נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) גדלים באופן משמעותי במספר מחלות. LDN מבודדים בדרך כלל באמצעות מיון תאים. אנו מציגים שיטה מעשית להשגת LDN טהור ובר קיימא. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות של דם היקפי, התאים מודגרים עם מיקרו-חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן LDN מופרדים באמצעות עמודות מגנטיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת מיקרו-חרוזים מגנטיים מהירה לטיהור יעיל של נויטרופילים בצפיפות נמוכה
במאמר זה
סיכום
תקציר
נויטרופילים, לויקוציטים חשובים של חסינות מולדת, נחשבו באופן מסורתי לאוכלוסיית תאים הומוגנית. עם זאת, עדויות עדכניות הראו כי נויטרופילים קיימים בכמה תת-אוכלוסיות. תת-אוכלוסייה אחת כזו היא נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN). LDN נמצא במספרים קטנים בדם של אנשים בריאים, אך מספרם עולה משמעותית במחלות כמו זאבת אדמנתית מערכתית, הפרעות אוטואימוניות, סרטן וזיהומים. במקרים אלה, LDN עשוי להשתתף בפתוגנזה של המחלה. הדרך היחידה לבודד LDN היא באמצעות צנטריפוגה בשיפוע צפיפות של דם היקפי. עם זאת, לאחר צנטריפוגה, LDN מטהר במשותף עם תאים חד-גרעיניים. לפיכך, חקר תת-אוכלוסיית הנויטרופילים הזו הוא מאתגר. אין מתודולוגיה סטנדרטית להפרדת LDN מתאים חד-גרעיניים. בדרך כלל, LDN מופרדים על ידי מיון תאים בציטומטר זרימה. עם זאת, שיטה זו דורשת זמני מיון ארוכים (שעות) כדי להשיג מספיק תאים טהורים למחקרים פונקציונליים נוספים. זה משפיע ברצינות על הכדאיות והתפקוד של התאים. כאן, אנו מציעים שיטה מעשית להשגת מספרים גדולים של LDN טהור ובר קיימא בזמן קצר. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, חלק התא החד-גרעיני מודגר עם מיקרו-חרוזים מגנטיים נגד CD66b, ולאחר מכן LDN מופרדים דרך עמודים מגנטיים תוך < 30 דקות. LDN מטוהר (תאי CD66b+ ) מסומנים בנוגדנים חד שבטיים כנגד CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b ו-CD98, ומנותחים על ידי ציטומטריית זרימה לאישור. LDN מטוהר הם פונקציונליים לחלוטין כפי שמעיד על יכולתם לייצר מיני חמצן תגובתיים, וליצור מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות. שיטת טיהור חדשה זו מביאה ל-LDN עם טוהר גבוה (יותר מ-90%) וכדאיות (יותר מ-96%) בפרק זמן קצר. ניתן בקלות להגדיל שיטה זו כדי להשיג מספר רב של LDN טהור כדי להעריך פונקציות LDN במחלות שונות באמצעות ניתוח ביוכימי או אומיקס אחר.
מבוא
נויטרופילים, הלויקוציטים העיקריים בדם אנושי1, הם משתתפי מפתח במערכת החיסון המולדת. הם מגיעים במספרים גדולים לרקמות עם דלקת או זיהום2. שם, נויטרופילים מפעילים מספר פונקציות אפקטור, כגון פגוציטוזיס 3,4, דה-גרנולציה 5,6 ויצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs)7. בנוסף, נויטרופילים משתתפים גם בתגובה החיסונית הנרכשת8. התפיסה הקלאסית של נויטרופילים רואה בהם תאים הומוגניים המיוצרים במח העצם עם תגובות קבועות מראש
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הנהלים בפרוטוקול זה פועלים בהתאם להנחיות הוועדה לביו-אתיקה של מחקר אנושי ב-Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). כל המשתתפים נתנו הסכמה מדעת.
1. בידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) ונויטרופילים מדם אנושי
- השג כ-10 מ"ל דם ממתנדב בוגר בריא על ידי ניקור ורידים. הוסף 10 U/mL של הפרין כנוגד קרישה.
זהירות: השלך את המחט למיכל סילוק מחט ביולוגית. יש להניח מזרקים וחומרים אחרים במגע עם דם בשקית ולבצע חיטוי לפני השלכתם. - בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל, הוסף 2 מ"ל של 6% דקסטרן T500 ב-PBS. לאחר מכן הוסף 10 מ"ל דם על ידי ניקוז בצד הצינור.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) אצל אנשים בריאים מייצגים כ-5% מה-PBMC (איור 2A). הפרוטוקול המתואר כאן מספק בדרך כלל LDN טהור (> 90%). התאים גם מתאוששים ביעילות (תשואה בסביבות 98%) עם כדאיות גבוהה (> 95%; איור 2B). לשם השוואה, LDN טוהר גם על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט כפי שתואר קודם לכן22. בקצרה, PBMC סומנו בנוגדנים נגד CD16b ומוינו בסדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנט. LDN מוינו במשך 3 שעו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באופן כללי, נויטרופילים נחשבו לתאים הומוגניים. עם זאת, עדויות עדכניות הראו כי נויטרופילים יכולים להתקיים כתאים עם מצבי הפעלה שונים ו/או פנוטיפים מרובים. לפיכך, תת-אוכלוסיות נויטרופילים שונות עשויות להתקיים 13,14,15. תת-אוכלוסייה אחת של נויטרופילים, הנויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN), זכתה לעניין רב בשל תכונותיהם הפנימיות המיוחדות וגם מכיוון שהם גדלים במחלות מרובות 16,17,18........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מציינים כי מחקר זה בוצע ללא כל קשרים מסחריים או פיננסיים שעלולים להיתפס כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.
תודות
המחברים מודים לסזאר דיאז-גודינז (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) על עזרתו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית NETs. מחקר זה נתמך על ידי מענק PAPIIT IN205523 מ-Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), מקסיקו, ועל ידי מענק CF-2023-I-610 מ-Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), מקסיקו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן פוליקלונלי לארנב אנטי-ציטרולין | AbCam | ab100932 | דילול של 1/50 |
| לוח תרבית רקמות עם 96 בארות | Costar; קורנינג, בע"מ. | 3596 | |
| אלקסה פלואור 488 נוגדן עכבר CD11b אנטי-אנושי IgG1 | ביולג'נד | 301317 | 0.25 & mu; g/mL |
| נוגדן IgM עכבר CD66b אלקסה פלואר 647 אנטי-אנושי | ביולג'נד | 305109 | 0.05 & mu; g/mL |
| נוגדן עז נגד עכבר IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen - תרמו פישר סיינטיפיק | A-11001 | דילול של 1/50 |
| נוגדן IgG1 מונוקלונלי של עכבר אנטי-נויטרופילי | ביוטכנולוגיה של סנטה קרוז | SC-55549 | 10 ומיקרו; g/mL |
| נוגדן לחמור אנטי-ארנב IgG (H+L), אלקסה פלואר 555 | Invitrogen - תרמו פישר סיינטיפיק | A-31572 | דילול של 1/50 |
| נוגדן IgG1 עכבר CD62L אנטי-אנושי APC | ביולג'נד | 304809 | 0.03 & mu; g/mL |
| נוגדן IgG1 עכבר CD14 אנטי-אנושי APC/Cyanine7 | ביולג'נד | 367107 | 0.25 & mu; g/mL |
| Attune NxT ציטומטר זרימה | תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ. | (לייזרים כחולים/אדומים) | |
| אלבומין סרום בקר (BSA) Fraction V | ביומדיקל MP | 810025 | |
| נוגדן IgG1 עכבר Brilliant Violet 510 אנטי-אנושי CD33 | ביולג'נד | 366609 | 0.30 & mu; g/mL |
| DAPI | קלביוכימ/EMD מיליפור | 268298 | |
| דקסטרן T500 | Pharmacosmos A/C | 5.51005E+11 | |
| דיהידרורודמין-123 | אנאספק, בע"מ. | AS-85711 | |
| מיון תאים של FACS | בקטון דיקינסון | דגם FACSAria | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | גיבקו | 16000-044 | |
| פיקול-פאקה | מרק KG | GE 17-1440-03 | |
| נוגדן IgG1 לעכבר CD98 אנטי-אנושי FITC | ביולג'נד | 315603 | 0.30 & mu; g/mL |
| FlowJo Software | בקטון דיקינסון | גרסה 10, 2019 | |
| מיקרוסקופ הפוך עם פלואורסצנציה | אולימפוס | דגם IX-70 | |
| הפארין | Inhepar - PiSA Farmaceutica | 3660149 | 5000 ממשק/מ"ל |
| הפס | סיגמא אולדריץ' | H7006 | |
| מיקרו-חרוזי כימריזם MACSprep CD66b | מילטני ביוטק | 130-111-552 | |
| מגנט | מילטני ביוטק | 130-042-102 | |
| עמודת הפרדה מגנטית | מילטני ביוטק | 130-042-201 | |
| מיקרוצנטריפוגה | אפנדורף | דגם 5415C | |
| קורא מיקרופלט | ביו-טק אינסטרומנטס | Model Synergy HT | |
| פאראפורמלדהיד | סיגמא אולדריץ' | 158127 | |
| נוגדן IgG1 עכבר CD10 אנטי-אנושי PE | ביולג'נד | 312203 | 0.05 & mu; g/mL |
| נוגדן IgG2a עכבר PE נגד אדם CD16b | BD פארמינגן | 550868 | דילול 1/40 |
| PE/Cyanine5 נוגדן IgG1 לעכבר CD15 אנטי-אנושי | ביולג'נד | 323013 | 0.25 & mu; g/mL |
| פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA) | סיגמא אולדריץ' | P8139 | |
| פולי-אל-ליסין | סיגמא אולדריץ' | P2658 | |
| צנטריפוגה מקוררת | אפנדורף | דגם 5702R | |
| מדיום תרבית רקמות RPMI-1640 | גיבקו | 23400-021 | |
| סיטוקס גרין | Molecular Probes, Inc. | S-7020 | |
| טווין-20 | סיגמא אולדריץ' | P2287 | |
| וקטשילד | מעבדות וקטור | H-1000 |
מקורות
- Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
