גישה השוואתית למחקרי ספירת תאים כמותיים במוחות יונקים שונים מאוד

סיכום

מדעי המוח המודרניים צריכים לחקור הבדלים בין מינים רבים, כולל מכרסמים במעבדה ובני אדם. עם זאת, קשיים טכניים מתעוררים כאשר מעורבים יונקים בעלי מוח גדול. גישה זו מתייחסת לשונות בין-מינים באוכלוסיות נוירונים ביונקים שונים מאוד, ומניבה תוצאות דומות למיפוי לחשיפת דפוסי אבולוציה.

תקציר

רוב המחקרים הנוירוביולוגיים נערכים על מכרסמים במעבדה. למרות דמיון רב בין מוחות יונקים, קיימים גם הבדלים חשובים, שיכולים להטעות בתרגום. נמצאו הבדלים בין-מינים בולטים בפלסטיות המוח, במיוחד בנוירוגנזה. תהליכים נוירוגניים שונים יכולים להיות נפוצים בשל פשרות אבולוציוניות, המפגינים שונות בין מבני מוח ויונקים ומשנים את הפוטנציאל לפלסטיות במינים שונים, כמו עכברים ובני אדם. השוואה בין מינים שונים מעלה מספר סוגיות: מחקרים השוואתיים נתקלים בקשיים טכניים כאשר מעורבים מוחות גדולים; שימוש בגישות ניסוייות הטרוגניות על ידי מעבדות שונות עלול להגביל את השוואת התוצאות; הטרוגניות עשויה להיות קשורה למסלולי זמן שונים של תהליכים נוירו-התפתחותיים בין יונקים, וכך מוסיפים משתנים להשוואה.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, נקבעה גישה לחקר השונות הבין-מינים של אוכלוסיית נוירונים קורטיקליים לא בוגרים בשכבה II ביונקים, השונים מאוד בגודל המוח, גיירנצפליה, נישה סוציו-אקולוגית וגיל. למרות כמה משתנים שלא ניתן לסטנדרטים במלואם, מוצעת שיטה המשלבת הפחתת הטרוגניות באיסוף מוחות והקמת מבנים אנטומיים משותפים כנקודות ייחוס לביצוע ספירת התאים ברמות מוח מתאימות. נתונים שנרכשו (למשל, צפיפויות תאים) יכולים להיות ממופים לעצים פילוגנטיים כדי לחשוף דפוסי אבולוציה, ולנתח קווריאנטיות עם תכונות נוירואנטומיות (למשל, גודל מוח, שטח פנים קורטיקלי). גישה זו הראתה שונות מרשימה במספר הנוירונים הבלתי בוגרים בקורטקס בין קבוצות פילוגנטיות וגילתה קווריאציה עם גודל המוח. השיטה יכולה לשמש גם לכימות הבדלים בשלבי התפתחות שונים באותו מין, וניתן להרחיב אותה ליונקים מגוונים ותהליכים ביולוגיים נוספים כדי למפות תוצאות דומות שמאפשרות כימות מדויק יותר של אוכלוסיות תאים שונות במוח הבוגרים לתמיכה בפלסטיות.

מבוא

מחקרי מדעי המוח משתמשים בעיקר בעכברים וחולדות קרובי משפחה כדי לתרגם תוצאות לבני אדם. למרות דמיון מולקולרי, תאי ואפילו אנטומי רב, קיימים גם הבדלים חשובים בין מינים, שיכולים להטעות את פרשנות הנתונים הפרה-קליניים ^1,2. למרות שנדרשים מחקרים השוואתיים, הם מוגבלים על ידי קשיים טכניים ומעשיים כאשר מעורבים מוחות גדולים (למשל, מממוצע של 0.5 גרם בעכברים ועד 1300 גרם בבני אדם; איור 1A). יתרה מזאת, גישות ניסוייות הטרוגניות של מעבדות שונות עלולות להגביל את השוואת התוצאות, במיוחד ניתוחים כמותיים, ולעיתים גורמות למחלוקות. זהו המקרה של פלסטיות מבנית במוח, עם התייחסות מיוחדת לתהליכים נוירוגניים ^3,4,5, נושא שמעניין להבנת נוירופלסטיות התפתחותית ותיקון מוח ^6,7.

תגליות אחרונות בתחום הפלסטיות המוחית מצביעות בחוזקה על כך שהבדלים משמעותיים הופיעו במהלך האבולוציה בהופעה, קצב ומיקום אנטומי של סוגים שונים של תהליכים נוירוגניים⁸. דוגמה לכך היא הירידה הברורה בנוירוגנזה המונעת על ידי תאי גזע המתרחשת ביונקים בוגרים בעלי מוח גדול בהשוואה למכרסמי מעבדה ^5,9,10, ככל הנראה קשורה להתרחבות שונה של אזורי מוח ותפקודים כהסתגלות ללחצים אקולוגיים ^7,8, וכן לקורסים שונים של זמן נוירו-התפתחותי^11,12. קצב הנוירוגנזה נראה שונה באופן ניכר בין עכברים לבני אדם, מה שמעלה את סוגיית התרגום¹³.

מצד שני, סוג חדשני של "נוירוגנזה ללא חלוקה" המיוצגת על ידי נוירונים חסומים בתהליך הבשלות עצור (מה שמכונה נוירונים לא בוגרים או רדומים 14,15,16,17,18,19) הועלתה ממין קטן מוח למינים בעלי מוח גדול ^20,21. מעניין לציין כי אוכלוסיית הנוירונים הבלתי תלויה בתאי גזע של נוירונים לא בוגרים מאוחסנת בקורטקס המוחי (אתר קוגניציה ברמה גבוהה במינים גיירנצפליים^22,23) ורחוקה מהאתרים הנוירוגנטיים הקנוניים, שמקושרים בעיקר לריח ולניווט מרחבי, אשר שומרים על חשיבות רבה במינים הליסנצפליים ^7,8. ההבדלים הללו בין מבני המוח ובין מיני היונקים חורגים מעבר לעניין השוואתי בלבד, שכן הם יכולים להיות רלוונטיים בתרגום על ידי שינוי הפוטנציאל לפלסטיות בעכברים ובבני אדם. מסיבות אלו, חשוב להעריך באופן "דומה" עד כמה ההבדלים מייצגים שונות פילוגנטית בין יונקים שונים מאוד, עם התייחסות מיוחדת למכרסמים ופרימטים במעבדה.

גישה שהוקמה לאחרונה ללימוד השונות הבין-מינים של אוכלוסיית נוירונים קורטיקליים לא בוגרים (cINs) בשכבה II ביונקים, השונים מאוד בגודל המוח, גיירנצפליה ונישה סוציואקולוגית 22,24,25. שיטה זו מבוססת על שלושה עקרונות: i) לשקול מספר מיני יונקים (מגוונים) שיעבדו במקביל באותם פרוצדורות; ii) למזער משתנים שאינם ניתנים לסטנדרטיזציה מלאה במוחות שונים מאוד (תהליך קיבוע, מרווח לאחר המוות, גיל) ולטפל בספציפיות המין של נוגדנים לאימונוציטוכימיה באמצעות שימוש בתכונות משותפות נרחבות של אוכלוסיית התאים הנבדקת כבקרות חיוביות פנימיות; ו-iii) לקבוע מבנים אנטומיים תואמים כנקודות ייחוס לביצוע ספירת תאים ברמות מוח תואמות של מינים שונים (איור 1B ואיור 2). נתונים שהתקבלו (למשל, צפיפויות תאים) על ידי ספירת תאים המזוהים עם הסמן המוכר כפולקורטין (DCX 15,17,26) ניתנים למיפוי לעצים פילוגנטיים כדי לחשוף דפוסי אבולוציה ולניתוח קווריאנטיות עם פרמטרים שונים, כגון גודל מוח, גיירנצפליה ושטח פנים קורטיקלי.

איור 1: עיבוד מוחות יונקים שונים מאוד להערכת התפלגות וכמות ה-cINs במעטפת הקורטיקה. (א) יונקים השייכים למינים וסדרות שונות מאופיינים בגדלי מוח שונים ובדרגות של גיירנצפליה והתרחבות קורטיקלית. אייקוני מוח משוכפלים ברישיון BioRender. (ב) חתכי קורונליים ייצוגיים טולואידין מוצבעים בכחול, שנחתכו ממוחות בגדלים שונים והתרחבות מעטפת קורטיקלית. חתכים סדרתיים מוכתמים היסטולוגית (חתך קריוסטטי, קורונלי, בעובי 40 מיקרון) משמשים לזיהוי המבנים הנוירואנטומיים העיקריים בכל מין בעל חיים (ראו איור 3); שימו לב להבדלים המרשימים בגודל המוח ובהיקף הקורטקס. האייקונים של בעלי החיים בלוח A שוכפלו באישור לה רוזה ואח' ²². אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

לבסוף, מכיוון שכל התהליכים הפלסטיים עוברים בדרך כלל הפחתה הדרגתית עם העלאת גיל^27,28, סוגיה נוספת בנוירופלסטיות השוואתית היא הערכת מסלולי הזמן השונים של הפחתה כזו, שעשויים להיות קשורים למסלולי זמן שונים של תהליכים נוירו-התפתחותיים ביונקים 12,29,30. למעשה, קיומו של מינים מתבגרים במהירות (עכברים) לעומת מינים מתבגרים לאט (פרימטים) הוא סיבה נוספת לכך שמערכת המודלים הנפוצה ביותר, עכבר המעבדה, מוגבלת בפתרון אתגרים במדעי הביו-רפואה. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות שימושית גם לשקול אוכלוסיות תאים בגילאים שונים לאורך חיי כל מין ואז להשוות את המגמות המתקבלות בין מינים. נמצאה שונות פילוגנטית בצפיפות cIN, וכן הבדלים בעמידותם לאורך השנים, בין יונקים בעלי מוח קטן לגדול מוח^22,28.

פרוטוקול

כל נהלי בעלי החיים עמדו בתקנות הלאומיות והמוסדיות הרלוונטיות. רקמות העכבר הושגו מהמכון למדעי המוח Cavalieri Ottolenghi (NICO), אורבסאנו, איטליה, באישור משרד הבריאות האיטלקי (RRID: MGI:3696370), באדיבות Serena Bovetti ומעבדות צ'ארלס ריבר. רקמות עכברוש עירום נאספו באוניברסיטת קווין מרי בלונדון (בריטניה) מיד לאחר המתת חסד בהתאם ללוח 1 של חוק בעלי החיים (הליכים מדעיים) משנת 1986. ניסויי הארנבים בוצעו בהתאם להוראת מועצת הקהילות האירופית 86/609/EU ולחוק האיטלקי (DL.vo 116/92), באישור משרד הבריאות האיטלקי (אישור 66/99-A). מוחות של כבשים וסוסים הושגו לאחר המוות בבית מטבחיים מסחרי תחת הנחיה 86/609/EEC ובפיקוח וטרינרי מתמשך. מוחות כלבים סופקו לאחר המוות על ידי מעבדות MarshallBio (ליון, צרפת) עם האישורים הנדרשים; מוחות חתולים נאספו לאחר המוות באוניברסיטת פדובה במהלך נתיחות אבחנתיות שגרתיות בהסכמת הבעלים. כל ההליכים התקיימו לפי חוקי האיחוד האירופי והאיטלקי. דגימות השימפנזים טופלו לפי עקרונות הנחיה בינלאומיים של המועצה לארגונים בינלאומיים למדעי הרפואה (CIOMS) ותחת היתר המכון הלאומי לבריאות - משרד רווחת בעלי החיים במעבדה (NIH-OLAW) A5761-01 (לפרטים על כל מיני בעלי חיים וניסוי ראו טבלה משלימה 1 והמקור ^22,25).

1. איסוף מוחות

1. אסוף מוחות ישירות או ממוסדות אחרים ומבנקי רקמות, אבל שקול רק את כל חצאי הכדור. קבע עם המוסדות את ההליך הטוב ביותר להפקת מוחות ממין החי, תוך התחשבות בהפחתת הנזק לחצי הכדור ולהבטיח את מרווח התקופה המינימלי לאחר המוות (PMI, ראו הערה למטה) וטבילה מהירה בתמיסה קיבועית לאחר החילוץ.
   הערה: בהתאם לרגישות הנוגדן הרלוונטי, יש להיות מודעים ל-PMI. בהינתן הרגישות הגבוהה של דאבלקורטין (DCX) לפירוק, יש לאסוף דגימות עם טווח PMI של 0-1 שעה (מלבד השימפנזה, שהיה לו עד 14 שעות PMI, שלא גרם לשינוי באיכות הצביעה, טבלה משלימה 1).
2. בהינתן השונות הגבוהה של תוחלת החיים של בעל החיים, יש לקבוע מראש את קבוצות הגיל שיאספו בין היונקים השונים שנבחנו למחקר, כדי לקבל נתונים דומים.
   1. לעיצוב מחקר זה ולקביעת קבוצות גיל דומות, ניתן לנתח מידע משני מאגרי מידע על היסטוריה וגיוון של בעלי חיים: AnAge, מאגר מידע אוצר של הזדקנות והיסטוריה חיים בבעלי חיים, ו-Animal Diversity Web, מאגר מידע מקוון של היסטוריה טבעית, תפוצה, סיווג וביולוגיה של שימור בעלי חיים.
   2. חלק את תוחלת החיים של בעל החיים לארבעה שלבים (אחד לפני גיל ההתבגרות ושלושה לאחר גיל ההתבגרות, כלומר "בוגר"), החל מסיווג של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית (AVMA) לשלבי חיים בכלבים³¹, כאשר תוחלת החיים חולקה לשישה שלבים: גור, צעיר, בוגר, בוגר, מבוגר, קשיש, וגריאטרי.
   3. על ידי דחיסת שלב הגיל המבוגר והגריאטרי, וכן השלבים הבוגרים והבוגרים, יש להשתמש במונחים אלה: טרום-גיל ההתבגרות, צעיר-בוגר, גיל הביניים, וקשיש/^{גיל 22}.

2. קיבוע ועיבוד רקמת המוח

הערה: נהלי קיבוע יכולים להשתנות בהתאם לגודל המוח ולחששות האתיים לגבי מינים מסוימים של בעלי חיים (רוב הפרימטים או הסוסים בעלי המוח הגדול אינם ניתנים לפרפיוז ויש לתקן אותם בטבילה בתמיסה הקיבועית לאחר החילוץ).

1. שמור על המוח שקוע לחלוטין בתמיסה קיבועית (מומלץ 4% פרפורמלדהיד או 10% פורמלין).
   הערה: זמן הקיבוע משתנה בהתאם לגודל המוח (למשל, 3 שבועות למוח כלבי; 3 חודשים למוח הסוסים, טבלה משלימה 1). הימנעו מזמן קצר או מופרז בתמיסת הקיבוע כדי לשמור על שלמות האנטיגן הרלוונטי.
2. חותכים את חצי הכדור המועדף של המוח לפרוסות שוות (בעובי 1-1.5 ס"מ) באמצעות סרגל (לחיתוך ישר) וסכין דקירה.
3. טבלו פרוסות מוח בבופר פוספט (PB) 0.1 מ' (28.49 גרם נתרן פוספט דיביסי ו-7.8 גרם נתרן פוספט מונובסיסי מומס במים מזוקקים, pH 7.4) ושמרו אותן תחת ערבוב עדין על שייקר למשך 24 שעות. אם צריך (ראו הערה למטה), זרקו את התמיסה והחליפו בתמיסה חדשה של PB 0.1 M, pH 7.4 ביום הבא.
   הערה: נפח ומספר השטיפות ב-PB 0.1 M משתנים בהתאם לגודל המוח (למשל, 30 דקות למוח עכבר, 3 ימים למוח סוס). ודא שהמוח שקוע לחלוטין ב-PB 0.1M ושהפורמלין, הדם והרקמות כבר לא קיימים כדי להפסיק לשטוף.
4. הגן על הפרוסות על ידי הטבילה בתמיסות סוכרוז בריכוז הולך וגדל בהדרגה (10%, 20%, עד 30%) ב-pb 0.1 M, pH 7.4, ושמור אותן בערבוב עדין על שייקר.
   הערה: נפח תמיסות הסוכרוז משתנה בהתאם לגודל המוח. ודא שהמוח שקוע לחלוטין בתמיסות סוכרוז וששוקע לחלוטין לפני שמזיזים אותו לריכוז סוכרוז מוגבר.

3. חיתוך קריוסטט של כל חצי הכדור

1. הסר את קרום המוח מפרוסות המוח באמצעות פינצטה מעוקלת כדי למנוע בעיות במהלך החיתוך.
2. הכניסו את הפרוסות לתבניות הטמעה מלאות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). אם הפרוסה לא ממלאת את התבנית המוטמעת, חתוך חתיכת פרפילם מרובעת מעט גדולה יותר מהפרוסה המוחית, הוסף מדיום OCT למרכז החתיכה, ואז מניח את הפרוסה מעל ה-OCT.
3. הקפיאו את הפרוסה על ידי טבילה ב-300 מ"ל איזופנטן נוזלי מקורר בחנקן בטמפרטורה של -50°C עד שהמדיום של ה-OCT יהפוך ללבן לחלוטין. פרוסות מוח יכולות להישמר בטמפרטורה של -80°C לאחסון ממושך עד לחתך.
4. לפני החתך, שמרו על פרוסת המוח בטמפרטורה של -20°C לפחות 5 שעות כדי לאפשר לרקמה להגיע לאט ובהומוגניות לאותה טמפרטורה כמו הקריוסטט.
5. חתוך את הפרוסה לחתכי קורונל סדרתיים בעובי 40 מיקרון באמצעות קריוסטט, תוך שמירה על טווח טמפרטורות פנימיות של -20°C עד -25°C.
6. אסוף מקטעים צפים חופשיים בלוחות של 12 בארות ואחסן אותם בתמיסת קריופרוטקטנט (150 מ"ל גליצרול, 150 מ"ל אתילן גליקול, 150 מ"ל מים מזוקקים, ו-50 מ"ל בופר F [1.682 גרם נתרן פוספט מונובסיסי דיהידרט ו-0.385 גרם נתרן הידרוקסיד מומס במים מזוקקים, pH 7.4]) (1 מ"ל לבאר, או יותר לכיסוי מלא של החלקים במקרה של מוח גדול) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לצביעה.
   הערה: פרוסות ההמיספרה השלמות משתנות בהתאם לגודל המוח. מוחות גדולים יותר (למשל, שימפנזים, סוסים) צריכים להיות מחולקים לשני בלוקים שווים (גב וונטרלי) כדי לעבד אותם בקריוסטט. במקרה זה, ניתן לאסוף מקטעים צפים בשני לוחות בעלי 6 בארות. חלופה היא לחתוך חצאי כדור ממינים בעלי מוח גדול באמצעות מיקרוטום מחליק, שמאפשר בלוקים גדולים יותר.

איור 2: עיבוד מוחות שונים לחלוטין העוקבים אחרי אותו תהליך ומתמודדים עם משתנים שאינם ניתנים לסטנדרטיזציה. בשיטה שתוארה לעיל, כל ההליכים שניתן לתקן מתבצעים באותו אופן (קיבוע כללי, חיתוך חתכים קורונליים סדרתיים בעובי דומה בכל חצי הכדור, פרוצדורות אימונוציטוכימיות כלליות, ספירת תאים). הדמות נוצרה באמצעות BioRender (https://app.biorender.com/). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. צביעה היסטולוגית

1. בחר קטעים קורונליים סדרתיים (1 מתוך 12). כדי לקבל את המרווח הזה, בחר את כל החלקים של באר אחת מפלטת 12 הבארות. השתמשו בהם כדי לקבל ייצוג מלא של כל ההמיספרה וכהפניה לבחירת חתכים קורונליים ברמות מוח שונות בין המינים השונים שנבדקו (ראו סעיף 5). התקן אותם על שקופיות ג'לטיניות 1%. תן להם להתייבש כמה שעות.
2. הכינו את התמיסות הבאות (150 מ"ל לתמיסה): אתנול 50%, 70%, 96%, 100%, קסילול וטולואידין כחול.
3. פרוטוקול צביעה: מניחים את השקופיות בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול (50%-100%), דקה אחת כל אחת ב-50%-70%, 2 דקות כל אחת ב-96%-100%, ואז העבר לתמיסת קסילול למשך דקה.
4. מניחים את השקופיות בסדר הפוך: תמיסת קסילול לדקה אחת ואז ריכוזי תמיסות אתנול מופחתות (100%-50%), 2 דקות כל אחת ב-100%-96%, דקה אחת כל אחת ב-70%-50%.
5. הניחו את המחסניות ב-150 מ"ל_H2O מזוקק (2 דקות).
6. הניחו את הסליידס בתמיסת הצבע Toluidine Blue (5-10 דקות). לאחר שלב זה, חלקים מוכתמים מופיעים בכחול כהה.
   הערה: חלקי הזמן נשמרים בתמיסות לצביעת היסטולוגיה יכולים להשתנות בהתאם למין. בדקו את חלקי המוח של המין המעניין כדי לקבוע את פרוטוקול הצביעה האופטימלי.
7. שטפו את השקופיות ב-150 מ"ל נוזל מזוקק_למשךדקה.
8. המשך בשלב ההתמיינות על ידי הנחת השקופיות בריכוזים עולים של אתנול (70%-100%) למשך דקה אחת ב-70%, 2 דקות כל אחת ב-96%-100%, ואז העבר לתמיסת קסילול למשך דקה ו-30 שניות. במהלך שלבים אלו, החלקים ישתנו מכחול כהה לצבע תכלת שמיימי.
9. ודא שהחלקים עדיין רטובים מהשלב האחרון של הקסילול לפני שמכסה מחליק עם מדיום התקנה (אם הם מתייבשים, שטוף אותם בתמיסת קסילול במשך 5 שניות). אחר כך תן למחסניות להתייבש לכמה ימים.

5. בחירת רמות המוח וצביעה אימונוהיסטוכימית

1. באמצעות החתכים המוצבעים היסטולוגית שהתקבלו בסעיף 4 כהפניה, זהו רמות מוח בהתאם לתכונות נוירואנטומיות ספציפיות: רמה 1 (L1) - מהפתיחה הקדמית של החדר הלטרלי ל-L2; רמה 2 (L2) - מההתחלה הקדמית של הקפסולה הפנימית ל-L3; רמה 3 (L3) - מההתחלה הקדמית של האמיגדלה ל-L4; רמה 4 (L4) - מסגירה אחורית של החדר הלטרלי להארכה השווה לזו של L2 (אותו מספר של חתכים סדרתיים בעובי 40 מיקרון; איור 3).
   הערה: ההתייחסויות הנוירואנטומיות המפורטות לעיל נועדו לאפשר השוואה בין קליפת המוח השייכת למוחות בגדלים ובג'ירנצפליה שונים מאוד. בהתאם לאזור המוח המעוניין, התכונות האנטומיות המשמשים כהפניה יכולות להשתנות.
2. בחר שלושה קטעים קורונליים במרווחים שווים מכל גובה מוח.
   הערה: נפח כל בופר בשלבים הבאים משתנה בהתאם לגודל המוח (למשל, 0.5 מ"ל לבאר לחלקי עכבר, 1.5 מ"ל לבאר לחלקי סוסים). ודא שהחלקים הצפים מכוסים לחלוטין על ידי כל בופר.
3. שטיפה שלוש פעמים ב-PBS 0.01 M, pH 7.4, למשך 5 דקות כל אחת.
4. דגרו חתכים בתמיסת חסימת פרוקסידאז אנדוגנית (0.6% H_{2O 2}, 1% Triton X-100 ב-0.01 M PBS, pH 7.4; 20 דקות) או מבצעים שאיבת אנטיגן באמצעות חומצה ציטרית (10 מ"מ חומצה ציטרית במים מזוקקים עם תוספת 0.05% Tween 20, pH 6.0), 5 דקות ב-90 מעלות צלזיוס.
   הערה: בהתאם להליך/זמן הקיבוע ולאנטיגן הרלוונטי, ייתכן שיידרש שליפת אנטיגן כדי להשיג צביעה אופטימלית (בופר, טמפרטורה, pH וזמן הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לאנטיגן הרלוונטי).
5. קטעי שטיפה שוב ב-PBS 0.01 מ', pH 7.4 (3 שטיפות של 5 דקות).
6. דגרו חתכים בתמיסת חסימה (1-5% אלבומין סרום בקר (BSA), סרום תקין, 1-1.5% טריטון X-100 ב-0.01 מטר PBS, pH 7.4; 90 דקות ב-RT).
7. דגרו חתכים עם תמיסת נוגדנים ראשונית (1-5% BSA, 2-3% סרום תקין, 1-1.5% טריטון X-100, נוגדן ראשוני ב-0.01 מ' PBS, pH 7.4; 48 שעות ב-4°C תחת ערבוב עדין).
   הערה: נוגדנים נגד האנטיגן המדובר עשויים להניב תוצאות שונות מבחינת איכות הצביעה כאשר משתמשים בהם באזורים שונים במוח^{ובמינים} שונים. יש צורך בהשוואה בין סט נוגדנים מיצרנים שונים כדי לבחור את הכלי האופטימלי לשימוש במינים השונים שנבחנו למחקר (כדי להפחית שונות בין דגימות).
8. חזור על שלב הכביסה שתואר בשלב 5.3.
9. דגרו חתכים עם תמיסת נוגדנים ביוטיניליים משנית (1-5% BSA, 2-3% סרום תקין, 1-1.5% טריטון X-100, נוגדן ביוטינילט משני ב-0.01 M PBS, pH 7.4; 2 שעות ב-RT).
   הערה: שיטת קומפלקס אבידין-ביוטין פרוקסידאז משמשת לספירת התאים על Neurolucida (ראו סעיף 6), שכן היא יוצרת משקע צפוף ועמיד לאורך זמן, וכך מאפשר למקד את עובי החתך בזמן הספירה. ניתן גם להשתמש באימונופלואורסצנציה וניתוח קונפוקלי לביצוע צביעת אימונוס כפולה/משולשת כדי לאפיין את התאים (לפרוטוקולים ראו רפרנס 22,25,32).
10. הכינו את קומפלקס אבידין-ביוטין-פרוקסידאז באמצעות הערכה הזמינה.
    הערה: יש להכין תמיסת קומפלקס אבידין-ביוטין פרוקסידאז ב-Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5 (שמספק pH יציב ליצירת קומפלקסים) לפחות שעה לפני השימוש, כדי לאפשר היווצרות קומפלקס.
11. שטיפה פעמיים ב-PBS 0.01 מ', pH 7.4 (2 שטיפות של 5 דקות), ופעם אחת ב-Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5 (5 דקות).
    הערה: מאחר שקומפלקס אבידין-ביוטין-פרוקסידאז נמצא בתמיסה עם Tris-HCl 0.05M, שטיפה עם Tris-HCl 0.05 M מאפשרת הרגל של הרקמה לתמיסה.
12. דגרו חתכים בקומפלקס אבידין-ביוטין-פרוקסידאז (שעה אחת ב-RT).
13. מקטעי שטיפה ב-Tris-HCl 0.05 מ', pH 7.5 (3 שטיפות של 5 דקות).
14. מתחת למכסה אדים, יש לדוגר חתכים בתמיסת צביעה 3,3'-דימינובנזידין (DAB) (H₂O₂, DAB ב-Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5) עד להשגת הצביעה האופטימלית. במהלך שלב זה, החלקים משתנים מצבע שקוף לאדום חום/בורדו.
    הערה: הזמן לקבלת הצביעה האופטימלית משתנה בהתאם למין שנבדק (למשל, ל-DCX, 2-5 דקות לחלקי עכברים, 20-30 דקות לחלקי סוסים). בדוק אזורים עם כתמים כל 2 דקות כדי למנוע כתמים יתר.
15. מקטעי שטיפה ב-PBS 0.01 מ', pH 7.4 (3 שטיפות של 5 דקות).
16. הרכבו חלקים על מגלשה, לאחר התייבשות, מכסים בכיסוי עם מדיום התקנה, ותנו למחסניות להתייבש כמה ימים.

איור 3: קביעת רמות נוירואנטומיות במוח לצורך חקר התפלגות וכמות הנוירונים הלא בוגרת DCX+ בקורטקס המוחי. ארבעה מבנים נוירואנטומיים תואמים (התחלה קדמית של החדר הלטרלי [רמה 1, L1]; התחלה קדמית של הקפסולה הפנימית [L2]; התחלה קדמית של האמיגדלה [L3]); סגירה אחורית של החדר הלטרלי [L4]; מסומנים בעיגולים אדומים) נחשבו לקבוע ארבע "רמות מוח" מקדמיות לאחוריות בכל היונקים שנבחנו, כדי לחקור את מספר ה-cIN בקורטקס המוחי בצורה "דומה". (א) דוגמה ניתנת למכרסמי מעבדה (עכבר, שמאל) ופרימטים (שימפנזה, מימין). שלושה חתכים קורונליים מכל גובה מוח (בסך הכל 12 מקטעים; ראשי חץ אדומים) נשקלים לספירת תאים בכל היקף השכבה II של כל חתך קורונלי (הערה: כל החתכים מכילים נאוקורטקס, בעוד שרק חלקם יכילו גם פלאוקורטקס). גישה זו שואפת לאפשר ביצוע ניתוחים על רמות נוירואנטומיות תואמות במוחות בגדלים משתנים מאוד. (ב) דוגמה לזיהוי הרמה הראשונה (L1) בקטעים מוכתמים היסטולוגית של מינים שונים מאוד של יונקים. אייקונים של מוח ובעלי חיים שנוצרו באמצעות BioRender. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. ספירת תאים

1. פתח את תוכנת Neurolucida על תחנת העבודה והניח את השקופית מתחת למיקרוסקופ עם המטרה שנבחרה לספירת תאים.
   הערה: לספירת תאים ב-DCX+, השתמשו באובייקטיב של 20x.
2. בהגדלה נמוכה (למשל, 4x), צייר את קווי המתאר של שכבת הקורטיקה II באמצעות כלי קווי הקוטור Freehand בתפריט Trace בתוכנה, כדי לקבל את היקף האורך (גם פלאוקורטקס וגם ניאוקורטקס).
3. בחר את הסמלים המועדפים לספירת תאים בסרגל הכלים של Markers, הנמצא בחלק השמאלי של המסך. לניתוח זה, סופרים באופן דיפרנציאלי שני תאים שונים בכל אזור עניין (פלאוקורטקס, ניאוקורטקס) בהתאם למורפולוגיה שלהם (בהתאם למצבים בוגרים שונים: סוג 1, עם סומה קטנה וצורה דו-קוטבית, טווח קוטר סומה של 3-9 מיקרון; סוג 2, עם סומה גדולה יותר וארבוריזציה דנדריטית מורכבת, טווח קוטר סומה של 9-18 מיקרון).
   הערה: לניתוח זה, נבחרים שני סמלים/סוגי תאים שונים לכל אזור עניין בסרגל הכלים של Markers. חלוקת קוטר הסומה לטווחים שונים היא קריטית לסיווג מדויק של התאים ללא מורפולוגיה ברורה, שעשויים להיות במצב ביניים של בגרות. כדי למנוע ספירת יתר, תאים שנחתכו במשטח העליון של החתך אינם כלולים בניתוח.
4. אסוף את הנתונים לניתוח הפילוגנטי משלושה אזורים שונים: פלאוקורטקס, ניאוקורטקס וקרטקס מוחי (האחרון מתקבל על ידי הוספת נתונים מהפלאוקורטקס והניאוקורטקס).
5. אסוף בקובץ בגיליון אלקטרוני את השכבה הקורטיקלית של היקף שתיים (מ"מ), שנראה בסרגל הכלים של מדידות קונטור בתוכנה.
6. באותו גיליון אלקטרוני, אספו את מספר התאים מסוג 1 וסוג 2 (הנראים בסרגל הכלים של Markers) ואת מספר התאים הכולל (שהושגו על ידי חיבור תאים מסוג 1 וסוג 2) בכל אזור מוח ורמת מוח שנבדקו (שלושה חלקים לרמה, סך הכל 12 חלקים לדגימה).
7. השתמש בנתונים אלו כדי לקבל, עבור כל חלק בכל אזור, את צפיפות התאים הליניארית (מספר התאים למילימטר) ואת אחוז התאים מסוג 1 וסוג 2 (מספר תאים מסוג 1/סוג 2 חלקי מספר התאים הכולל ומוכפל ב-100).
8. חשב את ערך החציון של הצפיפות (באמצעות פונקציית החציון בגיליון האלקטרוני) של 12 החלקים שנבחנו/הדגימה, כדי לייצג גרפית את צפיפות התא הליניארית. השתמש במדיאן כמדד מרכזי כי המדגם לכל קבוצה קטן יחסית (4 בעלי חיים לקבוצה), וחלק מהקבוצות מציגות התפלגויות א-סימטריות (החציון פחות מושפע מערכים קיצוניים).
9. חשב את אחוז התאים מסוג 1 ו-2 בכל דגימה (באמצעות הנוסחה שתוארה לעיל) ואז קבל את הערך הממוצע של האחוזים בין ארבעת הדגימות/המינים שנבחנו (באמצעות פונקציית הממוצע בגיליון האלקטרוני). לאחר מכן, השתמשו בצפיפות התאים הליניארית לביצוע ניתוחים פילוגנטיים (ראו סעיף 7), והשתמשו בכלל התאים שנספרו בכל חתך קורונלי כדי להעריך את מספר הנוירונים/חצאי הכדור הלא בשלים.
10. השתמשו בכלי הקונטור Freehand בתוכנת Neurolucida כדי לצייר קו על קוטר הסומה בניצב לציר הראשי שלו. על ידי ביצוע שלב זה, יש לחשב את אורך הקוטר של לפחות 100 תאים DCX-חיוביים (DCX+) שנבחרו באקראי משני הסוגים בכל מין (25 תאים/דגימה) בכל אזור מוח, כדי לקבל את טווח קוטר הסומה של תאים מסוג 1 וסוג 2.

7. ניתוחים פילוגנטיים: יצירת עצים פילוגנטיים

1. צור רשימה של המינים שנבדקו ב-Notepad באמצעות שמותיהם המדעיים, ואז העלה אותה לאתר https://timetree.org/.
   הערה: ניתן לבדוק את השמות המדעיים באמצעות האתר: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
2. יצא את קובץ העץ שהושג על ידי לחיצה על כפתור קובץ ל-Newick .

8. ניתוחים פילוגנטיים: ספירת אינטגרציה של נתונים בעץ הפילוגנטי

1. בעמודות נפרדות בגיליון נתונים, יש לרשום את כל המינים שנותחו ואת הנתונים המתאימים שיש לקשר איתם (במקרה זה: צפיפות תאים DCX+ של כל הקורטקס, צפיפות תאים DCX+ של ניאוקורטקס, וצפיפות תאים פליאוקורטקס DCX+). אם יש מספר פרטים זמינים לכל מין, יש לחשב את ממוצע הצפיפות החציונית עבור הפרמטרים הנבחרים.
2. הורידו את תוכנת פרויקט מסקיט (https://www.mesquiteproject.org/) למיזוג עץ הפילוגנטיקה עם נתוני הספירה.
   הערה: תוכנה זו דורשת ש-Java כבר תהיה נוכחת במחשב.
3. פתח את קובץ Newick שנשמר בעבר על ידי Timetree על ידי לחיצה על Open File. לאחר מכן, בחר באפשרות Simple Newick/Phylip Treefile . תתייחס לקובץ כטקסט ותשמור אותו כ-".nex".
4. בעמוד החדש שנפתח, בחר Taxa&Trees ואחריו New Three Window, ובחר With Trees from Source. בחלון הקופץ, בחר עץ מאוחסן ולחץ אישור. תוצג לשונית חדשה בשם עצים מיובאים .
5. שנו גרפית את עץ הפילוגנטיקה (למשל, גופן, גודל, ענפים פרופורציונליים לאורך) בחלק התצוגה .
6. הוסף לשונית חדשה ב-Mesquite, בחר Add ואחריו New Character Matrix ובחר את מספר התווים (למחקר זה, מספר = 3, שמתאים לשלוש צפיפויות התאים DCX+). תתייחס לדמויות כנתונים רציפים.
   הערה: תווים מייצגים את הנתונים שיש לקשר עם עץ הפילוגנטיקה.
7. העתק ללשונית החדשה הזו את הנתונים שיהיו מקושרים לעץ הפילוגנטיקה (חלק 6.4) ושמור אותם.
8. בלשונית עצים מיובאים, בחר ב-Analysis:Tree ו-Trace Character History כדי לבצע ניתוח מצבים אבותיים של Parsimony.
9. שמור קובץ כ-PDF.

9. ניתוחים פילוגנטיים: גודל המוח וצפיפויות תאי DCX+ מתאם

1. בגיליון הנתונים שנוצר קודם, הוסף עמודה עם גודל המוח של כל אחד מהמינים.
2. חשב את הלוגריתם הטבעי של צפיפויות התאים DCX+ ושל גודל המוח.
3. השיק את חבילת התוכנה הסטטיסטית המועדפת (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) ובצע רגרסיה ליניארית פשוטה
4. הורידו את קבצי התוצאות ושמרו את השאריות כעמודות חדשות בגיליון הנתונים.
   הערה: שאריות מייצגות את הסטייה של נקודות הנתונים מקו הרגרסיה.
5. בגיליון הנתונים, בחרו את עמודת השאריות ואת עמודת שמות המינים. לאחר מכן, עבור ל-insert ובחר את גרף ההיסטוגרמה כדי להציג גרפית את השאריות.

10. ניתוחים פילוגנטיים: התרחבות ניאוקורטיקלית וקורטיקלי DCX+ של תאים

1. בגיליון הנתונים שנוצר קודם, הוסף עמודה עם נתוני שטח הפנים של שכבת הנאוקורטיקה II של כל אחד מהמינים, וחשב את הלוגריתמים הטבעיים.
2. בתוכנה הסטטיסטית, יש לבצע רגרסיה ליניארית פשוטה על ידי שימוש בערכי שטח הפנים של שכבת הנאוקורטיקה הלוגריתמית II כמשתנה X ובצפיפות התאים DCX+ של הקורטקס הלוגריתמי כמשתנה Y.
3. הורידו את הקבצים שהושגו ושמרו את השאריות בעמודה חדשה בגיליון הנתונים, שם ניתן ליצור את גרף השאריות כפי שהיה בשלב 9.5.

תוצאות

תאי DCX+ בקורטקס המוחי של כל המינים שנבדקו חולקים בעקביות סדרת מאפיינים המעידים על קיומה של אוכלוסייה שמורה היטב של נוירונים לא מוייחסים (איור 4A). בקיצור, הם: (i) מסודרים טופוגרפית ליצירת שכבה מונו-שכבה לאורך שכבת הקורטקס II; (ii) מציגים את תת-הסוגים המורפולוגיים המתוארים לשלבים שונים של בגרות בנוירונים לא בוגרים, (א) עם שכיחות גבוהה של תאים חד-קוטביים/דו-קוטביים קטנים וחלק קטן של תאים עם דנדריטים מורכבים המזכירים נוירונים פירמידליים, (ב) רובם מבטאים יחד את סמני חוסר הבגרות PSA-NCAM ו-DCX, ...

דיון

השיטה המתוארת כאן מספקת נתונים כמותיים דומים כאשר נלקחים בחשבון מינים מגוונים השונים מאוד בגדלי מוח ובנוירואנטומיה. ניתן להשתמש בה להערכת עקביות אוכלוסיות התאים במוח כולו של יונקים מגוונים, וכן למעקב אחר התפתחותן במין אחד בשלבים הבאים, מהתקופה שלאחר הלידה ועד להזדקנות. זה מתחיל בהנחה שמספר יחסית גבוה של מוחות (חצאי כדור שלמים) ומינים יהיו מעורבים, שיעובדו על ידי אותה מעבדה לפי סטנדרטים איכותיים של דגימה וקיבוע, ואז ינותחו באותו הליך³³ (איור 1 ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10% פורמלין	סיגמא-אלדריץ'	HT501128
2-מתילבוטאן	סיגמא-אלדריץ'	320404	איזופטן
3,3′-דיאמינובנזידין טטרהידרוקלורייד הידראט	סיגמא-אלדריץ'	D5637
4% פאראפורמלדהיד	סיגמא-אלדריץ'	441244
אלבומין סרום בקר	סיגמא-אלדריץ'	A9647
חומצה ציטרית	סיגמא	C0759
הרכבה DPX להיסטולוגיה	סיגמא-אלדריץ'	06522
אתנול	מרק	1.00983
אתילן גליקול	סיגמא-אלדריץ'	102466
גליצרול	סיגמא-אלדריץ'	G7893
תמיסת מי חמצן	סיגמא-אלדריץ'	H1009
קיליק - O.C.T. קומפאונד	ביו-אופטיקה	05-9801
תוכנת מסקיט	פרויקט מסקיט	גרסת מסקוויט 3.81 (בניית 955)
ניאו-מאונט	סיגמא-אלדריץ'	1.09016
בופר פוספט (PB)	לא	לא	בהתאמה אישית
סליין עם בופר זרחן (PBS)	לא	לא	בהתאמה אישית
נתרן הידרוקסיד	רידל-דה האן	6213
נתרן פוספט דיביסיקלי דיהידרט	סיגמא-אלדריץ'	71645
נתרן פוספט מונו-בסיסי דיהידרט	סיגמא-אלדריץ'	71500
סוקרוזה	סיגמא-אלדריץ'	S9378
טולואידין בלו	סיגמא-אלדריץ'	89640
טריטון X-100	סיגמא-אלדריץ'	T8787
גיל 20	סיגמא-אלדריץ'	P9416
ערכת פרוקסידאז ABC-HRP Elite של VECTASTAIN (סטנדרט)	מעבדות וקטור	PK-6100
Xylol	סיגמא-אלדריץ'	247642