הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ראשוני, תרבית ואימות פנוטיפי של כונדרוציטים מפרקיים בברך חולדה

861 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69509

⸱

7 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של כונדרוציטים מפרקיים ראשוניים בברך חולדה באמצעות עיכול אנזימטי רציף. השיטה מניבה כונדרוציטים בעלי מאפיינים פנוטיפיים מאומתים, ומספקת לחוקרים גישה אמינה ליישומי מחקר סחוס.

תקציר

נזק לסחוס כתוצאה מטראומה, הזדקנות או מצבים דלקתיים נותר אתגר קליני משמעותי בשל יכולת ההתחדשות המוגבלת של הרקמה. כונדרוציטים, בהיותם המרכיב התאי היחיד של הסחוס, אחראים לשמירה על מבנה ותפקוד המטריצה החוץ-תאית, מה שהופך אותם לחיוניים להבנת הפיזיולוגיה של הסחוס, הפתולוגיה והתחדשות. המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול מקיף וסטנדרטי לבידוד, תרבית ואימות פנוטיפי של כונדרוציטים מפרקיים ראשוניים של חולדה ממפרק הברך. ההליך משתמש בחולדות צעירות ויונקות כדי להבטיח כדאיות תאים מקסימלית ומשתמש בעיכול אנזימטי רציף עם טריפסין וקולגנאז מסוג II למיצוי תאים יעיל. הפנוטיפ של הכונדרוציטים מאומת באמצעות אימונופלואורסצנציה של קולגן מסוג II, ניתוח זרימה ציטומטרי ומבחני גירוי אינטרלוקין (IL)-1β כדי לאשר זהות תאית ותגובתיות דלקתית. זרימת עבודה אופטימלית וניתנת לשחזור זו מאפשרת יצירת תרביות כונדרוציטים בטוהר גבוה המתאימות לסינון תרופות, חקירות מכניסטיות ויישומי הנדסת רקמות, ומקדמת את מחקר הביולוגיה של הסחוס.

מבוא

סחוס הוא סוג מיוחד של רקמת חיבור המבצעת מספר פונקציות חיוניות, כולל מתן תמיכה, ריפוד ובלימת זעזועים1. הוא ממלא תפקיד חיוני בשמירה על יציבות מבנית והבטחת ניידות בתוך מערכת השלד 2,3. פגיעה מכנית, שינויים ניווניים, דלקת או הפרעות מטבוליות עלולות לגרום נזק לסחוס 4,5,6. בשל המחסור המובנה בכלי דם ועצבים, בשילוב עם יכולת ההתפשטות המוגבלת של כונדרוציטים, תיקון הסחוס מציב אתגרים משמעותיים. מחלות כמו דלקת מפרקים ניוונית (המונעת על ידי שינויים ניווניים ופגיעה מכנית) ודלקת מפרקים שגרונית (הנגרמת על ידי תגובות דלקתיות אוטואימוניות) עלולות לגרום לנזק בלתי הפיך לסחוס, ולהפחית מאוד את איכות החיים של החולים 7,8,9. כסוג התא הבלעדי ברקמת הסחוס, כונדרוציטים אחראים על פונקציות מפתח כגון הפרשה ותחזוקה של המטריצה החוץ-תאית, תמיכה בהתפתחות השלד, השתתפות בריפוד ותיקון מפרקים, וויסות מרכזי של צמיחת הסחוס וחילוף החומרים 10,11,12.

כונדרוציטים מוגבלים בתוך לקונות מטריצה אווסקולריות, וכתוצאה מכך היכולת מוגבלת מאוד להתפשטותם ולתיקון רקמות13,14. המצב התפקודי של כונדרוציטים קובע ישירות את בריאות רקמת הסחוס15. תפקוד לקוי של כונדרוציטים, הנגרם על ידי הזדקנות, דלקת, טראומה או גורמים גנטיים, גורם לירידה בסינתזת המטריצה ולהשפלה מוגברת16,17. תהליך פתולוגי זה מניע ניוון סחוס (כגון בדלקת מפרקים ניוונית), מה שמוביל לפגיעה בתפקודי התמיכה, הריפוד והסיכה החיוניים שלו. יכולת ההתחדשות המוגבלת של הסחוס היא הסיבה המרכזית לאתגר המשמעותי בתיקונו ומהווה תחום מחקר מרכזי באורתופדיה מודרנית וברפואה רגנרטיבית. המחקר הנוכחי על סחוס הפך למוקד מרכזי בתחום, כאשר התערבויות מבוססות תרופות, הנדסת רקמות וריפוי גנטי דורשים כולם בידוד של כונדרוציטים למחקרי מבחנה 18,19,20,21,22,23,24,25. כתוצאה מכך, בידוד וזיהוי כונדרוציטים מהווה צעד קריטי בגישות ניסיוניות רבות. בעוד שקווי תאים דמויי כונדרוציטים אימורטליים כגון SW1353 משמשים כתחליפים נוחים במחקרים מסוימים, הם חסרים ביטוי של סמנים פנוטיפיים קריטיים, בעיקר קולגן מסוג II, החיוני לתפקוד כונדרוציטים אותנטיים ולהיווצרות מטריצה26. לכן, כונדרוציטים ראשוניים נותרו תקן הזהב למחקר הדורש רלוונטיות פיזיולוגית. בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר הדורשים שילובי אנזימים מרובים או מניפולציה מכנית נרחבת, גישת העיכול האנזימטי הפשוטה מפחיתה את המורכבות וזמן העיבוד בהשוואה לשיטות הדורשות שילובי אנזימים מרובים או מניפולציה מכנית נרחבת. יתר על כן, שילוב שלבי אימות מקיפים מבטיח זיהוי עקבי של כונדרוציטים פונקציונליים ומשפר את יכולת השחזור בניסויים ובמעבדות.

כונדרוציטים מאופיינים בהפרשת קולגן מסוג II, בעוד שתחת גירוי על ידי גורמים דלקתיים, הם מסנתזים ומשחררים באופן נרחב מטריצת מטאלופרוטאינאזות (MMPs)27. לכן, לאחר בידוד כונדרוציטים, התאים זוהו באמצעות אימונופלואורסצנציה של קולגן מסוג II, וטוהר הכונדרוציטים הוערך באמצעות ציטומטריית זרימה. ומגורה עם אינטרלוקין (IL)-1β כדי לאשר את הסינתזה האופיינית שלהם והפרשה של מטריצות מטאלופרוטאינאזות. מחקר זה מתאר את תהליך מיצוי הכונדרוציטים ואפיונם מעכברים יילודים, ומניח בסיס לניסויים הבאים הקשורים לכונדרוציטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בנבדקים בבעלי חיים במחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הניסיונית לטיפול ורווחה בבעלי חיים של בית החולים לידידות סין-יפן (No. zryhyy21-21-05-16). הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. חיות ניסוי ועבודת הכנה

הערה: ניתן להשתמש בסחוס ממפרקי חולדות, ארנבים ובני אדם לאחר ניתוח מפרקי ברך מלא לבידוד כונדרוציטים. עם זאת, בשל הכדאיות הגבוהה יותר שלהן, חולדות יונקות שימשו למיצוי כונדרוציטים במחקר זה.

  1. הובלת חולדות יונקות ממתקן הניסוי לייצור בעלי חיים למעבדה באמצעות מיכלי העברה מיוחדים.
  2. המתת חסד של חולדות יונקות על ידי חנק CO2 (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד) ושטוף את משטחי גופן בתמיסה סטרילית.
  3. טבלו את החולדות היונקות בהמתת חסד באתנול 75% למשך 10 דקות כדי לחטא את מזהמי פני השטח.
  4. העבירו את החולדות היונקות המחוטאות לארון בטיחות ביולוגית והניחו אותן בצלחות פטרי סטריליות.
    הערה: ניקוי משטח יסודי וטבילת אתנול של חולדות יונקות הם צעדים קריטיים למניעת זיהום חיידקי או פטרייתי, שעלול להשפיע לרעה על הניסויים הבאים.

2. בידוד רקמת סחוס מפרקית

הערה: סחוס היילוד מופיע כשכבה שקופה, לבנה-כחלחלה, המכסה את האפיפיזה הגרמית. יש להקפיד על טכניקות אספטיות קפדניות במהלך שלב זה כדי למנוע זיהום שעלול לפגוע בניסויים הבאים.

  1. בודד את מפרק הברך של החולדה היונקת באמצעות אזמל ומספריים עיניים, ולאחר מכן הסר את רקמת העור שמעליו.
  2. העבירו את מפרק הברך המנותח לצלחת פטרי סטרילית חדשה והחליפו את האזמל והמספריים לעיניים.
  3. קצור סחוס מפרקי ממפרק הברך באמצעות אזמל, ולאחר מכן חתוך היטב את רקמת החיבור שמסביב בעזרת מספריים עיניים.

3. עיכול רקמת הסחוס

הערה: השתמשו בטריפסין לעיכול רקמות חיבור המקיפות את הסחוס, ולאחר מכן ב-0.2% קולגנאז II לעיכול מטריצת הסחוס.

  1. מוסיפים את הסחוס שנקטף ל-3 נפחים של 0.25% טריפסין ודוגרים בשייקר תרמוסטטי של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה למשך 30 דקות.
  2. יש להפסיק את העיכול על ידי הוספת PBS המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS). הסר רקמות דבקות מהסחוס באמצעות מספריים עיניים. צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות) והשליכו את הסופרנטנט.
  3. השעו מחדש את רקמת הסחוס ב-PBS, צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), והשליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב כביסה זה 3 פעמים.
  4. הוסיפו 0.2% קולגנאז II לרקמת הסחוס המעובדת ועכלו בשייקר תרמוסטטי של 37 מעלות צלזיוס עם ערבול למשך 4 שעות.

4. בידוד ותרבות כונדרוציטים

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית. יש ללבוש כפפות סטריליות במהלך דיסוציאציה מכנית של רקמת הסחוס באמצעות בוכנת מזרק על מסננת התאים כדי למנוע זיהום ניסיוני. בתנאי תרבית סטנדרטיים, כונדרוציטים ראשוניים דורשים בדרך כלל כ-2-3 ימים כדי להגיע למפגש של 80%-90% במעבר הראשון.

  1. מניחים מסננת תאים של 200 מיקרומטר על צלחת תרבית סטרילית ומסננים את תרחיף הסחוס המעוכל דרך הרשת.
  2. טוחנים את שברי הסחוס שנותרו על המסננת בעזרת בוכנת מזרק סטרילית, ולאחר מכן שוטפים את המסננת במדיום DMEM שלם.
  3. אוספים את כל התסננים, הצנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), וזורקים את הסופרנטנט.
  4. השעו מחדש את הגלולה ב-PBS, צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), והשליכו את הסופרנטנט.
  5. השעו מחדש תאים במדיום DMEM שלם והעבירו לבקבוק תרבית T25.
  6. דגרו את הבקבוק בחממה לחה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  7. תאי מעבר במפגש זה באמצעות טריפסין-EDTA ותת-תרבות ביחס של 1:2.

5. צביעת קולגן אימונופלואורסצנטי מסוג II לזיהוי כונדרוציטים

הערה: הכונדרוציטים המודבקים מאופיינים במורפולוגיה בצורת ציר ומצולע. כל ניתוחי הסמנים הביולוגיים שהוצגו במחקר זה בוצעו באמצעות תאים במעבר 2. כונדרוציטים במעבר 3 מתחילים להפגין דה-דיפרנציאציה בולטת יותר, המאופיינת במעבר לעבר מורפולוגיה דמוית פיברובלסטים בצורת ציר והאטה בקצב ההתפשטות. שינוי פנוטיפי זה נעשה ברור יותר לאחר פסקה 4. במעבר 6, הרוב המכריע של התאים מאמצים צורה מוארכת דמוית פיברובלסטים. דילול הנוגדנים נקבעו על סמך המלצת היצרן ואושרו על ידי הניסויים הראשוניים שלנו כדי להבטיח ספציפיות ועוצמת אות אופטימליות.

  1. זרעי כונדרוציטים בצלחת של 24 בארות ותרבית למשך 24 שעות כדי לאפשר הידבקות תאים.
  2. השליכו את מדיום התרבות ושטפו את התאים 3 פעמים עם PBS (הוסיפו PBS לכל באר, דגרו למשך 5 דקות ואז שאפו).
  3. תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות, ואז שטוף 3 פעמים עם PBS.
  4. לחדור לתאים עם 0.3% טריטון X-100 (מוכן ב- PBS) למשך 10 דקות.
  5. שטפו את התאים 3 פעמים עם PBS, ואז חסמו עם תמיסת חסימה ללא בעלי חיים (150 מיקרוליטר / באר, מדולל 5× ב- PBS) בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  6. יש להסיר את התמיסה החוסמת ולדגור עם נוגדן ראשוני (anti-Col II, דילול 1:200) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  7. אחזר את הנוגדן הראשוני ושטוף את התאים 3 פעמים עם PBS.
  8. הוסף נוגדן IgG מצומד נגד ארנב Alexa Fluor 488 (דילול של 1:50) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות בחושך.
  9. הסר את הנוגדן המשני ושטוף את התאים 3 פעמים עם PBS.
  10. הר עם מדיום אנטי-דהייה המכיל DAPI וייבש בחושך למשך 10 דקות.
  11. התבונן וצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.

6. אנליזה ציטומטרית זרימה של טוהר כונדרוציטים

הערה: כונדרוציטים מאופיינים ביכולתם לסנתז ולהפריש קולגן מסוג II, המשמש כסמן סופי לזיהוי. קו תאי הכונדרוסרקומה SW1353, למרות שהוא מציג כמה מאפיינים כונדרוציטים, חסר יכולת הפרשת קולגן מסוג II ולכן משמש כבקרה שלילית בניסוי זה.

  1. לעכל גם כונדרוציטים וגם תאי SW1353 באמצעות טריפסין נטול EDTA.
  2. לנטרל את העיכול עם מדיום DMEM שלם ולהשעות תאים ב-PBS.
  3. דגרו על תאים עם תמיסת קיבוע/חדירות למשך 15 דקות, ולאחר מכן הוסיפו מאגר כביסה של 1 מ"ל.
  4. צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות), השליכו את הסופרנטנט ודגרו עם נוגדן קולגן 100 מיקרוליטר אנטי סוג II (דילול 1:100) למשך 15 דקות מוגן מאור, ולאחר מכן הוספת מאגר כביסה של 1 מ"ל.
  5. צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות), השליכו את הסופרנטנט ודגרו עם נוגדן IgG מצומד נגד ארנב Alexa Fluor 488 למשך 30 דקות מוגן מפני אור, ולאחר מכן הוסיפו מאגר כביסה של 1 מ"ל.
  6. צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות), השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש כל דגימה במאגר כביסה של 200 מיקרוליטר ונתחו על ידי ציטומטריית זרימה.

7. גירוי IL-1β של כונדרוציטים

הערה: ייצור מטריצות מטאלופרוטאינאזות (MMPs) בתגובה לגירוי IL-1β הוא מאפיין סימן היכר של כונדרוציטים. לכן, מחקר זה משתמש בגירוי IL-1β כדי לאמת מאפיין פנוטיפי זה בכונדרוציטים מבודדים.

  1. לעכל כונדרוציטים מצלוחיות תרבית ולהשעות מחדש במדיום DMEM שלם.
  2. ספרו את התאים והתאימו את הריכוז ל-5 ×-105 תאים/מ"ל באמצעות DMEM מלא.
  3. תאי זרע לצלחת של 6 בארות (24 בארות בסך הכל), כאשר 12 בארות מוגדרות כקבוצת הביקורת הריקה ו-12 בארות כקבוצת הגירוי IL-1β.
  4. דגרו את הצלחת בחממת תרבית תאים למשך 12 שעות.
  5. הוסף 10 ננוגרם/מ"ל IL-1β לקבוצת הגירוי לאחר הידבקות מלאה של התאים.
  6. אסוף סופרנטנטים של תרבית תאים לאחר 24 שעות לניתוח בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA).
  7. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS.
  8. Lyse 6 בארות בקרה ו-6 בארות מגורה IL-1β עם מאגר RIPA לניתוח כתמים מערביים לאחר מכן.
  9. חלץ RNA מ-6 בארות בקרה ו-6 בארות מגרות IL-1β באמצעות TRIzol לניתוח qPCR.

8. ניתוח PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)

הערה: כל הניסויים הקשורים ל-RNA בוצעו באמצעות חומרים מתכלים שטופלו ב-DEPC. בקצרה, צינורות וקצוות הושרו ב-0.1% DEPC למשך 12 שעות, עברו חיטוי (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות) כדי לנטרל הן RNases והן DEPC שיורי, ויובשו בתנור לפני השימוש.

  1. הוסף 1 מ"ל טריזול לגלולת התא והומוגניזציה באמצעות הומוגנייזר. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  2. מוסיפים 0.2 מ"ל כלורופורם ומערבולת במרץ למשך 30 שניות. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם למשך 15 דקות. העבירו את השלב המימי חסר הצבע לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש והוסיפו נפח שווה של איזופרופנול.
  4. מערבבים היטב ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושמרו על כדור ה-RNA.
  5. הוסף 1 מ"ל של אתנול 75% מקורר מראש לגלולת ה-RNA. מערבולת ביסודיות וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושמרו על כדור ה-RNA.
  6. יבש באוויר את כדור ה-RNA בארון בטיחות ביולוגית. ממיסים את ה-RNA ב-20 מיקרוליטר של מים נטולי RNase.
  7. למדוד את ריכוז ה-RNA ואיכותו באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop.
  8. תמלל הפוך את ה-RNA הכולל ל-cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוך.
  9. הכן את תערובת התגובה המכילה 1 מיקרוגרם RNA כולל, תמיסת מגנזיום כלוריד 4 מיקרוליטר, תערובת 2 μL dNTP, מעכב RNase 0.5 מיקרוליטר, 0.6 מיקרוליטר AMV טרנסקריפטאז הפוך, 1 מיקרוליטר פריימרים אקראיים ומים ללא RNase כדי להתאים את הנפח הסופי ל-20 מיקרוליטר.
  10. דגרו את התגובה ב-42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מצננים ל-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז מדללים את ה-cDNA במים ללא RNase.
  11. הכן את תערובת תגובת ה-PCR המכילה 2 μL cDNA, 10 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix, פריימרים קדימה ואחורה (טבלה 1) בריכוז סופי של 0.2 מיקרומול/ליטר כל אחד, ומים נטולי RNase לנפח סופי של 20 מיקרוליטר.
  12. הגדר את תנאי ה-PCR כדלקמן: דנטורציה מוקדמת ב-95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. אסוף נתוני פלואורסצנטיות במהלך שלב ההארכה של 72 מעלות צלזיוס.
  13. לאחר התגובה, רשום את ערכי ה-CT עבור כל דגימה ואת ההתייחסות הפנימית. חשב את רמות הביטוי היחסיות של גני המטרה בשיטת 2-ΔΔCT.

9. בדיקת ELISA

הערה: הכן תמיסת עבודה של נוגדנים ביוטיניליים ותמיסת עבודה מצומדת אנזים טריים לפני השימוש.

  1. הוציאו את ערכת ELISA מהמקרר 30 דקות מראש והניחו לה להתאזן לטמפרטורת החדר.
  2. הכן את כל הפתרונות הנדרשים על פי הוראות הערכה.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של דגימות או תמיסות סטנדרטיות (בריכוזים משתנים) לבארות המיועדות (בארות אפס מכילות רק מאגר דילול סטנדרטי/דגימה). אוטמים את הצלחת בניילון דבק ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות (לא כולל בארות בקרה ריקות).
  4. השליכו את הנוזל ושטפו כל באר עם מאגר כביסה של 350 מיקרוליטר. דגירה למשך 30 שניות, השליכו את הנוזל וייבשו על נייר סופג עבה. חזור על הכביסה 4 פעמים.
  5. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של נוגדנים ביוטיניים לכל באר. אטמו את הצלחת ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות (לא כולל בארות בקרה ריקות).
  6. השליכו את הנוזל ושטפו כל באר 4 פעמים כמתואר בשלב 4.
  7. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה מצומדת אנזים לכל באר. אטמו את הצלחת ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (לא כולל בארות בקרה ריקות).
  8. השליכו את הנוזל ושטפו כל באר 4 פעמים כמתואר בשלב 4.
  9. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע לכל באר. יש להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  10. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר, ערבב היטב ומדוד מיד את הצפיפות האופטית (OD) ב-450 ננומטר.
  11. צור עקומה סטנדרטית באמצעות תוכנת CurveExpert וחשב את ריכוזי הדגימה.

10. ניתוח כתמים מערביים

הערה: לפני הניסוי, הכינו מראש מאגר אלקטרופורזה, מאגר העברה, TBST, חלב דל שומן 5% וחתכו מראש את קרום PVDF לגודל המתאים. לאחר מכן, ללכוד את האותות הכימילומינסנציוניים באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציונית. הגדר את המכשיר למצב אוטומטי או ידני לחשיפת שיפוע, שנעה בדרך כלל בין 10 שניות ל-5 דקות, כדי להבטיח שהאותות נלכדים בטווח הדינמי הליניארי וכדי למנוע רוויה של פיקסלים. לאחר לכידת האות, בחר את תמונת החשיפה שבה פסי היעד ברורים והרקע נמוך לניתוח כמותי לאחר מכן.

  1. הכן מאגר ליזה RIPA (המכיל 1% PMSF ו-1% מעכב פוספטאז) והוסף מאגר ליזה RIPA ביחס של 250 מיקרוליטר לבאר של צלחת 6 בארות.
  2. ליז תאים באמצעות משבש קולי (3 מחזורים, 7-10 שניות כל אחד) ולדגור על קרח למשך 30 דקות.
  3. צנטריפוגה של הליזאט בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם למשך 10 דקות, ואז לאסוף את הסופרנטנט לכימות חלבון.
  4. קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA).
  5. התאם את ריכוזי החלבון לאותה רמה באמצעות מאגר ליזה של RIPA.
  6. הוסף 5× מאגר טעינה לדגימות ביחס של 4:1 (מדגם: מאגר).
  7. מרתיחים דגימות למשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם למשך 10 דקות, ואוספים את הסופרנטנט לאלקטרופורזה.
  8. הרכיבו את ג'ל SDS-PAGE בתא האלקטרופורזה ומלאו במאגר אלקטרופורזה עד שהמסרק שקוע.
  9. הסר את המסרק, טען דגימות לבארות והוסף סולם חלבון לנתיבי ייחוס.
  10. הפעל אלקטרופורזה עד שהצבע הכחול ברומופנול מגיע לתחתית הג'ל, ואז פרק את המכשיר ואחזר את הג'ל.
  11. הרכיבו את "כריך" ההעברה ובצעו העברה רטובה במתח קבוע.
  12. חסום את קרום ה-PVDF עם חלב דל שומן 5% ב-TBST למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  13. דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  14. שחזר את הנוגדן הראשוני ושטוף את הממברנה עם TBST (5 × 5 דקות).
  15. דגירה עם נוגדן משני מצומד HRP למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
  16. שחזר את הנוגדן המשני ושטוף את הממברנה עם TBST (5 × 5 דקות).
  17. הכן את תמיסת המצע ECL ואחסן אותה מוגנת מפני אור.
  18. החל את מצע ה-ECL על הממברנה וללכוד אותות כימילומינסצנטיים באמצעות מערכת הדמיה עם חשיפה לשיפוע.
  19. נתח את עוצמות הלהקה באמצעות תוכנת ImageJ וחשב את רמות ביטוי החלבון היחסיות להמשך ניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

צביעה אימונופלואורסצנטית עבור קולגן מסוג II הדגימה שהכונדרוציטים המבודדים היו חיוביים מאוד (איור 1A). ניתוח זרימה ציטומטרי הראה עוד כי יותר מ-98% מהתאים היו חיוביים לקולגן מסוג II (איור 1B), בעוד שתאי הביקורת השליליים SW1353 היו שליליים (איור 1C). לאחר גירוי עם 10 ננוגרם/מ"ל IL-1β במשך 24 שעות, Western Blotting הראה עלייה ניכרת ברמות החלבון MMP3 ו-MMP13 בכונדרוציטים (איור 2A), ניתוח RT-PCR גילה עלייה מש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מציע מספר יתרונות מרכזיים לבידוד ותרבית של כונדרוציטים מפרקיים ראשוניים של חולדות. השימוש בחולדות יונקות הוא קריטי להשגת תפוקת תאים אופטימלית וכדאיות, שכן סחוס מבעלי חיים צעירים מכיל יותר כונדרוציטים מתרבים ופחות מטריצה מינרלית בהשוואה לסחוס בוגר. בחירת גיל זו משפרת משמעותית את יעילות העיכול האנזימטי ואת התאוששות התאים שלאחר מכן.

גישת העיכול האנזימטי הרציף מייצגת היבט מכריע של פרוטוקול זה. הטיפול הראשוני בטריפסין מסיר ביעילות רקמות חיבור ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על ניגודי אינטרסים בעבודה זו.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מימון המחקר הקליני של בית החולים הלאומי ברמה גבוהה ויוזמת אנשי מקצוע רפואיים מובחרים של בית החולים לידידות סין-יפן (NO. ZRJY2025-QM05).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פאראפורמלדהידסולרביולוגיהP1110
5× בופר טעינהסולרביולוגיהP1040
אלקסה פלואר 488-קונוגטייטד אנטי-ארנב IgGביוטכנולוגיה ג'ונגשאן ג'ינגצ'יאוZF-0511
פתרון חסימה ללא בעלי חייםטכנולוגיית איתות סלולרי15019
נוגדן אנטי-קולגן IIאבקאםab34712
ערכת בדיקת חלבון חומצה ביצינכונונית (BCA)סולרביולוגיהPC0020
קולגנאז IIYeasen Biotechnology40508ES60
מדיום התקנה פלואורסצנטי המכיל DAPIביוטכנולוגיה ג'ונגשאן ג'ינגצ'יאוZLI-9556
מדיום הנשר המותאם של דולבקוסולרביולוגיה11995
סרום בקר עוברי (FBS)סולרביולוגיהS9010
פרוקסידאז חזרת (HRP) - עז מצומדת נגד IgGביוטכנולוגיה ג'ונגשאן ג'ינגצ'יאוZB-2301
IL-1 ובטא;פפרוטק400-01B
MMP13 ארנב mAbABclonalA11148
MP3 ארנב mAbABclonalA11418
חלב יבש דל שומןסולרביולוגיהD3840
מלח זרחן (PBS)סולרביולוגיהP1020
ממברנת PVDFתרמו פישר סיינטיפיק88518
ערכת ELISA של עכברוש MMP-13נובNBP3-06931
ערכת RAT MMP-3 ELISAנובNBP3-06894
ערכת תמלול הפוךפרומגהA3500
RIPA Lysis BufferסולרביולוגיהR0010
מים ללא RNaseסולרביולוגיהR1600
ג'ל SDS-PAGEאפיזיםPG112
SYBR Green Real-time PCR Master MixטויובוQPK-201
טריטון X-100סולרביולוגיהT8200
טריזולסולרביולוגיה15596026
טריפסיןסולרביולוגיהT1320
ערכת מצע ECL כימילומינסנציה רגישה במיוחדNCM ביוטכנולוגיהP10300
β-אקטין ארנב mAbABclonalAC026

מקורות

  1. Min, Q., et al. Strong and elastic chitosan/silk fibroin hydrogels incorporated with growth-factor-loaded microspheres for cartilage tissue engineering. Biomimetics (Basel). 7 (2), 41(2022).
  2. Kloppenburg, M., Namane, M., Cicuttini, F. Osteoarthritis. Lancet. 405 (10472), 71-85 (2025).
  3. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: The value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  4. Han, Y., et al. High-precision, gelatin-based, hybrid, bilayer scaffolds using melt electro-writing to repair cartilage injury. Bioact Mater. 6 (7), 2173-2186 (2021).
  5. Molnar, V., et al. Cytokines and chemokines involved in osteoarthritis pathogenesis. Int J Mol Sci. 22 (17), 9208(2021).
  6. Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
  7. Ouyang, Z., et al. Cartilage-related collagens in osteoarthritis and rheumatoid arthritis: From pathogenesis to therapeutics. Int J Mol Sci. 24 (12), 9841(2023).
  8. Mueller, A. L., et al. Recent advances in understanding the pathogenesis of rheumatoid arthritis: new treatment strategies. Cells. 10 (11), 3017(2021).
  9. Cao, F., et al. Trends and cross-country inequalities in the global burden of osteoarthritis, 1990-2019: A population-based study. Ageing Res Rev. 99, 102382(2024).
  10. Wu, X., Fan, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. The metabolic landscape in osteoarthritis. Aging Dis. 13 (4), 1166-1182 (2022).
  11. Deng, H., et al. Altered expression of the Hedgehog pathway proteins BMP2, BMP4, SHH, and IHH involved in knee cartilage damage of patients with osteoarthritis and Kashin-Beck disease. Cartilage. 13 (1), 19476035221087706(2022).
  12. Hui, L., et al. Effects of androgen receptor overexpression on chondrogenic ability of rabbit articular chondrocytes. Tissue Eng Regen Med. 18 (4), 641-650 (2021).
  13. Drevet, S., Favier, B., Lardy, B., Gavazzi, G., Brun, E. New imaging tools for mouse models of osteoarthritis. Geroscience. 44 (2), 639-650 (2022).
  14. Wu, S., Guo, W., Li, R., Zhang, X., Qu, W. Progress of platelet derivatives for cartilage tissue engineering. Front Bioeng Biotechnol. 10, 907356(2022).
  15. Zhang, Y., et al. DL-3-N-butylphthalide promotes cartilage extracellular matrix synthesis and inhibits osteoarthritis development by regulating FoxO3a. Oxid Med Cell Longev. 2022, 9468040(2022).
  16. Krych, A. J., Saris, D. B. F., Stuart, M. J., Hacken, B. Cartilage injury in the knee: assessment and treatment options. J Am Acad Orthop Surg. 28 (22), 914-922 (2020).
  17. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  18. Morici, L., Allémann, E., Rodríguez-Nogales, C., Jordan, O. Cartilage-targeted drug nanocarriers for osteoarthritis therapy. Int J Pharm. 666, 124843(2024).
  19. Urlić, I., Ivković, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipein the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  21. Bai, L., et al. Engineering bone/cartilage organoids: Strategy, progress, and application. Bone Res. 12 (1), 66(2024).
  22. Dönges, L., et al. Engineered human osteoarthritic cartilage organoids. Biomaterials. 308, 122549(2024).
  23. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  24. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: the value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  25. Yu, L., et al. Hyaline cartilage differentiation of fibroblasts in regeneration and regenerative medicine. Development. 149 (2), dev200249(2022).
  26. Gebauer, M., et al. Comparison of the chondrosarcoma cell line SW1353 with primary human adult articular chondrocytes with regard to their gene expression profile and reactivity to IL-1β. Osteoarthritis Cartilage. 13 (8), 697-708 (2005).
  27. Yan, W., et al. Chondrocyte-targeted delivery system of Sortase A-engineered extracellular vesicles silencing MMP13 for osteoarthritis therapy. Adv Healthc Mater. 13 (16), e2303510(2024).
  28. Goldring, M. B. Chondrogenesis, chondrocyte differentiation, and articular cartilage metabolism in health and osteoarthritis. Ther Adv Musculoskelet Dis. 4 (4), 269-285 (2012).
  29. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  30. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  31. Dou, Y., Fang, Y., Zhao, C., Fu, W., Jiang, D. Editorial: Bioengineering and translational research for bone and joint diseases. Front Bioeng Biotechnol. 10, 969416(2022).
  32. Ye, K., et al. Bioengineering of articular cartilage: Past, present and future. Regen Med. 8 (3), 333-349 (2013).
  33. Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

IIII
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.