מאמר שיטה

ריצות לוחית אחת של בדיקות לחץ וגליקוליזה של מיטו באמצעות תאים דביקים או לא דביקים

202 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69504

⸱

22 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג פרוטוקולים אופטימליים לביצוע ניתוח מטבולי בזמן אמת של בדיקות לחץ מיטו ובדיקות לחץ גליקוליזה בו-זמנית על אותה צלחת. ההליכים מותאמים הן לתאים דבקים (BMDMs) והן לתאים לא דבקים (לימפוציטים), ומאפשרים הערכה מדויקת, ניתנת לשחזור ובמקביל של תפקוד המיטוכונדריה והגליקוליטי של התאים הרלוונטיים.

תקציר

ניתוח מטבולי בזמן אמת מספק מדידות ללא תוויות של נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזה, ומאפשר לחוקרים לקשר את חילוף החומרים של אנרגיה תאית למנגנוני מחלה ותגובות טיפוליות בתחומים מגוונים. כאשר משווים מטבוליזם אנרגיה בין עכברים, בעלי חיים אחרים, בני אדם או תאים תחת טיפולים שונים, חשוב לבצע מדידות בתוך ריצה אחת כדי להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות. יתרה מזאת, תכנון ניסוי חייב לשקול את סוג התא הנבדק, לדוגמה, האם הוא דבק, כמו מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDMs), או לא דבקים, כמו לימפוציטים. לכן, פותח פרוטוקול שמאפשר ביצוע בו-זמני של בדיקות לחץ מיטו וגליקוליזה על אותה פלטה, למרות שהבדיקות דרשו הזרקות תרופות ותוכניות אנליטיות שונות. פרוטוקולי טיפול נפרדים הותאמו לניתוח של תאים דביקים מאוד (למשל, BMDM) ותאים "צפים" לא דבוקים (למשל, תאי T ולימפוציטים אחרים). כאן מוצגים פרוטוקולים מפורטים לביצוע הבדיקות הללו בצורה יעילה וניתנת לשחזור.

מבוא

מנתח Seahorse XF הוא מכשיר ייחודי המאפשר מדידה בזמן אמת של נשימת מיטוכונדריה וגליקוליזה בסוגי תאים רבים. על ידי כימות מקביל של קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב החמצה החוץ-תאית (ECAR), טכנולוגיה זו מאפשרת ניתוח מדויק של מסלולים ביואנרגטיים בתנאי פיזיולוגיה או לחץ. הרב-גוניות שלו הפכה אותו לבלתי ניתן להחלפה בתחומי מחקר מגוונים, כולל סרטן1, מדעי המוח2, אימונולוגיה3, הזדקנות 3,4,5, ותרופות גילוי6, שם תכנות מחדש מטבולי הוא סימן היכר של התקדמות המחלה ותגובה טיפולית. על ידי קישור ביואנרגטיקה פונקציונלית לפנוטיפים תאיים 7,8, הניתוח מספק פלטפורמה עוצמתית לחשיפת מנגנונים, זיהוי פגיעויות מטבוליות והערכת השפעות של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות.

בתחומים רבים, השוואת ההשפעות המיידיות של תרופות, מולקולות קטנות, ציטוקינים או תרכובות טבעיות על חילוף החומרים התאי מתבצעת בצורה הטובה ביותר בתנאים ניסיוניים זהים, אותו צלחת, זמן דגירה, פרמטרים סביבתיים ושעות ביום. בהתאם לכך, גישה זו היא ללוות תאים עם טיפולים או רקע גנטי שונים על אותו לוח ולנתח בו זמנית פרמטרים מטבוליים מרובים. אסטרטגיה זו מבטיחה את ההשוואה המדויקת ביותר של שינויים הקשורים לתרופות או גנטיקה במטבוליזם של אנרגיה תאית.

סוגי תאים רבים מתנהגים אחרת בתרבית. הלימפוציטים נשארים בתלייה ולעולם אינם נצמדים ללוח9, המקרופאגים נדבקים בחוזקה, מה שמקשה על העברתם, ותאי הסרטן מתרבים במהירות אך בקצב משתנה בהתאם לקו. הבדלים אלו מציבים אתגרים לניתוח מטבולי בזמן אמת; לכן, כל סוג תא בניסוי דורש פרוטוקול מותאם אישית.

מאמר זה מספק פרוטוקולים שלב אחר שלב לביצוע בדיקות אלו באמצעות ניתוח מטבולי בזמן אמת, ומבטיח יעילות ושחזוריות. פרוטוקולים אלו ניתנים ליישום על כל הגרסאות של אנלייזרים הזמינים בשוק.

פרוטוקול

העכברים טופלו בהתאם לנהלים שנקבעו בפרוטוקול של המכון הלאומי לבריאות וועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במכללת מהארי לרפואה. מוסד זה מוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה בינלאומי ופועל בהתאם למדיניות שירות הבריאות הציבורי לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה בתנאים נטולי פתוגנים. פרטי הריאגנטים והציוד בו משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. אופטימיזציה לצפיפות תאים

הערה: לכל סוג תא יש תכונות מטבוליות ייחודיות ושונות משמעותית בגודל. שני הגורמים קריטיים בקביעת מספר התאים המתאים לטעינה בכל באר כדי להשיג תוצאות מיטביות. לפני ביצוע מבחן ניסויי ראשוני, יש להכין ולהריץ לוח בדיקה שבו התאים הנבחרים מצופים בצפיפויות משתנות.

  1. עבור תאים דביקים (למשל, תאי סרטן), בדקו את צפיפויות הזריעה הנעות בין 20,000–100,000 תאים לבאר. עבור תאים מטבוליים מאוד ו/או גדולים (למשל, תאי סרטן אנושיים או פיברובלסטים), אופטימיזציה של צפיפות מתחילה ב-10,000 תאים או פחות בכל באר.
  2. לתאים שאינם דבקים (למשל, לימפוציטים), יש למקסם את צפיפות הזריעה בטווח של 100,000–500,000 תאים לבאר. לכל סוגי התאים, שאפו לשכבה מונו-תאית אחידה כדי להשיג תוצאות מיטביות (ראו איור 1 לדוגמה פריסת לוחות דגימות).
  3. הרץ את מבחן Mito Stress (כמו למטה). הנתונים מהבדיקה הראשונית הזו יכולים לשמש לקביעת צפיפות התאים האופטימלית לניסוי הראשי. בחר את הצפיפות שמראה את ההבדל הגדול ביותר בין תנאי הבדיקה.
    הערה: פרוטוקול זה אינו חל על ניתוח דגימות תלת-ממדיות (למשל, ספרואידים של תאים, אורגנואידים). עם זאת, ניתן לשנות אותו כדי להתחשב בעובי הדגימה ובמשטח הלא אחיד.

2. הכנה לבדיקה

  1. ביום שלפני ביצוע הבדיקה, הרימו בעדינות את מחסנית החיישן מתוך לוח השירות והוסיפו 200 מיקרולטר מים ללא RNAase/DNAse לכל באר של פלטת השירות, והנמו את מחסנית החיישן לתוך פלטת השירות עד שהחיישנים טובלים לחלוטין במים.
    הערה: מפלס המים חייב להיות גבוה מספיק כדי לוודא שהחיישנים שקועים לחלוטין במהלך הלילה, שכן הפלואורופורים של מחסנית החיישן לא יעבדו אם לא יידרשו כראוי. אם משתמשים ב-XF Hydrobooster כדי להרטיב את המחסנית, ניתן להכניס את המחסנית ישירות לתמיסת כיול ולהוציא את שלב ההידרציה במים.
  2. הנח את מחסנית החיישן/פלטת השירות ההידרטית באינקובטור ללא CO 2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי למנוע אידוי מהצלחת, יש גם להניח מיכל עם מים מזוקקים כפול בתוך האינקובטור.
  3. ביום הבדיקה, הסר את מחסנית החיישן/פלטת השירות מהאינקובטור ללאCO-2 והוציא בעדינות את מחסנית החיישן מהפלטה, והניח את צד החיישן כלפי מעלה על השולחן.
  4. להשליך את המים מפלטת השירות ולנער את הטיפות הרופפות לייבש, והוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת קליברנט XF לכל באר.
  5. מניחים בעדינות את מחסנית החיישן חזרה ללוח השירות כך שהחיישנים יהיו שקועים לחלוטין בתמיסת כיול, והחזירו אותה לאינקובטור ללא CO-2 בטמפרטורה של 37°C.

3. הכנת מדיה לבדיקה

  1. מיטו סטרס הכנה לתקשורת:
    1. בצינור של 50 מ"ל, הוסף ל-45 מ"ל של מדיום XF RPMI: 500 מיקרוליטר של 100x נתרן פירובט (ריכוז סופי: 1 מ"מ), 500 מיקרוליטר של 100x L-גלוטמין (ריכוז סופי: 2 מ"מ), ו-550 מיקרוליטר של 45% תמיסת גלוקוז (ריכוז סופי: 25 מ"מ)
  2. כוון את ה-pH ל-7.4. השלמה עם XF RPMI בינוני לנפח סופי של 50 מ"ל. שמרו את המדיום המוכן באמבט מים או אמבטיה יבשה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  3. הכנת מדיום לבדיקת גליקוליזה:
    1. בצינור של 50 מ"ל, יש להוסיף 250 מיקרוליטר של 100x L-גלוטמין ל-45 מ"ל של מדיום XF RPMI.
  4. כוון את ה-pH ל-7.4, ואז טען עם XF RPMI בינוני לנפח סופי של 50 מ"ל. שמרו את המדיום המוכן במים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או באמבט יבש לפני השימוש.
    הערה: יש לכוונן מחדש את ה-pH של מדיום הבדיקה של מיטו סטרס וגליקוליזה ל-7.4 לאחר הוספת תוספים שמשנים את ה-pH, שכן גם סטיות קטנות יכולות להשפיע משמעותית על תוצאות הבדיקה.

4. שטיפת תאים והחלפת מדיה לפני ניתוח

הערה: שלב הכביסה של מיקרופלטות XFe96/XF Pro Cell Culture ישתנה בהתאם לסוג התאים הדבקים או הלא-דביקניים. אנא עיינו בשלב 9, תאי דבק (תאי סרטן, תאי BMDM ראשוניים) ותאים לא דביקים (תאי T ולימפוציטים אחרים), כדי לקבוע את שיטת השטיפה הטובה ביותר לסוג התא בו משתמשים.

  1. הסר 160–180 מיקרוליטר של מדיום גדילה מכל באר באמצעות פיפטור מרובה, תוך עבודה של שורה/עמודה אחת בכל פעם כדי למנוע התייבשות של תאים. הימנע מלגעת בתחתית הבארות.
  2. באמצעות פיפטמן חד-קצה, הסר את 20–30 מיקרולטר הנותרים מהבארות, תוך הימנעות ממגע בשכבת התא בתחתית הבאר.
  3. הוסף 180 מיקרוליטר של מדיום מבחן גליקוליזיס או לחץ מיטו (ראה שלב 3) לכל באר, בהתאם לפריסה באיור 1. כדי לא להפריע לשכבת התאים, יש לפזר בעדינות את המדיה לאורך דופן הצד של כל באר עד שכל הבארות מתמלאות. שתי הבדיקות נמצאות באותה לוחית.
    הערה: הבארות שאינן מכילות תאים ובארות בקרה חייבות להיות מלאות גם הן במדיום בדיקה.
  4. הניחו את המיקרופלטה באינקובטור ללא CO 2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40–45 דקות לפני תחילת הבדיקה, והתחילו בהכנת התרופות.

5. הכנת תרופות וטעינת המחסנית

זהירות: חלק מהתרופות (FCCP, אנטימיצין A/ רוטנון, אוליגומיצין) מסוכנות ויש לטפל בהן בזהירות. נדרשים אמצעים מתאימים להגנה על הצוות; אלה כוללים שימוש בכפפות וציוד מגן אישי (PPE) וכן השלכת חומרים בפח או מיכל פסולת כימית המאושרת על ידי המוסד.

הערה: ריכוז FCCP/אוליגומיצין האופטימלי תלוי בסוג התא ולפני הבדיקה, עובר טיטרציה אמפירית בעבודה עם תאים רגישים במיוחד. הריכוזים הסופיים עשויים להשתנות עבור תרופות בהתאם לסוג התא. הכינו תרופות ומדדי בדיקה חדשים ביום השימוש. אל תקפיאו או תשתמשו בו שוב. הכנת תרופות הבדיקה יכולה להתבצע בתוך תקופה של 45 דקות זו לתוצאות מיטביות.

  1. באמצעות מדיום מתח ומיטו וגליקוליזיס מחוממים מראש משלב 3, דילל את התרכובות לפי טבלאות 1 ו/או טבלה 2 לריכוזים המתאימים לכל סוג תא. הכינו כל תרכובת בצינור נפרד בנפח 15 מ"ל (אם משתמשים בכל שש התרכובות, יידרשו שישה צינורות).
  2. הסר את מחסנית החיישן/פלטת השירות מהאינקובטור ללא CO 2 בטמפרטורה 37°C והסר את המכסה, והניח בזהירות את מדריך הטעינה XF שסופק עם הערכה, מדריך הטעינה XF המתאים ליציאת המזרק (מדריך A ליציאה A) מעל ראש מחסנית החיישן (ראו איור 2).
  3. באמצעות פיפטור רב-ערוצי ומאגר תגובה לכל תרופה, הוסף בהדרגה את הנפח הנדרש לפורט המתאים (ראו טבלה 1 וטבלה 2 לנפח). החזק את הפיפטור זקוף בקפדנות בעת טעינת הסמים (ראו איור 2).
  4. החלפת או שימוש חוזר לאחר שטיפה וייבוש יסודי של מדריך הטעינה לפי הצורך לכל פורט (פורט A, B, C ו-D) וזרוק את קצות הפיפטה אחרי כל טעינה.
    הערה: קצות הפיפטה מיועדים להתאים היטב לפתח המדריך, אך לא הדוקים מדי, כי קצות הפיפטה עלולים להיתקע במדריך! מומלץ לבדוק את קצות הפיפטה/הפיפטור ששימשו במדריכים לפני טעינת התרכובות כדי למנוע טעות בדגימות.
  5. לאחר טעינת כל התרכובות ליציאות שלהן, הסר את המדריך, וודא ויזואלית שכל הפתחים מלאים, ואבטח את המחסנית עם המכסה. התרופות צריכות להתאים למבחן בכל חלק של אותו לוח (איור 1).
    הערה: הריכוזים הסופיים של בארות מומלצים ללחץ מיטו הם 1 מיקרומום אוליגומיצין, 1 מיקרומום FCCP, ו-0.5 מיקרומום רוטנון/אנטימיצין; לגליקוליזה, 10 מ"מ גלוקוז, 1 מיקרומום אוליגומיצין, ו-50 מ"מ 2-DG.

6. הקמת מנתח Seahorse XFe96

  1. הפעל את המנתח ופתח את תוכנת WAVE (ראה איור 3).
  2. בחר במבחן מאמץ של XF Mito.
    הערה: כל עוד נעשה שימוש במדיום הבדיקה והתרכובות המתאימות, המנתח יכול לבצע בו-זמנית בדיקות מיטוכונדריה וגליקוליזה על אותה פלטה באמצעות בדיקת מאמץ מיטו XF.
  3. בחר את מספר ה'קבוצות' לפי סידור הפלטת ותתייג כל קבוצה. המשיכו ללשונית הבאה כדי להקצות בארות למפת הלוחות (ראו איור 3). שתי הבדיקות נעשות באותה פלטה.
  4. הדגישו את הבארות לכל קבוצה בהתאם לאופן הטעינה של הלוח.
  5. התאימו את התוכנית לסוג התא ולמטרת הניסוי. לדוגמה, אם ההגדרה כוללת קבוצה מוקדמת לפני הניתוח או שמוסיפים מפעיל במהלך הריצה, האריך את זמן הדגירה בכל מחזור כדי לאפשר הפעלה.
  6. בחר את הלשונית הבאה, 'הרץ את הבדיקה' ומלא את המידע לפי הצורך כדי לשמור את קובץ הנתונים.
  7. העמיסו את המחסנית המיובשת מראש עם תרופות (משלב 5) לתוך המכונה כאשר מצביעים על אתחול. שלב האתחול יראה אם החיישנים מיודרים ופועלים כראוי.
  8. התחל את המבחן וטען ופרוק את הלוחות כפי שמצוין בהוראות במהלך התוכנית.
    הערה: כשאתה טוען את המחסנית או המיקרופלטה לאנלייזר, ודא שכל המכסים מוסרים! בעוד שלחלק מהדגמים של האנלייזרים יש תכונת בטיחות שיכולה לזהות מכסים, הדגמים המוקדמים לא. זה עלול להזיק למכונה אם המכסה שלם במהלך ריצת הלוחות.

7. שיטות נורמליזציה: (SRB) וספירת גרעין (צביעה והדמיה של DAPI)

אזהרה: חלק מהתגובות בערכת הבדיקה של SRB הם קורוזיביים ועלולים לשרוף אם הם במגע עם העור. DAPI עלול לגרום לתגובה אלרגית בעור. מומלץ להשתמש בכפפות ובציוד מגן אישי אחר, כמו גם השלכת חומרים במיכל או פסולת כימית המאושרת על ידי המוסד.

הערה: בחרו את שיטת הנרמול בהתבסס על המאפיינים והטיפולים המקדימים של התאים שנבדקו. כל אחת מהשיטות מתאימה להשוואה בין תאים עם קצבי רבייה שונים, שכן שתי השיטות מתחשבות בשינויים אלו. עם זאת, אם טיפולים תרופתיים גורמים להזדקנות, עצירת התרבות תוך הגדלת גודל התא, צביעת DAPI היא הגישה המועדפת לנרמל. DAPI עשוי שלא להתאים לסוגי תאים שבהם קשה לראות צביעת גרעינית (למשל, שומנים, אריתרוציטים) או שתאים עשויים להיות רב-גרעיניים (כלומר, הפטוציטים הפרנכימליים, המיוציטים).

  1. כדי לנרמל תאים באמצעות מבחן SRB (ערכת בדיקת ציטוקסיות של תאי סולפוהודמין B) לאחר ניתוח מטבולי בזמן אמת, יש להסיר את הפלטה מהמכונה ולהוסיף רבע מנפח המדיה (למשל, 50 מיקרו-ליטר ב-200 מיקרו-ליטר של תרבית) של תמיסת הקיבוע לכל באר.
    1. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה או לילה בטמפרטורה של 4°C.
    2. הסר את התמיסה ושטוף בעדינות את הבארות שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מים ללא RNase/DNase, תוך זהירות שלא להפריע לשכבת התא. לאחסון קצר טווח (אם צריך), החלף את הכביסה הסופית ב-PBS ואחסן בטמפרטורה של 4°C.
    3. לנרמול מיידי באמצעות בדיקת SRB, הסר את תמיסת השטיפה ואפשר לפלטה להתייבש באוויר לחלוטין בטמפרטורת החדר.
    4. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת SRB לכל באר וצבע במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, או עטוף את הפלטה בנייר אלומיניום במהלך תקופת הדגירה.
      הערה: תמיסת SRB רגישה לאור, וחלק זה של הניסוי חייב להתבצע באזור עם תאורה נמוכה.
    5. הסר את תמיסת הכתם והוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת כביסה אחת לשטיפה של כל באר 2–3 פעמים.
    6. שטפו במהירות האפשרית כדי להימנע מהלבנה והסירו את תמיסות הכביסה ככל האפשר באמצעות שאיבת ואקום.
    7. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת מסה 1x לכל באר והניחו את הפלטה על שייקר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. מדדו את צפיפות האופטיקה (O.D.) ב-565 ננומטר על קורא לוחות כדי לקבוע צפיפות באר בהתבסס על רוויית הצבע (ראו איור 3 לעיון ויזואלי).
    9. ייצא את נתוני ערכי ה-O.D. כקובץ אקסל. גיליון אלקטרוני זה יודבק לתוכנת WAVE לצורך נרמול (שלב 8).
      הערה: אם נצפה צבע עז (> O.D. 3.5) עקב עומס יתר על התא, ניתן להשתמש באורך גל תת-אופטימלי (למשל, 490–530 ננומטר) כדי להוריד את הקריאות חזרה לטווח הליניארי של המכשיר. הרקע הנכון על ידי חיסור ה-O.D. של הבקרה שמכילה רק את מדיום התרבית (באר בקרת הרקע) מכל קריאות הדגימות.
  2. לצביעה של DAPI, דיללו את תמיסת ה-DAPI ל-300 ננומטר ב-1x PBS.
    1. שטוף כל באר של לוח התא בעדינות 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר 1x PBS.
      הערה: אם יש תאים שאינם דבקים, צנטריפוגה את הלוח בעוצמה של 200 x g למשך 3 דקות ללא בלימה כדי להבטיח שתאים תלויים בתחתית כל באר לאחר כל שלב שטיפה.
    2. תאים קבועים ב-2%–4% PFA מדוללים ב-1x PBS למשך 10–15 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. שטוף כל באר של לוח התא בעדינות 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר 1x PBS.
    4. הוסף כ-150 מיקרוליטר מתמיסת צביעת DAPI מדוללת זו לכל באר, כדי לוודא שהתאים מכוסים לחלוטין בכל באר.
    5. דגרו 1–5 דקות בטמפרטורת החדר באזור עם תאורה נמוכה (או לכיסוי בנייר אלומיניום).
    6. הסירו את תמיסת הכתמים DAPI מכל באר.
    7. שטוף כל באר של לוח התא בעדינות 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר 1x PBS.
    8. הסר כל PBS שנותרו.
    9. דמיינו את התאים בכל עירוץ/פליטה בין 358–461 ננומטר או תחת כל הגדרת מסנן DAPI על מיקרוסקופ.
    10. ייצא את נתוני ערכי הפליטה כקובץ אקסל. גיליון אלקטרוני זה יודבק לתוכנת WAVE לצורך נרמול (שלב 8).

8. ניתוח ונרמול הנתונים

הערה: לניתוח נתונים ניתן להשתמש בתוכנה "Wave" או תוכנה אחרת. הפרוטוקול שניתן חל על תוכנת Wave.

  1. פתח את תוצאות הניתוח בגל (ראה איור 3). הנרמול מתבצע באמצעות ערכים שמתקבלים מקובץ האקסל שנוצר על ידי קורא המיקרופלטה לאחר צביעת SRB (שלב 7).
  2. לחץ על "נרמל".
  3. בחלון הפתוח, בחר "בחר כולם" ואחריו "הדביק" כדי להדביק את הנתונים שהועתקו מגיליון האקסל שנוצר במהלך שלב הנירמל. לחץ על "הגשה". הליך זה נרמל אוטומטית את כל נתוני הניסוי.
  4. כדי ליצור דוח, לחץ על "ייצוא ל", בלוח שנפתח מימין בחר "XF Cell Stress Trial Report Generator". שמור את הקובץ שנוצר. במהלך הניתוח, בחרו רק את הבארות שהוקצו למבחן מאמץ מיטו (ראו איור 3).
  5. כדי ליצור דוח, לחץ על "ייצוא ל", בלוח שנפתח מימין, בחר "מחולל דוחות מבחן לחץ של תא גליקוליזה XF". שמור את הקובץ שנוצר. במהלך הניתוח, בחרו רק את הבארות שהוקצו למבחן מאמץ גליקוליזי (ראו איור 3).

9. תאים דבקים לעומת תאים לא דבקים

הערה: תאים דביקים ותאים לא דביקים שונים בהתנהגות הצמיחה שלהם, בהיצמדות פני השטח ובדרישות הטיפול. תאים דביקים (למשל, תאי סרטן, BMDMs) נצמדים למשטח התרבית, ולכן ציפוי ושטיפה אינם דורשים אמצעי זהירות מיוחדים. תאים שאינם דבקים (למשל, תאי T, לימפוציטים אחרים) נשארים במצב תלייה ודורשים שיטות שונות לצנטריפוגה, השעיה מחדש וציפוי. הבנת ההבדלים הללו חיונית לזריעה מדויקת של תאים, טיפול תרופתי ועקביות בבדיקה.

  1. ודא שכל התאים ששימשו לניסוי מתרבתים במדיום ובכלי תרבית תאים מועדף ממש לפני ביצוע הבדיקה, ואז מועברים למיקרופלטה כדי להריץ את הבדיקה.
    הערה: בעוד שמדיום XF RPMI מומלץ עבור סוגי התאים המתוארים בפרוטוקול זה, עבור סוגי תאים אחרים יש להתייעץ עם היצרן כדי לוודא שהשימוש במדיום המתאים.
  2. לתאים דבקים (תאי סרטן, תאי BMDM), זרעו את התאים למיקרופלטה XFe96/XF Pro Cell Culture 4–5 שעות לפני הבדיקה בצפיפות תא אופטימלית (ראו שלב 1) בנפח המדיה 200 מיקרוליטר והניחו אותםבאינקובטור CO 2 בטמפרטורה של 37 °C.
    הערה: תאי BMDM ניתנים לציפוי עד 24 שעות לפני הבדיקה, שכן הם אינם מתרבים ושומרים על אותה צפיפות תאים. לתאים דבקים שגדלים במהירות, כמו קווי תאי סרטן, מומלץ להצלח ביום הבדיקה אם אין צורך בטיפול נוסף ולנתח אותם מיד עם חיבור התאים כדי למנוע צמיחה נוספת. אם עיצוב זה אינו אפשרי, נרמול לכמות/באר חלבון או למספר גרעינים/באר הוא שלב הכרחי.
  3. ודא שבארות הפינה לכל ארבע פינות של המיקרופלטה נקיות מתאים אך מלאות במדיה, שכן זה נמדד כמו בארות הבקרה הריקות.
  4. לאחר 3–5 שעות של דגירות, יש להתבונן במיקרופלטה כדי לוודא שהתאים מחוברים לפלטת בגובה אחיד בתחתית כל באר.
  5. אם התאים עדיין לא מחוברים, ניתן להניח את הפלטה באינקובטורCO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לזמן נוסף עד שהתאים מחוברים היטב.
  6. לאחר מכן, הכינו את המיקרופלטה עם תאים דביקים לשטיפה כפי שצוין בשלב 4 כדי להמשיך בבדיקה.
  7. לתאים שאינם דביקים (תאי T ולימפוציטים אחרים), ציפו את המיקרופלוח בפולי-די-ליזין לפני הוספת תאים לפלטה.
    הערה: בעוד שציפוי פולי-די-ליזין מומלץ בפרוטוקול זה, בהתאם לסוג התא, ציפוי לוחות אחר (כגון קולגן, פיברונקטין, ג'לטין) עשוי להתאים יותר. אם משתמשים בציפוי חלופי, אנא עקבו אחר הוראות היצרן לשימוש.
  8. לציפוי המיקרופלטה, יש להכין 2.5 מ"ל של תמיסת פולי-די-ליזין של 20 מיקרוגרם/מ"ל (דילול של פי 50 של 1 מ"ג/1 מ"ל תמיסת מים) ב-0.1 מ' נתרן ביקרבונט, pH 8.0 (ביקרבונט מספק את ה-pH האופטימלי לספיחת דבק). שלב זה ניתן לבצע לפני ביצוע הבדיקה או ביום הבדיקה.
  9. מרחו 25 מיקרוליטר מהתמיסה על כל באר בלוח ודגרו על הספסל או על נדנדה על הלוח בטמפרטורת החדר למשך 20–30 דקות.
  10. שאיפת או פיפטה מכל תמיסה שנותרה ושוטפת כל באר פעמיים באמצעות 200 מיקרוליטר מים ללא RNAase/DNASE.
  11. המתינו עד שהבארות יתייבשו (1–2 שעות) לפני שזורעים את התאים למיקרופלטה.
  12. לאחר מכן, הכינו את המיקרופלטה עם תאים לא דביקים לשלב השטיפה על ידי צנטריפוגה של הפלטה בעוצמה של 200 x גרם למשך 3 דקות ללא בלימה כדי להבטיח שהתאים תלויים בתחתית כל באר.
  13. המשיכו לשלב 4 והמשיכו את שאר הבדיקה כפי שהוזכר בשלבים 5–7.

תוצאות

פרוטוקול משולב זה פותח כדי לאפשר לשתי הבדיקות להתבצע על אותו לוח. לדוגמה, שיטה זו שימשה להבהרת איתות mGluR1−TCR על המיומנות המטבולית של תאי CD8+ T במהלך הפעלה10. המטרה הייתה להעריך את השפעת עיכוב mGluR1 על המעבר לגליקוליזה ועל השינויים בנשימת המיטוכונדריה, תהליכים חיוניים לתפקוד מיטבי של תאי T, תוך מזעור מספר תאי T המשמשים בכל ניסוי. אותה טכניקת לוח יחיד יושמה ביעילות גם על סוגי תאים אחרים, כגון מקרופאגים דבקים שמקורם במח עצם (BMDMs; איור 4 ואיור 5), ולתאים שאינם דבקים, כגון תאי דם היקפיים מונוגרעיניים (PMBCs; איור 3). הוכח כי חסימת איתות mGluR1 על תאי CD8+ T מופעלים משפיעה על ייצור אנרגיה מיטוכונדריאלית ולא מיטוכונדריאלית. לעומת זאת, תאים נאיביים לא הראו שינויים משמעותיים בפרופיל האנרגיה המטבולית שלהם (איור 6A,B). מבחן הלחץ של מיטו לתאי CD8+ T מופעלים הראה נשימה בסיסית ומקסימלית גבוהה, וכן קיבולת רזרבה נשימתית (איור 6C). תאי T שטופלו ב-CPCCOEt, אנטגוניסט לא תחרותי שחוסם איתות במורד הזרם בעת קישור גלוטמט ל-mGluR1, היו בעלי קצב צריכת חמצן (OCR) נמוך יותר כמו התאים התמימים וגרמו לירידה בייצור ATP (איור 6C). בדיקת הגליקוליזה גם הראתה שרק תאי CD8+ T מופעלים שלא טופלו ייצרו ATP באמצעות גליקוליזה, וטיפול ב-CPCCOE הראה פעילות מטבולית הדומה למצב הנאיבי (איור 6D). תוצאות אלו מאשרות כי איתות mGluR1 חיוני לתפקוד תקין של תאי CD8⁺ T בעת ההפעלה.

figure-results-1
איור 1: איור זה ממחיש את הסקירה של סידור הלוחות של המיקרופלטה הכוללת את מבחן מאמץ מיטו וגליקוליזה באותו לוח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: טעינת מחסנית התרופה. (א) מפה מפורטת של החיישנים והיציאות מאחור ומקדמת המחסנית, תוך תיוג איזו תרופה יש להיטען לאיזו פורט. (ב) הכיוון המומלץ של המדריכים מעל המחסנית לטעינת היציאות המתאימים והמיקום המומלץ לשימוש בפיפטור רב-ערוצי מעל המדריכים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: שימוש בתוכנית WAVE להרצה וניתוח הבדיקה. (א) תהליך הקמת התוכנית כולל בחירת סוג הבדיקה, הקצאת קבוצות, יצירת מפת הלוחות ותכנות פורטי התרופות. (ב) סדר הטעינה של התרופות לפורטים המתאימים תלוי בשאלה האם הדגימה היא דחוס מיטו או גליקוליזה. (ג) תקריב של כתם ה-SRB במהלך השלב האחרון של הנרמליזציה. (ד) לאחר הנרמליזציה, ניתן לייצא את נתוני הלוחית בנפרד כבדיקת גליקוליזה ומבחן מאמץ מיטו לאותה לוח. (ה) ניתן לבחור את הנתונים עבור לחץ מיטו על ידי עריכת הבחירה הנוכחית עבור דגימות לחץ מיטו בלבד. (ו) ניתן לבחור את הנתונים עבור גליקוליזה על ידי עריכת הבחירה הנוכחית רק לדגימות גליקוליזה. הנתונים לדוגמה בתרשים זה הם מניתוח של תאי דם מונו-גרעיניים היקפיים של האדם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: ביצועים סימולטניים של Mito Stress פועלים על אותה פלטה. מקרופאגים שמקורם במח עצם שמקורם בעכברי WT ו-Tusc2 KO בני חודשיים עברו את שני סוגי הניתוחים. התאים נותרו ללא טיפול (שמה מדומה) או גורים ב-LPS (100 ng/mL) במשך 5 שעות לפני הציפוי (30,000 תאים לבאר). בדיקות לחץ מיטו וגליקוליזה בוצעו במקביל כדי לאפשר השוואה מדויקת, כפי שמוצג באיור 1. (א) פרופילי לחץ מיטו לסוגי תאים שונים (WT ו-KO) ותנאים שונים (נאיביים ומופעלים), שנוצרו באמצעות תוכנת Wave. הנרמול בוצע באמצעות צביעת SRB כפי שמתואר בשלב 7. (B) גרפים שורתיים השוואתיים של הפרמטרים שנותחו בכל בדיקה. ∗ ≤ 0.05, ∗∗ ≤ 0.005, מבחן T לתלמיד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: ביצוע סימולטני של בדיקות מאמץ גליקוליז מתבצעות על אותה פלטה. מקרופאגים שמקורם במח עצם שמקורם בעכברי WT ו-Tusc2 KO בני חודשיים עברו את שני סוגי הניתוחים. התאים נותרו ללא טיפול (שמה מדומה) או גורים ב-LPS (100 ng/mL) במשך 5 שעות לפני הציפוי (30,000 תאים לבאר). בדיקות לחץ מיטו וגליקוליזה בוצעו במקביל כדי לאפשר השוואה מדויקת, כפי שמוצג באיור 1. (א) פרופילי לחץ גליקוליזה לסוגי תאים שונים (WT ו-KO) ותנאים (נאיביים ומופעלים), שנוצרו באמצעות תוכנת Wave. הנרמול בוצע באמצעות צביעת SRB כפי שמתואר בשלב 7. (B) גרפים שורתיים השוואתיים של הפרמטרים שנותחו בכל בדיקה. ∗ ≤ 0.05, ∗∗ ≤ 0.005, מבחן T לתלמיד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: בדיקות מאמץ של מיטו וגליקוליזה על לוח יחיד באמצעות תאי CD8⁺ T שטוהקו מטפלים של עכברים. (א) פרופילים מייצגים של מבחן לחץ מיטוכונדריאלי השוואה בין שינויים תלויים בתרופות בקצב צריכת החמצן (OCR) של תאי T מסוג CD8+ שבוצעו עם קבוצות תאי T מעכבי +mGluR1 תמימות, מופעלים ומופעלים. (B) פרופילים מייצגים של מבחן גליקוליזה המשווים שינויים תלויים בתרופות בקצב החמצה החוץ-תאית (ECAR) של תאי T מסוג CD8+ שבוצעו על קבוצות מעכבי +mGluR1 תמימות, מופעלים ומופעלים. (C) גרפים עמודים המציגים שינויים כמותיים בפרמטרים שונים של נשימת מיטוכונדריה של תאי T מסוג CD8+ בקבוצות מעכבי + mGluR1 תמימות, מופעלים ומופעלים. הפסים מייצגים את ממוצע ± SEM (n = 4). (D) גרפים של עמודות המציגים שינויים כמותיים בפרמטרים שונים של גליקוליזה בתאי T נאיביים, מופעלים ומופעלים + מעכב mGluR1 CD8+. הפסים מייצגים את ממוצע ± SEM (n = 4). ∗ ≤ 0.05, ∗∗ ≤ 0.005, מבחן T לתלמידים. איור זה מותאם מ-Aquino ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הבאר הסופית (μM)נפח תמיסת המלאי (μL)נפח מדיה (uL)10x פורט (μM)הוספת נפח לפורט (μL)
פורט A אוליגומיצין0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
פורט B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
פורט C רוטנונה/אנטימיצין0.53002700524

טבלה 1: הכנת תרכובות לטעינת מחסניות חיישני XFe96 למתח מיטו.

הבאר האחרונהנפח תמיסת המלאי (μL)נפח מדיה (μL)10x פורטהוספת נפח לפורט (μL)
פורט A גלוקוז250 מ"מ100240020
אוליגומיצין פורט B0.5 מיקרומטר15028505 מיקרומטר22
1.5 מיקרומטר450255015 מיקרומטר22
2.5 מיקרומטר630189025 מיקרומטר22
פורט C 2-DG50 מ"מ30000500mM24

טבלה 2: הכנת תרכובות לטעינת מחסניות חיישני XFe96 לגליקוליזה.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השוואות מדויקות ואמינות של שני מסלולים עיקריים לייצור אנרגיה: פוספורילציה חמצונית (ייצור ATP מיטוכונדריאלי) וגליקוליזה אנאירובית (ייצור ATP מחוץ למיטוכונדריה, ללא צורך בחמצן), ושתי בדיקות מאמץ שונות בתוך רצף אחד. בנוסף, עיצוב הניסוי מתחשב בסוג התאים המנותחים, ומאפשר הבנה רחבה יותר של ניתוח חילוף החומרים של התאים, תוך מזעור כמות הדגימה והתגובות בשימוש.

ההבדלים בין מבחני הלחץ של מיטו ובדיקות לחץ גליקוליזה שבוצעו על פרוטוקולי כלי ניתוח מטבולי בזמן אמת שתוכננו ונמכרו על ידי Agilent, Inc. הם משמעותיים. שני הבדיקות הללו דורשות מדיות בדיקה נפרדות, תרופות ספציפיות ותוכניות מכשירים שונות. מבחן הלחץ של מיטו משתמש במדיית בדיקה המכילה גלוקוז, L-גלוטמין ופירובט, בעוד שמבחן הלחץ של גליקוליזה משתמש במדיה נטולת גלוקוז המושלמת רק ב-L-גלוטמין. הבדיקות נבחנות עם תרכובות שונות: אוליגומיצין → FCCP → אנטימיצין A + רוטנון למבחן הלחץ של מיטו, ואוליגומיצין → גלוקוז →-DG למבחן הלחץ של גליקוליזה. כתוצאה מכך, בדיקות אלו מתבצעות בדרך כלל על לוחות נפרדים בזמנים שונים, שכן מנתח מטבולי בזמן אמת מכיל רק לוח אחד בכל פעם.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פותח פרוטוקול משולב שמאפשר לבצע את שתי הבדיקות על אותו לוח באמצעות הגדרת מבחן המתח של מיטו במאמר10 קודם. להלן המלצות לניתוח סוגי תאים שונים, כולל תאי חיסון, תאי סרטן, תאים דבקים ותאי תלוי. הנחיות אלו יכולות להיות מיושמות בנפרד או בשילוב, ומציעות גמישות בהתאם למטרות הניסוי והמשאבים הזמינים.

נרמול התאים באמצעות SRB Assay או DAPI מאפשר גם גמישות רבה יותר, במקרה של שימוש במספר סוגי תאים עם קצב גדילה וגודל שונים 9,11. יתרה מזאת, מאחר שטכניקה זו דורשת רק לוח אחד לשני מבחנים, ניתן לשלב אותה עם מגוון סוגי דגימות למדידת תהליכים מטבוליים.

גורמים המשפיעים על הצלחת השיטה: (1) מספר תאים אופטימלי לכל באר; (2) חיבור תאים יעיל; ו-(3) טעינה זהירה מהמחסנית, שכן יש להטעין שתי קבוצות שונות של תרופות לחלקים נפרדים של המחסנית.

היתרונות המדעיים והניסיוניים של השיטה כוללים השוואה ישירה באותו הקשר ביולוגי. שימוש באותם תאים בתנאי תרבית זהים מבטל שונות בין לוחות או רצפים ומאפשר השוואה מדויקת יותר של תפקוד מיטוכונדריה וגליקוליז באותה דגימה. הוא כולל גם מבט משולב על חילוף החומרים התאי. מדידת פוספורילציה חמצונית (OXPHOS) וגליקוליזה במקביל מספקת תמונת מצב מקיפה של מטבוליזם האנרגיה הכולל של התא ושל הגמישות שלו במעבר בין מסלולים. בדיקה מקבילה זו גם מפחיתה שונות ביולוגית. הבדלים בצפיפות ציפוי התאים, מספר המעבר או תנאי הסביבה מצטמצמים מכיוון ששתי הבדיקות מתבצעות על אותה אוכלוסיית תאים, מה שמוביל לשיפור השחזוריות. ביצוע שתי הבדיקות בו-זמנית מפחית את השונות בין הריצה להפעלה הנגרמת מכיול מחסנית החיישן, שינויים בטמפרטורה או הכנת תגובה.

היתרונות הטכניים של טכניקה זו כוללים יעילות מוגברת על ידי שילוב מבחנים, מה שחוסך זמן, מגיבים ומוצרי צריכה לצלחות, מה שהופך אותה לחשובה למחקרים רחבי היקף או בעלי תפוקה גבוהה. זה מאפשר דרישות דגימה נמוכות יותר. נדרש רק לוח אחד של תאים, מה שמועיל בעבודה עם תאים ראשוניים מוגבלים או נדירים (למשל, לימפוציטים, תאים שמקורם במוח). נרמליזציה טובה יותר בין הבדיקות מתרחשת מכיוון ששתי הבדיקות משתמשות באותו לוח, נרמול (למשל, לתכולת חלבון או למספר תא), והן עקביות ואמינות יותר. עם עקביות זו, מתאם הנתונים משתפר. שילוב ישיר של פרמטרים מיטוכונדריאליים וגליקוליטיים מאותו דגימה מאפשר פרופיל מטבולי וניתוחים סטטיסטיים.

המגבלה היחידה הידועה לטכניקה זו היא ששילוב שני פרוטוקולים על לוח אחד מפחית את מספר השכפולים הזמינים של בארות. מומלץ להגביל את מספר התנאים בכל לוח כדי להבטיח לפחות 8 שכפולים של בארות בכל מצב.

תודות

מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות מיעוטים ופערי בריאות (NIMHD), מענק מספר 5U54MD007586-37, פרויקט פיילוט ל-A. Ivanova; UG3HG013248 מענק של מרכז הגיוון למחקר גנום של NHGRI, פרויקט מחקר 2, PI-Ivanova, וגם תמיכה מסוימת ניתנה על ידי Genprex Inc.  בנוסף, מחקר זה נערך במתקני הליבה של מכללת הרפואה מהארי, המקבלים תמיכה ממענקי NIH MD007586, CA163069 ו-S10RR025497.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, בשקית עם פקק בורג, סטרילי, 500 שפופרות ליחידהג'נסי סיינטיפיק21-408B
טיפים לפיפט ביולוגיקס-200 ו-mu; l מורחב (חבילה, סטרילי)ביולוגיקס ארה"בSKU 21-0200
BioTek Synergy H1BIOSPX
מיקרוסקופ פלואורסצנציה BZ-X700קיינס
קורנינג  מאגרי חומרים חד-פעמיים סטריליים של Costarפישר4873
תמיסת D-(+)-גלוקוז 45% ב-H20סיגמאG9769
DAPI, הידרוכלוריד תרמופישר סיינטיפיקD1306
צנטריפוגה אפנדורף 5810 Rאפנדורף
GenClone סרום בקר עוברי מושבת, חוםג'נסי סיינטיפיק25-514H
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)גיבקו25030-081
Olympus Plastics 22-284, Olympus Microtubes 1.7 מ"ל, פוליפרופילן שקוף וסטרילי, עמיד לרתיחה, סטר, 50/שקית, 250 שפופרות ליחידהג'נסי סיינטיפיק22-284
Olympus Plastics 28-108, צינורות צנטריפוגה חרוטיים בנפח 50 מ"ל, נפח פוליפרופילן, סטרילי, 20 שקיות של 25 שפופרות, 500 ליחידהג'נסי סיינטיפיק28-108
פרפורמלדהיד 16% תמיסה בדרגת EMמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710
פולי-די-ליזין הידרוברומיד ליופילסיגמאP6407
אמבט מים Precision 180Precision Scientific51221060
חממת Precision Scientific GCA דגם 26תלקו51221091
QBI 120-095-671 תערובת פניצילין/סטרפטומיצין, 100x תערובת עט/סטרפטוקוקוליטוקה, 10 x 10 מ"ל ליחידהג'נסי סיינטיפיק25-827
QBI PBS, 1x, ללא קאלטימון, מיליגניום, פנול אדום, 0.1 מיליון מסונן סטריליג'נסי סיינטיפיק25-507B
RPMI 1640, עם L-גלוטמיןג'נסי סיינטיפיק25-506
Seahorse XF RPMI בינוני, pH 7.4, 500 מ"לאג'ילנט103576-100
אנלייזר Seahorse XFe96אג'ילנט
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakאג'ילנט103792-100כולל 18 מחסניות חיישנים XFe96/XF Pro, 18 לוחות מיקרופלט לתרבות תאים XFe96/XF, בקבוק אחד של Seahorse XF Calibrant Solution בנפח 500 מ"ל ו-3 זוגות מדריכי טעינה XF
נתרן ביקרבונטסיגמאS6014
נתרן פירובט (100mM) 100Xגיבקו11360-070
בדיקת SRB (ערכת בדיקה סולפורהודמין B)אבקאםAB235935
פיפטור רב-ערוצי ארגונומי עם חתימת VWRאוונטור89079-956
ערכת בדיקת מאמץ של XF Cell Mitoאג'ילנט103015-100
ערכת בדיקת קצב גליקוליטי XFאג'ילנט103344-100

מקורות

  1. Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
  2. Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
  3. Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
  4. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
  5. Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
  6. Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
  7. Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
  8. Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
  9. Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
  10. Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
  11. Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.