הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

צביעת חיסון שלמה של שחלות עכברים עובריים וילודים

297 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69455

⸱

28 באפריל 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לתיוג חיסוני שלל של שחלות עכברים מתפתחות, עם יישומים לרקמות קטנות נוספות.

תקציר

מאגר השחלות מורכב מהביציות הזמינות לנקבה לרבייה, והן נמצאות בזקיקים פרימורדיאליים, שכל אחד מהם מכיל ביצית אחת מוקפת במספר תאי גרנולוזה. הביציות מתחילות כתאי נבט פרימורדיאליים שנוצרים מחוץ לגונדה ונודדים לשחלה המתפתחת במהלך ההתפתחות העוברית. כאשר הן מגיעות לשחלה, הן הופכות לאוגוניה ומתחלקות באמצעות מיטוזה, עם ציטוקינזיס לא שלם, ויוצרות אשכולות של תאים מקושרים הנקראים ציסטות תאי נבט. במהלך הציסטות, התאים נכנסים למיוזה והופכים לביציות. בעכבר, יומיים לפני הלידה, הציסטות מתחילות להתפרק, וכל ביצית נארזת לזקיק קדום. רק חלק מהביציות שורדות בתהליך זה, והשאר עוברים אפופטוזיס. הוויסות של פירוק הציסטות והיווצרות הזקיקים הראשוניים מובן רק חלקית, וזיהוי המולקולות המעורבות הוא קריטי להבנת תהליך זה. צביעת חיסון שלמה של שחלות עכברים מתפתחות יכולה לשמש לקביעת מיקום מולקולות רגולטוריות פוטנציאליות ולהערכת השפעות על היווצרות זקיקים פרימורדיאליים עקב מוטציה או שינויים מולקולריים אחרים באמצעות סמנים של ביציות ותאי סומטיים. השחלות נקצרות מעכברים עובריים או יילודים, מקובעות בפורמלדהיד ונחסמות. השחלות נחשפות לאחר מכן לנוגדנים נגד חלבון מעניין, ואחריהם נוגדנים משניים שמחוברים לתג פלואורסצנטי שמזהה את הנוגדנים הראשוניים. לבסוף, השחלות מותקנות ונבדקות במיקרוסקופיה קונפוקלית. הליך זה יכול לזהות מספר חלבונים רלוונטיים וניתן ליישמו על רקמות קטנות נוספות, כגון אשכי עכבר עוברי.

מבוא

צביעת חיסון שלמה בשילוב עם הדמיה קונפוקלית היא שיטה עוצמתית לניתוח ביטוי חלבונים ומורפולוגיית תאים ברקמות קטנות ללא חתך1. בשיטה זו, רקמות נאספות ראשונים, מקובעות וחוסמות, ואז נחשפות לנוגדנים נגד חלבונים מעניינים. הנוגדנים מצומדים ישירות לפלואורופורים או מלווים בתיוג עם נוגדנים משניים שמחוברים לפלואורופורים שמזהים את הנוגדנים הראשוניים. הרקמה מודגרת לאחר מכן עם צבע פלואורסצנטי, 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) כדי להמחיש את גרעיני התא. שלב זה חשוב כדי לספק כיוון מרחבי בעת הדמיית הרקמה. לבסוף, הרקמה מורכבת ומוצגת במיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה נוספת ששימשה לחקר מורפולוגיית הרקמות כוללת הטמעת הרקמה בפרפין, חיתוך, ותיוג באמצעות צבעים כמו המטוקסילין ואאוזין או באמצעות נוגדנים. חלופה נוספת היא להכין חתכים קפואים ולצבוע חיסונים. למרבה הצער, שתי הטכניקות הללו כוללות חיתוך, שגורם לאובדן מידע תלת-ממדי. בעוד שקטעים סדרתיים יכולים לעזור, ניתוח הוא מייגע ודורש צפייה במספר רב של מדורים. לכן, שיטת ההרכבה הכוללת היא יתרון שכן היא שומרת על המבנה התלת-ממדי של הרקמה שניתן להמחיש באמצעות חתך אופטי.

התפתחות תאי נבט פרימורדיאליים (PGCs) לביציות והרכבה של הביציות לזקיקים פרימורדיאליים הם חיוניים לפוריות נשית. PGCs נוצרים מחוץ לעובר וחייבים להגר לשחלה במהלך ההתפתחות העוברית. כאשר ה-PGCs מגיעים לשחלה, החל בערך ביום עוברי (E) 10.5 בעכבר, הם מסווגים כאוגוניה2. האוגוניה עוברת מיטוזה אך עם ציטוקינזיס לא שלם, ויוצרת אשכולות תאים מקושרים הנקראים ציסטות תאי נבט3. אוגוניה נכנסת למיוזה החל מ-E 13.5, הופכת לביציות ומתקדמת דרך פרופאזה I לשלב הדיפלוטנה. כאשר הביציות מתפתחות, הציסטות מתפרקות, ומאפשרים לכל ביצית להיות מוקפת בשכבת תאי גרנולוזה, ויוצרים זקיקים פרימורדיאליים שכל אחד מהם מכיל ביצית דיפלוטניתשנעצרה 4. יש אובדן רב של ביציות במקביל לפירוק ציסטות, וזה נחשב חשוב לבקרת איכות במהלך היווצרות זקיקים פרימורדיאליים. מספר הביציות שנעצרו על ידי דיפלוטן בזקיקים פרימורדיאליים מהווה את מאגר השחלות של הביציות הזמינות לרבייה והוא קשור ישירות לפוריות. אם היווצרות הזקיקים מופרעת, הדבר עלול להוביל למאגר שחלות קטן יותר, מה שיגביל את תוחלת החיים הרבייה של הנקבות.

שימוש באימונוסיינטינג של הר מלא שימש לזיהוי וניתוח ביטוי חלבונים במהלך התפתחות הביציות העוברית, העוברית והתינוקת. המולקולות שנבדקו כוללות את MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT ו-STAT3 5,6,7,8,9. טכניקה זו שימשה גם באופן נרחב כדי לחשוף כיצד מווסת היווצרות זקיקים פרימורדיאליים. שחלות עובריות או יילודות גודלו ונחשפו למולקולות או מעכבים מאותות. ביציות בשחלות מתורבתות עוברים היווצרות זקיקים פרימורדיאליים בדומה ל-in vivo10. תרבית שחלות שימשה בהצלחה לבחינת הורמון סטרואידים 6,10,11, KIT8 ו-PI3K12 בשלב זה של התפתחות השחלה. לאחר התרבית, נעשה שימוש בצביעת חיסון שלמה באמצעות נוגדנים נגד הליקאז DEAD box 4 (DDX4, הידוע גם כהומולוג ואזה עכבר (MVH)), חלבון המובע בציטופלזמה של ביציות. השחלות נבדקות לאחר מכן במיקרוסקופיה קונפוקלית להערכת היווצרות זקיקים פרימורדיאליים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המשתמשים בעכברים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של אוניברסיטת סירקוז (IACUC). הפרוטוקול הבא מיועד לתיוג שחלות עכבר יילודות בימים שלאחר הלידה 1–5 (ראו איור 1 לסכימה). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. קטיף ותיקון שחלות

  1. החסל עכברים יילודים מסוג C57BL/6 בהתאם ל"מדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה" של המכון הלאומי לבריאות ופרוטוקולי בעלי חיים שאושרו על ידי IACUC. נתח שחלות ב-1x מלח מפופר פוספט (PBS).
    הערה: בהליך זה, עכברים יילודים הושמתו באמצעות כריתת ראש כפי שאושר בפרוטוקול בעלי החיים של IACUC שלנו. זכרים ונקבות בזן העכברים C57BL/6 ניתנים להבחנה אצל יילודים על ידי נוכחות כתם כהה קטן בין פתחי האנוגניטלי אצל זכרים. כדי לנתק את השחלות, תחילה חתכו את הקיבה והסרו את המעיים. לאחר מכן, פתח את הבטן עם חתך אמצעי בזנב, ואז בצע שני חתכים אופקיים. מצאו את השחלות מתחת לכל כליה, בודדו כל שחלה, ונקו רקמות עודפות.
  2. הנח שחלות ישירות לתוך 600 מיקרוליטר 5.3% פאראפורמלדהיד (PFA; 16% PFA בדרגת EM מדולל ב-1x PBS) (תיקון) בצינור מיקרופוג בטמפרטורת החדר (RT). דגרו את השחלות במצב קבוע על נוטאטור (O/N) בלילה בטמפרטורה של 4°C.
    אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל. השתמש במכסה אדים או באזור מאוורר היטב. לבשו כפפות, מגן עיניים וביגוד מגן כדי למנוע מגע עור וקשר עין. להשליך אותה כפסולת מסוכנת.
  3. הסירו את השחלות פעמיים ב-1 מ"ל 0.1% טריטון X-100 ב-1x PBS (PT) במהירות, ואז פעם אחת ב-1 מ"ל PT על נוטאטור לפחות 30 דקות ב-RT. דגרו ב-1 מ"ל PT + 5% BSA (בלוק) לפחות 30 דקות ב-RT על נוטאטור או אחסנו ב-4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.

2. דגירה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים

  1. הדגר עם נוגדן ראשוני מדולל ב-500 מיקרוליטר PT + 5% BSA O/N בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על נוטאטור. שטוף שלוש פעמים ב-1 מ"ל PT + 1% BSA, 30 דקות ב-RT על נוטאטור.
    הערה: דילול תלוי בנוגדן. הנתונים המייצגים המוצגים כאן מסומנים ב-DDX4 מדולל ב-1:200. נוגדנים נגד שני חלבונים שונים יכולים לשמש בו זמנית כל עוד הנוגדנים הראשוניים מיוצרים משני מינים שונים ואחד משני לא מיוצר במין שהמשני השני מזהה (אל תשתמש באנטי-עכברים-אלקסה 488 ואנטי-עז-אלקסה 568).
  2. בעת דגירה של שחלות עם נוגדן ראשוני, דגרו נוגדן משני מדולל עם קמצוץ אבקת עובר ב-500 מיקרוליטר PT + 5% BSA O/N בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על נוטאטור (מכוסה בניילון) כדי להפחית את הקשר הלא ספציפי של הנוגדן המשני. צנטריפוגה את הנוגדן המשני בעוצמה של 6000 x גרם למשך 30 שניות כדי לאסוף את אבקת השאריות בתחתית. ודא שלא תצייר את השארית הזו בעת העברת הצינור המשני לצינור הדגימה.
    הערה: דילול תלוי בנוגדן. הנתונים המייצגים המוצגים כאן מסומנים ב-Alexa 488 נגד ארנב עזים מדולל ב-1:200.
  3. דגרו עם נוגדן פלואורסצנטי משני נספג מראש (מיוצר בשלב 2.2) למשך 2–4 שעות ב-RT על נוטאטור. מכאן והלאה, כיסה בנייר אלומיניום. שטוף שלוש פעמים ב-1 מ"ל PT + 1% BSA, למשך 30 דקות ב-RT על נוטאטור.

3. תיוג גרעינים עם DAPI והתקנת שחלות על שקופית

  1. תדגר ב-DAPI 1:1000 ב-PBS למשך 90 דקות ב-RT. תשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל 1x PBS.
  2. העבר שחלות למחסנית מיקרוסקופ באמצעות קצה מיקרופיפט רחב של 200 מיקרוליטר. הסר עודפי PBS עם מחט או מזרק. הוסף 3 טיפות של מדיה מתלוננת על השחלות.
  3. מרחי בעדינות כיסוי על גבי השחלות, כדי להבטיח שהמדיה המתגברת תתפשט לקצוות הכיסוי. אטום את קצוות הכיסוי עם לק לציפורניים ותן ללק להתייבש, ואז שמור בטמפרטורה של מינוס 20°C.

4. הכנת אבקת עובר

  1. הומוגניזציה ~ E 12.5–E 14.5 עוברים בעכבר בנפח מינימלי של 1x PBS קר כקרח. הוסיפו 4 נפחים של אצטון קר כקרח, ערבבו, ודגרו על קרח למשך 30 דקות.
    אזהרה: אצטון דליק ומגרה לעין ולעור. השתמש במכסה אדים או באזור מאוורר היטב. לבשו כפפות, מגן עיניים וביגוד מגן כדי למנוע מגע עור וקשר עין. להשליך אותה כפסולת מסוכנת.
  2. צנטריפוגה בעוצמה של 10,000 x גרם למשך 10 דקות, הסר את הסופרנטנט, ואז שטוף את הכדור עם אצטון קר וסובב שוב.
  3. מרחו את הכדור על דף נייר סינון, הניחו אותו במגש פלסטיק, ואפשרו להתייבש את ה-O/N בתוך מכסה כימיקלים. טחנו לאבקה דקה, נותנים להם להתייבש באוויר לחלוטין, ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.

5. ניתוח ביטוי חלבונים במיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. לאחר סימון החלבון המעניין, הצג אותו במיקרוסקופיה קונפוקלית. לבחינת ביטוי חלבון, אנו בדרך כלל משתמשים ב-3–4 בעלי חיים (6–8 שחלות) ומצלמים מספר תמונות של כל שחלה.
    הערה: התמונות המתוארות בחלק התוצאות המייצגות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסק מסתובב או מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי. הפרמטרים בהם נעשה שימוש מתוארים בסעיף התוצאות המייצגות ומשתנים בהתאם למיקרוסקופ בו משתמשים.

6. ניתוח היווצרות והתפתחות זקיקים פרימורדיאליים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. לאחר סימון שחלות לסמן ציטופלזמה כמו DDX4, עבור כל שחלה, יש להקצות באקראי שני אזורים או "ליבות" להמחשה.
    הערה: הליבה מורכבת מ-4 מקטעים אופטיים עיקריים שאורכם 212 × 212 מיקרון, וכל אחד מהם מופרד בעומק של 15–20 מיקרון. ארבעת החלקים האופטיים משתרעים הן על הקורטקס והן על המדולה כדי להבטיח שכל אזורי השחלה מוערכים. לכל שחלה יהיו 2 ליבות עם 4 חתכים אופטיים, בסך הכל 8 חלקים (ראו איור 2).
  2. לאחר הדמיית החלק האופטי הראשי לניתוח, צילם ערימת Z של 5 תמונות מעל ו-5 תמונות מתחת לחלק הראשי, כל אחת במרחק של 1 מיקרון. לכל חלק עיקרי, סופרים את סך כל הביציות במקטע
  3. לאחר מכן, עבור כל ביצית במקטע הראשי, יש לקבוע אם הוא קשור לביצית אחרת או לא, על ידי בחינת החלק הראשי וגם את ערימת החתכים כדי לקבוע אם הביציות בחלק הראשי היו קשורות לביציות מעל או מתחת למישור המיקוד. לבסוף, עבור כל ביצית בודדת, קבעו באיזה שלב של התפתחות הזקיק הוא (ראשוני, ראשוני או משני).
    הערה: מומלץ לנתח לפחות 4 בעלי חיים (8 שחלות) כדי לקבל נתונים מובהקים סטטיסטית.

7. שימוש ביודיד פרופידיום כסמן גרעיני חלופי

  1. לאחר שלב 2.3, דגרו במשך 30 דקות ב-0.1 מ"ג/מ"ל RNase A (10 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל ב-1 מ"ל של PT + 1% BSA). הסר RNase A ודוגר ביוד פרופידיום של 10 מיקרוגרם/מ"ל (10 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל ב-1 מ"ל PT + 1% BSA) למשך 20 דקות ב-RT על נוטאטור. כסה את הצינור בנייר כסף מהנקודה הזו והלאה.
    אזהרה: יודיד פרופידיום הוא רעיל ומוטגני. השתמש במכסה אדים או באזור מאוורר היטב. לבשו כפפות, מגן עיניים וביגוד מגן כדי למנוע מגע עור וקשר עין. להשליך אותה כפסולת מסוכנת.
    הערה: טוטו-3 יכול לשמש גם כסמן גרעיני.
  2. הסר את היודיד פרופידיום ושוטף 30 דקות ב-1 מ"ל PT + 1% BSA. דלג על שלב 3.1 (צביעת DAPI).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות טיפוסיות משיטת הצביעה החיסונית המתוארת כאן מוצגות. התמונות באיור 3, איור 4, איור 5 ואיור 6 צולמו במיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב באמצעות מטרת שמן 40x, NA 1.3, עם זמן חשיפה בין 100–250 מילישניות ועוצמת לייזר בין 0.01 ל-0.1%. באיור 3, שחלות עכבר יילודות מסומנות בנוגדנים נגד DDX4, חלבון המובע בציטופלזמה של ביצי העכברים,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דוח זה מתאר שיטה לסמן פלואורסצנטי שחלות שלמות עבור חלבונים מעניינים. הליך זה שימש רבות לקביעת ביטוי חלבונים במהלך היווצרות זקיקים פרימורדיאליים וכן לאפיון שינויים ביצירת זקיקים בתנאים שונים 4,5,6,7,8,9,10,11. היתרון של שיטה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ההדמיה בוצעה במרכז ההדמיה בלאט באוניברסיטת סירקיוז. התמונות באיור 7 התקבלו מ-Zeiss LSM980 עם Airyscan2 הנתמך על ידי NIH S10 OD026946-01A1. עבודה זו נתמכה במענקים R03 HD102016 ו-R21 HD112756 מה-NIH (ל-MEP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
VASA אנטי-אנושי (תוצרת בעז)R& DAF2030
אנטי-DDX4/MVH (תוצרת ארנב)אבקאםab13840
אנטי-GCNA1/TRA98 (מיוצר בעכברוש)אבקאםab82527
אלבומין סרום בקר (BSA)פישרBP-1600
החלקות כיסוי 22 x 22 #1.5וורנר אינסטרומנטס64-0721
DAPI (אבקה)סיגמא אולדריץ'D-9542הכינו תמיסה של 5 מ"ג/מ"ל ב-dH2O
טווח הדיסקציה
חמור נגד עז אלקסה 568InvitrogenA11057
חמור נגד עכבר אלקסה 488InvitrogenA21202
חמור נגד ארנב אלקסה 568InvitrogenA10042
אלקסה 647 נגד ארנב חמורInvitrogenA31573
חמור נגד עכברוש אלקסה 488InvitrogenA21208
הוכחת אתנול 200פארמקו111000200
מספריים עדינים - חדיםכלי המדע המדויק14060-09לעבודות עדינות של הסרת שחלות וגזירת רקמות עודפות
מלקחיים (פינצטה דומונט, סגנון 5)מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים72705-01 (0209-5-PO)
עז נגד ארנב אלקסה 488InvitrogenA11008
צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"לתרמו-סיינטיפיק3451PK
שקופיות מיקרוסקופפישרברנד12-550-123
מערבל אגוזיםLabNetS0500
פאראפורמלדהיד 16%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710
צלחות פטרי בגודל 100 על 15 מ"מייצור ביופלסט940-10774
מלח מפופר זרחן 1X(פישר) S271-1;                   (סיגמא) P9541-500G; (פישר) BP332-500; (פישר) P285-500800 מ"ל MQ H2O                            80 גרם NaCl                                        2.0 של KCl                                                14.4 גרם Na2HPO4                  2.4 גרם KH2PO4                  כוונן pH ל-7.4 עם HCl; כרך סופי 1 L ואז מדלל מ-10X ל-1X לשימוש
מחזיק סיכהכלי המדע המדויק26016-12להחזיק מחט ישרה בעיקול קל
קצות פילטר לפיפטהOneTip(10uL) 1121-3810;                           (20 uL) 1120-1810;                   (200 uL) 1120-8810;         (1000 uL XL) 1122-1830
טיפים של פיפטהOneTIp(10 uL) 1111-3800;                   (200 uL) 1111-1800;         (1250 uL) 1112-1820
פיפטים 0.2-2, 2-20, 20-200, 100-1000גילסון(0.1-2 uL) F144054M;       (2-20 uL) F144056M;     (20-200 uL) F144058M;       (100-1000 אלומטר) F144059M
יודיד פרופידיום, 1 מ"ג/מ"ל ב-dH2OInvitrogenP3566
אבקת RNase Aסיגמא אולדריץ'RG513-50mgהכינו תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל באצטט נתרן של 0.1 מ' (pH 5.2). חמם ל-100 oC למשך 15 דקות. קירור ל-RT וכיוון pH על ידי הוספת נפח של 0.1 מטר Tris-Cl (pH 7.4)
מחט ישרהמחט ישרה מעוקמת לניתוק רקמות עודפות מהשחלה
טריטון X-100תרמו-סיינטיפיקX100-100ML
מזרק טוברקולין 28G x 1/2Tyco/Healthcare קנדל מונוג'קט1180128012
וקטשילדלברטוריות וקטוריותH-1900
מספריים וגנרכלי המדע המדויק14068-12לכריתת ראש, וחתכים גדולים יותר
קצה פיפטה רחב-קוטר 20 אולטרLabCon1026-965-008-9

מקורות

  1. Wong, F. C. K. Whole-mount immunofluorescence staining of early mouse embryos. Methods Mol Biol. 2214, 143-155 (2021).
  2. Monk, M., McLaren, A. X-chromosome activity in foetal germ cells of the mouse. J Embryol Exp Morphol. 63, 75-84 (1981).
  3. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125, 3323-3328 (1998).
  4. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Dev Biol. 234 (2), 339-351 (2001).
  5. Burks, D. M., et al. Molecular analysis of the effects of steroid hormones on mouse meiotic prophase I progression. Reprod Biol Endocrinol. 17 (1), 105(2019).
  6. Chen, Y., Breen, K., Pepling, M. E. Estrogen regulates oocyte cyst breakdown and primordial follicle assembly via multiple pathways in the neonatal mouse ovary. J Endocrinol. 202 (3), 407-417 (2009).
  7. Dutta, S., Mark-Kappeler, C. J., Hoyer, P. B., Pepling, M. E. The steroid hormone environment during primordial follicle formation in perinatal mouse ovaries. Biol Reprod. 91 (3), 68(2014).
  8. Jones, R. L., Pepling, M. E. Kit signaling regulates primordial follicle formation in the neonatal mouse ovary. Dev Biol. 382 (1), 186-197 (2013).
  9. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. E. Expression of STAT3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  10. Chen, Y., Jefferson, W. N., Newbold, R. R., Padilla-Banks, E., Pepling, M. E. Estradiol, progesterone, and genistein inhibit oocyte nest breakdown and primordial follicle assembly. Endocrinology. 148 (8), 3580-3590 (2007).
  11. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  12. Burton, J. J. N., Luke, A. J., Pepling, M. E. Regulation of mouse primordial follicle formation by PI3K signaling. Biol Reprod. 106 (3), 515-525 (2022).
  13. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: An update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  14. Pina, R., et al. Ten approaches that improve immunostaining: advances in immunofluorescence optimization. Int J Mol Sci. 23 (3), 1426(2022).
  15. Yau, C. N., et al. Principles of deep immunohistochemistry for 3D histology. Cell Rep Methods. 3 (5), 100458(2023).
  16. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , Springer-Verlag. (2010).
  17. Ino, H. Antigen retrieval by heating for double-label fluorescent immunohistochemistry with identical species-derived antibodies. J Histochem Cytochem. 52 (9), 1209-1217 (2004).
  18. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  19. Boateng, R., et al. Whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for 3D analysis of the ovarian reserve in mouse. J Vis Exp. (175), e62972(2021).
  20. Folts, L., et al. Oocount: A machine-learning-based approach to mouse ovarian follicle counting and classification. Biol Reprod. 113 (5), 1083-1101 (2025).
  21. Rinaldi, V. D., Bloom, J. C., Schimenti, J. C. Whole-mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries. J Vis Exp. (135), e57593(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

זקיקים ראשונייםציסטות של תאי נבטסממני אוקיציטיםסממני תאים סומטייםמיקרוסקופיה קונפוקליתשחלות עובריות של עכבריםהיווצרות זקיקים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.