Method Article

שיטת מיקרו-חרוזים מגנטיים מהירה לטיהור יעיל של נויטרופילים בצפיפות נמוכה

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) גדלים באופן משמעותי במספר מחלות. LDN מבודדים בדרך כלל באמצעות מיון תאים. אנו מציגים שיטה מעשית להשגת LDN טהור ובר קיימא. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות של דם היקפי, התאים מודגרים עם מיקרו-חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן LDN מופרדים באמצעות עמודות מגנטיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נויטרופילים, לויקוציטים חשובים של חסינות מולדת, נחשבו באופן מסורתי לאוכלוסיית תאים הומוגנית. עם זאת, עדויות עדכניות הראו כי נויטרופילים קיימים בכמה תת-אוכלוסיות. תת-אוכלוסייה אחת כזו היא נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN). LDN נמצא במספרים קטנים בדם של אנשים בריאים, אך מספרם עולה משמעותית במחלות כמו זאבת אדמנתית מערכתית, הפרעות אוטואימוניות, סרטן וזיהומים. במקרים אלה, LDN עשוי להשתתף בפתוגנזה של המחלה. הדרך היחידה לבודד LDN היא באמצעות צנטריפוגה בשיפוע צפיפות של דם היקפי. עם זאת, לאחר צנטריפוגה, LDN מטהר במשותף עם תאים חד-גרעיניים. לפיכך, חקר תת-אוכלוסיית הנויטרופילים הזו הוא מאתגר. אין מתודולוגיה סטנדרטית להפרדת LDN מתאים חד-גרעיניים. בדרך כלל, LDN מופרדים על ידי מיון תאים בציטומטר זרימה. עם זאת, שיטה זו דורשת זמני מיון ארוכים (שעות) כדי להשיג מספיק תאים טהורים למחקרים פונקציונליים נוספים. זה משפיע ברצינות על הכדאיות והתפקוד של התאים. כאן, אנו מציעים שיטה מעשית להשגת מספרים גדולים של LDN טהור ובר קיימא בזמן קצר. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, חלק התא החד-גרעיני מודגר עם מיקרו-חרוזים מגנטיים נגד CD66b, ולאחר מכן LDN מופרדים דרך עמודים מגנטיים תוך < 30 דקות. LDN מטוהר (תאי CD66b+ ) מסומנים בנוגדנים חד שבטיים כנגד CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b ו-CD98, ומנותחים על ידי ציטומטריית זרימה לאישור. LDN מטוהר הם פונקציונליים לחלוטין כפי שמעיד על יכולתם לייצר מיני חמצן תגובתיים, וליצור מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות. שיטת טיהור חדשה זו מביאה ל-LDN עם טוהר גבוה (יותר מ-90%) וכדאיות (יותר מ-96%) בפרק זמן קצר. ניתן בקלות להגדיל שיטה זו כדי להשיג מספר רב של LDN טהור כדי להעריך פונקציות LDN במחלות שונות באמצעות ניתוח ביוכימי או אומיקס אחר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נויטרופילים, הלויקוציטים העיקריים בדם אנושי1, הם משתתפי מפתח במערכת החיסון המולדת. הם מגיעים במספרים גדולים לרקמות עם דלקת או זיהום2. שם, נויטרופילים מפעילים מספר פונקציות אפקטור, כגון פגוציטוזיס 3,4, דה-גרנולציה 5,6 ויצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs)7. בנוסף, נויטרופילים משתתפים גם בתגובה החיסונית הנרכשת8. התפיסה הקלאסית של נויטרופילים רואה בהם תאים הומוגניים המיוצרים במח העצם עם תגובות קבועות מראש 9,10. עם זאת, מחקרים אחרונים מגלים כי נויטרופילים הם תאים הטרוגניים עם מצבים פנוטיפיים ותפקודיים מרובים הן במצב בריא והן במצב מחלה 11,12,13,14,15.

בקרב מספר תת-אוכלוסיות נויטרופילים, הנויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) משכו עניין רב בגלל תכונותיהם הפנימיות ומכיוון שמספרם גדל במספר מחלות 16,17,18. LDN נמצאו בדמם של חולי זאבת אדמנתית מערכתית (SLE) בשנת 198619. הם זוהו בעקבות תהליך הפרדת לויקוציטים בשיפוע צפיפות20,21. לאחר צנטריפוגה של דם או פלזמה עשירה בלויקוציטים על מדיום צפיפות (למשל, Ficoll-Paque), מונוציטים ולימפוציטים (הידועים כתאים חד-גרעיניים בדם היקפי [PBMC]) יוצרים רצועה בחלק העליון (בצפיפות נמוכה) של הצינור. נויטרופילים משקעים בתחתית הצינור. בקרב PBMC נמצאו גם כמה נויטרופילים; אלה הם LDN (איור 1). מספר קטן של LDN נמצא בדמם של אנשים בריאים22. עם זאת, מספרי ה-LDN עולים באופן משמעותי במצבים של דיכוי חיסוני מרובה ודלקת כרונית, כולל זאבת23,24, אלח דם25, פסוריאזיס26, אסתמה27, דלקת מפרקים אידיופטית של נעורים28, דלקת כלי דם הקשורה לנוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים (ANCA)29, זיהום HIV30, מלריה31 ושחפת32. למרות שמספרי ה-LDN עולים בכל הפתולוגיות שהוזכרו, LDN נחקר בעיקר בהקשר של SLE17. נראה כי ל-LDN מדמם של חולי זאבת יש יכולת גדולה יותר ליצור NETs33, להפריש כמויות גדולות של מתווכים פרו-דלקתיים34 ולהפעיל תאי T24. עם זאת, במצבים אחרים, כגון סרטן, LDN מדווח כמורכב מנויטרופילים בוגרים ולא בשלים35, עם תכונות דיכוי של תאי T 36,37,38. באופן דומה, בחולי COVID-19, LDN מדווח גם כמדכא התפשטות תאי T39, אך בניגוד לזאבת, נראה כי LDN מייצר פחות NETs39. לכן, המקור, ההרכב והתכונות הפונקציונליות של LDN עדיין שנויים במחלוקת.

מכיוון ש-LDN נמצאים יחד עם PBMC, מחקרם מסובך מבחינה טכנית. כדי לחקור באופן מלא את תכונות ה- LDN בפתולוגיות שונות, יש צורך לטהר אותן. הליך נפוץ של הפרדת LDN הוא מיון תאים פלואורסצנטיים 22,40,41,42,43,44,45. עם זאת, מיון תאים דורש זמן רב להפרדת תאים. זה עלול להוביל לאובדן תאים או התאוששות נמוכה אם זמן המיון אינו מספיק. בנוסף, תאים נתונים ללחץ מוגזם, מה שגורם לתוצאות משתנות תוך כדי חקר תפקוד התאים הללו. זמן מיון ארוך גם מגדיל את עלות הליכי הניסוי ודורש כוח אדם מומחה.

כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ויעילה להשגת מספר רב של LDN אנושי טהור ובר קיימא בזמן קצר מאוד. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, LDN מופרדים על ידי מיון תאים מגנטיים (MACS; איור 1). היתרון העיקרי של שיטת טיהור זו הוא ש- LDN מופרדים בטוהר גבוה (יותר מ- 90%) ובכדאיות (יותר מ- 96%). כמו כן, LDN מטוהר הם פונקציונליים לחלוטין כפי שמצוין על ידי יכולתם לייצר מיני חמצן תגובתיים (ROS) ולשחרר NETs. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות בכל מעבדה המתעניינת בביולוגיה של נויטרופילים כדי להפריד במהירות LDN מדמם של אנשים עם מחלות מרובות על מנת להמשיך לחקור תאים אלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים בפרוטוקול זה פועלים בהתאם להנחיות הוועדה לביו-אתיקה של מחקר אנושי ב-Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). כל המשתתפים נתנו הסכמה מדעת.

1. בידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) ונויטרופילים מדם אנושי

  1. השג כ-10 מ"ל דם ממתנדב בוגר בריא על ידי ניקור ורידים. הוסף 10 U/mL של הפרין כנוגד קרישה.
    זהירות: השלך את המחט למיכל סילוק מחט ביולוגית. יש להניח מזרקים וחומרים אחרים במגע עם דם בשקית ולבצע חיטוי לפני השלכתם.
  2. בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל, הוסף 2 מ"ל של 6% דקסטרן T500 ב-PBS. לאחר מכן הוסף 10 מ"ל דם על ידי ניקוז בצד הצינור. הפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב את הדם והדקסטרן.
  3. תן לצינור לנוח במשך 45 דקות, בעוד אריתרוציטים שוקעים. הפלזמה העשירה בלויקוציטים מופיעה מעל שכבת האריתרוציטים.
  4. בצינור צנטריפוגה נוסף של 15 מ"ל, הוסף 5 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות. פיפטה בזהירות את הפלזמה, מבלי לגעת באריתרוציטים, והניחו אותה על גבי המדיום. יש ליצור שני שלבים נפרדים.
  5. צנטריפוגה את הצינור ב-516 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. תאים חד-גרעיניים (PBMC) יוצרים פס בין הפלזמה לשכבות הבינוניות. נויטרופילים יוצרים כדור בתחתית (איור 1).
  6. בידוד PBMC
    1. הסר על ידי שאיבת הפלזמה על גבי ה- PBMC מבלי לגעת בתאים. אסוף את התאים מהרצועה שבין הפלזמה למדיום. הקפידו לשאוף כמה שפחות מדיום.
    2. מניחים תאים בצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מ"ל. הוסף 20 מ"ל PBS. צנטריפוגה את הצינור ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. שאפו בזהירות את הסופרנטנט וגרדו את הצינור כדי להפריד בין התאים. הוסף 10 מ"ל PBS קר כדי להשעות מחדש את התאים. ספרו את ה-PBMC באמצעות תא נויבאואר.
      הערה: אל תשתמש בפיפטה כדי להשעות את התאים, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לתאים.
  7. בידוד נויטרופילים
    1. הסר את מדיום מעבר הצפיפות. הפרד את התאים על ידי גירוד הצינור והוסף 10 מ"ל PBS קר.
    2. הכניסו את התאים לצינור צנטריפוגה טרי של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט והפרידו את התאים כמתואר בשלב 1.6.3.
  8. כדי לחסל שאריות אריתרוציטים, הוסיפו 10 מ"ל של תמיסה היפוטונית, קרה (0.2% NaCl, 1% BSA, 20 מ"מ Hepes, pH = 7.4), וערבבו בעדינות במשך דקה אחת בדיוק.
  9. הוסף במהירות 10 מ"ל של תמיסה היפרטונית קרה (1.6% NaCl, 1% BSA, 20 מ"מ HEPES, pH = 7.4) כדי להפוך את התמיסה לאיזוטונית.
  10. ספרו את הנויטרופילים באמצעות תא נויבאואר (טוהר > 95%). גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה כמו בשלב 1.6.2. ולהשעות אותם ב-PBS קר. שמור את הצינור על קרח.
    הערה: מדווח כי זמן מחצית החיים של נויטרופילים במבחנה הוא 8 - 12 שעות 46,47,48. מניסיוננו עם פרוטוקול זה, נויטרופילים שומרים על תפקודיהם במשך כ-6 עד 8 שעות.

2. טיהור נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN)

  1. צנטריפוגה PBMC ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש תאים ב-120 מיקרוליטר של מאגר כביסה קרה (1% BSA ב-PBS).
  2. הוסף 35 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים מגנטיים CD66b. דוגרים את התערובת בחושך בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. יש לערבב בעדינות כל 10 דקות כדי למנוע הצטברות תאים.
  3. הוסף 1 מ"ל מאגר כביסה קרה. מניחים תאים במיקרו-צנטריפוגה וסובבים ב -400 x גרם למשך 3 דקות.
  4. הסר את חומר העל, הפרד את כדור התא על ידי גירוד הצינור, והשהה מחדש תאים ב-1 מ"ל של מאגר כביסה.
  5. הנח עמוד הפרדה מגנטי על מגנט. הוסף 0.5 מ"ל מאגר כביסה לעמודה ותן לו לעבור דרך העמודה.
  6. העבירו תאים (1 מ"ל) אל העמודה. תן למאגר לעבור דרך העמודה טיפה אחר טיפה.
  7. הוסף 0.5 מ"ל של מאגר כביסה לעמודה ותן לו לעבור. הוסף עוד 0.5 מ"ל של מאגר כביסה לעמודה.
  8. הסר את העמוד מהמגנט והכניס אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה. הוסף 1 מ"ל של מאגר כביסה לעמודה.
  9. הכנס את הבוכנה על גבי העמוד והפעל בעדינות לחץ כדי להוציא את התאים. הסר את הבוכנה והניח את העמוד על גבי צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.
  10. הוסף עוד 1 מ"ל של מאגר כביסה. הכנס את הבוכנה על גבי העמוד והפעל בעדינות לחץ כדי להוציא את התאים.
  11. מניחים את שני הצינורות במיקרו-צנטריפוגה וסובבים אותם בחום של 800 x גרם למשך 3 דקות. לבסוף, השעו מחדש את התאים (LDN) משני הצינורות ל-1 מ"ל של PBS קר. המשיכו על הקרח.
    הערה: 2 המ"ל הראשונים של זרימה מכילים את שאר ה-PBMC. תאים אלה יכולים לשמש למחקרים אחרים.

3. ציטומטריית זרימה צבעונית

  1. השעו מחדש תאים מטוהרים ב-1 x 106 תאים/מ"ל במאגר תיוג (1% FBS ב-PBS). הוסף 250 מיקרוליטר תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. הוסף את הנוגדנים המתאימים כנגד מולקולות ממברנת נויטרופילים (לפרטים, ראה טבלת חומרים). דגרו על התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והגנו עליהם מפני אור.
  3. הוסף 1 מ"ל PBS. מניחים צינורות במיקרו-צנטריפוגה וסובבים אותם בחום של 800 x גרם למשך 3 דקות.
  4. שאפו את הסופרנטנט, שברו את כדור התא על ידי הקשה על הצינור, והשעו מחדש תאים ב-0.5 מ"ל של 1% פרפורמלדהיד.
  5. שמור על התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנים מפני אור, עד לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. לנתח תאים לפי ציטומטריית זרימה, ללכוד 10,000 אירועים לדגימה. בצע מיון תאים כמתואר קודם לכן22.
    זהירות: פרפורמלדהיד הוא חומר מגרה לעור ולדרכי הנשימה. הקפד לא לנשום את האדים.

4. איתור מיני חמצן תגובתיים (ROS)

  1. בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הוסף 2.5 x 105 תאים. מניחים צינורות במיקרו-צנטריפוגה ומסובבים בחום של 800 x גרם למשך 3 דקות.
  2. שאפו את הסופרנטנט, גרדו את הצינור כדי להפריד בין התאים, והשעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של 15 מיקרומטר דיהידרורודמין 123 ב-PBS.
  3. דגרו על התאים המוגנים מפני אור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הוסף 1 מ"ל PBS.
  4. מניחים צינורות במיקרו-צנטריפוגה ומסובבים בחום של 800 x גרם למשך 3 דקות. שאפו את הסופרנטנט, גרדו את הצינור כדי להפריד בין התאים, והשעו אותם מחדש ב-100 מיקרוליטר של 50 ננומטר פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) ב-PBS.
  5. דגרו על התאים המוגנים מפני אור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. הוסף 1 מ"ל PBS.
  6. מניחים צינורות במיקרו-צנטריפוגה וסובבים אותם בחום של 800 x גרם למשך 3 דקות. שאפו את הסופרנטנט, גרדו את הצינור כדי להפריד בין התאים, והשעו אותם מחדש ב-0.5 מ"ל של 1% פרפורמלדהיד ב-PBS.
  7. שמור על התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנים מפני אור עד לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. לנתח תאים לפי ציטומטריית זרימה, ללכוד 10,000 אירועים לדגימה.

5. הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs)

  1. מניחים כיסויים בבארות של צלחת של 12 בארות ומכסים אותם ב-10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-L-ליזין. דגרו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
  2. הסר את הפולי-L-ליזין, ושטוף את הכיסויים עם PBS, דגר את הצלחת למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה. שטפו את הכיסויים עם PBS פעמיים נוספות.
  3. הסר את ה-PBS ותן לכיסויים להתייבש על ידי הנחת הצלחת בתוך קולט אדים עם זרימה למינרית למשך שעתיים.
  4. השהה מחדש את ה-LDN ב-1 x 106 תאים/מ"ל ב-RPMI-1640 בינוני עם 5% FBS. קח 350 מיקרוליטר (3.5 x 105 תאים) מתרחיף התאים והכניס אותם לבאר של צלחת 12 הבארות המכילה את הכיסויים.
  5. שמור את הצלחת למשך 30 דקות בחממה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף 3.5 מיקרוליטר של 5 מיקרומטר PMA מדולל ב-PBS לכל באר (הריכוז הסופי של PMA הוא 50 ננומטר).
  6. שמור את הצלחת למשך 4 שעות בחממה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף 350 מיקרוליטר של 8% פרפורמלדהיד ב-PBS, ושמור את הצלחת למשך הלילה באינקובטור של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
  7. הנח סרט שקוף מעל מעמד מבחנה כמתואר קודם לכן49, כך שייווצרו בארות על חורי הצינור.
  8. מלאו כל באר בתמיסות השונות כדי לשטוף או להכתים את הכיסויים וליצור טיפה גדולה. הסר את הכיסויים והניח אותם הפוכים על טיפת מים למשך 5 דקות. באותו אופן, שטפו את הכיסויים שלוש פעמים נוספות במים.
  9. הנח את החלקות הכיסוי הפוך על טיפת חיץ חוסם (5% BSA ב-PBS) ודגר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. העבירו את תלושי הכיסוי לטיפה של הנוגדן הראשוני המתאים (למשל, אנטי-אלסטאז או אנטי-ציטרולין) במאגר חוסם ודגרו למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. כיסויי כביסה 2x ב-0.01% Tween-20 ב-PBS. העבירו את תלושי הכיסוי לטיפה של הנוגדן המשני המתאים במאגר חוסם המכיל 150 ננומטר DAPI, ודגרו למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור.
  12. כיסויי כביסה 2x ב-0.01% Tween-20 ב-PBS. הנח טיפה של מדיום הרכבה נגד דהייה על מגלשת זכוכית והניח כיסויים הפוכים.
  13. כיסוי חותםמחליק סביב ההיקף עם לק. אחסן שקופיות רכובות ב-4 מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור. דמיין NETs באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

6. איתור מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs)

  1. השעיה מחדש של תאים ב-5 x 105 תאים/מ"ל ב-500 ננומטר Sytox Green, מדולל במדיום RPMI-1640 עם 5% FBS.
  2. קח 100 מיקרוליטר (5 x 104 תאים) מתרחיף התאים והכניס אותם לבאר של צלחת תרבית רקמות של 96 בארות.
  3. שמור את הצלחת למשך 20 דקות בחממה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף לכל באר 20 מיקרוליטר של 300 ננומטר PMA מדולל במדיום RPMI-1640 (הריכוז הסופי של PMA הוא 50 ננומטר).
  4. העבירו את הצלחת לקורא מיקרו-פלטות מחומם מראש. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות, תוך ביצוע מדידות פלואורסצנטיות מתחתית הצלחת כל 5 דקות (באמצעות מסנני עירור של 485 ננומטר ופליטה של 528 ננומטר).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) אצל אנשים בריאים מייצגים כ-5% מה-PBMC (איור 2A). הפרוטוקול המתואר כאן מספק בדרך כלל LDN טהור (> 90%). התאים גם מתאוששים ביעילות (תשואה בסביבות 98%) עם כדאיות גבוהה (> 95%; איור 2B). לשם השוואה, LDN טוהר גם על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט כפי שתואר קודם לכן22. בקצרה, PBMC סומנו בנוגדנים נגד CD16b ומוינו בסדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנט. LDN מוינו במשך 3 שעו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן כללי, נויטרופילים נחשבו לתאים הומוגניים. עם זאת, עדויות עדכניות הראו כי נויטרופילים יכולים להתקיים כתאים עם מצבי הפעלה שונים ו/או פנוטיפים מרובים. לפיכך, תת-אוכלוסיות נויטרופילים שונות עשויות להתקיים 13,14,15. תת-אוכלוסייה אחת של נויטרופילים, הנויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN), זכתה לעניין רב בשל תכונותיהם הפנימיות המיוחדות וגם מכיוון שהם גדלים במחלות מרובות 16,17,18....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מציינים כי מחקר זה בוצע ללא כל קשרים מסחריים או פיננסיים שעלולים להיתפס כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לסזאר דיאז-גודינז (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) על עזרתו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית NETs. מחקר זה נתמך על ידי מענק PAPIIT IN205523 מ-Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), מקסיקו, ועל ידי מענק CF-2023-I-610 מ-Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), מקסיקו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  נוגדן פוליקלונלי לארנב אנטי-ציטרוליןAbCamab100932דילול של 1/50
לוח תרבית רקמות עם 96 בארותCostar; קורנינג, בע"מ.3596
אלקסה פלואור 488 נוגדן עכבר CD11b אנטי-אנושי IgG1ביולג'נד3013170.25 & mu; g/mL
נוגדן IgM עכבר CD66b אלקסה פלואר 647 אנטי-אנושיביולג'נד3051090.05 & mu; g/mL
נוגדן עז נגד עכבר IgG (H+L), Alexa Fluor 488Invitrogen - תרמו פישר סיינטיפיקA-11001דילול של 1/50
נוגדן IgG1 מונוקלונלי של עכבר אנטי-נויטרופיליביוטכנולוגיה של סנטה קרוזSC-5554910 ומיקרו; g/mL
נוגדן לחמור אנטי-ארנב IgG (H+L), אלקסה פלואר 555Invitrogen - תרמו פישר סיינטיפיקA-31572דילול של 1/50
נוגדן IgG1 עכבר CD62L אנטי-אנושי APCביולג'נד3048090.03 & mu; g/mL
נוגדן IgG1 עכבר CD14 אנטי-אנושי APC/Cyanine7ביולג'נד3671070.25 & mu; g/mL
Attune NxT ציטומטר זרימה תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ.(לייזרים כחולים/אדומים)
אלבומין סרום בקר (BSA) Fraction Vביומדיקל MP810025
נוגדן IgG1 עכבר Brilliant Violet 510 אנטי-אנושי CD33ביולג'נד3666090.30 & mu; g/mL
DAPIקלביוכימ/EMD מיליפור268298
דקסטרן T500Pharmacosmos A/C5.51005E+11
דיהידרורודמין-123אנאספק, בע"מ.AS-85711
מיון תאים של FACSבקטון דיקינסון דגם FACSAria
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקו16000-044
פיקול-פאקהמרק KGGE 17-1440-03
נוגדן IgG1 לעכבר CD98 אנטי-אנושי FITCביולג'נד3156030.30 & mu; g/mL
FlowJo Softwareבקטון דיקינסוןגרסה 10, 2019
מיקרוסקופ הפוך עם פלואורסצנציהאולימפוסדגם IX-70
הפאריןInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 ממשק/מ"ל
הפססיגמא אולדריץ'H7006
מיקרו-חרוזי כימריזם MACSprep CD66bמילטני ביוטק130-111-552
מגנטמילטני ביוטק130-042-102
עמודת הפרדה מגנטיתמילטני ביוטק130-042-201
מיקרוצנטריפוגהאפנדורףדגם 5415C
קורא מיקרופלטביו-טק אינסטרומנטסModel Synergy HT
פאראפורמלדהידסיגמא אולדריץ'158127
נוגדן IgG1 עכבר CD10 אנטי-אנושי PEביולג'נד3122030.05 & mu; g/mL
נוגדן IgG2a עכבר PE נגד אדם CD16bBD פארמינגן550868דילול 1/40
PE/Cyanine5 נוגדן IgG1 לעכבר CD15 אנטי-אנושיביולג'נד3230130.25 & mu; g/mL
פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA)סיגמא אולדריץ'P8139
פולי-אל-ליסיןסיגמא אולדריץ'P2658
צנטריפוגה מקוררתאפנדורףדגם 5702R
מדיום תרבית רקמות RPMI-1640גיבקו23400-021
סיטוקס גריןMolecular Probes, Inc.S-7020
טווין-20 סיגמא אולדריץ'P2287
וקטשילדמעבדות וקטורH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
  2. Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  3. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A fundamental process in immunity. Biomed Res Int. 2017, 9042851(2017).
  4. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  5. Faurschou, M., Borregaard, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 5 (14), 1317-1327 (2003).
  6. Lacy, P., Eitzen, G. Control of granule exocytosis in neutrophils. Front Biosci. 13, 5559-5570 (2008).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Leukoc Biol. 108 (1), 377-396 (2020).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Lawrence, S. M., Corriden, R., Nizet, V. The ontogeny of a neutrophil: Mechanisms of granulopoiesis and homeostasis. Microbiol Mol Biol. Rev. 82 (1), e00057-e00117 (2018).
  11. Aroca-Crevillén, A., Vicanolo, T., Ovadia, S., Hidalgo, A. Neutrophils in physiology and pathology. Annu Rev Pathol. 19, 227-259 (2024).
  12. Hellebrekers, P., Vrisekoop, N., Koenderman, L. Neutrophil phenotypes in health and disease. Eur J Clin Invest. 48 (Suppl 2), e12943(2018).
  13. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nat Rev Immunol. 19 (4), 255-265 (2019).
  14. Qu, J., Jin, J., Zhang, M., Ng, L. G. Neutrophil diversity and plasticity: Implications for organ transplantation. Cell Mol Immunol. 20 (9), 993-1001 (2023).
  15. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Front Physiol. 9, 113(2018).
  16. Silvestre-Roig, C., Fridlender, Z. G., Glogauer, M., Scapini, P. Neutrophil diversity in health and disease. Trends Immunol. 40 (7), 565-583 (2019).
  17. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  18. Ning, X., Wang, W. M., Jin, H. Z. Low-density granulocytes in immune-mediated inflammatory diseases. J Immunol. 2022, 1622160(2022).
  19. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheum. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  20. Böyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  21. García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J Vis Exp. (74), e50410(2013).
  22. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  23. Midgley, A., Beresford, M. W. Increased expression of low-density granulocytes in juvenile-onset systemic lupus erythematosus patients correlates with disease activity. Lupus. 25 (4), 407-411 (2016).
  24. Rahman, S., et al. Low-density granulocytes activate T cells and demonstrate a non-suppressive role in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 78 (7), 957-966 (2019).
  25. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low-density subpopulations and CD10 (calla) negative neutrophils in severely infected patients. Surg Today. 22, 322-327 (1992).
  26. Lin, A. M., et al. Mast cells and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in psoriasis. J Immunol. 187 (1), 490-500 (2011).
  27. Fu, J., Tobin, M. C., Thomas, L. L. Neutrophil-like low-density granulocytes are elevated in patients with moderate to severe persistent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 113 (6), 635-640 (2014).
  28. Ramanathan, K., et al. Neutrophil activation signature in juvenile idiopathic arthritis indicates the presence of low-density granulocytes. Rheumatology (Oxford). 57 (3), 488-498 (2018).
  29. Grayson, P. C., et al. Neutrophil-related gene expression and low-density granulocytes associated with disease activity and response to treatment in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis. Arthritis Rheumatol. 67 (7), 1922-1932 (2015).
  30. Cloke, T., Munder, M., Taylor, G., Müller, I., Kropf, P. Characterization of a novel population of low-density granulocytes associated with disease severity in HIV-1 infection. PLoS One. 7, e48939(2012).
  31. Rocha, B. C., et al. Type I interferon transcriptional signature in neutrophils and low-density granulocytes is associated with tissue damage in malaria. Cell Rep. 13 (12), 2829-2841 (2015).
  32. Deng, Y., et al. Low-density granulocytes are elevated in mycobacterial infection and associated with the severity of tuberculosis. PLoS One. 11 (4), e0153567(2016).
  33. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
  34. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  35. Sagiv, J. Y., et al. Phenotypic diversity and plasticity in circulating neutrophil subpopulations in cancer. Cell Rep. 10 (4), 562-573 (2015).
  36. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The multifaceted roles neutrophils play in the tumor microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (December), 125-158 (2015).
  37. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  38. Vanhaver, C., et al. Immunosuppressive low-density neutrophils in the blood of cancer patients display a mature phenotype. Life Sci Alliance. 7 (1), e202302332(2023).
  39. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).
  40. Cabrera, L. E., et al. Characterization of low-density granulocytes in COVID-19. PLoS Pathog. 17 (7), e1009721(2021).
  41. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils and neutrophil extracellular traps (nets) are new inflammatory players in heart failure. Can J Cardiol. 40 (9), 1524-1535 (2024).
  42. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils contribute to subclinical inflammation in patients with type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1674(2024).
  43. Jones, B. E., et al. Anca autoantigen gene expression highlights neutrophil heterogeneity, where expression in normal-density neutrophils correlates with anca-induced activation. Kidney Int. 98 (3), 744-757 (2020).
  44. Li, Y., et al. The proportion, origin, and pro-inflammation roles of low-density neutrophils in SFTS disease. BMC Infect. Dis. 19 (1), 109(2019).
  45. Martin, K. R., et al. Cd98 defines a metabolically flexible, proinflammatory subset of low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Clin Transl Med. 13 (1), e1150(2023).
  46. Murphy, M. P., Caraher, E. Mcl-1 is vital for neutrophil survival. Immunol Res. 62 (2), 225-233 (2015).
  47. Nauseef, W. M. Neutrophils, from cradle to grave and beyond. Immunol Rev. 273 (1), 5-10 (2016).
  48. Pérez-Figueroa, E., Álvarez-Carrasco, P., Ortega, E., Maldonado-Bernal, C. Neutrophils: Many ways to die. Front Immunol. 12, 631821(2021).
  49. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  50. Emmendörffer, A., Hecht, M., Lohmann-Matthes, M. L., Roesler, J. A fast and easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorhodamine 123. J Immunol Methods. 131 (2), 269-227 (1990).
  51. Pioch, J., Blomgran, R. Optimized flow cytometry protocol for dihydrorhodamine 123-based detection of reactive oxygen species in leukocyte subpopulations in whole blood. J Immunol Methods. 507, 113308(2022).
  52. Liu, X., et al. Pad4 takes charge during neutrophil activation: Impact of pad4 mediated net formation on immune-mediated disease. J Thromb Haemost. 19 (7), 1607-1617 (2021).
  53. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  54. Alemán, O. R., Mora, N., Cortes-Vieyra, R., Uribe-Querol, E., Rosales, C. Transforming growth factor-β-activated kinase 1 is required for human fcγriiib-induced neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 7, 277(2016).
  55. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent net release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  56. Sanchez Gonzalez, A., Bardoel, B. W., Harbort, C. J., Zychlinsky, A. Neutrophil methods and protocols. , Humana Press - Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  57. Mishalian, I., Granot, Z., Fridlender, Z. G. The diversity of circulating neutrophils in cancer. Immunobiology. 222 (1), 82-88 (2017).
  58. Wright, H. L., Makki, F. A., Moots, R. J., Edwards, S. W. Low-density granulocytes: Functionally distinct, immature neutrophils in rheumatoid arthritis with altered properties and defective TNF signalling. J Leukoc Biol. 101 (2), 599-611 (2017).
  59. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of mdsc: Assays, problems and potential solutions. Cancer Immunol Immunother. 68 (4), 631-644 (2019).
  60. Kimberly, R. P., Ahlstrom, J. W., Click, M. E., Edberg, J. C. The glycosyl phosphatidylinositol-linked FCγRIII PMN mediates transmembrane signaling events distinct from FCγRII. J Exp Med. 171 (4), 1239-1255 (1990).
  61. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Fc receptors: Cell activators of antibody functions. Adv Biosci Biotech. 4, 21-33 (2013).
  62. Unkeless, J. C., Shen, Z., Lin, C. W., Debeus, E. Function of human fcγriia and fcγriiib. Semin Immunol. 7 (1), 37-44 (1995).
  63. Ghaemdoust, F., Keshavarz-Fathi, M., Rezaei, N. Natural killer cells and cancer therapy, what we know and where we are going. Immunotherapy. 11 (14), 1231-1251 (2019).
  64. Lanier, L. L., Le, A. M., Civin, C. I., Loken, M. R., Phillips, J. H. The relationship of CD16 (leu-11) and leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 136 (12), 4480-4486 (1986).
  65. Huizinga, T. W., et al. The pi-linked receptor fcriii is released on stimulation of neutrophils. Nature. 333 (6174), 667-669 (1988).
  66. Jongstra-Bilen, J., Harrison, R., Grinstein, S. Fcγ-receptors induce mac-1 (cd11b/cd18) mobilization and accumulation in the phagocytic cup for optimal phagocytosis. J Biol Chem. 278 (46), 45720-45729 (2003).
  67. Tak, T., et al. Human CD62Ldim neutrophils identified as a separate subset by proteome profiling and in vivo pulse-chase labeling. Blood. 129 (26), 3476-3485 (2017).
  68. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Exp Cell Res. 342 (2), 200-209 (2016).
  69. Schröder, A. K., Uciechowski, P., Fleischer, D., Rink, L. Crosslinking of CD66 b on peripheral blood neutrophils mediates the release of interleukin-8 from intracellular storage. Hum Immunol. 67 (9), 676-682 (2006).
  70. Skubitz, K. M., Campbell, K. D., Skubitz, A. P. Cd66a, cd66b, cd66c, and cd66d each independently stimulate neutrophils. J Leukoc Biol. 60 (1), 106-117 (1996).
  71. Basic principle of magnetic cell separation. , Miltenyi Biotec. https://www.miltenyibiotec.com/UN-en/products/macs-cell-separation/basic-principle-of-magnetic-cell-separation.html?query=:relevance:allCategoriesOR:10000089 (2025).
  72. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci. Rep. 12 (1), 3667(2022).
  73. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  74. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J Clin Invest. 126 (5), 1612-1620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Low Density NeutrophilsMagnetic MicrobeadsNeutrophil PurificationDensity GradientPeripheral BloodFlow CytometryMononuclear CellsReactive Oxygen SpeciesNeutrophil Extracellular TrapsCD66b Marker

Related Articles