים קנוניים. עם זאת, הם לא מצליחים לשחזר את הסביבה המורכבת ורב-הגורמית שמאקרופאגים נתקלים בה בתוך גידולים, שבה הקיטוב נובע מהשפעה סימולטנית של מתווכים מסיסים רבים, אותות מטבוליים ואינטראקציות תא-תא15,16. למרות שהסיווג הקלאסי של M1/M2 נותר שימושי לתיאור מצבים פונקציונליים של מקרופאגים, כעת ברור שקיימות אוכלוסיות מקרופאגים רבות יותר ממה שחשבו בעבר. עבודת קבוצת ד"ר ג'ינהו ואחרים, תוך שימוש בגישות טרנסקריפטומיות חד-תאיות, הראתה את המגוון הרחב של תת-קבוצות מקרופאגים שנמצאות הן בתנאים פיזיולוגיים והן במחלות17,18. דבר זה מדגיש ש-TAMs, אף שלעיתים מתוארים כדומים לפרופילים דמויי M2, אינם שווים במדויק למקרופאגים המובחנים אך ורק באמצעות ציטוקינים קנוניים; במקום זאת, הם חולקים תכונות מסוימות אך גם מציגים הבדלים מובחנים ותלויי הקשר.

כדי לגשר על הפער הזה, אנו מציגים פרוטוקול במבחנה שמדגם קיטוב דמוי TAM על ידי חשיפת מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים למדיה מותנית שנאספה מקווי תאי גידול. שיטה זו לוכדת את השפעת הסקרטום של הגידול, תערובת עשירה של ציטוקינים, כימוקינים וגורמי גדילה המופרשים על ידי תאי סרטן. כך היא מציעה מערכת רלוונטית ונגישה ניסיונית לחקירת התכנות מחדש הפנוטיפי והשעתוק של מקרופאגים בתגובה לגורמים מסיסים שמקורם בגידולים. בניגוד לגישות קודמות שבהן מונוציטים נחשפו ישירות למדיה מותאמת גידול, פרוטוקול זה מתמקד במיוחד בתכנות מחדש של המאקרופאגים, ובכך משקף טוב יותר את התנהגות המקרופאגים התושבים בתוך מיקרו-סביבת הגידול19,20. בנוסף, הוא משלב פאנל אופטימלי ופשוט של סימני משטח להערכת קיטוב המאקרופאגים באמצעות ציטומטריית זרימה, שקל ליישם וניתן להרחיב אותו בהתאם לצרכי החוקר14,21. לבסוף, מאחר ש-M-CSF הוכח כמוביל מונוציטים לפנוטיפ דמוי M2 10,15,22,23,24, השמטנו אותו במכוון כדי להבטיח שכל קיטוב מקרופאג' שנצפה ייגרם במיוחד מחשיפה למדיה מותנית שמקורם בקו תאי הגידול.

לגישה זו יש מספר יתרונות: היא שומרת על השחזוריות והפשטות של מערכות במבחנה, משתמשת בתאים אנושיים ראשוניים לרלוונטיות תרגומית גבוהה יותר, ומשקפת טוב יותר את האופי ההטרוגני והרב-גורמי של מיקרוסביבת הגידול מאשר מודלים חד-ציטוקינים 25,26,27,28. יתרה מזאת, הוא מסייע במחקרים השוואתיים של תגובות מקרופאגים למדיה מותנית מסוגי גידולים שונים או תאי סרטן שעברו שינוי גנטי, ומשמש כפלטפורמה לבדיקת גורמים פרמקולוגיים שעשויים לשנות את קיטוב TAM. מעבר ליישום הכללי שלה, ניתן להתאים שיטה זו למודלים שונים של גידולים על ידי בחירת קווי תאים מתאימים או התאמת יחס המדיה המותנית. עם זאת, המשתמשים צריכים להיות מודעים לכך ששונות בין תורמים בריאים וקווי תאי גידול עשויה להשפיע על השחזור, מה שמדגיש את חשיבות התכנון והסטנדרטיזציה המדויקים של ניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות דם היקפיות נאספו מתורמים בריאים לאחר הסכמה מדעת, בהתאם להצהרת הלסינקי. פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של אוניברסיטת בואנוס איירס. ראו את טבלת החומרים לפרטים על כל החומרים והמגיבים המשמשים בפרוטוקול זה.

הערה: שמרו על תנאים סטריליים לאורך כל הפרוטוקול, תוך עבודה בארון בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2), והבטחו את עמידות התאים >90%. לצורך השלכה, כל הפסולת הביולוגית חייבת להיות מזוהמת תחילה על ידי השרייה בתמיסת נתרן היפוכלוריט 10% למשך לפחות 30 דקות, ולאחר מכן להניח במיכל הטיפול הביולוגי המתאים.

1. תרבית קו התאים של הגידול והכנת מדיה מותנית

  1. הפשרה של קו התאים MDA-MB-231 השלילי המשולש של סרטן השד האנושי (או גידול נבחר אחר) מאחסון חנקן נוזלי. טבלו מיד צינורות קירור המכילים קווי תאים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וסובבו בעדינות את הבקבוקון כדי להבטיח הפשרה מהירה ואחידה. הסר את הבקבוקון מיד כשהוא כמעט הפשר.
  2. העבר את התאים המופשרים לצינור צנטריפוגציה בנפח 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מלח סטרילי עם בופר פוספט (PBS). צנטריפוגה את מתלי התא ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: תהליך ההפשרה חייב להתבצע במהירות כדי לשמור על חיוניות התאים.
  3. השליכו בזהירות את הסופרנטנט והחזירו במהירות את כדור התא ל-1 מ"ל של מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) המכיל גלוקוז גבוה (4.5 גרם לליטר) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 4 מ"מ גלוטמין ו-1 מ"מ פירובט נתרן (1 מ"מ). ספירת התאים בכדור התלוי מחדש, תוך ביצוע דילול סדרתי דו-שלבי הבא:
    1. ראשית, הכינו דילול תלייה של תאים ביחס 1:5 במדיום DMEM סטרילי ואז (1:2) עם כתם היתכנות Trypan Blue כדי לקבל דילול סופי של 1:10.
    2. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לספור את התאים הבריאים בתוך ההמוציטומטר של נויבאואר (או תא הספירה). ספירת תאים ברי קיימא (רק תאים שמוציאים את הצבע הכחול) וקבעה את מספר התאים הבריים הממוצע לכל ריבוע פינה גדול.
    3. חשב את הריכוז הסופי באמצעות הנוסחה הבאה: תאים/מ"ל = (ממוצע תאים לריבוע) x (מקדם דילול) x 10,000.
      הערה: החזירו את התאים בנפח רצוי של מדיום DMEM מלא כדי לקבל ריכוז סופי של 1x105תאים/מ"ל.
  4. זרעים בגודל 2.5 x10 עד 5.0 x 105 תאים לתוך בקבוק תרבית T25 המכיל 5 מ"ל של מדיום DMEM מלא. שמרו על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5%CO2 עד להגעה לצפיפות התאים הנדרשת לקציר.
  5. למחרת אחרי הזריעה, בדוק את חיבור התאים תחת מיקרוסקופ. אם יותר מ-50% מהתאים צפים (מה שמעיד על מוות תאים), שאפו בעדינות את המדיום הישן והחליפו ב-2.5 מ"ל של מדיום טרי ומחומם מראש.
  6. עקוב אחרי גדילה יומיומית. כאשר התרבית מגיעה לכ-90% מפגש (כ-2.3 x10 6 תאים בבקבוק T25), בדרך כלל בתוך 5 ימים, התאים מוכנים לתרבית תת-(פיצול). כדי לחלק את התאים ביחס של 1:8, יש לעקוב אחר השלבים הבאים:
    1. הסירו את המדיום המשומש באמצעות פיפטת פסטר סטרילית.
    2. שטוף את שכבת התא פעם אחת עם 3 מ"ל של 1x PBS סטרילי כדי להסיר סרום שאריתי, שמעכב טריפסין. שאיפת וזרקה של 1x PBS.
    3. הוסיפו לתאים 1 מ"ל של 0.25% טריפסין - 1 מ"מ חומצה אטילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 על אינקובטור לח למשך 3 דקות לניתוק התאים.
      הערה: זמן הדגירה האופטימלי עם טריפסין/EDTA תלוי בקו התאים הספציפי וייתכן שיש להזדקק לכוונתו. בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ אחרי 3 דקות כדי לוודא שהם מנותקים לחלוטין.
    4. לנטרל את הפעילות האנזימטית על ידי הוספת 3 מ"ל של תווך DMEM מלא. מיד לאחר מכן, הפיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי להתנתק לחלוטין ולהשקיע את התאים.
  7. העבר 3.5 מ"ל מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב-400 x g ב-RT.
  8. הסר בזהירות את הסופרנטנט ותשהה מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מדיום הקפאה (שחייב להכיל 90% FBS ועוד 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). העבר וחילק את תליית התא לקריוביאלים, תוך הבטחת ריכוז של 5 x 10תאים לכל צינור לשימוש עתידי.
    1. ההקפאה צריכה להיות מקוררת בהדרגה על ידי הכנסת הקריוביאלים למיכל Mr. Frosty (או מיכל הקפאה בקצב מבוקר). העבר את המיכל למקפיא בטמפרטורה של -80°C והשאיר את התאים להקפיא ללילה. ניתן לשמור תאים בטמפרטורה של -80°C למשך מספר ימים, אך לאחר מכן יש להעביר אותם לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
      הערה: שמרו תיעוד מפורט של מעברי תאים והשתמשו בקטעים מוקדמים לניסויים. מומלץ להשתמש בתאים עם פחות מ-20 מעברים.
  9. כאשר תרביות חדשות מגיעות שוב ל-~90% מפגש גוף, שואפים ואוספים סופרנטנט לתוך צינור קוני בקוטר 15 מ"ל. אם ברצונך לשמור על התרבות מתמשכת, החלף את הכרך שנאסף במדיה DMEM מלאה וחדשה.
    1. צנטריפוגה את הסופרנטנט שנאסף ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לפרוק ולהסיר פסולת תאית. שמור על הסופרנטנט (המדיה המותנית המובהרת), וזרוק את הכדור.
  10. מחלקים את המדיה המובהקת לחלקים של 1 מ"ל, מתייגים את השפופרות, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    הערה: לצורך בקרת איכות, תמיד שמרו תיעוד של תאריך איסוף המדיה המותנה והאם האליקווט הופשרה בעבר. מומלץ בחום להימנע מהפשרת אותו אליקו יותר מפעמיים. בנוסף, השתמש במכשיר המותאם בתוך חודש ממועד ההקפאה כדי להבטיח את פעילותו האופטימלית.

2. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs)

הערה: PBMCs מבודדים מתוך 40 מ"ל דם היקפי שנוגד קרישה עם 3.8% נתרן ציטראט. הבידוד מתבצע באמצעות גרדיאנט צפיפות Ficoll-Hypaque (1077) וצנטריפוגה. כל הפרוטוקול הזה חייב להתבצע בתנאים סטריליים בארון BSL2.

  1. העבירו את דגימת הדם ההיקפית הנוגדת קרישה לצינור קוני של 15 מ"ל או 50 מ"ל לפני שלב הצנטריפוגה.
  2. דגימות דם בצנטריפוגה במהירות נמוכה, 200 × גרם למשך 15 דקות ב-RT להפרדת רכיבי הדם. תהליך זה מניב פלזמה עשירה בטסיות (PRP) כשכבה העליונה והחלק התאית (תאי דם אדומים ולבנים) מתחת. השתמש בהגדרת צנטריפוגה של האצה: 4 והאטה: 2, כאשר המקסימום הוא 5.
  3. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף את הסופרנטנט (החלק העליון), שהוא ה-PRP, ולהעביר אותו לצינור סטרילי חדש.
    הערה: אם יש צורך בניסויים במורד הזרם, ניתן לצנטריפוגה שוב את ה-PRP שנאסף ב-600 × גרם ב-RT למשך 10 דקות (תאוצה והאטה מקסימליים) כדי להסיר את הטסיות, ולאחסן את הפלזמה ללא טסיות בטמפרטורה של -20°C לבדיקות נוספות.
  4. החלק התחתון התאי שהתקבל מהצנטריפוגה הראשונית בשלב 2 צריך להיות מדולל בעדינות לנפח סופי של 2 עד 3 פעמים באמצעות PBS 1x PBS סטרילי בטמפרטורת החדר. הומוגניזציה רכה על ידי היפוך המתלה המתקבל והשתמשו בו לצנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות Ficoll-Hypaque.
  5. שפוך 15 מ"ל של Ficoll-Hypaque בטמפרטורת החדר לצינור סטרילי של 50 מ"ל.
  6. בזהירות ובאיטיות שכבת 30 מ"ל דם מדולל מעל ה-Ficoll-Hypaque, כדי לוודא ששני הפאזות לא יתערבבו.
  7. צנטריפוגה את צינור שכבת דם Ficoll למשך 25 דקות ב-600 × g ב-RT. כוון את הצנטריפוגה ללא בלם (תאוצה: 1; האטה: 0).
  8. השתמש בפיפטה סטרילית של פסטר כדי להשליך לפחות 4 מ"ל מהחלק העליון שהתקבל כדי למנוע שפיכה. לאחר מכן משתמשים באותה פיפטה כדי לשחזר את הטבעת הלבנה המכילה את ה-PBMCs שנוצרת בין השבר העליון לשבר השקוף Ficoll-Hypaque. הימנעו מאיסוף Ficoll עם טבעת PBMC.
  9. העבר את טבעת ה-PBMC מהצינור לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל עם לפחות 3 מ"ל של 1x PBS.
  10. מלא את צינור ה-15 מ"ל בעוד 1x PBS וצנטריפוגה ב-600 × גרם (תאוצה והאטה מקסימליים) למשך 10 דקות ב-RT.
  11. הסר את הסופרנטנט על ידי היפוך, מלא שוב ב-1x PBS, וצנטריפוגה ב-600 × גרם (תאוצה והאטה מקסימליים) למשך 10 דקות ב-RT.
  12. הסר את הסופרנטנט והחזיר את כדור ה-PBMC ל-2 עד 3 מ"ל סטרילי של 1x PBS ועוד 2% FBS מושבת חום (1x PBS-2% FBS), ואז העלה את הנפח ל-10 מ"ל. סופרים את התאים, מכינים תלייה תאית ביחס 1:5 מדולל ב-PBS קר סטרילי 1x ואז (1:2) ב-0.4% Trypan Blue כדי לקבל דילול סופי של 1:10. השתמש בתא תא על מיקרוסקופ אור כפי שמתואר בשלב 1.3.2 לספירה.
  13. סובב את מתלה ה-PBMC ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 8-10 מעלות צלזיוס. החזירו את התאים בנפח סטרילי וקר של 1x PBS-2% FBS כדי לקבל ריכוז סופי של 108 תאים/מ"ל. השאירו את התאים האלה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא.
    הערה: בשלב זה, PBMCs שנאספו יכולים להיות מוקפאים בבקבוקון קריוגני ב-108 תאים/מ"ל במדיה מקפיאה (90% FBS-10% DMSO). אחסן בטמפרטורה של מינוס 80°C במיכל Mr. Frosty למשך הלילה כדי לאפשר לתאים לקפוא לאט. למחרת, העבר את התאים לתיבת אחסון והשאיר אותם בטמפרטורה של -80°C לכמה ימים או העבר למיכל חנקן נוזלי לתקופת אחסון ארוכה או המשך בפרוטוקול.

3. מיון מונוציטים CD14+ באמצעות חרוזים מגנטיים

הערה: מונוציטים מטוהרים של CD14+ מתקבלים מ-PBMC באמצעות ערכת מיון מגנטית עם ברירה חיובית CD14+ אנושית11. אחוז התאים CD14+ ב-PBMC תלוי בתורם אך ניתן להעריך אותו ב-10% (נע בין 5-20%). התאימו את מספר ה-PBMC ההתחלתי ואת נפחי התגובה הסופיים בהתאם למספר המונוציטים הנדרש לניסוי שלכם. נפח התגובה המינימלי המומלץ הוא 100 מיקרוליטר, גם כאשר מעבדים פחות מ-1 ×10 7 PBMC.

  1. הוסף 10 מיקרולטר מקוקטייל הבחירה החיובית לכל 100 מיקרוליטר של PBMCs, הפיפט למעלה ולמטה, והשאיר על הקרח למשך 15 דקות.
  2. מתלה החרוזים ל-Vortex למשך 30 שניות לפני השימוש. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מהחרוזים לכל 100 מיקרוליטר של מתלה PBMC. מערבבים היטב ודגרו 15 דקות על הקרח.
  3. הוסף 1x PBS - 2% FBS - 1 mM EDTA לנפח סופי של 2.5 מ"ל, ערבב בעדינות את המתלה והכנס את הצינור למגנט ודגרה במשך 5 דקות.
  4. הפוך את המגנט (בלי להסיר את הצינור) מעל צינור מקבל שנזרק למשך 2-3 שניות, כדי למנוע תנועה של רעידות. תאים חיוביים יישארו בתוך הצינור.
  5. הוצא את הצינור מהמגנט והוסיף 1x PBS - 2% FBS -1 mM EDTA מעל דפנות הצינור עד לנפח סופי של 2.5 מ"ל.
  6. הכנס את הצינור שוב למגנט ודגרה במשך 5 דקות.
  7. הפוך את המגנט (בלי להסיר את הצינור) מעל צינור מקבל שנזרק למשך 2-3 שניות, כדי למנוע תנועה של רעידות. הוצא את הצינור מהמגנט והוסף 3 מ"ל של 1x PBS-2% FBS מעל דפנות הצינור כדי לשחזר את כל התאים.
  8. קחו 10 מיקרוליטר כדי לספור את מספר תאי CD14+ בתא נויבאואר באמצעות מיקרוסקופ אור. מדלל עם Trypan Blue 1:2.
    הערה: חשב את מספר התאים לפי המשוואה הזו: מספר תאי CD14+ = מספר תאים חיים לכל רבע x מקדם דילול כפול 10.000.
  9. הניחו את מתלה תא CD14+ בצינור סטרילי חדש בנפח 15 מ"ל ושוטפים את התאים על ידי צנטריפוגה ב-600 × גרם (תאוצה והאטה מקסימליים) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. החזירו את תאי CD14+ עם מדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) בנפח נוח כדי לקבל 2.5 x 106 תאים למ"ל לשלב הבא, בהתחשב במספר התאים שנקבל.
    הערה: שמור על המונוציטים של CD14+ על קרח עד לשלב הבא כדי להימנע מהיצמדות של תאים אלה לדופן הצינור הפלסטי.

4. התמיינות של מקרופאגים

  1. מונוציטים CD14+ טוהר בצלחת בגודל 2.5 על 105 תאים תלויים ב-250 מיקרוליטר של מדיום RPMI מלא (10% FBS-1% PS) בכל באר בלוח מטופל עם 48 בארות.
    הערה: ניתן לעשות זאת גם עם חצי ממספר התאים בצלחת מטופלת היטב עם 96 תאים.
  2. הוסף מים סטריליים לבארות הריקות שמסביב כדי להפחית את האידוי במהלך דגירה של הצלחות.
  3. דגרו תאים למשך 5 ימים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ באינקובטור לח ללא הפרעה, תוך ניטור יומי למורפולוגיה, התמיינות ויכולת השריות.
    הערה: בעוד שניתן להוסיף M-CSF (25 ng/mL) לצורך התמיינות, אנו מאשרים שהפרוטוקול שלנו משתמש ב-10% FBS איכותיים בלבד כדי לקבל מקרופאגים M0 לאחר חמישה ימי תרבית. אנו ממליצים במיוחד להימנע מ-M-CSF בשל הפוטנציאל שלו לקדם מונוציטים לכיוון פנוטיפ דמוי M210,22.

5. חשיפה של מקרופאגים למדיה מותנית וניתוח

  1. ביום החמישי של ההתמיינות, הסר בעדינות 50% (125 מיקרוליטר) מהמדיום מכל באר והחלף באחד מהם:
    1. 125 מיקרוליטר של מדיום מלא טרי RPMI (בקרה),
    2. 125 מיקרוליטר של מדיה מותנית בקו תאי הגידול (למשל, מ-MDA-MB-231), או
    3. 125 מיקרוליטר של מדיום מלא DMEM (בקרה למדיה מותנית).
      הערה: לאופטימיזציה ראשונית עם קווי תאי גידול חדשים, יש לבדוק טווח ריכוזי מדיה מותנים (למשל, 10%, 25% ו-50%). טווח זה מומלץ להבטחת חיוניות ושינויים בהתמיינות. בחר את הריכוז הגבוה יותר של מדיום מותנה שמראה חיוניות גבוהה של מקרופאגים.
  2. המשך דגירה עד היום השביעי.
    הערה: ביום החמישי מתקבלים מקרופאגים M0, ואז עוד יומיים של תרבית בנוכחות מדיום מותנה מספיקים כדי לעורר ביטוי של סימני קיטוב פני השטח. סמני פני הקיטוב נקבעים על ידי ציטומטריית זרימה, בדומה לכך, כאשר משתמשים בציטוקינים סטנדרטיים ליצירת מקרופאגים M1 או M211,14.
  3. העריכו את החיוניות והמורפולוגיה של המאקרופאגים תחת מיקרוסקופ מדי יום.
    הערה: יש לעקוב אחרי התבדלות בין המקרופאגים מדי יום במהלך תקופת התרביות של 7 ימים. היצמדות תאית משמשת כאינדיקטור לתרבית בריאה וברת קיימא. אחוז גבוה יותר של תאי פוזיפורם מעיד על התמיינות וקיטוב מוגברים בקבוצת הטיפול במדיה המותנית (CM), כפי שמוצג באיור 2.

6. איסוף מקרופאגים להערכת סמני קיטוב באמצעות ציטומטריית זרימה

הערה: באופן אופציונלי, כדי להרחיב עוד יותר את אפיון הפנוטיפ של מקרופאגים הקשורים לגידולים, יש לבודד RNA למדידת ביטוי גנים הקשורים לקיטוב (למשל, TGM2, IRF-4 ו-CXCL10) באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) או איסוף סופרנטנטים של תרבית למדידת ייצור ציטוקינים קנוני (כגון TNFα, IL-6 ו-IL-10) באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים (ELISA) כפי שדווח על ידי קבוצת11 שלנו, 14.

  1. יש להשליך על ידי שאיפה עדינה עם פיפט פסטר סטרילי או קצה נפח המדיום הכולל של כל באר ולהוסיף 200 מיקרוליטר של בופר EDTA קר של 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA לאיסוף תאים.
  2. דגרו 10 עד 15 דקות על קרח ואז הוסיפו 200 מיקרוליטר של 1x PBS-2% FBS כדי לדלל את בופר ה-EDA. אסוף את המקרופאגים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה (עדיין על קרח) למשך 5 דקות נוספות עד שכל התאים מתנתקים.
    הערה: שלב זה חיוני להשגת מספר טוב של מקרופאגים ברי קיימא. חשוב לא להאריך את זמן החשיפה של EDTA יותר מהמומלץ כדי לשמור על חיוניות התאים. בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ לאחר סיום ההליך כדי לוודא שהם מנותקים לחלוטין.
  3. אספו מקרופאג'ים על מיקרוצינור בנפח 1.5 מ"ל ושטפו אותם עם 1 מ"ל של 1x PBS-2% FBS בצנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 8-10 מעלות צלזיוס.
  4. תלה מחדש את כדור המקרופאגים עם 200 מיקרוליטר של 1x PBS-5% FBS והעבר אותם למיקרופלטה עגולה עם 96 בארות לחסימה לא ספציפית ב-RT למשך 15 דקות. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 8-10 מעלות צלזיוס.
  5. השליך את הסופרנטנט על ידי הפיכת הלוחית במהירות.
  6. הכינו את הקוקטייל המתאים של נוגדנים מצומדים ישירות ב-1x PBS - 2% FBS תוך שימוש בפקטור דילול של 1:50 לכל נוגדן. צבעו כל דגימה ב-50 מיקרו-ליטר של קוקטייל הנוגדנים ודגרו במשך 30 דקות בחושך על קרח.
    הערה: קוקטייל נוגדנים: CD11b-PE/Cy7 (200 מיקרוגרם/מ"ל), CD64-AlexaFluor 647 (150 מיקרוגרם/מ"ל), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 מיקרוגרם/מ"ליטר), HLADR-PE (40 מיקרוגרם/מ"ל) ו-CD206-אלקסה פלור 488 (400 מיקרוגרם/מ"ל). ריכוז נוגדנים מוקדם מופיע בטבלה 1; מספרי קטלוג ניתן למצוא בטבלת החומרים.
  7. שטוף את המקרופאגים המוכתמים על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של 1x PBS וצנטריפוגט ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 8-10 מעלות צלזיוס.
  8. השליך את הסופרנטנט על ידי הפיכת הלוחית במהירות.
  9. כדי למדוד את חיוניות התאים, הוסף 100 מיקרו-ליטר מהצבע החיוני שניתן לתיקון Zombie Violet (1:1,000 ב-1x PBS) ולדגור בחושך למשך 30 דקות על הקרח.
  10. שטוף את התאים המוכתמים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 1x PBS וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 8-10 מעלות צלזיוס. חזור על תהליך הכביסה עם 200 מיקרוליטר של 1x PBS.
  11. תיקון על ידי החזרת כדור התא עם 20 מיקרו ליטר של פרפורמלדהיד טרי מוכן 1% ודגירה למשך 20 דקות על קרח ובחושך.
    הערה: 1% פאראפורמלדהיד שימש לקיבוע ללא חדירה. אופציונלי: הרכיב הקיבועי המסחרי (מערכת הפרמיאביליזציה של BD) יכול לשמש גם לשלב11 זה.
  12. שטיפו תאים על ידי הוספת 180 מיקרוליטר של 1x PBS-2% FBS וצנטריפוגה ב-400 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 8-10 מעלות צלזיוס. חזור על תהליך הכביסה עם 200 מיקרוליטר של 1x PBS-2% FBS.
  13. השליכו את הסופרנטנט על ידי היפוך לוח והחזירו את הכדור ל-200 מיקרוליטר של 1x PBS כדי לעבור לציוד ציטומטריית הזרימה למדידה.
    הערה: אם דגימות מוכתמות וקבועות אינן יכולות לפעול באמצעות ציטומטריית זרימה באותו יום, יש לאחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהגן עליהן מהאור. נתח את הדגימות בהקדם האפשרי בימים הבאים.
  14. ניתוח תוצאות ציטומטריית זרימה באמצעות תוכנת FlowJo. אסטרטגיית השער מתחילה בהוצאת פסולת באמצעות פיזור קדמי וצדדי (FSC/SSC). לאחר מכן, בחרו מקרופאגים חיים בתאי CD11b⁺ Zombie Violet- תאי CD11b⁺.
    הערה: מכיוון שאוטופלואורסצנציה במקרופאגים תלויה בתורם, חשוב להשתמש בבקרות שמקורן באותו תורם בכל ניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יצרנו תאים דמויי מקרופאגים (TAM) הקשורים לסרטן השד בשלושה שליליים על ידי טיפול במקרופאגים שמקורם במונוציטים עם 50% מדיום מותנה (CM) מקו התאים MDA-MB-231. המונוציטים מוינו מתאי דם מונו-גרעיניים היקפיים (PBMC) של שישה תורמים בריאים עצמאיים והובחנו בהתאם לפרוטוקול שלנו. הכנת ה-CM השתמשה בתאי MDA-MB-231 בחיבור של 90% (איור 1). CM נוסף לתרבות המאקרופאג' ביום החמישי, והתאים נקטפו ביום השביעי. איור 2 מציג את המורפולוגיה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה שחזורית ומעשית לחקר קיטוב דמוי מקרופאגים הקשור לגידול, על ידי חשיפת מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים למדיומים המותנים לקו תאי הגידול. מערכת זו לוכדת את השפעת הגורמים הממסים המופרשים על ידי תאי הגידול, הידועים כממלאים תפקיד מרכזי בתכנות מחדש של המאקרופאגים בתוך מיקרו-סביבת הגידול 7,9,10,15,19,20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

אנו מודים לתמיכה הכספית שניתנה על ידי הסוכנות הלאומית לקידום המדע והטכנולוגיה (ANPCyT-FONCYT) באמצעות מענקים PICT 2021 I-INVI-00034 (ל-DR), PICT 2021-I-A-00807 (ל-E.A.C.S.) ו-PICT 2021-I-A-00716 (ל-A.E.E.). אנו מודים גם למועצה הלאומית למחקר מדעי וטכני (CONICET) על מענק PIP 2022-0763 ולאוניברסיטת בואנוס איירס על PIDAE 2022, שהוענק ל-A.E.E.

M.C.L. זכה במלגת Legado Peruilh מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת בואנוס איירס, והוא זכה במלגת דוקטורט ANPCyT-FONCYT. D.R., E.A.C.S. ו-A.E.E. הם חוקרים מקצועיים ב-CONICET.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלקסה פלואר 488 עכבר אנטי-אנושי  שיבוט נוגדנים CD206 15-2BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.Cat# 321113; RRID:AB_571874
העכבר Alexa Fluor 647 נגד אדם CD64 שיבוט 10.1BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.Cat# 305012; RRID:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה, ארה"בCat# 554714ערכת קיבוע/פרמיאביליזציה
מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM), עם רמות סוכר גבוהותGibco  Thermo Fisher Scientific, וולת'ם, MA ארה"ב  Cat# 11965092
ערכת בחירה חיובית ל-EasySep Human CD14; קוקטייל מבחר חיובי של EasySep; ננו-חלקיקים מגנטיים של EasySep; מגנט קל לספטכנולוגיות STEMCELL, ונקובר, קנדהקט# 18058
ציטומטר קנטו של FACS  בקטון דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב.
סרום בקר עוברי, מוקדל, ניו זילנד  Gibco™   Thermo Fisher Scientific, וולת'ם, MA ארה"ב  חתול# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - מדעי החיים, ארה"בCat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
ציטומטר חלל Partec CyFlow Sysmex Partec, גרמניה
שיבוט נוגדן HLA-DR אנטי-אנושי ל-PE L243BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.Cat# 307605; RRID:AB_314683
שיבוט נוגדנים CD11b נגד עכברים/בני אדם PE/Cy7BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.Cat# 101216; RRID:AB_312799
העכבר PerCP/Cy5.5 נגד נוגדן CD163 שיבוט GHI/61BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.Cat# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 בינוניGibco  Thermo Fisher Scientific, וולת'ם, MA ארה"ב  Cat# 11875119
תמיסת פירובט נתרןסיגמא-אלדריץ' מרק, סן לואיס, מיזורי, ארה"ב.Cat#  S8636
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםGibco  Thermo Fisher Scientific, וולת'ם, MA ארה"ב  חתול# 25200056
ערכת תיקון זומבי סגולBioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.Cat# 423113

מקורות

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קיטוב מקרופאגיםמידול אין ויטרו (In Vitro)דיפרנציאציה של מונוציטיםמצע גידול מותנהאינטראקציות בין גידול למקרופאגתכנות מחדש של מקרופאגיםאימונולוגיה של הסרטן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.