הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל השתלה תוך-ורידית יילודים להערכת פעילות חיסונית מוקדמת נגד תאי סרטן

252 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69478

⸱

26 ביוני 2026

 ,  ,  ,  , 
1Michael Cuccione Childhood Cancer Research Program, BC Children's Hospital Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of British Columbia

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים הזרקת וריד טמפורלי למתן תאי סרטן ילדים לתוך-ורידיים לעכברים יילודים, ומאפשר מודל מדויק וניתן לשחזור של תגובות חיסוניות בחיים המוקדמים נגד סרטן. השיטה מאפשרת הערכה של השפעת התערבויות, כגון אימונומודולציה או טיפול, כאשר הן מיושמות במהלך תקופת הניואונטל.

תקציר

יותר ממחצית מסוגי סרטן הילדים מתחילים ברחם, כאשר ההתקדמות למחלה גלויה נמשכת לאורך תקופת היילודים. בעוד שאימונתרפיות מציעות כיום אפשרויות טיפול חדשות לילדים רבים עם סרטן, כיצד מערכת החיסון המוקדמת משפיעה על התקדמות הסרטן ועל תגובת הטיפול עדיין אינה מובנת במלואה. התמודדות עם פער זה תדרוש הערכה של ההתערבויות הטיפוליות בתקופת התינוקות, כאשר תגובות החיסון שונות באופן מהותי מאלו שבגיל הילדות והבגרות.

כאן, אנו מתארים מודל השתלות יילודים שמשתלב עם הדמיה ביולומינצנטית ב-vivo כדי לחקור את השפעת מודולציית מערכת החיסון המוקדמת על סרטן ילדים.

הזרקת וריד טמפורלי של תאים מסומנים בלוציפראז שמקורם בשניים בסרטן שהחל ברחם השיגה השתלת גידול ניתנת לשחזור בקרב נמענים סינגניים בני יום-יומיים, ללא תמותה הקשורה לפרוצדורה והצלחה פרוצדורלית גבוהה כפי שאושר בהדמיה ביולומינצנטית. באמצעות מודולציה חיסונית מונעת זיהום כמשתנה ניסיוני, אנו מראים כי זיהום תוך-פריטוניאלי בציטומגלוווירוס עכברי חמישה ימים לאחר ההשתלה מביא לירידה ניכרת בנטל של לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL), אך לא נוירובלסטומה (NB). פלטפורמה זו מאפשרת חקר הבדלים ספציפיים לסרטן בתגובה למודולציה חיסונית מוקדמת ומדגישה את חשיבות הקשר הגידולי בעת מידול אינטראקציות בין מערכת החיסון לסרטן בחיים המוקדמים.

ביחד, שיטה זו מספקת פלטפורמה גמישה ובעלת שכפול גבוה לחקירת מנגנוני חיסון של יילודים הרלוונטיים לאימוניטורציה חיסונית של סרטן, ויסות חיסון מונע זיהומים והתערבות טיפולית. מעבר ל-ALL ו-NB, ניתן להתאים גישה זו לממאירות ילדים נוספות ולאסטרטגיות אימונומודולטוריות, לתמוך במחקרים מכניים והערכה פרה-קלינית של התערבויות סרטן בגיל מוקדם.

מבוא

התקדמות אחרונה באימונותרפיה שיפרה משמעותית את התוצאות עבור חולי סרטן מסוימים, אך השימוש האופטימלי בהם בילדים קטנים מחייב הבנה מעמיקה של האופן שבו מערכת החיסון המתפתחת מזהה ומחסלת תאי סרטן. בעוד שכ-50% מסרטני הילדות מקורם ברחם, כולל לוקמיה לימפובלסטית חריפה בתאי B (B-ALL) ו-NB, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שאירועים לאחר הלידה משפיעים באופן קריטי על התפתחות המחלה והתוצאה הקלינית 1,2.

תגובות החיסון של יילודים שונות כמותית ואיכותית מזו של מבוגרים3. בהיעדר חסינות אדפטיבית מפותחת במלואה, ההגנה על יילודים נשענת במידה רבה על נוגדנים אימהיים ותאי חיסון מולדים. עם זאת, אפקטורים מולדים אלו פחות יעילים פונקציונלית מהמקבילים הבוגרים שלהם בשל תת-תגובה פנימית לתאים והפעלה מוגברת של מסלולי דיכוי חיסון, מה שהופך את התינוקות לפגיעים במיוחד לזיהום 4,5,6. עם זאת, ההשפעה של תכונות אלו על יכולת מערכת החיסון הלא בוגרת לבצע תגובות אנטי-סרטניות יעילות נותרה מובנת היטב.

מידול חיסון נגד סרטן בצעירותו דורש אספקה מדויקת וניתנת לשחזור של תאי סרטן ומודולטורים או פתוגנים חיסוניים במהלך חלון התקופה הקצר שלאחר הלידה, כאשר תפקוד מערכת החיסון מוגבל. הזרקת וריד טמפורלי היא שיטת מתן תוך-ורידי (IV) ליילודים העונה בצורה הטובה ביותר על דרישות אלו ומציעה הצלחה פרוצדורלית גבוהה, תמותה נמוכה, לחץ טיפול מינימלי ותאימות להתערבויות עוקבות, כגון אתגר זיהום או מתן טיפולי 7,8,9,10.

במחקר זה, בנינו ושינינו טכניקות לידה תוך-ורידית שאומתו בעבר ואת הרב-גוניות של הדמיה ביולומינצנטית ב-vivo כדי לתאר מודל השתלה לחקר השפעת זיהום בגיל מוקדם על התקדמות תאי סרטן ילדים. גישה זו מאפשרת העברה תוך-ורידית של תאי B-ALL או NB עם סימון לוסיפראז לגורים בני יום עד יומיים, ואחר כך ויסות חיסון באמצעות מתן תוך-פריטוניאלי (i.p.) של ציטומגאלווירוס עכברי (mCMV) ביום השביעי לאחר הלידה (P7). התקדמות הסרטן הוערכה לאחר מכן 10 ימים לאחר ההדבקה (P17).

למרות שהגישה לווריד הטמפורלי מוגבלת לחלון זמן מוגבל לאחר הלידה (P0–P3), שיטה זו משפרת את השכפול והשליטה הניסויית, ומציעה פלטפורמה גמישה לחקר השפעת מנגנוני החיסון המוקדמים על ניטור חיסוני של סרטן, אינטראקציות בין זיהומים לסרטן ותגובות לאימונותרפיה. בנוסף, גישה זו תומכת באיתור יעיל של תאים מושתלים, ובכך מאפשרת הקמה שכפולה של מודלים של מחלות למחקרים מכניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים (איור 1) בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קולומביה הבריטית (פרוטוקול A23-0169).

1. יצירת תאים לוקמיים עם תוויות לוסיפראז

  1. בידוד תאים לוקמיים מעכברי Eμ-Ret לוקמיים
    1. הרדמו עכברים בתא השראה בנפח 1 ליטר עם 5% איזופלוראן ו-1 ליטר-דקה 1 חמצן עד להשגת מישור כירורגי עמוק (אובדן רפלקס יישור ונשימה איטית וסדירה).
    2. לאחר אישור ההרדמה העמוקה, יש להפסיק להשתמש באיזופלוראן ולהזריק פחמן דו-חמצני (CO₂) בקצב זרימה גבוה (פי 3–4 מהקצב ההדרגתי הסטנדרטי; למשל, 6-8 ליטר·דקה לתא של 10 ליטר) מבלי להעביר את החיה בין התאים. שמרו על חשיפה ל-CO₂ לפחות 5 דקות לאחר הפסקת הנשימה כדי להבטיח מוות.
    3. אוורור ואיסוף גזי הפסולת לפני פתיחת החדר.
    4. לאשר מוות בהיעדר דופק ונשימה, ואז לבצע ניתוק צוואר הרחם כשיטה פיזית משנית בהתאם למוסדות.
    5. העבר את הגופה לארון בטיחות ביולוגית, אשר מחדש את המוות, רשם מין ומשקל גוף, וריסס את החלק החיצוני ב-70% אתנול.
    6. בצע חתך בטן בקו אמצע, השקף את העור ודופן הפריטונאלית, וחתוך את הטחול ל-PBS סטרילי של 5 מ"ל.
    7. נתח את הטיביה והירך משתי הרגליים, הסרת רקמות עודפות וכריתת הטחול בתנאים סטריליים. העבר מיד את הטחול לתמיסת PBS סטרילית, קרה, של 5 מ"ל כדי לשמור על חיוניות התא.
    8. עבד את הטחול.
      1. הומוגניזציה של רקמת הטחול ב-1 מ"ל של 1× בופר תאי דם אדומים (RBC) (השתמשו ב-2 מ"ל לטחול > 200 מ"ג). דגרו במשך 2–3 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. פירוק קירור על ידי הוספת 10 מ"ל PBS + 2% סרום בקר עוברי (FBS) (בופר FACS), סינון דרך מסננת של 40 מיקרון, וצנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      3. החזירו את כדור הטחול בבופר FACS של 5 מ"ל.
    9. עיבוד מח עצם.
      1. הסר את שתי האפיפיזות ושטף כל עצם עם בופר FACS של 1 מ"ל באמצעות מזרק של 1 מ"ל עם מחט 29 לתוך צינור של 15 מ"ל.
      2. צנטריפוגה את תליית התא, השליך את הסופרנטנט והשלים תאים ב-1 מ"ל של בופר ליזיס 1× RBC, דגירה למשך 2 דקות ב-RT, פירוק הקירור על ידי הוספת בופר FACS של 10 מ"ל, סינון דרך מסננת 40 מיקרון, וצנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      3. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את כדור ה-BM לבופר FACS של 1 מ"ל על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      4. סחרור בעדינות וסינן דרך מסננת של 40 מיקרון במידת הצורך.
      5. השעתי מחדש 0.5 × 10^6 תאים לוקמיים במדיות תרבית תאים של 200 מיקרוליטר (למשל Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco) בתוספת 20% FBS ואינטרלוקין-7 (IL-7; 250 pg·mL-1).
        נקודת הפסקה: השאירו את תליית התאים על קרח עד שעתיים לפני הצביעה.
  2. טרנסדוקציה לנטיוויראלית של תאי לוקמיה:
    1. תאי סטרומל שמקורם במח עצם של עכברים ב-1 × 10^5 תאים לבאר בלוח של 24 בארות 24 שעות לפני ההעברה כדי לאפשר היצמדות ולהשיג חיבור של 70–80%.
    2. תאי לויקמיה בלוחית (0.5 × 10^6 תאים בנפח סופי של 200 מיקרוליטר) בתרבית לא רקמה מטופלת עם 24 בארות.
    3. הוסף וקטור לנטי-ויראלי משבית את עצמו (SIN) המקודד מדווח מיזוג כפול הכולל לוסיפראז חיפושית אדומה (CBR) וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP), מונע על ידי פרומוטר יוביקוויטין מרכיב, עם ריבוי זיהום (MOI): 10–20, טיטר ויראלי: ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (יחידות המרה למיליליטר) בנפח הטרנסדוקציה הסופי של 200 מיקרוליטר יחד עם פוליברן (8 מיקרוגרם·מיליטר-1; Sigma, H9268-5G).
      אזהרה: פוליברן הוא ציטוטוקסי בריכוזים גבוהים. אל תעלה על 8 מיקרוג·מ"ל-1. לטפל בלנטיווירוס תחת בידוד ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).
    4. אטום את הפלטה עם פאראפילם וצנטריפוגה ב-1,200 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. לאחר הספינוקולציה, העברת תאי לוקמיה מועברים לשכבת מונולר סטרומלית ותרבית למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ב-DMEM + 20% FBS + IL-7 (250 pg·mL-1) לתמיכה בהישרדות התאים ובביטוי המדווח.
      הערה: ניתן להוסיף אנטיביוטיקה לאחר 24 שעות במידת הצורך, אך יש להימנע מהן במהלך העברת הווירוס.
    6. לאחר 24 שעות, אספו תאים לוקמיים לא דביקים ושוטפים פעמיים עם תמיסת מלח סטרילית עם בופר זרחן (PBS), 350 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, להסרת וירוס ופוליברן שנותרו.
    7. החזירו תאים ב-PBS סטריליים ב-1 × 10^7 תאים·מ"ל-1 להשתלה.
      נקודת הפסקה: לאחר הכביסה, ניתן לשמור על התאים באותו תנאי תרבית עד 48 שעות לפני ההשתלה במידת הצורך.
  3. השתלה בעכברי NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) בוגרים
    1. השתמש בעכברי NSG בני 4–6 שבועות כמקבל.
    2. חמם את העכבר במשך 5 דקות באמצעות כרית חימום או מנורת חימום להרחבת הוורידים הזנביים.
    3. להגביל עכבר בעזרת מגבלת אקריליק.
    4. הזרקו 1 × 10^6 תאים ב-PBS סטרילי בנפח 100 מיקרוליטר דרך וריד זנב צדדי באמצעות מזרק אינסולין 29 גייג'. אין צורך בהרדמה (אלא אם כן נדרש על פי הנחיות מוסדיות)
    5. הפעילו לחץ עדין על אתר ההזרקה כדי למנוע דימום.
      זהירות: הימנעו מהתפשטות. הזרקה תוך ורידית מוצלחת אינה גורמת לנפיחות נראית לעין.
    6. עקבו אחרי עכברים פעמיים בשבוע להתפתחות מחלה.
  4. מיון תאי לוקמיה GFP+
    1. עם הופעת המחלה, יש לקצור BM או טחול מעכברי NSG לוקמיים.
    2. הכינו תלייה חד-תאית כפי שתואר לעיל.
    3. תאי צבע עם צבע חיוני (7-AAD).
    4. השתמש במיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) למיון תאי לוקמיה GFP+.
    5. למיון השתמשו במיון תאים מהיר ופעל לפי אסטרטגיית השער של פיזור קדמי (FSC) מול פיזור צד (SSC) → להוציא פסולת, FSC-A מול FSC-H → סינגלטים נבחרים, צבע חי שלילי → תאים חיים נבחרים, שער GFP+ → בידוד תאי לוקמיה חיוביים לדיווח.
    6. אסוף תאים ממוינים לצינורות המכילים DMEM + 20% FBS. טוהר יעד לאחר המיון: ≥ 95% תאי GFP+.
      נקודת הפסקה: תאים ממוינים יכולים להישמר על הקרח עד שעתיים לפני ההקפאה.
  5. שימור קירור של תאים ממוינים
    1. החזירו תאים ממוינים ב-5 × 10^6 תאים/מ"ל בתווך קפוא המכיל 90% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
    2. עליקווט 1 מ"ל לכל קריוביאל ומניחים בקבוקונים במיכל הקפאה מבוסס איזופרופנול ואחסון בטמפרטורה של −80°C במהלך הלילה (12–18 שעות).
    3. העברת בקבוקונים לחנקן נוזלי (LN₂) לאחסון ארוך טווח.
      אזהרה: DMSO רעיל ונספג בקלות דרך העור. לטפל בזה עם כפפות ולעבוד במהירות.
      נקודת הפסקה: תאים עשויים להישמר לטווח ארוך בחנקן נוזלי עד לשימוש בניסויים בהשתלות יילודים.

2. יצירת תאי NB מסומנים בלוציפראז

הערה: עכברים טרנסגניים TH-MYCN מפתחים גידולי NB ספונטניים ונשמרו תחת פרוטוקולי טיפול מוסדי מאושרים. וקטור לנטיוויראלי בשימוש זהה לתיאור בסעיף 1.2.

  1. איסוף גידולים ופירוק רקמות
    1. הורד עכברים נושאי גידול מסוג TH-MYCN בהתאם להנחיות טיפול בבעלי חיים מאושרות.
    2. קצור גידולי NB תת-עוריים או בטניים בתנאים סטריליים.
    3. שקלו את רקמת הגידול וטחצו לחלקי ~1–2 מ"מ באמצעות מספריים סטריליים.
    4. העברת רקמה לבופר עיכול של כ-5 מ"ל לכל רקמת גידול במשקל 0.5 גרם בצינור קווני של 15 מ"ל, הכולל DMEM, דאוקסיריבנוקלאז I (DNase I; 50–100 U·mL-1), ותערובת אנזימים מבוססת קולגנאז (ריכוז סופי של 10 מיקרוג·מ"ל-1 ).
    5. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד במהירות 150 סל"ד למשך 30 דקות.
      אזהרה: תגובות עיכול אנזימטיות עלולות לגרום לגירוי בעור ובעיניים. תלבש כפפות והגנה על העיניים.
    6. לאחר העיכול, יש פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי להפריד רקמות נוספות. מסנן מתלה דרך מסננת תא 70 מיקרון לצינור חדש.
    7. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (20–22 מעלות צלזיוס).
    8. להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את הכדור ל-DMEM עם תוספת של 10% FBS.
    9. בצע ליזיס RBC באמצעות מאגר הליזה של RBS כפי שתואר קודם בסעיף 1.1.
    10. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות והשלת מחדש את הכדור ב-10 מ"ל DMEM עם גלוקוז גבוה עם תוספת של 10% FBS ו-50 מיקרומום 2-מרקפטואנול.
      אזהרה: 2-מרקפטואנול הוא רעיל ונדיפ. לבצע טיפול במכסה אדים כימימי.
      נקודת הפסקה: ניתן לשמור תאים על הקרח עד שעה לפני ההעברה.
  2. טרנסדוקציה לנטיוויראלית
    1. פלט 2 × 10^6 תאי NB ב-300 × גרם למשך 5 דקות והסרת הסופרנטנט לחלוטין.
    2. החזירו את כדורי התא ישירות בווקטור לנטיויראלי מרוכז בנפח 14 מיקרוליטר (אותו וקטור המתואר בסעיף 1.2; טיטר וירוס ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, בערך MOI: 10–20).
    3. דגרו תערובת תאים-וירוס למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח (% CO₂).
    4. הוסף 200 מיקרוליטר DMEM עם רמות רמות סוכר גבוהות + 10% FBS והמשך את הדגירה במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
      אזהרה: יש לטפל בווקטורים לנטיויראליים בתנאי BSL 2.
    5. שטפו תאים מועברים ארבע פעמים עם DMEM גבוה גלוקוז כדי להסיר וירוס שאריתי.
    6. ספירת תאים ברי קיימא באמצעות הדרה של טרייפן בלו.
      חשוב: שמרו על הכנת המטריצה על הקרח כל הזמן כדי למנוע ג'לציה מוקדמת.
  3. השתלה תת-עורית בעכברי NSG
    1. להחזיר תאים ב-5 × 10^6 תאים ל-100 מיקרוליטר בהכנת מטריצת ממברנה בבסיס קר (מטריצה חוץ-תאית מופחתת בפקטור גדילה).
    2. הרדמו עכברי NSG בני 6–8 שבועות (ראו סעיף 1.1) באמצעות איזופלורן שנשאף (2–3% בחמצן).
    3. תערובת תא עומס–מטריצה למזרק מקורר מראש בנפח 1 מ"ל המצויד במחט 27 גייג'.
    4. הזרקו 5 × 10^6 תאים בנפח כולל של 100 מיקרוליטר תת-עורית לאזור הצד.
    5. עקוב אחרי עכברים עד להחלמה מלאה מהרדמה.
      הערה: הזרקו מיד לאחר הערבוב עם המטריצה כדי למנוע התקשות בתוך המזרק.
    6. אפשר לגידולים לגדול לקוטר ~1 ס"מ.
  4. מיון תאים
    1. קצור גידולים ויצירת תלייה חד-תאית כפי שמתואר בסעיפים 2.1–2.2.
    2. העשרת תאים מתויגים בלוציפראז באמצעות FACS בהתבסס על ביטוי GFP, בהתאם לאסטרטגיית השער המתוארת בסעיף 1.4.
    3. בצע שני סבבים עוקבים של מיון כדי להשיג טוהר חיובי ל-GFP ≥ 95%.
  5. שימור קריופ
    1. תאים ממוינים בקריופרף כפי שמתואר בסעיף 1.5.
      נקודת הפסקה: ניתן לאחסן תאים לטווח ארוך בחנקן נוזלי לניסויים עתידיים בהשתלה.

3. הכינו את תליית התא להזרקת וריד טמפורלי

  1. הפשרה מהירה של תאים לוקמיים מסומנים על ידי לוסיפראז או תאי NB באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שנשאר גביש קרח קטן.
  2. חיטא מיד את החלק החיצוני של הבקבוקון עם 70% אתנול, ואז העבר את התוכן ל-9 מ"ל של מדיום DMEM + 10% FBS מחומם מראש בצינור קוני של 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, שאיפת סופרנאנט, והשיה מחדש את הכדור ב-PBS קר וסטרילי.
  4. קבעו את הקיימות באמצעות החרגת טרייפן בלו והמוציטומטר (או מונה תאים אוטומטי). השתמש רק במתלים עם ≥-80% כדאיות.
  5. העבירו את תליית התא דרך מסננת תאים בגודל 40 מיקרון כדי להסיר גושים.
    אזהרה: גושי תאים מגבירים הזרקות כושלות ופגיעות ברקמות.
  6. כוונן את הריכוז להכנת 20 מיקרוליטר לכל יילוד המכיל 1 × 10^4 תאי לוקמיה (להשתלת לוקמיה), או 5 × 10^4 תאי NB (להשתלת NB).
  7. השאירו את תליית התא על קרח וערבבו בעדינות מיד לפני טעינת המזרק כדי לשמור על אחידות.
    נקודת הפסקה: השאירו תאים על הקרח עד שעתיים לפני ההזרקה אם החיוניות נשארת ≥ 80%.

4. הזרקת וריד טמפורלי (גורי P1–P2)

הערה: הזרקת וריד טמפורלי יילודים יכולה להתבצע ללא הרדמה. עם זאת, קיבוע היפותרמי קצר משמש בדרך כלל להפחתת תנועה ולשיפור דיוק ההזרקה. שימוש בשיבוט היפותרמי אינו מותר על ידי כמה ועדות טיפול בבעלי חיים מוסדיות - החוקרים חייבים להתייעץ עם הוועדה המוסדית הרלוונטית לפני ביצוע ההליך. אם מאושרת על ידי המוסד שלך, הצעדים הבאים יעילים לקיבוע היפותרמיה.

  1. הכינו מיכל קטן מרופד במפית סטרילית וקיררו אותו מראש על ידי הנחתו על קרח.
  2. גורי המקום (יום 1–2 לאחר הלידה; P1–P2) על המפית בתוך המיכל לקיבוע היפותרמי למשך 2–3 דקות עד שהתנועה הספונטנית מצטמצמת משמעותית.
    חשוב: אל תאפשרו לגורים לגעת ישירות בקרח (השתמשו במחסום המיכל והמפית בכל עת).
  3. טעין 60 מיקרוליטר של מתלה התא לתוך מזרק זכוכית בנפח 100 מיקרוליטר וחבר מחט בקוטר 30. להוציא את המתלה חזרה לתוך הצינור כדי למלא את הנפח המת של המזרק והמחט. לאחר שהנפח המת מוכן, יש לשאוף 20 מיקרו-ליטר של תליית תא להזרקה, כדי להבטיח שאין בועות אוויר. השתמשו בעכברי BALB/c ו-TH-MYCN כמקבלים של תאי לוקמיה ותאי NB, בהתאמה.
  4. הכינו שלב מואר על ידי הצבת מקור אור קר מתחת לפלטפורמת פלקסיגלס.
  5. ללבוש משקפי מגדלת (או להשתמש במיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ) כדי להמחיש את אתר ההזרקה.
  6. הניחו מפית סטרילית עם חור מרכזי על הבמה ומקמו את הגור כך שהווריד הטמפורלי יהיה גלוי.
  7. הנח חתיכת חימר קטנה (בצק משחק) ליד ראש הגור כדי לייצב את המחט במהלך ההזרקה.
  8. הכנס את המחט בזול כלפי מעלה לווריד הטמפורלי הנראה והזריק באיטיות את תליית התא, תוך צפייה במילוי כלי הדם כדי לאשר הצלחה במתן תוך-ורידי.
  9. לאחר ההזרקה, יש להפעיל לחץ עדין על אתר ההזרקה באמצעות מטוש כותנה סטרילי. מניחים את הגור על משטח התאוששות מחומם (כ-37 מעלות צלזיוס, למשל, כרית חימום על חום נמוך עם מחסום מגבת) עד שהתנועה הרגילה והצבע הורוד חוזרים.
  10. יש לעקוב אחרי הגור 5–10 דקות לאחר ההחלמה, ואז להחזיר אותו לסם.
    אזהרה: הימנעו מהתחממות יתר במהלך ההתאוששות. השתמש בשכבת מחסום ועקוב באופן רציף.
  11. שטוף את המזרק מיד עם PBS, ואז עם תמיסת ניקוי מזרק, וסיים עם 70% אתנול.

5. הכנה לזיהום וירוסים

  1. בצע את כל ההליכים הקשורים לציטומגלוווירוס עכברים (mCMV) תחת כלילת BSL-2 בהתאם לאישורי בטיחות ביולוגית מוסדית וטיפול בבעלי חיים.
  2. לטפל במלאי וירוסים בארון בטיחות ביולוגית מוסמך מסוג Class II ולבצע זיהומים בבעלי חיים באזורים ייעודיים לפרוצדורות BSL-2.
  3. לבצע הכנה וטיפול בנגיף בארון בטיחות ביולוגית מוסמך מסוג Class II, ולבצע את זיהומי בעלי החיים באזורים מוגדרים להליך BSL-2.
  4. לבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה או חלוק חד פעמי, כפפות והגנה לעיניים. התייחסו לכל החומרים המכילים וירוסים (מזרקים, מצעים, כלובים ומשטחים) כבעלי פוטנציאל זיהותי.
  5. מזער שימוש במחטים וזרוק מיד במיכלים מאושרים לחומרים ביו-מסוכנים. חטא משטחי עבודה וציוד לאחר השימוש. להשליך את כל הפסולת המוצקה והנוזלית כפסולת ביו-מסוכנת בהתאם לנהלים המוסדיים.
  6. הדביק עכברים ב-P7 (5–6 ימים לאחר השתלת תאי לוקמיה).
  7. הפשיר וירוס על הקרח, ערבב בעדינות באמצעות היפוך, והשאיר על הקרח במהלך ההכנה. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים (השתמשו באליקוטים חד-פעמיים).
  8. הכינו mCMV ב-2 × 10^5 יחידות יצירת פלאק (PFU)/מ"ל ב-PBS והזרקו ל-pups תוך-פריטונית (i.p.) עם 1 × 10^4 PFU ב-50 מיקרוליטר PBS באמצעות מחט 30 גייג'. הזרקו לרבע הימני התחתון של הבטן בזווית רדודה כדי להימנע מאיברי בטן.
    אזהרה: mCMV מדבק (BSL-2). השתמש בבידוד וניקוי מתאימים.
  9. רשמו זיהוי בעלי חיים, גיל, קבוצת ניסוי, מינון וירוס, נפח ופרטי הזרקה.

6. הדמיית ביולומינסציה (BLI)

הערה: יש לבצע BLI ב-P7 (5–6 ימים לאחר הזרקת התאים ולפני ההדבקה) וב-P17 (10 ימים לאחר ההדבקה) כפי שמתואר להלן.

  1. המיס את D-לוציפרין ב-PBS ב-10 מיקרוג·μL-1. לסנן-סטריליזציה באמצעות פילטר של 0.22 מיקרון, אליקווט, ולאחסן בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס מוגן מאור.
    אזהרה: ד-לוסיפרין רגיש לאור. מזער חשיפה לאור במהלך ההכנה והשימוש.
  2. הזרקו D-luciferin i.p. ב-50 מיקרוליטר לכל גור באמצעות מחט 30 גייג'.
  3. הרדמו גורים עם איזופלורן (השראה 3–4%, תחזוקה 1.5–2%) בחמצן (0.8–1.0 ליטר·דקה-1). לשמור על טמפרטורת גוף בשלב הדמיה מחוממת (כ-37 מעלות צלזיוס).
    אזהרה: איזופלוראן הוא חומר הרדמה נדיף. השתמש במכשיר אידוי ומערכת איסוף מאושרת.
  4. הניחו גורים מורדמים במערכת הדמיה של בעלי חיים קטנים (פרטי המכשיר מסופקים בטבלת החומרים).
  5. לצלם תמונות ביולומינסנטיות ותמונות רנטגן באמצעות הגדרות חשיפה עקביות 10 דקות לאחר הזרקת D-luciferin (הגדרות BLI: זמן חשיפה 120 שניות לתמונות P7 ו-30 שניות ל-P17, Binning B4 עבור P7 ו-B4 לתמונות P17, שדה ראייה (FOV) 25, f-stop 1.2, גובה אובייקט 1.5 והגדרות רנטגן: רזולוציה גבוהה, הספק גבוה).
    נקודת הפסקה: אחסון קבצי תמונות מיד לאחר ההדמיה; ניתן לבצע ניתוח מאוחר יותר.
  6. נתח תמונות באמצעות תוכנת הדמיית BLI מתאימה על ידי הגדרת אזורי עניין (ROI) המקיפים את כל גוף כל עכבר וכימות האור הנפלט כפוטונים·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1.
  7. ערכי תשואה כמותיים לייצוא לניתוח סטטיסטי במורד הזרם.

7. איסוף תאי לוקמיה מעכברים שהושתלו בתאים

  1. לקצור תאי לוקמיה ולייצר תלים חד-תאיים כפי שמתואר בסעיף 1.1.

8. צביעה ורכישת ציטומטריית זרימה

  1. ספירת תאים ותליות צנטריפוגות ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשעיה מחדש ב-1 × 10^7 תאים·מ"ל-1 בבופר FACS.
  2. העבר 100 מיקרוליטר (1 × 10^6 תאים) לצינורות ציטומטריה בזרימת פוליסטירן.
  3. הוסף נוגדן חוסם קולטני Fc (נוגדן CD16/32; 1 מיקרוליטר לכל צינור) ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הכינו תערובת נוגדנים ראשית בבופר FACS והוסיפו לכל צינור CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC וסמנים שליליים של שושלת (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP), 1 מיקרוליטר מכל נוגדן לכל תא 1 x 10^6 בבופר FACS של 100 מיקרוליטר.
  5. דגרו ל-20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  6. שטוף עם בופר FACS של 5 מ"ל, צנטריפוגה, והשלים מחדש בבופר FACS של 200 מיקרוליטר המכיל 7-AAD (3 מיקרוליטר) וחרוזי ספירה (6 מיקרוליטר; 6,000 חרוזים).
  7. הכינו בקרות פיצוי עם צביעה אחת באמצעות חרוזי לכידת נוגדנים או תאים ורכישת בקרות לצד דגימות ניסיוניות.
  8. רכישת דגימות על ציטומטר זרימה באמצעות הגדרות גלאי סטנדרטיות FITC/PE/APC/PERCP וקצב זרימה בינוני. אספו אירועים עד שיקבלו 1,000 חרוזים.
  9. ייצוא קבצי FCS וניתח באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה ( המופיעה בטבלת החומרים) באמצעות אסטרטגיית השער המובנת (איור 2D).
  10. חשב מספר תאים מוחלט לכל טחול או מח עצם באמצעות ספירת חרוזים על ידי כפל מספר האירועים היעדיים שנאספו ב-1,000 חרוזים בפקטור קנה מידה של 6 (6,000 חרוזים נוספים), ונרמול לתאי האיברים הכולל בהתבסס על חלק התאים המוצבעים (1 × 10^6 תאים).

9. גרפים וניתוח סטטיסטי

הערה: יצירת גרפים וביצוע ניתוחים סטטיסטיים עבור נתוני BLI וציטומטריית זרימה באמצעות חבילת תוכנה סטטיסטית (המופיעה בטבלת החומרים).

  1. הצג נתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
    הערה: אף בעל חיים לא הוצא מהמחקר הזה.
  2. עבור BLI, השוו קבוצות PBS ו-mCMV בנפרד ב-P7 ו-P17 באמצעות מבחני מאן–וויטני לא מזווגים, כאשר תיקון הולם–שידאק מיושם כדי להתאים השוואות מרובות בנקודות זמן.
  3. ניתוח תוצאות ציטומטריית זרימה באמצעות מבחן מאן–וויטני דו-זנבי לא מזווג.
  4. הגדר מובהקות סטטיסטית כ-p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הזרקת וריד טמפורלי מאפשרת השתלה יעילה של לוקמיה ותאי נוירובלסטומה בידי יילודים
כדי למודל את השפעת הזיהום בגיל מוקדם על התקדמות סרטן ילדים, תאי B-ALL מסומנים בלוציפראז שמקורם בעכברי Eμ-Ret בוגרים לוקמיים או תאי NB שמקורם בעכברי Th-Mycn גוססים הועברו תוך-ורידי דרך הווריד הטמפורלי לגורים סינגניים בני יום–יומיים. ההשתלה המוצלחת אושרה חמישה ימים לאחר ההשתלה באמצעות BLI ודימות רנטגן הן ללוקמיה (איור 2A, n = 7) והן ל-NB (איו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הבנת האופן שבו התפתחות מערכת החיסון בגיל צעיר משפיעה על התקדמות הסרטן חיונית לעיצוב אסטרטגיות אימונומודולציה מתאימות לגיל. במחקר זה, אנו מתארים פלטפורמת השתלות יילודים ניתנת לשחזור המאפשרת שליטה מדויקת בזמן על השתלת תאי סרטן ומודולציה חיסונית במהלך חלון קריטי של חוסר בגרות חיסונית לאחר הלידה. על ידי שילוב מתן תוך-ורידי בתיווך וריד טמפורלי עם BLI, מודל זה מאפשר חקירה שיטתית של האופן שבו זיהום בגיל צעיר משפיע על התקדמות סרטן הילדים בהקשרים מחלותיים שונים.

באמצעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים תפעוליים מהמכון הקנדי למחקר בריאות ל-G.S.D.R. (MOP-126122). א.פ. זכה במלגת פוסט-דוקטורט של תוכנית מחקר סרטן הילדות של מייקל קוצ'ונה (MC3RP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100µL, מזרק מיקרוליטר, טיפ Luer Hamilton  80601 -
מחט 30 G  BD  305106 -
7-AAD Biolegend 420404 - 
מערכת הדמיה Ami-X Spectral Instruments Imaging - - 
anti-mouse B220- APC Biolegend 103212  -
anti-mouse CD19-FITC Biolegend 152404  -
anti-mouse CD3ε- PerCPBiolegend  100326 - 
anti-mouse Ly-51-PEBiolegend  108308 נקרא גם BP1 
anti-mouse TER119- PerCP  Biolegend 116226 - 
anti-mouse/human CD11b- PerCP Biolegend 101230 - 
תוכנת Aura Spectral Instruments Imaging - גרסה 4.0.8
BD Accuri C6  BD- - 
BD Fortessa X-20  BD- - 
פתרון ניקוי Hamilton 18310  -
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen by Thermo Fisher Scientific 2770930 6 µL מכיל 6000 חרוזים 
D-Luciferin GoldBioeLUCK-1G- 
DMEMGibco11965092-
DNase ISigma1.13E+10-
Falcon 40µm Cell Strainer, כחול, סטרילי, ארוז בנפרד FALCON 352340 - 
FBSGibcoA5256701- 
תוכנת FlowJo BD- v10.8
GeltrexTMThermo Fisher Scientific A1413202- 
תוכנת GraphPad Prism Dotmatics- v10.4.1
LE.5209 מקור אור קר Euromex -- 
Liberase™ TM Research GradeSigma5.4E+09-
עכברי NSGJackson Labrotary5557NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ
PolybreneSigmaH9268-5G-
נוגדן מטוהר anti-mouse CD16/32Biolegend 101301- 
מאגר RBC Lysis (10X)Biolegend 420301- 

מקורות

  1. Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
  2. Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
  3. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  4. Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
  5. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  6. Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
  7. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous Injections in Neonatal Mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
  8. Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread Gene Delivery and Structure-Specific Patterns of Expression in the Brain after Intraventricular Injections of Neonatal Mice with an Adeno-Associated Virus Vector. J Virol. 75 (24), 12382-12392 (2001).
  9. Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
  10. Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
  11. Farrokhi, A., et al. Early-life infection depletes preleukemic cells in model of hyperdiploid B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 144 (8), 809-821 (2024).
  12. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
  13. Pavathuparambil, A. M. N., et al. Facial vein injection of human cells in severe combined immunodeficiency (SCID) neonatal mice. MethodsX. 5, 1281-1286 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אימונולוגיה וזיהומיםגיליון 232גיליון 232ערך ריקגיליוןסרטן בילדיםלוקמיהנוירובלסטומהB-ALLזיהוםהזרקה לנשוייםהזרקה לווריד רקה
מודל השתלה תוך-ורידית יילודים להערכת פעילות חיסונית מוקדמת נגד תאי סרטן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.