מאמר שיטה

קביעת ביומסה מיקרוביאלית בקרקע באמצעות PCR טיפות דיגיטליות (ddPCR)

DOI:

10.3791/69467

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג שיטה מהירה של ddPCR לכימות ביומסה מיקרוביאלית בקרקע ויחס פטרייתיה-חיידקים. למרות שפחמן ביומסה מיקרוביאלי שמקורו ב-ddPCR מראה רק קורלציה חלשה עם הערכות הפיוגציה של כלורופורם, השיטה מספקת גישה מולקולרית רגישה וניתנת להרחבה להערכת שפע מיקרוביאלי ללא דגימת קרקע נוספת או שימוש בדגימות קשות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרקע מייצגת את מאגר הפחמן האורגני היבשתי הגדול ביותר, אך יותר מ-133 ג'יטון פחמן אבדו מהקרקעות במהלך מאתיים השנים האחרונות. כימות מדויק של ביומסה מיקרוביאלית בקרקע, במיוחד פטריות וחיידקים, המפריקים העיקריים המניעים את מחזור הפחמן והחומרים המזינים, חיוני להבנת תפקוד ובריאות האקולוגיה של הקרקע. גישות קונבנציונליות, כולל חילוץ חיטוי כלורופורם וניתוח PLFA, מוגבלות בשל דרישות דגימות גבוהות ואי-ודאויות הקשורות להמרת סמנים ביוכימיים להערכות ביומסה מיקרוביאלית. כאן אנו מציגים תהליך עבודה אופטימלי לכמת שפע חיידקים ופטרייתיים בקרקע באמצעות PCR טיפות דיגיטליות (ddPCR) המיועד לגנים 16S ו-18S rRNA. השיטה מאפשרת כימות מוחלט של העתקי גנים מיקרוביאליים, המרה למספרי תאים באמצעות גורמי תיקון מספר עותקי גנים, והערכה מאוחרת של פחמן ביומסה מיקרוביאלי. יישמנו פרוטוקול זה על קרקעות מחמש מערכות חקלאיות מבוזרות ברחבי העולם, השונות, במרקם הקרקע, בשימושי קרקע ובתכולת חומר אורגני. הערכות שמקורן ב-ddPCR הושוו להערכות הפחמן הביומסה המיקרוביאלי בכלורופורם קונבנציונליות. ddPCR סיפק כימות ברזולוציה גבוהה של שפע מיקרוביאלי והפיק הערכות רחבות ורגישות יותר של יחסי F:B בין סוגי הקרקע מאשר רצף גנום מלא. למרות ש-MBC שמקורו ב-ddPCR הראה רק קשר חלש עם ערכי חידוש כלורופורם, שיטה זו מציעה גישה מולקולרית יעילה להערכת מדדים ביומסה מיקרוביאליים ומדדים אקולוגיים כגון יחס F:B. פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה לשילוב מדדי שפע מיקרוביאלי עם ניתוחי הרכב לקידום הערכת בריאות הקרקע.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרקע היא מאגר הפחמן האורגני היבשתי הגדול ביותר, המכיל יותר פחמן מאשר צמחייה ופחמן אטמוספרי משולב1. יותר מ-133 גיגטון (Gt) של פחמן אבדו מהקרקעות ב-200 השנים האחרונות, ומאמצים מתמשכים לשיקום ושימור מאגרי הפחמן בקרקע חיוניים לבריאות הקרקעהעולמית 2. בהינתן קיבולת האגירה העצומה של הקרקעות, קביעת התורמים העיקריים למאגרי פחמן אלו היא חשובה ביסוד3. מיקרובים ממלאים תפקיד יסודי במחזור חומרי הזנה בקרקע, וביומסה מיקרוביאלית מהווה רכיב משמעותי בפחמן האורגני בקרקע (SOC)3. פטריות וחיידקים הם המפרקים העיקריים בסביבות הקרקע והם חיוניים במחזורי הביוגאוכימיה של מערכות אקולוגיות אלו 4,5. בקרקע הנשלטת על ידי חיידקים, פירוק חומר אורגני ומינרליזציה של חומרים מזינים מהירים בהרבה מאשר בקרקע הנשלטת על ידי פטריות5. יחס הפטרייה לחיידק (F:B) משמש יותר ויותר כמדד לבריאות הקרקע 6,7; לכן, הערכה מדויקת של פטריות וחיידקים היא קריטית.

הערכות ביומסה מיקרוביאלית בקרקעות מסתמכות לעיתים קרובות על טיפולים כימיים משבשים, כגון חיטוי כלורופורם8. גישות אחרות מכוונות באופן סלקטיבי לקהילה המיקרוביאלית הפעילה באמצעות טכניקות כמו נשימה מושרה על ידי מצע או ניתוח חומצות שומן פוספוליפידיות(PLFA) 9. ניתוח PLFA שימש באופן נרחב להערכת הרכב קהילות מיקרוביאליות ולהערכת יחס F:B. עם זאת, שונות משמעותית בגודל התאים בין מיני פטריות וחיידקים שונים יוצרת אי-ודאות בעת המרת ריכוזי PLFA לביומסה או יחסי F:B מבוססי אוכלוסייה, מה שהופך את ההערכות הללו לבלתי אמינות פוטנציאליות10. שיטות נוספות, כגון ציטומטריית זרימה, יכולות לשמש להגדלת קצב הדגימות לקביעת שפע חיידקים בקרקעות; עם זאת, הדיוק שלהם עשוי להיות מופחת בשל חלקיקים לא-מיקרוביאליים בעלי גודל, צורה ותכונות אוטופלואורסצנציה דומות לאלו של המיקרובים11. הדבריית כלורופורם דורשת כמות גדולה יחסית של קרקע (>10 גרם) להערכת ביומסה מיקרוביאלית, בעוד שגודל דגימה של 500 מ"ג קרקע מספיק לשיטות מבוססות DNA בעת ביצוע חילוץ עם ערכות מסחריות. השוואה קודמת בין שיטות מבוססות DNA לדיגוי כלורופורם הראתה שלמרות ששתי הגישות מסוגלות להעריך ביומסה מיקרוביאלית, השימוש בהן יחד סיפק הערכה חזקה יותר של ביומסה מיקרוביאליתבקרקע 12.

הערכות קהילות מיקרוביאליות הן מדד לא מנוצל מספיק לבריאות הקרקע, שיש לו פוטנציאל לשנות את האופן שבו אנו מודדים והבנו את הקרקע13. שיטות מטאברקודינג משמשות באופן קונבנציונלי לקביעת קהילת המיקרוביאליים בקרקע, כאשר שפע חיידקי יחסי מוערך על ידי הגברת אזורים בגן 16S rRNA, בעוד שטקסונים פטרייתיים מכוונים באמצעות גן 18S rRNA או אזור14 של מרווח פנימי מתועתק (ITS). גישות מטאברקודינג לפטריות עשויות להסתמך על אזורי מטרה גנומיים שונים, המשפיעים על המגוון והשפע של מיני הפטרייה שזוהו. אורך ה-ITS הלא אחיד בקרב מיני פטריות עשוי לקדם הגברה ורצף מועדפים, ולכן הערכה שגויה, מה שמוביל להערכה שגויה של קהילות הפטרייה15. הפריימרים של הפטריות פותחו כדי למקד אזורים משתנים מסוימים בגן 18S rRNA המציגים כיסוי מקיף של פטריות מגוונות וספציפיות בהשוואה לאאוקריוטים אחרים16.

רוב החיידקים והפטריות מחזיקים ביותר מעותק אחד של הגן הממוקד, מה שמוביל להערכות מוטות של ספירת תאים. יתרה מזאת, לפטריות לעיתים קרובות יש תאים רב-גרעיניים עם מספר גרעינים משתנה לכל תא6. ישנה שונות משמעותית במספר עותקי הגנים של rRNA הן בתוך והן בין קבוצות טקסונומיות, בדרך כלל פחות מ-15 עותקים בפרוקריוטים, ומוערכת בטווח של 28 עד 511 עבור פטריות17. עקב שונות זו, טכניקות מולקולריות המשמשות לניתוח מבני קהילות מיקרוביאליות נחשבות לחצי כמותיות, שכן הן עלולות לעוות את הערכת השפע היחסי של מינים בקהילה18. מספרי עותקי גנים שנמדדו (GCN) מומרים באופן שגרתי לשפע תאים באמצעות ממוצע ה-GCN המשוער בקבוצת הטקסונומית 18,19,20.

חלק מהמחקרים השתמשו בגישות מטהגנומיות, שכן הן מציעות מספר יתרונות על פני מטאברקודינג, כולל ביטול הטיית הגברה ויכולת לבחון את כל קהילת המיקרואורגניזמים באופן מקיף21. בנוסף, הם מאפשרים השוואה סימולטנית של הרכב פטרייה וחיידקים, וכן את הקשרים ביניהם22. באופן כללי, RT qPCR משמש לעיתים קרובות לזיהוי תוכן ותפקוד מיקרוביאלי23. ל-qPCR יש מגבלות בהשוואה ל-PCR טיפות דיגיטליות (DDPCR) לכימות מוחלט בשל רגישותו למעכבים, שכן הוא דורש תקן חיצוני24.

ddPCR היא טכנולוגיה פורצת דרך המתבססת על חלוקת תגובות הגברה בודדות לטיפות נפרדות. התבנית מוגברת לאחר מכן על ידי PCR בכל טיפה כתגובה נפרדת. ל-ddPCR רגישות נמוכה למעכבי אנזימה, דיוק, חזרתיות, רגישות ויציבות טובה יותר בכימות חיידקים ופטרייתיים לעומת qPCR25. יתרה מזאת, זו שיטה שניתן להשתמש בה לכימות מוחלט של חיידקים ופטריות בקרקע5. מכיוון ש-ddPCR נשען על אותו DNA מופק המשמש להערכת שינויים בהרכב מיקרוביאלי, ניתן לקשר ישירות לנתוני הרכב הקהילה26 ולהשתמש בהם לכימות ביומסה מיקרוביאלית בקרקע.

מחקר זה מספק מתודולוגיה לכימות פטריות וחיידקים בקרקעות באמצעות PCR טיפות דיגיטליות (ddPCR). שיטה אופטימלית זו יושמה על קרקעות מחמישה מיקומים ושימושי קרקע גלובליים שונים. מיקומי הדגימה נבחרו כך שיכללו טווח רחב של תכונות קרקע, תנאי סביבה ופרקטיקות ניהול, ובכך אפשרו הערכה של עמידות וכלליות הגישה שלנו במגוון הקשרים. נתונים אלו אפשרו לקבוע את יחס F:B כביואינדיקטור מולקולרי לאיכות האקולוגית של הקרקע. לבסוף, בוצעה השוואה של ביומסה מיקרוביאלית מוערכת בין נתוני ddPCR מיקרוביאלי לשיטות הדברת כלורופורם קונבנציונליות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סכמת כוללת של פרוטוקולים אלו מוצגת באיור 1. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. דגימת קרקע

  1. אסוף דגימות קרקע עליונה מרוכבת (0–20 ס"מ) מחמישה מיקומים עולמיים, עם שלוש דגימות מנקודות שנבחרו באקראי בתוך שטח של 25 מטר מכל מיקום.
    הערה: כל הדגימות נאספו ממערכות חקלאיות המייצגות את השימוש האזורי בקרקע שבו הן ממוקמות. מרקם הקרקע אופיין באמצעות דיפרקציה בלייזר, שנמדד באמצעות מנתח גודל חלקיקי דיפרקציית לייזר (טבלה 1). הדגימות הועברו בטמפרטורת הסביבה ונשמרו בטמפרטורה של 4°C עד לניתוח נוסף.

2. חילוץ DNA

הערה: בצע את חילוץ ה-DNA באמצעות ערכת חילוץ DNA קרקע בהתאם להוראות היצרן. טמפרטורת החדר בכל השלבים הייתה 20 מעלות צלזיוס.

  1. סובבו את צינור הקצבת החרוזים בנפח 2 מ"ל בקצרה כדי לוודא שהחרוזים שקעו בתחתית. הוסיפו 100 מ"ג אדמה ו-800 מיקרוליטר תמיסה CD1. מערבבים לזמן קצר.
  2. הומוגניזציה יסודית של דגימות באמצעות הומוגניזר מטחנת חרוזים, עם דגימות שנערכו ל-40 שניות בגובה 6 מטר לשנייה.
  3. צנטריפוגה: צינור חרוזים לליזיס מכני של תאים בעוצמה של 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 2 מ"ל.
    הערה: הסופרנטנט עשוי עדיין להכיל חלקיקי קרקע.
  5. מוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסה CD2 ומערבולת למשך 5 שניות.
  6. צנטריפוגה ב-15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
  7. העבר עד 700 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 2 מ"ל, תוך הימנעות מהכדור. הכדור צריך להיות גלוי.
  8. מוסיפים 600 מיקרוליטר של תמיסה CD3 ומערבולת למשך 5 שניות.
  9. טעין 650 מיקרוליטר של הליזאט על עמודת ספין וצנטריפוגה בטמפרטורה של 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
  10. השליכו את הזרימה וחזרו על שלב 2.9 כדי לוודא שכל הליזאט עבר דרך עמודת הספין.
  11. הניחו את עמוד הסיבוב בתוך צינור איסוף נקי של 2 מ"ל.
  12. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסה EA לעמוד הספין. צנטריפוגה בעוצמה של 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
  13. השליכו את ה-flow-through והחזירו את עמוד הסיבוב לאותו צינור איסוף בנפח 2 מ"ל.
  14. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסה C5 לעמוד הספין. צנטריפוגה ב-15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
  15. השליכו את ה-flow-through והניחו את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש בנפח 2 מ"ל.
  16. צנטריפוגה בעוצמה של עד 16,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  17. הניחו את עמוד הסיבוב בתוך צינור שחרור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
  18. הוסף 50–100 מיקרוליטר של תמיסה C6 למרכז ממברנת המסנן הלבנה.
  19. צנטריפוגה ב-15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את עמוד הסיבוב ושמרו את הצינור בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

3. כימות DNA מטוהר

הערה: DNA מטוהר נמדד באמצעות פלואורומטר וערכת בדיקה דו-גדילית (dsDNA) Broad range (BR) בהתאם להוראות היצרן.

  1. הכינו פתרון עובד באמצעות יחס של 199:1 בין בופר לתגובה.
  2. הוסף 10 מיקרוליטר מכל תקן DNA ל-190 מיקרוליטר של התמיסה הפועלת.
  3. הוסף 1–20 מיקרוליטר DNA מטוהר ל-180–199 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. הנפח הסופי צריך להיות 200 מיקרוליטר. מערבולת ודגירה דגימות סטנדרטיות ודגימות DNA בטמפרטורת הסביבה למשך 2 דקות.
  4. נתחו את התקנים לפני דגימות ה-DNA על הפלואורומטר לפי ההוראות שעל המסך.

4. בחירת פריימר

  1. לניתוח מיקרואורגניזמים בקרקע, בחרו פריימרים ספציפיים בהתבסס על מקורות רלוונטיים. לחיידקים, נעשה שימוש בפריימרים 16S rRNA25,27, ולפטריות, 18S rRNAפריימרים 16.
  2. בצע הגברה באמצעות תערובת ראשית של qPCR בזמן אמת (qPCR) המבוססת על צבע DNA ומחזור תרמי. רצפי הפריימרים מוצגים בטבלה 2.

5. כימות מיקרוביאלי באמצעות ddPCR

  1. הפשרה ומערבולת כולם מגבים על קרח.
  2. הגדר את תגובת ddPCR כך: 0.1 מיקרוליטר (10 מיקרומ') קדימה ו-0.1 מיקרוליטר (10 מיקרומ') הפוך של 16S או 18S, 10 מיקרוליטר ddPCR Evagreen Supermix, תבנית DNA X μL של 0.5 נגרם, תוך שימוש במים ללא נוקלאז (NFW) לכיוון נפח התגובה הסופי ל-22 מיקרוליטר. צור בקרה שלילית על ידי הוספת NFW במקום התבנית לכל עמודה.
  3. שים את ה-DG8 במחזיק המחסנית.
  4. הניחו בסך הכול 20 מיקרו ליטר של תערובת התגובה בבארות הדגימה במחסנית.
  5. הוסיפו 70 מיקרוליטר שמן ייצור טיפות עבור Evagreen לתוך המחסנית המסומנת 'שמן'.
  6. הכניסו את המחסנית לגנרטור הטיפות וכסו את המחסנית באטם.
  7. העבר 40 מיקרוליטר מהטיפות שנוצרו ללוח עם 96 בארות (חצי-חצאית) להגברת PCR.
  8. אטימו את הפלטת עם 96 בארות באמצעות איטום הלוחות (טמפרטורה, 180 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות).
  9. השתמשו בתנאי הרכיבה הבאים עם מכסה מחומם שמכוון ל-105 מעלות צלזיוס.
    הערה: (א) חיידקים: 98 מעלות צלזיוס ל-5 דקות, 40 מחזורים; 94 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 61 מעלות צלזיוס ל-60 שניות, 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, 10 דקות בטמפרטורה 98 מעלות צלזיוס. (ב) פטריות: 95 מעלות צלזיוס ל-5 דקות, 40 מחזורים; 95 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ו-5 דקות בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס.
  10. העבר את לוח ה-96 בארות לקורא הלוחות.
  11. הערך את ריכוז ההעתקה של כל באר באמצעות גרסת QuantaSoft 1.2. כוון את סף המשרעת להפרדת טיפות שליליות וחיוביות.
  12. מחשב את מספר עותקי הגנים לכל ng DNA בתגובה על ידי הכפלת עותקים ל-μL בנפח התגובה הסופי (20 מיקרוליטר) וחלוקה בכמות ה-DNA הכוללת של התבנית לתגובה כך: (מעתיק μL-1 x נפח תגובה) / סך קלט ה-DNA לתגובה.
  13. חישבו את סך עותקי הגנים לכל ng של DNA שהופק על ידי הכפלת עותקי הגנים לכל ng ב-DNA הכולל שהופק (ng) באופן הבא: (עותקי גנים ל-ng x סך ה-DNA שהופק).
  14. חשב את עותקי הגנים לגרם על ידי חלוקת סך עותקי הגנים לכל ng של DNA שהופק בכמות משקל היבש של הקרקע המעובדת בתהליך החילוץ (g), כדלקמן:
    עותקי גן לגרם = (סך עותקי הגן לכל ng של DNA שנחצב / גרם משקל יבש של הקרקע (GDW) של הקרקע המעובדת במהלך החילוץ).
  15. חשב את ספירת התאים לכל gdw על ידי המרת עותקי הגנים באמצעות מספר עותק הגן הממוצע (GCN) לפי המשוואה:
    ספירת תאים = עותקי גן לגרם / ממוצע עותקי גנים של תא-1).
  16. המרו את מספרי התאים לפחמן ביומסה מיקרוביאלי (MBC) באמצעות המשוואה הבאה:
    MBC ל-16S (mg C, קרקע g-1) = תאים gdw-1 × (100 fg תא-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    MBC עבור 18S (מ"ג C, קרקע g-1) = תאים gdw-1 × (6 fg תא-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    התהליך המלא מוסבר באיור 2.
    הערה: העתקה הגנטית הממוצעת של 16S rRNA (ממוצע ± SD) עבור 46 פיל חיידקי20 חושבה ושימשה כגורם תיקון לחיידקים, עם ערך סופי של 2.48. לעומת זאת, עבור פטריות, מספר עותק הגן חושב עם גורם תיקון של 113 לפי לופגרן ואח' 17. פחמן ביומסה מיקרוביאלי (MBC) הוערך מספירות תאים שמקורם ב-ddPCR, תוך שימוש בתכולת פחמן תאית משוערת של 100 fg לתא חיידקי28, ו-6 pg לתא פטרייתי29.

6. ניתוח מולקולות קרקע מריצוף גנום מלא

  1. הכינו את ספריית הריצוף בהתאם לפרוטוקול SQK-NBD114 של Oxford Nanopore Technologies, באמצעות ערכת הברקוד הטבעית 24 V14 (SQK-NBD114.24) (ראו טבלת חומרים). ודאו שאתם משתמשים בברקוד אחד, המסופק בערכה, עבור כל דגימה.
  2. רצף את הספרייה המוכנה באמצעות תא זרימה Oxford Nanopore Technologies R10.4.1.
  3. בצע קריאת בסיס ב-MinKnow במהלך ריצת הסיקוונסר על ידי בחירת מודל הדיוק-העל (SUP) ובחירת חיתוך ברקוד "ON". גרסת דוראדו: 0.7.2+9ac85c6.
  4. בצע סיווג טקסונומי של קריאות רצף DNA באמצעות מסווג טקסונומי Kraken2 (v2.1.3)30 מול מאגר הנתונים של NCBI לחלבון לא מיותר (nr), ביטחון 0.05.
  5. בדוק את קבצי הדו"ח של Kraken2 לסיווג כולל של חיידקים ופטריות.
  6. חשב את השפע היחסי של חיידקים ופטריות לכל דגימה.

7. הערכת פחמן ביומסה מיקרוביאלי בקרקע באמצעות חיטוי כלורופורם

  1. שקלו דגימות קרקע טריות לתוך מחבתות שנשקלו מראש וייבשו בתנור בטמפרטורה של 105 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  2. חשב את תכולת הלחות בקרקע על ידי הפחתת משקל הקרקע היבש ממשקל הקרקע הטרייה וחלוקת ההפרש במשקל קרקע טרייה.
    תכולת הלחות (%) = ((W רטוב – Wיבש)/ Wיבש) × 100
  3. השתמשו בתכולת הלחות כדי לחשב את החומר היבש של הקרקע.
    חומר יבש (%) = 100 – תכולת לחות (%)
  4. הוסיפו 5 גרם אדמה לשני צינורות צנטריפוגות נפרדים בנפח 50 מ"ל, המסומנים כלא מחוטאים ומנוטרים.
  5. הוסיפו סך הכל 25 מ"ל של 0.5 M K2SO4 לצינור המסומן ללא חיטוי.
  6. נער את הדגימות הלא מחוטאות בשייקר אורביטלי למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  7. הוסף 2 מ"ל כלורופורם ללא אתנול ישירות לקרקע בצינורות המסומנים כחיטוי. סגור ואבטח את המכסים עם פרפילם, ודגר בחושך במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  8. צנטריפוגה את הדגימה הלא מחוטאת למשך 10 דקות בעוצמה של 2,500 x גרם בטמפרטורת החדר.
  9. דפטור את הסופרנטנט מהדגימה הלא מדוירת, מסנן דרך מסנן תאית של 0.45 מיקרון, ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  10. הסר את המכסים מהדגימות החוטאות ושחרר את מכסה האדים למשך שעתיים, ואז בצע את החילוץ K2SO4 (חוזר על שלבים 5-9) ואחסן בטמפרטורה של -20°C.
  11. מדדו את ריכוז הפחמן בתמצית הן עבור דגימות 'מדוינות' והן 'לא מדוינות', באמצעות מנתח פחמן אורגני כולל.
  12. חישוב פחמן ביומסה מיקרוביאלי (MBC) באמצעות המשוואה הבאה: MBC = (תכולת פחמן מחולם-תכולת פחמן לא מחוטא)/0.45. נרמול עבור קרקע במשקל יבש לגרם.

8. הערכת תכולת חומר אורגני בקרקע

  1. ייבשו כור פורצלן בתנור הסעה בטמפרטורה של 105 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז שקלו אותו לאחר הקירור ל-20 מעלותצלזיוס (W C).
  2. הניחו עד 2 גרם אדמה לתוך הכור היבש ושוקלים שוב.
  3. ייבשו את דגימות הקרקע בכור המילוי בתנור הסעה בטמפרטורה של 105 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  4. הניחו במייבש אטום כדי להתקרר ולשקול שוב (WS).
  5. חממו תנור מופלה ל-550 מעלות צלזיוס, ואז הניחו את הכור המכיל את האדמה בתנור למשך 4 שעות.
  6. הסר את הכור עם האדמה מהתנור והניח אותו במייבש לקרר.
  7. שקלו את הכור עם אדמה (WA).
  8. מדדו את אחוז ה-SOM על ידי חישוב ההבדל במשקל היבש של הקרקע לפני ואחרי הדגירה בטמפרטורה של 550 מעלות צלזיוס.
    SOMLOI = [(WS –W A)/(WS –W C)] × 100

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות הקרקע נאספו מחמישה מקומות, ותכולת החומר האורגני בקרקע נקבעה על ידי אובדן בעת ההצתה. תכולת החומר האורגני בקרקע נעה בין 3.38% ל-10.34% בכל אחת מהקרקעות ששימשו במחקר (טבלה 1). בוצעו חילוצי DNA בכל דגימת קרקע בשלושה עותקים, כאשר תפוקת ה-DNA שנעה בין 32 ng ל-4,590 ng לגרם קרקע יבשה (איור 3A).

ריכוז ה-DNA היה שונה משמעותית בין קרקעות עם תכולת חומר אורגני משתנה (ANOVA p < חד-כיווני 0.0001, R2=0.97). הקרקע עם תכולת החומר האורגני הנמוכה ביותר, קרקע A, לא הציגה את ריכוז ה-DNA הנמוך ביותר. עם זאת, הקרקע E, שהייתה בעלת תכולת החומר האורגני הגבוהה ביותר, הכילה ריכוז DNA גבוה משמעותית מכל שאר הקרקעות (A–D, p < 0.0001), בעוד שקרקע B הייתה בעלת הנמוכה ביותר, שונה משמעותית מ-A ו-D (p < 0.05). פרוטוקול ddPCR בוצע על DNA מטוהר מכל דגימות הקרקע באמצעות פריימרים של 16S ו-18S rRNA. מספר עותקי הגנים לגרם משקל יבש של הקרקע עבור כל אחד מהגנים של 16S (איור 3B) ו-18S rRNA (איור 3C) נקבע באמצעות ddPCR. בכל דגימות הקרקע, היו פחות עותקים של גן 18S rRNA מאשר גן 16S rRNA. בדיקות הפוסט-הוק של טוקי גילו כי לקרקע B היו הכי מעט עותקי גנים של 16S ו-18S rRNA, עם ממוצע של 8.8 x 107 ו-4.6 x10 6 עותקי גנים, בהתאמה, לגרם קרקע יבשה. העתקי E בקרקע היו שונים משמעותית מכל שאר הקרקעות והציגו את המספר הגבוה ביותר של עותקי גנים של 16S ו-18S rRNA עם 4.4 x 109 ו-2.5 x 109 עותקי גן, בהתאמה, לגרם קרקע יבשה. עותקים פטרייתיים בקרקעות A–D לא היו שונים משמעותית זה מזה, בעוד שהעתקים חיידקיים בקרקע D היו שונים משמעותית מאלו של הקרקע B ו-E.

ריצוף גנום מלא (WGS) שימש על DNA שטוהר מכל דגימות הקרקע, וסיווגים טקסונומיים בוצעו באמצעות Kraken2 מול מאגר הנתונים של NCBI nr. מספר הקריאות הכולל של רצפי DNA שסווגו מול חיידקים ופטריות שימש לחישוב יחס פטרייתיה-חיידקי (F:B) לכל קרקע והשווה ליחס פטרייתיה-חיידקי שחושבו ממספרי עותקי גנים שהוערכו על ידי ddPCR (איור משלים 1). ערכי יחס F:B שהתקבלו עם ddPCR נעו בין 0.022 ל-0.66 בכל דגימות הקרקע והיו גבוהים יותר מאלו שהתקבלו מריצוף גנום מלא. הממוצע הגבוה ביותר F:B נצפה בקרקע E, עם F:B של 0.56 עבור ddPCR ו-0.038 בשיטות WGS. יתרה מזאת, זוהה טווח רחב יותר של ערכי F:B בדגימות הקרקע באמצעות ddPCR ולא WGS. בנוסף, נצפתה מתאם חיובי בין יחס F:B שנקבע בשיטת ddPCR לבין נתוני WGS (r = 0.59,R 2 = 0.35, p = 0.019), כפי שמוצג באיור המשלים 1.

מספר עותק גנים ממוצע לחיידקים ופטריות שימש להמרת עותקי גנים מחושבים למספר תאי החיידקים והפטריות בדגימות המקור (איור משלים 2). נתונים אלו שולבו להערכת מספר התאים המיקרוביאליים הכולל בקרקע (איור 3D) והיו שונים משמעותית בין הקרקעות (ANOVA חד-כיווני p < 0.0001). ניתוח השוואה זוגי של טוקי הראה שהתכולה המיקרוביאלית הגבוהה ביותר נצפתה בקרקע E, בעוד שהתכולה המיקרוביאלית הנמוכה ביותר נמצאה בדגימות שנאספו מקרקע B, שהייתה שונה באופן משמעותי מ-A, D ו-E.

בוצעה הדבריית כלורופורם על כל דגימת קרקע בשלושה עותקים כדי להעריך את סך הפחמן המיקרוביאלי (MBC) בכל דגימה (איור 4A). בין 3.6 ל-9.6 מ"ג פחמן לגרם קרקע יבשה זוהו בין הקרקעות שבהן השתמשו, ללא הבדלים משמעותיים בין כל אחת מהדגימות (ANOVA חד-כיווני p = 0.266). תכולת הפחמן הממוצעת לתאי חיידקים ופטרייתיים שימשה להמרת מספר התאים המיקרוביאליים המוערך על ידי ddPCR לסך הפחמן המיקרוביאלי המשוער. הערכות אלו שמקורן ב-ddPCR הושוו לשיטת ההדברה של כלורופורם (איור 4B). כדי להעריך את הקשר בין ה-MBC שנמדד בהדבריית כלורופורם לבין שיטת ddPCR, בוצעה קורלציה של פירסון (n = 15). נמצא מתאם חיובי בין שתי השיטות (r = 0.43, R2 = 0.18, ערך p = 0.05). חריגים מהקרקע E, שמאופיינים בתכולת החומר האורגני הגבוהה ביותר, ככל הנראה תרמו באופן לא פרופורציונלי לתוצאה שולית זו (איור 4B).

figure-results-1
איור 1: סקירה של עיבוד דגימות קרקע. האיור ממחיש את השיטות המולקולריות המשתמשות ב-DNA בקרקע לכימות מיקרוביאלי ובשיטות המקובלות למדידת פחמן ביומסה מיקרוביאלי וחומר אורגני בקרקע. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תרשים זרימה של תהליך ספירת התאים מעותקי ddPCR עבור 16S ו-18S, ועד להערכת הפחמן המיקרוביאלי הסופית, המציג את השלבים 5.11–5.16 של הפרוטוקול. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: כימות מיקרוביאלי של קרקעות. (א) ריכוז ה-DNA הממוצע שטוהר מכל דגימות הקרקע. (ב) מספר סך כולל ממוצע של עותקי גן 16S rRNA לגרם משקל יבש של הקרקע באמצעות ddPCR. (ג) מספר סך כולל ממוצע של עותקי גנים של 18S rRNA לגרם משקל יבש של הקרקע באמצעות ddPCR. (ד) מספר ממוצע כולל של תאים מיקרוביאליים לגרם משקל יבש על פני דגימות קרקע. כל פסי השגיאה מציגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. בוצעו ANOVA חד-כיווני ומבחן פוסט-הוק של טוקי להשוואות זוגיות, וההבדלים המשמעותיים מוצגים באמצעות תצוגת אות קומפקטית (סף מובהקות = 0.05). הדגימות מסודרות מה-OM% הנמוך ביותר לגבוה ביותר. מקור הקרקע (OM%) א: הולנד (3.38), ב: עיראק (5.14), ג: סין (6.41), ד: בריטניה (8.19), ומזרח: בריטניה (10.34). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הנתון.

figure-results-4
איור 4: פחמן ביומסה מיקרוביאלי שנמדד באמצעות חילוץ חיטוי כלורופורם והערכות תאים מבוססות גנים. (A) MBC שהופק על ידי חיטוי כלורופורם - מסודר מתכולת חומר אורגני נמוכה לגבוהה. פסי השגיאה מציגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. בוצעו ANOVA חד-כיווני ומבחן פוסט-הוק של Tukey להשוואות זוגיות, וההבדלים המשמעותיים מוצגים באמצעות תצוגת אותיות קומפקטית (סף מובהקות = 0.05). (B) MBC הוערך משפע תאים (תא gdw -1) שמקורו במספר עותק הגן של ddPCR והומר לפחמן ביומסה, הוצב מול סך החומר האורגני של אותו דגימה. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

דוגמהמקור הקרקעpHאחוז תכולת הלחותאחוז חומר אורגנימרקםשימושי קרקע
Aטקסל, הולנד7.1619.043.38אדמה חוליתגינון
Bנג'ף, עיראק7.588.335.14אדמה סילטיתאורז
Cג'יאנגשי, סין4.118.456.41אדמה סילטיתשומשום/רפת
Dקיימברידג', בריטניה6.8121.88.19אדמה סילטיתחיטה
Eאקסטר, בריטניה5.4420.2710.34אדמה סילטיתעשב

טבלה 1: תכונות פיזיוכימיות ומאפייני שימוש בקרקע של חמש דגימות קרקע (A–E), לקביעת ביומסה מיקרוביאלית.

מטרהBPקדימההפוךמקור
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGGGGCAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGGGG(לה גיי ואח', 2024; אובריוס ואח', 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCakcacga(ליו ואח', 2012)

טבלה 2: זוגות פריימר שנבחרו למיקוד בגנים 16S ו-18S rRNA באמצעות ddPCR.

איור משלים 1: מתאם בין יחס F:B לכל דגימות הקרקע, שנקבע על ידי שיטת ddPCR ו-WGS. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: מספר התאים בדגימות קרקע שונות שנמדדו בשיטת ddPCR, תוך התמקדות ב: (A) חיידקים; ו-(B) פטריות. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרובים בקרקע הם המפרקים העיקריים במערכות אקולוגיות יבשתיות וממלאים תפקיד חיוני במחזור חומרים מזינים ובאחסון פחמן בקרקע. למרות חשיבות המיקרובים בקרקע, כימות מדויק של שפעונם המוחלט באמצעות שיטות מבוססות העתקת גנים הוא אתגר. הדבר נובע מגורמים רבים, כגון מספר הגנים המשתנה במינים שונים. מחקר זה מדגים כיצד ניתן לכמת ביומסה מיקרוביאלית בקרקע באמצעות ddPCR על ידי מיקוד פרוקריוטים ואאוקריוטים באמצעות אזורי קידוד גנים של 16S ו-18S rRNA בהתאמה. היחס הגבוה ביותר F:B בקרקע E נצפה, כאשר מדגם זה גם הציג את אחוז החומר האורגני הגבוה ביותר. יחס F:B השני בגובהו נצפה בדגימת C, אשר תאם את החומציות הגבוהה של הקרקעות הללו. זה היה צפוי לדגימות C ו-E, כאשר צמיחת הפטריות עולה עם pHנמוך יותר 31. ריצוף הגנום המלא בוצע על אותם תמציות DNA ששימשו לשיטות ddPCR. יחס F:B בין WGS ל-ddPCR הושווא. יחס F:B שחושב מנתוני WGS היה נמוך יותר עבור כל הדגימות שנותחו בהשוואה ליחס F:B שחושב מנתוני ddPCR. עם זאת, המגמה הכוללת של יחס F:B בין הדגימות הייתה ניתנת להשוואה ויזואלית בין כל שיטה. זה הניב יחס F:B גבוה יותר בדגימות קרקע בהשוואה לריצוף הגנום המלא והראה שונות גדולה יותר ביחס F:B בין סוגי קרקע שונים. יחס F:B הנמוך שנצפה בנתוני WGS ככל הנראה נגרם מהבדלים בגודל הגנום בין פטריות לחיידקים, ורצפי הפטרייה עשויים להיות מיוצגים פחות ללא העשרה32. יתרה מזאת, למרות שלקרקע A יש את התכולה הנמוכה ביותר של חומר אורגני, היא לא הציגה את המספר הנמוך ביותר של עותקים מיקרוביאליים ופחמן ביומסה מיקרוביאלי, מה שמדגיש כי תכולת החומר האורגני אינה תמיד קשורה ישירות לביומסה מיקרוביאלית. ראוי לציין כי המגמות שנצפו בין ריכוז ה-DNA המקורי (איור 3A) לבין כל תאי המיקרוביאלים (איור 3D) היו דומות מבחינה ויזואלית, מה שמרמז שריכוז ה-DNA הוא תחליף טוב לביומסה מיקרוביאלית.

ddPCR מאפשר כימות מדויק של מספר עותקי הגנים בדגימות קרקע, ושיטה זו יכולה לשמש להערכת כלל תאים מיקרוביאליים. עם זאת, קיימות מגבלות שיש לקחת בחשבון. מספר עותקי הגנים של 16S ו-18S rRNA משתנה מאוד בין טקסונים מיקרוביאליים23. כתוצאה מכך, שימוש בגורם תיקון יחיד למספר עותקי הגנים עלול להוביל להערכה מופרזת או נמוכה של שפע מיקרוביאלי בדגימה33. מגבלה זו ניתנת לפתרון על ידי שילוב ידע מוקדם על קהילת המיקרוביאליים18, שימוש בנתוני ריצוף גנום מלא, ויישום תיקונים מתאימים המייצגים את המיקרוביום הספציפי של הקרקע. בעוד ששיטות מולקולריות עדיין מספקות הערכה ולא ספירה מדויקת, הן מציעות חיזוי מדויק יותר של שפע המיקרוביאלי. כאשר משולבים עם נתוני הרכב הקהילה, גישה זו מאפשרת פרשנויות החורגות מהשפע היחסי בלבד19,34.

פחמן ביומסה מיקרוביאלי (MBC), שהוערך באמצעות חיטוי כלורופורם, לא הראה הבדלים משמעותיים בין הדגימות שנבדקו, אם כי נצפו שונות גבוהה ב-MBC בין דגימות A–D. לעומת זאת, זוהו הבדלים משמעותיים בספירת תאים מיקרוביאלית כוללת שנמדדה בשיטת ddPCR, מה שמעיד כי גישה מולקולרית זו עשויה לספק רזולוציה גבוהה יותר מהטכניקות המסורתיות. עם זאת, חישוב פחמן ביומסה מיקרוביאלי ממספר תאים מיקרוביאליים יש לו מגבלות משלו. שונות בגודל התא יכולה להשפיע על המרת ספירות התאים לביומסה. בדומה לשימוש בפקטור המרה יחיד למספר עותקי גן, שימוש בפקטור המרה יחיד לתכולת פחמן חיידקי ופטרייתי עלול להוביל להערכה מופרזת או נמוכה של פחמן ביומסה מיקרוביאלי.

יתרה מזאת, שיטות מבוססות DNA עלולות להיות בעייתיות במיוחד בהשוואה בין קרקעות שמציגות הבדלים גדולים במידת הדומיננטיות בין חיידקים לפטריות. גם תפוקת DNA וגם GCN יכולים להיות מושפעים מבחירת שיטת חילוץ DNA ועיצוב פריימר35,36, מה שמקשה על השוואות בין מעבדות37. בנוסף, גם GCN וגם שיטות תפוקת DNA עלולות להיות פגיעות להערכות יתר עקב מה שמכונה "DNA שרידי", כלומר DNA באורגניזמים מתים או קשור לחרסית14,38. למרות ששיטות ddPCR הראו דיוק וחזרתיות טובים יותר, חלק מהחסרונות כוללים את התהליכים המורכבים, העלויות הגבוהות והשימוש בצבע DNA לא ספציפי, בעת שימוש בכימיה של Evagreen5. דבר זה עלול ליצור תוצאות חיוביות שגויות חלשות, מה שמקשה על הפרדת טיפות חיוביות מטיפות שליליות, ואי-התאמה קלה בסף עלולה להשפיע על יחס F:B כאשר עותקי הגנים נמוכיםב-14. כדי להגדיל את מספר הדגימות שניתן לעבד באמצעות שיטת ddPCR זו, ניתן להשתמש באוטומציה עם רובוטיקה לטיפול בנוזלים להפקת DNA והגדרת תגובה39. בנוסף, מערכת ddPCR החדשה מאפשרת ריבוב גדול יותר, ומייצרת טיפות עבור 96 דגימות בו-זמנית.

חשוב לציין שכל מדידות הביומסה המיקרוביאלית הן הערכות וכוללות גורמי המרה כלליים לקביעת המספרים37. לכן, יש לבצע השוואות בין שיטות בזהירות, שכן לא ידוע אילו מדויקות ביותר. למרות זאת, שיטות חיטוי-חילוץ כלורופורם היו בשימוש נרחב בעשורים האחרונים, תוך הסתמכות על אדי כלורופורם לחיטוי הקרקע. דבר זה עורר דאגות רבות בשל רעילותם לבני אדם ולסביבה, וכן ביעילותן בהסרת תאי מיקרוביאלים בקרקע40. בנוסף, חיטוי כלורופורם עלול להוביל להערכה מופרזת של ה-MBC המיוצר ממקורות לא חיים, כגון שאריות צמחים41. לבסוף, שיטה זו מתבססת גם על כמויות גבוהות יחסית של אדמה בהשוואה לשיטות מולקולריות אחרות שדורשות כמויות קטנות מאוד של אדמה (<500 מ"ג).

מחקר זה מספק ראיות לכך ששיטות מבוססות ddPCR למדידת ביומסה מיקרוביאלית בקרקע במגוון קרקעות הן עמידות ואינן מושפעות מסוגי קרקע שונים וממעכבים פוטנציאליים. הצלחת שיטה זו מושפעת מדגימת ה-DNA המקורית, ולכן חיונית להבטיח טיהור DNA יעיל מהדגימות הקיימות. שיטה זו מראה פוטנציאל לזיהוי וכימות מיקרוביאלי בסוגי קרקע ומרקמים שונים, ומשלימה שיטות קיימות להערכת ביומסה מיקרוביאלית ומאפשרת יישומים חשובים בעתיד במעקב אחר בריאות הקרקע ויכולת הרחבה לניטור מיקרוביום אזורי או גלובלי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר נינה לינדסטרום-פריגנס, ד"ר ליז קרסיי, ד"ר ג'ואנה זראגוסה-קסטלס, אנג'לה אליוט, ד"ר קיס יאן ואן גרוניגן ופרופ' איאן הארטלי. אנו גם מודים לבעלי הקרקעות על סיפוק הקרקעות למחקר זה. מחקר זה מומן על ידי Shell Research Ltd (CW648947-PT34767). מערכי הנתונים שנוצרו במהלך המחקר הנוכחי זמינים במאגר ארכיון NCBI Sequence Read Archive PRJNA1305539.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bettersizer S3 Plus בטרסייז, סיןBT-803
צנטריפוגהתרמוסנטיפיק SL16 
כלורופורם תרמו-סיינטיפיקיL14759. AU 
לוחות ddPCR 96-בארביו-רד, ווטפורד, בריטניה12001925
שמן קורא טיפות ddPCR  ביו-רד, ווטפורד, בריטניה1863004
Dessicator דייוויסיל
מחזיק תחמושת DG8ביו-רד, ווטפורד, בריטניה1863051
מחסניות DG8 לגנרטור טיפות QX200/QX100ביו-רד, ווטפורד, בריטניה1864008
אטמי DG8 לגנרטור טיפות QX200/QX100ביו-רד, ווטפורד, בריטניהQ33265
ערכת DNeasy Power Soil pro קיאגן, גרמניה47017
ערכת בדיקה רחבה (BR) דו-גדילית (dsDNA)Invitrogen, גרמניהQ33230
FastPrep-24 5G MP Biomedicals, בריטניה116005500
GridION אוקספורד ננופור טכנולוגיות, בריטניהGRD-MK1CAPX
K2SO4מרק, בריטניה7778-80-5
חרוזים מגנטיים מסוג Mag-Bindאומגה ביו-טק, ארה"בM1378-01
תא זרימת MinIONאוקספורד ננופור טכנולוגיות, בריטניהFLO-MIN114
תנור עמוםקרבוליט AAF1100
ערכת ברקודינג מקורית 24אוקספורד ננופור טכנולוגיות, בריטניהSQK-NBD114.24
אטם חום ללוח PCR, נייר כסף, ניתן לחדור ו-nbsp;ביו-רד, ווטפורד, בריטניה1814040
חותם לוחות PCR PX1ביו-רד, ווטפורד, בריטניה1814000
פלואורומטר קיוביטInvitrogen, גרמניהQ33226
מערכת ה-PCR הדיגיטלית QX200 Dropletביו-רד, ווטפורד, בריטניה1864001
QX200 ddPCR EvaGreen Supermixביו-רד, ווטפורד, בריטניה186-4033
שמן ייצור טיפות QX200 עבור EvaGreen ביו-רד, ווטפורד, בריטניה1864005
QXDx Droplet Generator ביו-רד, ווטפורד, בריטניה12001049
SENSOQUEST LABCYCLER ג'נפלו, גרמניה1120280125

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jobbágy, E. G., Jackson, R. B. The vertical distribution of soil organic carbon and its relation to climate and vegetation. Ecol Appl. 10 (2), 423-436 (2000).
  2. Sanderman, J., Hengl, T., Fiske, G. J. Soil carbon debt of 12,000 years of human land use. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9575-9580 (2017).
  3. He, Y., Li, J., Siemann, E., Li, B., Xu, Y., et al. Plant invasion increases soil microbial biomass carbon: meta-analysis and empirical tests. Glob Change Biol. 31 (3), e70109(2025).
  4. de Menezes, A. B., Richardson, A. E., Thrall, P. H. Linking fungal-bacterial co-occurrences to soil ecosystem function. Curr Opin Microbiol. 37, 135-141 (2017).
  5. Wang, D., et al. ddPCR surpasses classical qPCR technology in quantitating bacteria and fungi in the environment. Mol Ecol Resour. 22 (7), 2587-2598 (2022).
  6. Djemiel, C., et al. Biogeographical patterns of the soil fungal:bacterial ratio across France. mSphere. 8 (5), e0036523(2023).
  7. Bailey, V. L., Smith, J. L., Bolton, H. Fungal-to-bacterial ratios in soils investigated for enhanced C sequestration. Soil Biol Biochem. 34 (7), 997-1007 (2002).
  8. Vance, E. D., Brookes, P. C., Jenkinson, D. S. Microbial biomass measurements in forest soils: the use of the chloroform fumigation-incubation method in strongly acid soils. Soil Biol Biochem. 19 (6), 697-702 (1987).
  9. Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlio, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol Biochem. 25 (6), 723-730 (1993).
  10. Cao, Z., Li, D., Han, X. The fungal to bacterial ratio in soil food webs, and its measurement. Acta Ecol Sin. 31 (20), 6050-6058 (2011).
  11. Frossard, A., Hammes, F., Gessner, M. O. Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge. Front Microbiol. 7, 903(2016).
  12. Joergensen, R. G., et al. A hitchhiker’s guide: Estimates of microbial biomass and microbial gene abundance in soil. Biol Fertil Soils. 60 (4), 457-470 (2024).
  13. Fierer, N., Wood, S. A., Bueno de Mesquita, C. P. How microbes can, and cannot, be used to assess soil health. Soil Biol Biochem. 153, 108111(2021).
  14. Laine, M. B., Taipale, S. J., Tiirola, M. Comparison of methods for assessing fungi-to-bacteria ratio of soil. Biol Fertil Soils. 61 (5), 941-954 (2025).
  15. De Filippis, F., Laiola, M., Blaiotta, G., Ercolini, D. Different amplicon targets for sequencing-based studies of fungal diversity. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00905-e00917 (2017).
  16. Liu, C. M., et al. FungiQuant: A broad-coverage fungal quantitative real-time PCR assay. BMC Microbiol. 12, 255(2012).
  17. Lofgren, L. A., et al. Genome-based estimates of fungal rDNA copy number variation across phylogenetic scales and ecological lifestyles. Mol Ecol. 28 (4), 721-730 (2019).
  18. Angly, F. E., et al. W. CopyRighter: A rapid tool for improving the accuracy of microbial community profiles through lineage-specific gene copy number correction. Microbiome. 2 (1), 11(2014).
  19. Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002743(2012).
  20. Pan, P., Gu, Y., Sun, D. L., Wu, Q. L., Zhou, N. Y. Microbial diversity biased estimation caused by intragenomic heterogeneity and interspecific conservation of 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol. 89 (5), e0210822(2023).
  21. Chacón-Vargas, K., Torres, J., Giles-Gómez, M., Escalante, A., Gibbons, J. G. Genomic profiling of bacterial and fungal communities and their predictive functionality during pulque fermentation by whole-genome shotgun sequencing. Sci Rep. 10 (1), 15115(2020).
  22. Bahram, M., et al. Metagenomic assessment of the global diversity and distribution of bacteria and fungi. Environ Microbiol. 23 (1), 316-326 (2021).
  23. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology: Application of Q-PCR in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Le Geay, M., Mayers, K., Küttim, M., Lauga, B., Jassey, V. E. J. Development of a digital droplet PCR approach for the quantification of soil micro-organisms involved in atmospheric CO2 fixation. Environ Microbiol. 26 (6), e16666(2024).
  26. Hansen, P. M., Semenova-Nelsen, T. A., Platt, W. J., Sikes, B. A. Recurrent fires do not affect the abundance of soil fungi in a frequently burned pine savanna. Fungal Ecol. 42, 100852(2019).
  27. Ovreås, L., Forney, L., Daae, F. L., Torsvik, V. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3367-3373 (1997).
  28. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (12), 6578-6583 (1998).
  29. Cheng, J. Y. W., Chan, C. K., Lee, C. T., Lau, A. P. S. Carbon content of common airborne fungal species and fungal contribution to aerosol organic carbon in a subtropical city. Atmos Environ. 43 (17), 2781-2787 (2009).
  30. Wood, D. E., Lu, J., Langmead, B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 20 (1), 257(2019).
  31. Rousk, J., Brookes, P. C., Bååth, E. Contrasting soil pH effects on fungal and bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization. Appl Environ Microbiol. 75 (6), 1589-1596 (2009).
  32. Xie, Z., Canalda-Baltrons, A., d’Enfert, C., Manichanh, C. Shotgun metagenomics reveals interkingdom association between intestinal bacteria and fungi involving competition for nutrients. Microbiome. 11 (1), 275(2023).
  33. Větrovský, T., Baldrian, P. The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses. PLoS One. 8 (2), e57923(2013).
  34. Doyle, B., et al. Absolute quantification of prokaryotes in the microbiome by 16S rRNA qPCR or ddPCR. Nat Protoc. 20, 3471-3476 (2025).
  35. Frostegård, A., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl Environ Microbiol. 65 (12), 5409-5420 (1999).
  36. Lee, E., Lim, H. J., Son, A. Discrepancies in qPCR-based gene quantification and their dependencies on soil properties, inhibitor presence, and DNA extraction kit types. RSC Adv. 15 (25), 19656-19664 (2025).
  37. Buell, Z. W., et al. Interrelationships among methods of estimating microbial biomass across multiple soil orders and biomes. Soil Biol Biochem. 208, 109844(2025).
  38. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nat Microbiol. 2 (3), 16242(2016).
  39. Child, H. T., et al. Automated environmental metagenomics using Oxford nanopore sequencing. BMC Genomics. 26 (1), 835(2025).
  40. Paliaga, S., Laudicina, V. A., Muscarella, S. M., Said-Pullicino, D., Badalucco, L. Comparison of different methods for estimating microbial biomass in biochar-amended soils. Soil Biol Biochem. 203, 109733(2025).
  41. Setia, R., Verma, S. L., Marschner, P. Measuring microbial biomass carbon by direct extraction: comparison with chloroform fumigation-extraction. Eur J Soil Biol. 53, 103-106 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ddPCR16S rRNA18S rRNADNA

מאמרים קשורים