מידול גרורות מוח: ניתוח סטנדרטי של קולוניזציה גרורתית ודפוסי גדילה היסטולוגיים באמצעות הזרקה תוך-קורטית סטריאוטקטית

Jessica Alves-de-Lima; Tobias Pukrop; Raquel Blazquez

doi:10.3791/69415

מאמר שיטה

מידול גרורות מוח: ניתוח סטנדרטי של קולוניזציה גרורתית ודפוסי גדילה היסטולוגיים באמצעות הזרקה תוך-קורטית סטריאוטקטית

DOI:

10.3791/69415

⸱

16 בינואר 2026

Jessica Alves-de-Lima¹ , Tobias Pukrop¹^,²^,³^,⁴ , Raquel Blazquez¹

¹Department of Internal Medicine III, Hematology and Medical Oncology, University Hospital Regensburg, ²Bavarian Cancer Research Center (BZKF), ³Center for Translational Oncology, University Hospital Regensburg, ⁴Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine ITEM-R

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת ההזרקה התוך-גולגולתית הסטריוטקטית מאפשרת השתלה מדויקת וממוקדת של תאי גידול בקורטקס העכבר, מה שהופך אותה למודל עוצמתי לחקר קולוניזציה גרורתית במוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות מוח הן סיבוך נפוץ והרסני של גידולים מוצקים מתקדמים, שלרוב קשורים לתחזית לקויה, ירידה נוירולוגית וירידה באיכות החיים. שכיחות כשל מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומוות נוירולוגי עולה במהירות, אך המנגנונים המניעים את השלבים הסופיים של גרורות המוח, כגון התפשטות משנית, התיישבות מחודשת, ותרומת דפוס הגדילה ההיסטולוגי (HGP) כפרמטר תחליפי פוטנציאלי, עדיין אינם מובנים היטב.

מודל ההזרקה התוך-קורטיקלית הסטנדרטי מאפשר השתלה מדויקת וניתנת לשחזור של תאי גידול, או אוכלוסיות מעורבות כולל רכיבים סטרומליים או חיסוניים, ישירות לקורטקס המוח של העכבר. פרוטוקול זה תומך גם ביצירת ארכיון רקמות פרה-קליני, ומציע פלטפורמה איתנה לחקר היבטים חיוניים של קולוניזציה של מערכת העצבים המרכזית, כגון: צמיחה גרורתית, דינמיקת גדילה ייחודית ל-HGP, ומנגנונים פתופיזיולוגיים התורמים לכשל נוירולוגי. בנוסף, מודל זה תומך בבדיקות פרמקולוגיות בהקשר קליני שניתן לשחזר ורלוונטי.

בניגוד לשיטות הזרקה מערכתית (למשל, וריד זנב או תוך-לבבי), שמותאמות לחקר שלבים מוקדמים אך מובילות לשיעורי קולוניזציה מוחית משתנים ולעיתים נמוכים, המודל הסטריאוטקטי מבטיח צמיחה עקבית וספציפית למוח ומאפשר חקירה של שלבים מאוחרים של גרורות מערכת העצבים המרכזית. בהשוואה למערכות אקס-ויבו כמו אורגנואידים או תרביות פרוסות מוח, המודל הסטריוטקטי ב-in vivo שומר על כלי דם, איתות מערכתית ומורכבות מלאה של מערכת החיסון במוח, ותומך במחקרים ארוכי טווח של התקדמות הגידול ותגובתם הטיפולית.

על ידי מתן פלטפורמה ניתנת לשחזור ורלוונטית קלינית, המודל שלנו מקדם את יכולת התחום לזהות סמנים פרוגנוסטיים, לחקור אסטרטגיות טיפוליות ולהבין את המנגנונים של גרורות מוח בשלבים מתקדמים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות מוח הן סיבוך נפוץ והרסני אצל חולים עם גידולים מוצקים, שלרוב קשורים לתחזית לקויה, ירידה נוירולוגית משמעותית וירידה באיכות החיים ^1,2,3. במיוחד, כשל מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומוות נוירולוגי הפכו לתוצאות נפוצות יותר ויותר בסרטן ריאות, שד ומלנומה 4,5,6,7. כשל מערכת העצבים המרכזית בהקשר של גרורות מוחיות יכול להיגרם ממגוון מנגנונים, כולל אפקט מסה מקומי, בצקת סביב גידול, דימום תוך-גולגולתי והתפשטות מנינגיאלית, אשר עשויים לפעול באופן עצמאי או סינרגטי ולבסוף לגרום למוות נוירולוגי⁸.

למרות חשיבותו הקלינית, המנגנונים הפתופיזיולוגיים שמאחורי כישלון מערכת העצבים המרכזית והשלבים הסופיים של התקדמות הגרורות עדיין אינם מובנים היטב. תהליכים כמו הפצה חלופית, הפצה משנית והתיישבות מחדש הם לעיתים רחוקות במרכז החקירה הייעודית⁸. גם מחקרים קליניים וגם פרה-קליניים מגבילים לעיתים את הניתוחים שלהם לנקודות קצה כמו מספר גרורות מוח, גודל, או הישרדות כוללת (OS), ובכך מתעלמים מתובנות מכניות קריטיות ומהסיבות האמיתיות לירידה נוירולוגית ומוות.

בהקשר זה, אנחנו ואחרים זיהינו דפוסי גדילה היסטולוגיים (HGPs) מובחנים בגרורות מוח הקשורים לתוצאות קליניות ^9,10,11. תוארו שלושה HGPים עיקריים: i) לא חדרוניים, מסומנים בגבול גידול מסומן היטב שלעיתים מוקף בשוליים אסטרוציטיים תגובתי; ii) חדירה אפיתלית, שבה אשכולות תאי גידול חודרים לפרנכימת המוח הסמוכה ללא הכלה אסטרוציטית; ו-iii) חדירה מפוזרת, המאופיינת בחדירה נרחבת של תאי גידול בודדים או אשכולות קטנים, הגורמת לאסטרוגליוזיס נרחב^10,12.

קלינית, HGPs חודרניים קשורים לתחזית גרועה משמעותית לעומת דפוסים לא חדירה ^9,10,11. יתרה מזאת, HGPs נראים כמשקפים היבטים מרכזיים של דינמיקת צמיחת הגידול ומנגנונים המובילים למוות נוירולוגי. בעוד שגרורות שאינן חודרניות מתפשטות בדרך כלל כנגע יחיד ומגבילים מבנים חיוניים במוח, נגעים חדירה מראים התפשטות משנית (החל מהנגע הקיים ולא מהגידול הראשוני) בתוך מערכת העצבים המרכזית, מה שתורם לנזק נרחב ולהרס מלא של האיברים (נתונים שלא פורסמו). נגעים חדירה עשויים גם להתיישב מחדש במנינגים, לתרום לגרורות קרום המוח ולהחמיר את מהלך המחלה^10,13. למרות הרלוונטיות הקלינית שלהן, ה-HGPs של גרורות המוח והשלבים הסופיים של התיישבות מערכת העצבים המרכזית, כולל הפצה משנית וקולוניזציה מחדש של אותו איבר, נותרו לא נחקרו, בעיקר בשל חוסר במודלים ניסיוניים מתאימים.

כדי להתמודד עם פער זה, אנו מציגים מודל הזרקה תוך-גולגולתית סטריאוטקטי המאפשר השתלה מדויקת וניתנת לשחזור של תאי גידול או תערובות תאיות הכוללות תאי גידול ואחד או יותר מסוגי תאים שאינם גידולים לתוך קליפת המוח של עכברים ניסיוניים. מודל זה מתגבר על מגבלות מרכזיות של מודלים של גרורות מערכתיות ומציע פלטפורמה איתנה לחקר היבטים חיוניים של קולוניזציה של מערכת העצבים המרכזית, כגון: אינטראקציות בין תאי גידול לתאי חיסון במהלך קולוניזציה¹⁴, השפעת תערובות תאיות מטופלות^{מראש 15}, התפתחות גרורתית¹⁶, דינמיקת גדילה ספציפית ל-HGP ומנגנונים פתופיזיולוגיים התורמים לכשל נוירולוגי (נתונים שלא פורסמו). בנוסף, מודל זה תומך בבדיקות פרמקולוגיות בהקשר שכפול ורלוונטי קלינית^14,15.

פרוטוקול זה מציע מסגרת מתודולוגית מפורטת ליישום מודל ההזרקה הסטריוטקטית לחקר HGP בגרורות מוח. הוא גם תומך בפיתוח ארכיון דגימות פרה-קליני מובנה וספריית רקמות דיגיטלית לחקירה שיטתית של ביולוגיית התיישבות במערכת העצבים המרכזית בשלבים מאוחרים. מטרתנו היא לאפשר זיהוי סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ופוטנציאליים לחזוי, לתרום לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות משופרות, ולשפר את היכולת שלנו לחזות תגובות חריפות וכרוניות של הפרנכימה של המוח ומערכת החיסון. באמצעות גישה זו, אנו שואפים לספק פלטפורמה סטנדרטית למחקר שיטתי של קולוניזציה של מערכת העצבים המרכזית והתקדמות גרורה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ואושרו על ידי ממשלת פרנקוניה התחתונה (מספר היתר: RUF-55.2.2-2532-2-1678). פרוטוקול זה מיועד להזרקה תוך-קורטית סטריאוטקטית של תאי גידול בעכברים בוגרים סינגניים (10-12 שבועות) כמודל להתיישבות גרורתית במוח. כל שינוי בפרוטוקול צריך להידון עם קצין רווחת בעלי החיים המיועד.

1. הליכים טרום-ניתוחיים

הסתגלות בעלי חיים
הערה: יש להסתגל עכברים לפחות 7 ימים לפני תחילת ההליכים הניסיוניים.
1. לאחסן בעלי חיים ניסיוניים בקבוצות בתנאי מעבדה סטנדרטיים (22 ± 2 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 50-60%, מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ולמים.
2. כדי לקדם רווחה ולהפחית לחץ, לספק העשרה סביבתית בצורת חומרי קינון, מקלטים ובלוקי נשיכה.
3. לטפל בבעלי חיים פעם ביום (3-5 דקות במפגש) במהלך תקופת ההסתגלות כדי להכיר אותם למגע אנושי. בנוסף, לבצע הליכים מדומים המדמים היבטים מרכזיים של הניתוח הקרוב, כולל שקילה וחשיפה למערכת ההרדמה, ללא ביצוע התערבות פולשנית. המפגשים הללו נועדו להרגיל את בעלי החיים לסביבה הפרוצדורלית ולמזער שונות הקשורה ללחץ.
בדיקה גופנית (בדיקת בריאות טרום-ניתוחית)
הערה: לפני הזרקת תאי הגידול, כל בעלי החיים חייבים לעבור בדיקה פיזית ונוירולוגית מקיפה כדי למנוע חריגות קיימות שאינן קשורות למחקר. בעלי חיים שמפגינים ליקויים או אנומליות צריכים להיפסל מהמחקר. הבדיקה הגופנית יכולה להתבצע ביום שלפני ההזרקה.
1. בצע בדיקה גופנית מלאה להערכת הבריאות הכללית, כולל מצב הפרווה שלה, יציבה, נשימה, הליכה, משקל גוף והתנהגות כללית.
2. העריכו תפקוד נוירולוגי באמצעות מבחן חוט תלוי כדי להעריך את חוזק האחיזה והקואורדינציה. לביצוע מבחן חוט תלוי, יש לתלות חוט אופקי (בקוטר של כ-2 מ"מ) בין שני תומכים, כאשר פלטפורמות המילוט ממוקמות בקצוות כ-30 ס"מ מעל משטח מרופד. הנח את העכבר במרכז החוט ותן לו לאחוז בחוט עם כפות רגליו הקדמיות. שחרר את העכבר והתחל לזמן מיד. מפסיקים את הניסיון כאשר העכבר מגיע לאחת הפלטפורמות או נופל. תחשוב על עכבר כמוצלח אם הוא מגיע לפלטפורמה בתוך 60 שניות; רשם ככשל אם הוא נופל או לא מגיע לפלטפורמה במסגרת הזמן הזו.
הכנת תחנות עבודה
1. ביום הניתוח (היום 0), הקימו ארבע עמדות עבודה ייעודיות כפי שמתואר להלן כדי להבטיח זרימת עבודה יעילה ולשמור על טכניקה סטרילית לאורך כל ההליך.
  הערה: השתמשו בחומרים כירורגיים סטריליים (שכבות תחתונה, קומפרסי גזה, תפרים וכו') ובכלים כירורגיים עם אוטוקלב (סכין מנתח, מלקחיים, מספריים, מרית וכו').
  1. תחנת עבודה #1 - הכנת בעלי חיים לפני ניתוח: השתמשו בתחנת העבודה הזו לשקול העכברים, הכנת תמיסת ההרדמה ומתן ההרדמה. הכינו משטח נקי המכיל משקל שקילה, שני כלובים עם מצעים (ייעודו אחד לעכברים מורדמים), מזרק של 1 מ"ל מלא בתמיסת ההרדמה, ומשחת עיניים.
  2. תחנת עבודה #2 - הכנה לפני ואחרי הניתוח: השתמשו בתחנת העבודה הזו לביצוע חתך בקרקפת, לאטום את הגולגולת ולתפור את הפצע. הכינו משטח נקי המכיל סכין מנתח, מזרק בנפח 10 מ"ל עם 0.9% NaCl, שעוות עצם, מרית, חומר תפירה, מלקחיים ומספריים, מטליות כותנה, חומר חיטוי (70% אתנול), מזרק של 1 מ"ל עם משככי כאבים, וכרית חימום או פלטפורמת חימום דומה.
  3. תחנת עבודה #3 - הכנת תאי הגידול: השתמשו בתחנת עבודה זו להכנת תמיסת תאי הגידול לפני החיסון. הכינו משטח נקי המכיל קופסת קרח עם מזרק המילטון בנפח 10 מיקרוליטר וצינור אפנדורף עם תליית תא במדיום מטריצה חוץ-תאית (ECM), פיפטה עם קצות של 100 מיקרוליטר להשעיית תאים, ושלושה כלים לניקוי מזרק המילטון לאחר חיסון תאי הגידול המכילים מים מזוקקים, 70% אתנול ו-0.9% NaCl.
  4. תחנת עבודה #4 - הזרקה סטריאוטקטית: השתמשו בתחנת עבודה זו כדי לבצע את הזרקת תאי הגידול הסטריוטקטיים לקורטקס המוח. הכינו משטח נקי המכיל את המסגרת הסטריאוטקטית לבעלי חיים קטנים, מקדחה דנטלית מדויקת, מלקחיים גדולים ומשטחי כותנה.
הכנת השעיית תאי הגידול
הערה: כל ההליכים להכנת תליית תאי הגידול חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית מוסמך (מכסה Class II) באמצעות ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות והגנה על העיניים, כדי להבטיח סטריליות ולהגן על הצוות מחשיפה לביולוגית פוטנציאלית.
1. טריפסיניזציה של תאים באמצעות 1 מ"ל טריפסין 1x EDTA.
  הערה: מומלץ להשתמש בתאי גידול בשלב הצמיחה האקספוננציאלית.
2. קבעו את ספירת התאים במדויק באמצעות שיטת ספירה מתאימה (למשל, המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי).
3. הכינו מתלה תאים המכיל 1 x 10^תאים ב-3 מיקרוליטר ECM-medium לכל בעל חיים. השתמשו בתערובת 2:1 של ECM ומדיום תרבית סטנדרטי המכיל 10% FCS ותוספים נוספים לפי הצורך. הגדילו את נפח המתלים ומספר התאים בהתאם למספר בעלי החיים (למשל, עבור 10 עכברים, הכינו 10 ×-^{10 3} תאים ב-30 מיקרוליטר ECM-medium).
  הערה: מספר התאים המוזרקים צריך להיות מאוזן בקפידה עבור כל קו תאים.
4. השאירו את תליית התא על הקרח עד להזרקה, למשך מקסימום של 2 שעות.

2. הליכים תוך-ניתוחיים

הרדמה בעכברים
1. שקלו כל עכבר באמצעות משקל מדויק וחשבו את נפח ההרדמה הנדרש לפי משקל הגוף.
2. תנו את נפח ההרדמה המחושב תוך-הצפקית.
  הערה: השתמשו במשטר הרדמה שמכסה את כל ההליך (כ-2 שעות). לדוגמה: קטמין 10% (קטמין הידרוכלוריד, 100 מ"ג/מ"ל; 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) בשילוב עם דומיטור (מדטומידין הידרוכלוריד, 1 מ"ג/מ"מ; 0.25 מ"ג/ק"ג משקל גוף), או פרוטוקול מקביל.
3. לאחר שמאומת עומק הרדמה מספק, מניחים את העכבר על כרית חימום מחוממת מראש (נשמרת בטמפרטורה של 37-38 מעלות צלזיוס) לתמיכה בוויסות החום ומרחו משחה עיניים להגנה על הקרנית מהתייבשות.
  הערה: ודאו עומק הרדמה מספק על ידי צביטה עדינה של כף הרגל האחורית עם מלקחיים. המשך בניתוח רק אם לא נצפה רפלקס גמילה.
הכנת הקרקפת וחתך
1. ניתן לידוקאין לפני הניתוח כדי לספק הרדמה מקומית באתר החתך. השתמש בתמיסת לידוקאין 1% (5 מ"ג/מ"ל) והזריק כ-0.05-0.1 מ"ל תת-עורית לאורך קו החתך המתוכנן. יש לתת לפחות 2-3 דקות עד שההרדמה תשפיע לפני שממשיכים בחתך בקרקפת.
2. חטא היטב את הקרקפת באמצעות תמיסה מבוססת יוד.
3. מתוח את העור ויצר חתך באמצע של כ-3-4 מ"מ לאורך הגולגולת באמצעות סכין סטרילית.
4. באמצעות אותו סכין, גרדו בעדינות את הפריוסטאום כדי לחשוף את פני הגולגולת.
הגדרת מסגרת סטריאוטקטית, זיהוי קואורדינטות וקרניוטומיה
1. אבטח את ראש העכבר במסגרת הסטריאוטקטית באמצעות מוטות אוזניים.
2. באמצעות הזרוע הסטריוטקטית, אתר את הברגמה (הצטלבות התפרים של הגולגולת הקורונלית והסאגיטלית) ואז הזז את הזרוע הסטריוטקטית 2 מ"מ קדמי ו-1 מ"מ לרוחבי (ימין) לאתר ההזרקה במטרה בקורטקס הפרונטלי כפי שמצוין באיור 1B ומסמן אותה בסמן ניתוחי.
  הערה: אם יש כלי דם באתר ההזרקה המיועד, ניתן לכוונן את המיקום עד 0.5 מ"מ כדי למנוע דימום.
3. קדחו בזהירות דרך הגולגולת באמצעות מקדחה דנטלית מדויקת, תוך זהירות שלא לחדור את הדורה-מטר.
4. אשר את הפתח על ידי בדיקה עדינה עם מלקחיים סטריליים כדי להרגיש פריצה.
הזרקת תאי גידול
הערה: יש לעבוד במהירות בשלב זה, כאשר ה-ECM מתחיל להתגבש בטמפרטורת החדר, מה שעלול להפריע לדיוק ולעקביות של ההזרקה.
1. החזירו את השעיית תאי הגידול היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח חלוקה אחידה.
  הערה: הימנעו מערבולות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
2. טעינו 3 מיקרוליטר של מתלה התא לתוך מזרק המילטון בנפח 10 מיקרוליטר ומניחים אותו במסגרת הסטריאוטקטית באמצעות המחזיק המתאים.
3. מקם בזהירות את מחט המזרק מעל חור הבר.
  הערה: ודא שהזווית של המחט פונה שמאלה כדי לשפר את השחזור במהלך ההזרקה.
4. הכנס את המחט אנכית לרקמת המוח לעומק של 3.5 מ"מ. לאחר שמגיעים לעומק זה, משכו את המחט בהדרגה ב-0.5 מ"מ כדי לסייע במניעת ריפלוקס של תליית התא במהלך ואחרי ההזרקה.
5. הזרקו את 3 מיקרולטר של תאי תאי הגידול בהדרגה במשך דקה אחת. לאחר שהנפח כולו נמסר למים, השאר את המחט במקום עוד שתי דקות כדי לאפשר לתאים ול-ECM להירגע, ובכך למזער כל סיכון לריפלוקס.
6. הוצא בזהירות את המזרק והוציא את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית.
תפירה והחלמה מהרדמה
1. שטוף בעדינות את הגולגולת בתמיסת NaCl סטרילית של 0.9%.
2. ייבשו ואטומו את חור הבור עם שעוות עצם.
3. סגור את חתך הקרקפת באמצעות 3 עד 4 תפרים, ודא שכל תפר קשור בשלושה קשרים הדוקים המונחים קרוב לקצוות הפצע לצורך ריפוי תקין.
4. סמן את אוזני העכבר בדפוס מחורר אוזניים מתאים למספר הזיהוי המיועד.
5. יש למרוח מחדש משחה לעיניים במידת הצורך כדי למנוע ייבוש בקרנית במהלך ההחלמה. מיד לאחר מכן, החזירו את העכבר לכרית חימום מחוממת מראש (נשמרת על 37-38 מעלות צלזיוס) לתמיכה בוויסות החום ולהקל על התאוששות חלקה מההרדמה.
  הערה: מומלץ לאכלס עכברים בנפרד במהלך ההחלמה כדי למנוע פציעות כתוצאה מאינטראקציות בין בעלי חיים ערים למחלים.
6. נקה וחיטא היטב את מזרק המילטון על ידי שטיפת המחט והחבית שלוש פעמים ברצף: תחילה במים מזוקקים, אחר כך עם 70% אתנול, ולבסוף בתמיסת NaCl סטרילית של 0.9%.
7. לאחר הניקוי, אחסן את מזרק המילטון על קרח עד לשימוש הבא.

3. הליכים לאחר ניתוח

הקלה בכאבים לאחר ניתוח
1. נתנו משככי כאבים תת-עורית בזמן שהעכבר עדיין תחת הרדמה כדי להבטיח הקלה מיידית בכאבים לאחר הניתוח.
  הערה: השתמש במשככי כאבים המתאימים לסוג הליך זה. לדוגמה, קרפרופן ב-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
2. לאחר שהעכבר ער לחלוטין וחזר לתפקוד מוטורי תקין, העבירו אותו לכלוב נקי עם מצעים חדשים. לעקוב בקצרה אחרי החיה להתנהגות ודפוסי נשימה תקינים.
3. לאחר החלמה מלאה, יש לספק הקלה בכאבים באמצעות שתייה מים (למשל, מטאמיזול במינון של 200 מ"ג/ק"ג משקל גוף) למשך לפחות 24 שעות לאחר הניתוח.
  הערה: כדי לעודד צריכת מים, יש להמתיק את מי השתייה עם סוכרוז של 0.5%. עטוף בקבוקי שתייה בנייר אלומיניום כדי להגן על התמיסה מאור והחלף אותם מדי יום. תייגו כל בקבוק כדי לעקוב אחרי צריכת משכי הכאב. אם לא צורכים משככי כאבים במים שתייה או אם מופיעים סימני כאב, ניתן לתת קרפרופן (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) תת-עורית כל 12 שעות עד להחלמה מלאה.
ניטור עכברים
1. יש לעקוב מקרוב אחרי כל העכברים כל 24 שעות במהלך 48 השעות הראשונות לאחר הניתוח, תוך הערכת תפקוד מוטורי והתנהגות. מהיום השלישי ואילך, יש לעקוב אחרי עכברים לפחות כל 3 ימים, כולל מדידות משקל גוף.
2. אם נצפו סימני מצוקה או התנהגות חריגת (למשל, פגיעה בפעילות מוטורית, התנהגות חריגה), יש לבצע את מבחן חוט תלוי, כפי שתואר קודם. אם העכבר עובר את המבחן, המשך לעקוב ולחזור על הבדיקה כל יומיים.
3. הורד עכברים מיד (ראה סעיף 3.4) לאחר עמידה באחד מהיעדים האנושיים שהוגדרו מראש: ירידה במשקל > 20% ממשקל הגוף ההתחלתי (יום 0), כישלון לעבור את מבחן חוט התלוי, או מצוקה בינונית מתמשכת שנמשכת עד 48 שעות.
טיפול טיפולי (אופציונלי)
1. לאחר החלמה מלאה לאחר הניתוח, ניתן להתחיל משטר טיפולי בהתאם לעיצוב הניסוי. אם זה המצב, יש להגדיר בבירור את מועד תחילת הטיפול בפרוטוקול המחקר ולהתאים את תוכנית המעקב כך שתשקף את ההשפעות הצפויות ותופעות הלוואי האפשריות של ההתערבות הטיפולית.
  הערה: הטיפול לא צריך להתחיל עד שהחיות מציגות התנהגות תקינה, משקל יציב וללא סימני מצוקה לאחר הניתוח.
המתת חסד ואיסוף רקמות
הערה: יש להמתים עכברים מיד לאחר עמידה בנקודות סיום הומניות מוגדרות מראש או בנקודות זמן ניסוי מוגדרות, בהתאם לדרישות מטרות המחקר הספציפיות.
1. הרדימו את העכבר בשיטה מתאימה (ראו שלב 2.1.2).
2. פתח את חלל החזה ובצע פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם 10-20 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי קרח, ואחריו 10-20 מ"ל פאראפורמלדהיד 4% קר (PFA).
  הערה: אם נדרש רקמה טרייה ליישומים במורד הזרם (למשל, בידוד RNA או FACS), יש להשמיט את שלב הפרפוזיה של PFA.
3. אסוף את המוח ואיברים אחרים שמעניינים אותם.
  הערה: האיברים יכולים להיות מוקפאים בחנקן נוזלי, מקובע בפורמלין לעיבוד FFPE, או לשימוש ישיר לניתוחים במורד הזרם.
ניתוח מובנה לאחר המוות
הערה: כדי לאשר צמיחה גרורתית ולאפיין תכונות היסטופתולוגיות נלוות, יש לבצע ניתוח לאחר המוות של רקמת המוח באמצעות דגימות מקומיות (מוקפאות טריות) ודגימות קבועות (FFPE).
1. ניתוח רקמות
  1. נתח את המוח ברמת אתר ההזרקה, כפי שמוצג בסכמה שמופיעה באיור 1C.
  2. שמור את החלק הקדמי לעיבוד קפוא טרי (FF). חלק חלק זה לחצי כדור מוזרק (i.) וחצי כדור לא מוזרק (n.i.).
  3. שמרו את החלק המרכזי לקיבוע פורמלין והטמעת פרפין (FFPE).
  4. השליכו את החלק האחורי, כולל המוחון וגזע המוח.
2. עיבוד דגימות
  1. הקפיאו את החלק הקדמי בחנקן נוזלי ואחסנו דגימות FF בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
  2. מקבע את החלק המרכזי ב-5-7 מ"ל של 4% PFA בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות לפני עיבוד FFPE.
    הערה: יש לבצע קיבוע PFA באמצעות מכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן מתאים כדי להימנע מחשיפה לאדים רעילים.
3. כימות עומס גרורתי (דגימות FF)
  1. לבודד את סך ה-RNA באמצעות ערכת חילוץ מתאימה או פרוטוקול מותאם לרקמת מוח.
    הערה: בידוד ה-RNA חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית באמצעות ציוד מגן מתאים למניעת זיהום וחשיפה לחומרים מסוכנים.
  2. בצע PCR כמותי (qPCR) באמצעות סמן ספציפי לתאי הגידול, כגון Ck8.
    הערה: מטרות נוספות (למשל, סמנים חיסוניים או תאי סטרומל) עשויות להיבחן על ידי בחירת סמנים גנטיים מתאימים. ריצוף RNA (RNA-seq) עשוי לשמש כחלופה לניתוח טרנסקריפטום רחב.
  3. חישבו את נטל הגידול היחסי על ידי נרמול הגן הרלוונטי (GOI, למשל, Ck8) לגן ניקיון (HK).
4. ניתוח היסטולוגי (דגימות FFPE)
  1. הטמעת רקמה מקובעת בפורמלין בפרפין.
  2. דגימה בחתך לפרוסות בעובי 3 מיקרון באמצעות מיקרוטום.
    הערה: השימוש במיקרוטום חייב להתבצע על ידי צוות מיומן עם ציוד מגן מתאים, תוך שימוש במגן הלהבים כאשר אינם חותכים ולהשליך את הלהבים במיכלים חדים כדי להבטיח בטיחות.
  3. לבצע צביעת המטוקסילין ואיוזין (H&E) סטנדרטית ואימונוהיסטוכימיה (IHC) באמצעות נוגדנים רלוונטיים, כגון Ck8 (תאי גידול), Cd3 (תאי T), Iba1 (מיקרוגליה/מקרופאגים) ו-Gfap (אסטרוציטים).
    הערה: יש לבצע הליכי H&E ו-IHC באזור מאוורר היטב או במכסה אדים כדי להבטיח בטיחות ולמנוע חשיפה לכימיקלים.
  4. סרוק דיגיטלית את כל השקופיות המוכתמות באמצעות סורק שקופיות ברזולוציה גבוהה לבניית ספריית רקמות דיגיטלית.
  5. הערכת דפוס הגדילה ההיסטולוגי (HGP) של הגרורות המוחיות בהתאם לפרוטוקול^שפורסם ^10,12.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול ההזרקה הסטריאוטקטית (איור 1) יכול להיות מיושם הן על מודלים סינגניים והן על מודלים של עכברים מסוג זנוגרפט, כולל זנים מסוג פראי או מהונדסים גנטית, בהתאם לשאלה המדעית. ניתן להשתמש בכל קו תאים מתאים שיכול לגדול במוח. דוגמאות לקווי תאי גידול עכברים שיכולים ליישב את המוח כוללות, אך לא מוגבלות ל, תאי גידול השד 4T1 ו-410.4, תאי סרטן המעי הגס CMT93, וקו תאי המלנומה B16-F10. הזמן הנדרש לתאי הגידול להקים גרורות במוח משתנה בין קו תאים, ונע ממספר ימים ועד מספר שבועות, והחדירה משתנה גם היא. אנו ממליצים להשתמש במודל עם חדירות ~70%, כלומר לפחות 7 מתוך 10 בעלי חיים מפתחים גרורות בתוך תקופת ניסוי מקסימלית של 20 שבועות (איור 2A). כל קו תאים צריך להיות מותאם בנפרד, ומספר התאים המוזרקים צריך להיות מוטל בזהירות.

לדוגמה, השווינו שני מודלים קרובים של גרורות מוח של סרטן שד סינגני: 410.4 ונגזרתו 4T1. למרות הדמיון הגנטי שלהם¹⁷, קווי תאים אלו מציגים התנהגות גרורתית ודפוסי גדילה שונים באופן ניכר^במוח. בעוד ששניהם משיגים עומס גרורתי דומה (איור 2B), כל אחד מציג מסלול זמן ייחודי (איור 2C) ו-HGPs מובחנים בבירור (איור 2D). כדי להעריך ולהשוות באופן שיטתי את יעילות ההתיישבות בין קווי תאים שונים, פיתחנו את מדד הקולוניזציה, נוסחה מתמטית המשלבת את מספר התאים שהוזרקו, זמן הישרדות חציוני והצלחת הקולוניזציה (איור 2E-G).

כאשר מבצעים את הזרקת הסטריאוטקטיקה בפעם הראשונה או בודקים קו תאים חדש, חשוב להעריך בקפידה את דפוסי הגדילה ולהשוות תוצאות בין בעלי חיים, ניתוחים וניסויים כדי להבטיח שחזוריות. שלב קריטי הוא הזרקת תאי הגידול, שבמהלכה עלולה להתרחש דליפה של השעיית התא. דבר זה עלול לגרום למיקום מטעה של הגידול, במיוחד זריעה יטרוגנית של תאי גידול על הגולגולת ו/או על קרום המוח, מה שעלול להוביל לגרורות מנינגיאליות חיוביות שגויות שאינן מייצגות קולוניזציה תוך-מוחית אמיתית עם התפשטות משנית של קרום המוח בהמשך. תרחישים אלו מוצגים באיור 3.

figure-results-1
איור 1: פרוצדורות לפני, תוך-ואחרי ניתוח להזרקת תאי גידול תוך-קורטיקליים סטריאוטקטית בעכברים. סקירה סכמטית של ההליך. (א) השלב שלפני הניתוח כולל הסתגלות בעלי חיים, הערכת בריאות, הכנת אתר הניתוח והשעיית תאי הגידול. (ב) השלב התוך-ניתוחי כולל השראת הרדמה, חתך בקרקפת, מיקום במסגרת הסטריאוטקטית, קרניוטומיה מדויקת, הזרקת תאי גידול לקורטקס המוחי באמצעות קואורדינטות סטריאוטקטיות, סגירת פצע והחלמה מהרדמה. (ג) השלב שלאחר הניתוח כולל מתן משככי כאבים, ניטור שגרתי להערכת ההחלמה לאחר הניתוח, מצב בריאות כללי והתפתחות תסמינים נוירולוגיים (בדיקת חוט תלוי), ואחריו המתת חסד ואיסוף איברים. ניתוח מובנה לאחר המוות נכלול להערכת עומס גרורות ברקמה קפואה טרייה (FF) באמצעות qPCR ולהערכת דפוסי גדילה היסטולוגיים בדגימות FFPE מתוך ספריית שקופיות דיגיטלית. שלבים פרוצדורליים מרכזיים מוצגים ברצף כדי להדגיש את התזמון ותהליך הניתוח. תמונה נוצרה ב-BioRender. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: תוצאות מייצגות של גידול גרורתי במודלים של גרורות מוח בעכברים לאחר הזרקה סטריאוטקטית לתאי סרטן השד 4T1 ו-410.4. (א) תמונות מקרוסקופיות המראות היעדר גידול בעכברי בקרה שהוזרקו ל-ECM ב-Balb/C (בקרה) ונוכחות נגעים גרורתיים גלויים בעכברים שהוזרקו לתאי גידול-ECM (Met). (ב) כימות עומס גרורתי בעכברי ביקורת שהוזרקו ל-ECM (CTRL) ועכברים עם גרורות מוח שמקורן בתאי סרטן השד 4T1 ו-410.4. העומס הגרורתי הוערך על ידי qPCR באמצעות Ck8 כסמן גידול, כאשר Gapdh ו-Pgk1 היו גנים לניקיון (HK). הנתונים מוצגים כערכים ממוצעים עם נקודות נתונים בודדות. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דאנט (n = 5; ****P < 0.0001). (ג) עקומות הישרדות של קפלן-מאייר השוות את ההישרדות הכוללת (OS) של עכברים שהוזרקו סטריאוטקטית בתאי גידול עם ECM בלבד (ביקורת, שחור), 4T1 (כתום) או 410.4 (כחול). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן Log-rank (Mantel-Cox) (4T1 לעומת 410.4; n = 10; ***P < 0.001). (ד) תמונות היסטולוגיות מייצגות של גרורות מוח שמקורן בתאי 4T1 ו-410.4, הממחישות הבדלים בדפוסי גדילה, כולל HGP אפיתל חדרן דמויי קוהורט וחוט, בהתאמה. חתכי הרקמה צובקו בנוגדן אנטי-ציטוקרטין 8. (ה) ניתוח השוואתי של יעילות ההתיישבות באמצעות מדד ההתיישבות (CI). ערכי CI של 4T1 (כתום) ו-410.4 (כחול) מוצגים. (ו) נוסחה המשמשת לחישוב CI. (ז) טבלה המסכמת את הפרמטרים הכלולים ב-CI עבור שני המודלים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: דוגמאות מייצגות לתוצאות הזרקה סטריאוטקטית מוצלחות ולא אופטימליות. (A,C) תמונות מקרוסקופיות המציגות גידול גרורתי במיקומים שונים: (א) גידול בגולגולת ובקרום המוח כתוצאה מהזרקה שגויה, ודליפה לא נכונה של תאי הגידול, ו-(ג) גרורות פרנכימליות מוצלחות לאחר הזרקה תוך-קורטיקלית נכונה. (B,D) חתכים היסטולוגיים תואמים מאשרים (B) צמיחת גידול תוך-מנינגיאלי עם חדירה מאוחרת לפרנכימה במוח, ו-(D) התפשטות משנית למנינגות כתוצאה מגרורה פרנכימלית מבוססת. חתכי הרקמה צובקו בנוגדן אנטי-ציטוקרטין 8. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת ההזרקה התוך-גולגולתית סטריאוטקטית מאפשרת העברה מדויקת ומקומית של תאי גידול או תערובות תאיות ישירות לקורטקס המוחי של עכברים ניסיוניים. בשילוב עם ניתוח מובנה לאחר המוות, מודל זה בעל ערך מיוחד לחקר שלבים מאוחרים של גרורות מוח, כולל צמיחה גרורתית, התפשטות תוך-איברית משנית וסיבת המוות האפשרית. לעומת זאת, שיטות הזרקה מערכתית (למשל, וריד זנב או הזרקה תוך-לבבית) מתאימות יותר לחקירת השלבים הראשונים של מפל הגרורות, כגון הישרדות תאי הגידול במחזור הדם, אקסטרווזציה וזריעה באיברים רחוקים. עם זאת, גישות אלו אינן ספציפיות למוח ובדרך כלל מובילות לשיעורי התיישבות מוחיים נמוכים ובלתי עקביים 18,19,20.

מודלים מערכתיים מראים גם שונות ביולוגית גבוהה, במיוחד במונחים של אזורים מוחיים מושפעים, מה שהופך מחקרים טיפוליים למאתגרים ודורשים קבוצות בעלי חיים גדולות. בנוסף, בעלי חיים מפתחים לעיתים גרורות חוץ-גולגולתיות, שעלולות להוביל להפסקת ניסוי מוקדם¹⁹. מגבלות אלו מפחיתות משמעותית את יעילותן לחקר גרורות מוח בשלבים מתקדמים. יתרה מזאת, הפצה משנית והתיישבות מחדש קשה במיוחד לחקירה באמצעות מודלים מערכתיים, שכן ההבחנה בין התפשטות ראשונית (שמקורה בגידול הראשוני) לבין התפשטות משנית (הנובעת מטוסטזה שכבר קיימת) היא כמעט בלתי אפשרית. יתרה מזאת, ניתוח מובנה לאחר המוות, במיוחד להערכת צמיחה מאקרו-גרורתית ו-HGP של גרורות מוח, מוגבל במצבים אלו.

בהשוואה למערכות אקס ויבו, כגון אורגנואידים שמקורם במטופל (PDOs) ותרבויות אורגנוטיפיות של פרוסות מוח (קו)-^{תרביות 21,22,23,24}, ההזרקה הסטריוטקטית מציעה מספר יתרונות קריטיים. בעוד שמודלים אקס-ויבו שומרים על היבטים של מבנה המוח הטבעי ועשויים לכלול תאי חיסון תושבים וחודרים ממטופלים או תורמים, הם חסרים כלי דם, איתות מערכתית ומורכבות מלאה של מיקרו-סביבת הגידול ב-invivo, במיוחד חדירה נוספת של תאי T או תאי חיסון אחרים שמקורם בדם או מח עצם²³. מגבלות אלו מגבילות את יישומן למחקרים קצרי טווח ולסביבות פשוטות, כמו סקר סמים או בדיקות אינטראקציה גרורתיות בין תא למוח. לעומת זאת, הגישה הסטריוטקטית תומכת במחקרים ארוכי טווח של התקדמות הגידול, תגובה חיסונית והתערבות טיפולית בתוך אורגניזם חי ושלם. חשוב לציין שהערכת התסמינים הנוירולוגיים כנקודת סיום הומנית מאפשרת מדד קליני רלוונטי להופעת מאקרו-גרורה. זה הופך את המודל למשתקף עוד יותר את מסלול המחלה האנושית, שהוא בעל ערך מיוחד במחקר תרגומי. למרות שמדובר בשימוש בבעלי חיים, ומעלה שיקולים אתיים המטופלים על ידי היצמדות ל-3R (החלפה, הפחתה ועיבוד), מודל זה כיום אינו ניתן להחלפה מלאה בחלופות אקס ויבו. יכולתו לשחזר את ההקשר הפיזיולוגי המלא של גרורות המוח הופכת אותו לבלתי ניתן להחלפה לקידום הבנתנו של דינמיקת גרורות ופתופיזיולוגיה ייחודית למערכת העצבים המרכזית.

למרות יתרונותיו הרבים, למודל ההזרקה הסטריוטקטית יש מגבלות שיש לקחת בחשבון. דאגה מרכזית היא דליפה אפשרית של תאי הגידול בזמן הזריקה, מה שעלול לגרום לדפוסי גדילה מטעים. במיוחד, היצמדות לא מכוונת של תאי הגידול למנינגות עלולה להוביל לגרורות מנינגיאליות איאטרוגניות⁸, שאינה משקפת במדויק את מהלך ההתפשטות הטבעי של הגרורות בקו התאים הספציפי הזה. כדי להבטיח אמינות נתונים, יש להשוות באופן עקבי את דפוסי הגדילה של קו תאי גידול נתון בין בעלי חיים, פרוצדורות ניתוח וניסויים. כדי למזער דליפת תאי הגידול, אנו מציעים להשתמש במטריצה חוץ-תאית (ECM), שכן העקביות הג'לית שלה ויכולתה להתגבש בטמפרטורת הגוף הופכות אותה לכלי שימושי. עם זאת, ECM מציב גם אתגרים, כולל הצורך בטיפול מהיר במהלך ההזרקה כדי למנוע התגבשות מוקדמת. שיקול נוסף בפרוטוקול שלנו הוא שתאי הגידול מוזרקים בתערובת של ECM ותוים המכילים סרום. בעוד ש-FBS משפר את השתלת תאי הגידול על ידי אספקת חומרים מזינים שמוגבלים בדרך כלל במוח, הוא עשוי גם לקדם דלקת. אם זה מדאיג, ניתן להשתמש במדיה ללא סרום או תמיסות מלח מאוזנות (למשל, HBSS או PBS) כחלופות.

בנוסף, הזרקה סטריאוטקטית היא טכנית תובענית יותר משיטות אחרות, כמו הזרקה תוך-ורידית (in.v.). התהליך דורש הכשרה ייעודית כדי להבטיח שחזור, וההליך גוזל הרבה יותר זמן, בדרך כלל לוקח 15-30 דקות לכל בעל חיים לעומת 3-5 דקות להזרקות עירוי. משך הזמן הארוך הזה מגביל את מספר בעלי החיים שניתן לעבד בכל מפגש, מה שעלול להוות אתגר למחקרים טיפוליים שדורשים קבוצות גדולות כדי להשיג עוצמה סטטיסטית. עם זאת, ניתן לטפל במגבלה זו ביעילות על ידי חלוקת הזרקות על פני מספר ימים, מה שלא רק מגביר את הגמישות וההיתכנות הניסויית, אלא גם יוצר שונות ביולוגית חשובה, המשקפת הבדלים ריאליסטיים יותר בין-אישיים הן בהתנהגות תאי הגידול והן בתגובת המארח.

לבסוף, חשוב לציין שמודל זה עוקף את השלבים המוקדמים של מפל הגרורות, כפי שנדון קודם. המודל הניסויי המתאים צריך להיבחר בהתבסס על שאלת המחקר והשלב הספציפי של הגרורות הנחקר. לחקירת קולוניזציה מוחית בשלבים מתקדמים, ההזרקה התוך-קורטית הסטריוטקטית נשארת הסטנדרט הזהב.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.A.L. ו-R.B. קיבלו מימון מ-DFG (TRR305-B03).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג
פליירים עם מאגר אוזניים לבעלי חיים	LabArt
Bepanthen® משחה לעיניים ולאף	Bayer Vital GmbH	1578675
שעוות עצם	ב. בראון	210434
מטליות כותנה	הרטמן	143213
תמצית ממברנת בסיס Cultrex (ECM)	B& D	3432-005-01
חומר חיטוי	ב. בראון	107190
מקדח	Bilaney Consultants GmbH	D #76
מספריים לעיניים	הרמל	501
מזרק המילטון (10&מיקרו; כרך L)	VWR	5491135
כרית חימום	אינטרגסטרו	258122
בדיקת אף/מוט שיניים בעכבר (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
מספריים לעיניים של Noyes	הרמל	545
Paur 60 ו-deg; טיפ נון נופטור מוטות אוזן עכבר	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
סכין מנתח	PFM Medical AG	17027
מלקחיים סטנדרטיים של סמקין	הרמל	710
תפר פוליאמיד סרלון (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	סרג-ויסנר GmbH	V0053491
Stereotaxic Drill - ג'ייקובס צ'אק - 18000 סל"ד	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
סטריאוטקסית ללא מתאם עכברוש	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963% 920
הארדר מזרק ל-5& 10&מיקרו; ל המילטון	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
TC Needleholders Mayo-Heear 160 מ"מ	הרמל	6425

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wu, A., Colón, G. R., Lim, M. Quality of life and role of palliative and supportive care for patients with brain metastases and caregivers: A review. Front Neurol. 13, 806344(2022).
Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S. Brain metastases: Epidemiology. Handb Clin Neurol. 149, 27-42 (2018).
Aizer, A. A., et al. Brain metastases: A society for neuro-oncology (sno) consensus review on current management and future directions. Neuro Oncol. 24 (10), 1613-1646 (2022).
Wang, B. X., et al. Impacts of egfr mutation and egfr-tkis on incidence of brain metastases in advanced non-squamous nsclc. Clin Neurol Neurosurg. 160, 96-100 (2017).
Goncalves, P. H., et al. Risk of brain metastases in patients with nonmetastatic lung cancer: Analysis of the metropolitan detroit surveillance, epidemiology, and end results (seer) data. Cancer. 122 (12), 1921-1927 (2016).
Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in seer database. J Cancer Res Clin Oncol. 144 (9), 1803-1816 (2018).
Sampson, J. H., Carter, J. H. Jr, Friedman, A. H., Seigler, H. F. Demographics, prognosis, and therapy in 702 patients with brain metastases from malignant melanoma. J Neurosurg. 88 (1), 11-20 (1998).
Sparrer, D., et al. Primary and secondary metastatic dissemination: Multiple routes to cancer-related death. Molecular Cancer. 24 (1), 203(2025).
Siam, L., et al. The metastatic infiltration at the metastasis/brain parenchyma-interface is very heterogeneous and has a significant impact on survival in a prospective study. Oncotarget. 6 (30), 29254-29267 (2015).
Proescholdt, M. A., et al. Metinfilt: A prospective trial highlighting the importance of the histological growth pattern in brain metastases. Translational Oncology. 60, 102480(2025).
Berghoff, A. S., et al. Invasion patterns in brain metastases of solid cancers. Neuro Oncol. 15 (12), 1664-1672 (2013).
Blazquez, R., et al. The macro-metastasis/organ parenchyma interface (mmpi) - a hitherto unnoticed area. Semin Cancer Biol. 60, 324-333 (2020).
Dankner, M., et al. Invasive growth associated with cold-inducible rna-binding protein expression drives recurrence of surgically resected brain metastases. Neuro Oncol. 23 (9), 1470-1480 (2021).
Blazquez, R., et al. Intralesional tlr4 agonist treatment strengthens the organ defense against colonizing cancer cells in the brain. Oncogene. 41 (46), 5008-5019 (2022).
Blazquez, R., et al. Pi3k: A master regulator of brain metastasis-promoting macrophages/microglia. Glia. 66 (11), 2438-2455 (2018).
Blazquez, R., et al. Lef1 supports metastatic brain colonization by regulating glutathione metabolism and increasing ros resistance in breast cancer. Int J Cancer. 146 (11), 3170-3183 (2020).
Heppner, G. H., Miller, F. R., Shekhar, P. M. Nontransgenic models of breast cancer. Breast Cancer Res. 2 (5), 331-334 (2000).
Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
Singh, M., Bakhshinyan, D., Venugopal, C., Singh, S. K. Preclinical modeling and therapeutic avenues for cancer metastasis to the central nervous system. Frontiers in Oncology. 7, 220(2017).
Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: Molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
Zhu, L., Miarka, L., Baena, P., Perea-García, M., Valiente, M. Protocol to generate murine organotypic brain cultures for drug screening and evaluation of anti-metastatic efficacy. STAR Protocols. 4 (2), 102194(2023).
Steindl, A., Valiente, M. Potential of ex vivo organotypic slice cultures in neuro-oncology. Neuro Oncol. 27 (2), 338-351 (2025).
Blazquez, R., et al. Organotypic 3d ex vivo co-culture model of the macro-metastasis/organ parenchyma interface. Methods Mol Biol. 2764, 165-176 (2024).
Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells. J Vis Exp. (80), e50881(2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

מידול גרורות מוח: ניתוח סטנדרטי של קולוניזציה גרורתית ודפוסי גדילה היסטולוגיים באמצעות הזרקה תוך-קורטית סטריאוטקטית

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים