הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח וסטנדרטיזציה של מיקרושיטה אקס-ויבו לכימות תוך-תאי של וינקריסטין בתאי ALL ראשוניים באמצעות LC-MS/MS

499 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69535

⸱

23 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה נועד להקים ולייעל שיטת LC-MS/MS לכימות יחסי של הצטברות וינקריסטין בתאי ALL ראשוניים בילדים.

תקציר

כימות וינקריסטין תוך-תאי (VCR) בתאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה ראשונית (ALL) בילדים הוא חיוני להבנת ההבדלים הספציפיים בדגימה בקליטת תרופות ולתמיכה במחקרים ניסיוניים המשתמשים בחומר נדיר של מטופלים. כאן, אנו מציגים מיקרושיטה יעילה של LC-MS/MS, מותאמת במיוחד לתאי ראשוניים ALL שהושגו באמצעות קסנוגרפטים שמקורם במטופלים (PDX), תוך התמודדות עם אתגרים מרכזיים כמו זמינות מוגבלת של תאים, גודל תאים קטן וצורך בהתאוששות שחזורית לאחר שלבי שטיפה מרובים. בדיקות מסלול זמן שנעו בין 1 ל-5 שעות הראו שתקופת דגירה של 3 שעות מניבה את רמות ה-VCR התוך-תאי הגבוהות והעקביות ביותר, עם שונות נמוכה יותר בין השכפולים. אופטימיזציה של השיטה גם קבעה ששימוש ב-2.5 ×-106 תאים לכל תנאי משפר את החוסן האנליטי בהשוואה ל-1 ×-10תאים 6, שהראו פיזור גבוה יותר בניסויים חוזרים. שיפורים קריטיים נוספים כללו שימוש במתנול קר לשיפור יעילות המשקעים בחלבון ושילוב תקן פנימי לניטור ומזעור שונות פרוצדורלית. השיטה מאפשרת כימות רגיש ומדויק של וידאו תוך-תאי בטווחי ריכוז רלוונטיים, אם כי המינון הנמוך ביותר שנבדק (0.01 מיקרומון) לא היה ניתן לכימות לאחר דגירה של 3 שעות. בסך הכול, מיקרושיטה זו מספקת גישה מעשית, ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה למדידת וידאו תוך-תאי בדגימות ראשוניות של ALL. העיצוב שלו תומך בניתוחים השוואתיים, אימות מודלים ex-vivo ויישומים מתודולוגיים עתידיים שמטרתם לשלב כימות תרופות תוך-תאיים בהערכות פרמקולוגיות רחבות יותר.

מבוא

לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) מהווה כ-25% מכלל סוגי סרטן הילדים ונשארת הממאירה השכיחה ביותר בילדים 1,2. למרות שההתקדמות בטיפול שיפרה משמעותית את שיעורי ההישרדות, שכעת עוברים 90% – המורכבות הביולוגית של ALL ממשיכה להניע מאמצים לפתח כלים שמאפיינים טוב יותר את המחלה ברמההתאית 3.

אלקלואידים של וינקה, במיוחד וידאו, הם רכיבים מרכזיים בכל פרוטוקולי הטיפול4. מכיוון ש-VCR מפעיל את השפעותיו הציטוטוקסיות בתוך התא, הבנת קליטה והצטברות בתאי לוקמיה היא יסודית למחקרים העוסקים בתגובה לתרופות, פרמקודינמיקה והתנהגות תאית במערכות אקס ויבו. עם זאת, רוב הגישות הזמינות להערכת רמות תרופות תוך-תאיות מסתמכות על מדידות עקיפות או שיטות חצי-כמותיות, המגבילים את השחזוריות והרגישות 5,6,7.

במקביל, מחקרים רבים עדיין תלויות במידה רבה בקווי תאים של לוקמיה, שחסרים את ההטרוגניות הביולוגית והרלוונטיות הקלינית של תאים ראשוניים שמקורם במטופלים. דגימות ראשוניות מציבות לעיתים אתגרים כמו מספר תאים מוגבל, איכות דגימות משתנה, והצורך בטכניקות אנליטיות רגישות במיוחד המסוגלות לזהות תרכובות תוך-תאיות בעלות שכיח נמוך8.

ספקטרומטריית מסה טנדם בכרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) מספקת את הספציפיות והרגישות הנדרשות לכימות מדויק של התרופות הכימותרפיות, אך פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת VCR תוך-תאי ישירות בתאי לוקמיה ראשוניים נותרו נדירים. הקמת מיקרושיטות חזקות התואמות לחומר מוגבל למטופלים עשויה להקל על מגוון רחב של יישומים, כולל פרופילינג פרמקולוגי, הערכת אינטראקציות בין תרופות לתאים ומחקרים השוואתיים בין תת-סוגי מחלות או מצבים טיפוליים.

כאן בפרוטוקול זה, אנו מתארים את פיתוח ואופטימיזציה של מיקרו-שיטה לכימות אקס ויבו של וידאו תוך-תאי בתאי לוקמיה ראשוניים באמצעות LC-MS/MS. כדי להשיג חומר מספק לפיתוח שיטה, דגימות מטופלים הושתלו בעכברי NSG חסרי חיסון ליצירת מודלים PDX9. לאחר התרחבות in vivo , תאי לוקמיה אנושיים בודדו והוקפאו10. לאחר מכן, הם הופשרו, דגרו באמצעות וידאו, נשטפו, נערכו ונבדקו על ידי LC-MS/MS כדי לקבוע את רמות התרופות התוך-תאיות.

שיטה זו מציעה מספר יתרונות: היא דורשת מספר קטן של תאים (2.5 מיליון), רגישה ומהירה, ותואמת לדגימות ראשוניות רלוונטיות קלינית. מכיוון שהוא מודד ישירות את תכולת התרופות התוך-תאית, הוא מספק כלי כמותי אמין לחוקרים החוקרים קליטת תרופות, תגובות תאיות לכימותרפיה או שאלות פרמקולוגיות אחרות במלמאירויות המטולוגיות.

בסך הכול, פרוטוקול זה מרחיב את ערכת הכלים האנליטית הזמינה לחקר ALL בילדים וניתן להתאים בקלות לתרופות או סוגי דגימות אחרים, ותומך בחקירות עתידיות בביולוגיית לוקמיה, התנהגות תרופתית ופרמקולוגיה מדויקת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות הלוקמיה ששימשו במחקר זה נאספו מבקבוקים ביו-מקוריים של מטופלים שטופלו ב-Centro Infantil Boldrini, שאפשרו להשתמש בתאים שלהם באמצעות טופס הסכמה מדעת. הפרויקט אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית (CAAE 34601120.7.0000.5376). הפרוטוקולים ליצירת PDX בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות ולהנחיות האתיות של ועדת האתיקה לבעלי חיים (Comissão de Ética no Uso de Animais) של מרכז אינפנטיל בולדריני (CEUA/Boldrini 0011-2020).

1. הכנת דגימות ודגירה לתרופות (יום 1)

  1. הכנת מלאי ופתרונות עובדים
    1. שקלו 2.5 מ"ג וינקריסטין סולפט (משקל מולקולרי: 923 גרם למולול) והמסו ב-2.0 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (DMSO) במיקרוצינור בנפח 2.0 מ"ל להכנת תמיסת מאגר של 1.354 מ"מ. מערבולת עד שיתמוסס לגמרי.
      אזהרה: DMSO הוא מטרד; תלבש כפפות ותטפל בזה עם מכסה אדים כימי.
    2. הכינו את תמיסת העבודה של 100 מיקרומום על ידי ערבוב 147.71 מיקרוליטר של תמיסת ה-VCR עם 1,852.28 מיקרוליטר DMSO במיקרוצינור בנפח 2.0 מ"ל. מערבולת ביסודיות.
    3. פזר 500 מיקרוליטר מהתמיסה העובדת לארבעה מיקרו-צינורות של 0.6 מ"ל ואחסן בטמפרטורה של -20°C למשך מספר חודשים. הימנע מהפשרת האליקוטים יותר משלוש פעמים.
    4. הכינו תמיסת עבודה של 100 מיקרומום וינבלסטין (VINB) על ידי ערבוב של 181.81 מיקרוליטר של תמיסת מאגר 1.1 מ"מ (וינבלסטין סולפט 1 מ"ג/מ"ל, משקל מולקולרי: 909.07 גרם למולל) עם 1,818.19 מיקרוליטר מים סטריליים אולטרה-טהורים בתוך מיקרוצינור של 2.0 מ"ל. מערבולת עד שתהיה הומוגנית.
    5. Aliquot את הפתרון העובד של VINB באותו אופן כמו ב-VCR.
    6. הכינו תמיסת VINB של מתנול + 0.1 מיקרומום על ידי ערבוב של 49.95 מ"ל מתנול עם 50 מיקרוליטר של תמיסת העבודה של VINB בצינור של 50 מ"ל. מערבולת עד שתהיה הומוגנית. אחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.
      אזהרה: מתנול רעיל ודליק; לטפל בציוד מגן מתאים בתוך מכסה אדים.
    7. הכינו תמיסה של חומצה פורמית + מים + 0.1% על ידי ערבוב של 49.95 מ"ל מים אולטרה-טהורים עם 50 מיקרוליטר חומצה פורמית בצינור של 50 מ"ל. מערבולת, טוב. אחסן בטמפרטורת החדר (RT).
      אזהרה: חומצה פורמית היא קורוזיבית; לטפל בכפפות והגנה על העיניים.
  2. הפשרה ושטיפת תאים ראשוניים
    1. הפשרה של דגימות תאים שמורות בקפאה על ידי סיבוב עדין של הבקבוקון בכוס המכילה 15 מ"ל מים מזוקקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה מלאה.
      הערה: מידע על פרוטוקולי איסוף והקפאת תאים ניתן למצוא בפרסומים קודמים 9,10.
    2. העבר את תכולת הבקבוקון לצינור קוני בנפח 50 מ"ל המכיל 10-15 מ"ל של PBS סטרילי 1x PBS עם פיפט פסטר חד-פעמי סטרילי. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    3. השליך את הסופרנטנט על ידי הפיכת הצינור.
    4. תלה את הכדור ב-10 מ"ל של AIM V מדיום עם פיפט פסטר חד-פעמי. ספירת תאים ברי קיימא ומדידת גודל תא ממוצע באמצעות מונה אוטומטי.
      הערה: מומלץ להשתמש בתאים שמפגינים לפחות 80% עמידות יחסית למספר התאים הכולל שנאספו.
    5. חשב את הנפח הנדרש לאיסוף 2.5 ×-106 תאים ברי קיימא באמצעות פרופורציה פשוטה המבוססת על הריכוז הנמדד. לדוגמה, אם הריכוז הוא 5 × 106 תאים/מ"ל, הנפח הנדרש הוא 0.5 מ"ל.
      הערה: בצע כל טיפול בשלושה עותקים לצורך שחזור נתונים. שמרו על הגודל הבינוני של התאים המסופקים במונה התאים האוטומטי; השתמש בו כדי לחשב את נפח התאים.
  3. מערכת טיפול בסמים
    1. חשב את נפח תמיסת ה-VCR הנדרשת כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרומום בנפח כולל של 2.0 מ"ל. סחרור את התמיסה המקורית לפני פיפטינג.
    2. הוסיפו AIM V medium, אחר כך 2.5 ×-106 תאים, ולבסוף את תמיסת הווידאו למיקרופופרת של 2.0 מ"ל. מערבולת לזמן קצר וסובב בעדינות (5 שניות) כדי לאסוף נוזל מכסה הצינור.
    3. דגרו את הצינורות הפתוחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 3 שעות.
    4. לאחר הדגירה, סגרו את המכסים ובצנטריפוגה את הדגימות ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    5. זרקו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, ואז הוסיפו 1 מ"ל PBS ב-RT לצינור.
    6. חזרו על הצנטריפוגציה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-RT, הסרת הסופרנטנטים ושטיפת PBS פעמיים נוספות, לסך הכל שלוש שטיפות נוספות.
    7. הסר בזהירות את כל הסופרנטנט באמצעות פיפטה, החזיר את הכדור ל-100 מיקרו-ליטר של PBS, ומערבולת עד שהכדור יתלה לחלוטין.
    8. הוסיפו 400 מיקרוליטר מתנול קר + 0.1 מיקרומום וינבלסטין (-20 מעלות צלזיוס) ישירות לדגימה, תוך הימנעות ממגע עם דפנות הצינור.
    9. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורה של מינוס 80°C.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C למשך מספר שבועות (עצירה בטוחה).

2. עיבוד דגימות עבור LC-MS/MS (יום 2)

  1. חילוץ דגימה
    1. קרר מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס לפני הסרת דגימות מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.
    2. מיד לאחר לקיחת הדגימות מהמקפיא, צנטריפוגה אותן ב-13,000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. העבר 300 מיקרוליטר של סופרנטנט למיקרוצינור בנפח 1.5 מ"ל.
    4. ייבשו את הדגימות לחלוטין באמצעות ריכוז ואקום בטמפרטורה של 40-45 מעלות צלזיוס למשך שעה ו-40 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן כדורים מיובשים בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך מספר שבועות (עצירה בטוחה).
    5. החזירו כל כדור ב-400 מיקרוליטר מים + 0.1% חומצה פורמית (מוכנה מראש). מערבולת בעדינות עד שהכדור נמס לחלוטין.
    6. צנטריפוגה נוספת את הדגימות ב-13,000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. העבר 300 מיקרוליטר של סופרנטנט לבקבוקון בעל בורג בנפח 2.0 מ"ל לניתוח LC-MS/MS.

3. הגדרת ורכישת נתונים של LC-MS/MS

  1. הכנת פאזה ניידת והתניה בעמודה
    1. הכינו ממס A על ידי ערבוב מים אולטרה-טהורים עם חומצה פורמית של 0.1%.
    2. הכינו ממס B על ידי ערבוב אצטוניטריל עם חומצה פורמית של 0.1%.
      אזהרה: אצטוניטריל הוא רעיל ודליק; ידית בתוך מכסה אדים כימי.
    3. סוניקציה של כל ממס באמבטיה אולטרסונית למשך 5 דקות. חבר את הבקבוקים למודול המשאבה ונקה את המערכת בזרימה גבוהה כדי להסיר מזהמים.
    4. התקן עמוד BEH C18 הפוך (1.7 מיקרון, 2.1 מ"מ × 50 מ"מ).
      הערה: לצורך ביצוע הניתוח, המחקר השתמש במערכת כרומטוגרפית מסוג Acquity H-Class שהייתה מחוברת לספקטרומטר מסה משולש של Xevo TQS-Micro.
    5. השתמש בגרדיאנט בינארי המורכב מממסים A ו-B, שניהם מוכנים מראש.
    6. הרץ את הגרדיאנט הכרומטוגרפי מ-5% ל-95% מממס B בשתי הדקות הראשונות, ואחר כך 2 דקות של ממס A לשטיפת עמודות ואיזון מחדש.
    7. הגדר את קצב הזרימה ל-0.2 מ״ל לדקה לאורך כל 4 הדקות של הריצה. שמרו על טמפרטורת העמודה ב-40 מעלות צלזיוס והזרקו 10 מיקרוליטר מכל דגימה.
  2. הגדרת שיטת LC-MS/MS
    1. פתח את תוכנת LC-MS/MS. לחץ על קובץ > New > MS Method כדי להתחיל שיטה חדשה.
    2. גש ללשונית הפונקציה והגדר את סוג הפונקציה למעקב תגובות מרובות (MRM). הזן מעברי יון ופרמטרים המפורטים בטבלה 1 עבור VCR ו-VINB (התקן הפנימי).
    3. הגדר את זמן הרכישה ל-4 דקות. לחץ על הגשה לשמירה.
      הערה: אל תעלה על 4 דקות כדי להבטיח איזון מחדש בין הזריקות.
    4. הגדר פרמטרים של UHPLC תחת שיטת הכניסה > שיטת עריכת LC ושמור כקובץ .mth (טבלה 2).
    5. הגדר פרמטרי מקור תחת לשונית הכוונה לפי טבלה 3. שמור כקובץ .tun.
    6. שמור את השיטה המלאה: קובץ > Save As, וייצא כקובץ .mth.
  3. יצירת רשימת דוגמאות והתחלת הריצה
    1. במסך הבית של התוכנה, פתח את רשימת הדגימות וצור רשימה עם שמות הדגימות, נפחי ההזרקה, מיקומי הבקבוקונים והשיטה שיש להשתמש בה.
    2. הניחו בקבוקון עם מים אולטרה-טהורים במגש האוטוסמפלר וסמן אותו כבקבוק ריק. הרץ את הריקנות בין כל סט של שלוש הזרקות כדי למנוע העברה.
      הערה: לפני תחילת הריצה, ודא שלחץ העמודה (ΔP) יציב ופחות מ-10 psi.
    3. בחר את השורות הרצויות ברשימת הדוגמאות ולחץ על Run > OK כדי להתחיל באיסוף נתונים.

4. ניתוח נתונים

  1. ויזואליזציה וייצוא נתונים
    1. לאחר סיום הריצה, צפו בכרומטוגרמות על ידי בחירת דגימה ולחיצה על כרומטוגרמה בתפריט העליון.
    2. במסך הבית, לחץ על TargetLynx, בחר את הקבצים שרצו זה עתה, ולחץ על Process > Select the vincristine method > OK, כדי ליצור טבלאות פלט.
    3. לחץ על דיווח > ייצוא טבלה ושמור את הנתונים המעובדים כקובץ .csv או .xlsx.
      הערה: ייצוא אזורי שיא גולמי הן עבור האנליט והן עבור התקן הפנימי.
  2. ארגון נתונים וחישוב יחס
    1. פתח את הקובץ המיוצא וצור את העמודות הבאות:
      1. דגימה: הוסף את שם הדגימה או הבקבוקון.
      2. הרצה: ציין לאיזה שכפול הערך מתאים.
      3. אזור וידאו: הזן את האזור מתחת לשיא לווינקריסטין.
      4. אזור VINB: הזן את האזור מתחת לפסגה עבור וינבלסטין.
      5. יחס VCR/VINB: נרמול כל ערך VCR על ידי חלוקו בערך VINB המתאים לו.
    2. הוסף עמודות לערכי סטיית תקן של שטח ה-VCR, שטח VINB ויחס VCR/VINB עבור כל סט משולש.
      הערה: נרמול באמצעות התקן הפנימי מאפשר תיקון לשינויים בנפח החילוץ או בהזרקה.
  3. תוצאות שרטוט
    1. פתח את תוכנת הגרפים המועדפת ובחר את פורמט הטבלה הקבוצתית .
    2. בחר Enter או ייבא נתונים לטבלה חדשה, ותחת אפשרויות, בחר Enter 3 ערכים משכפלים בעמודות משנה זו לצד זו.
    3. צייר רק את יחסי ה-VCR/VINB המנורמליים עבור כל דגימה, תוך השמטת ערכי שטח גולם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות כרומטוגרפיות מייצגות שהושגו לאחר בדיקות הצטברות תוך-תאית באמצעות כל תאי PDX ראשוניים שדגרו עם VCR ו-VINB מוצגות באיור 1. הדגימות הוכנו באמצעות 2.5 ×-106 תאים לכל תנאי. בתנאים הכרומטוגרפיים שתוארו, הווידאו נשמר בעקביות על 2.85 דקות עם אפקט מטריצה מינימלי, וצורת השיא הייתה סימטרית וברורה היטב. פרופילים אלו ממחישים את ההתנהגות הכרומטוגרפית הצפויה של VCR ו-VINB כאשר הפרוטוקול מבוצע כראוי.

לפני יישום פרוטוקול זה על תאי לוקמיה ראשוניים, בוצעו בדיקות רא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הערכה מדויקת של רמות התרופות התוך-תאיות בתאי לוקמיה ראשוניים חיונית להבנת טיפול בתרופות ברמה התאית ולתמיכה בפיתוח בדיקות פונקציונליות שמשלימות את הפרופיל המולקולרי. גישות אנליטיות קיימות דורשות לעיתים מספר רב של תאים, כוללות שלבי עיבוד ארוכים, או מסתמכות על קריאות עקיפות שאינן משקפות את הזמינות התוך-תאית האמיתית של תרופות כימותרפיות 5,6. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בשיטות מהירות, רגישות וניתנות להרחבה המסוגלות לכמת הצטברות תרופות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים למרכז אינפנטיל בולדריני ולכל המטופלים שתרמו את הדגימות שלהם למחקר. אדרילי ס. סוארס קיבל מלגה מהקוורדנאסאו דה אפרפייסואמנטו דה פסואל דה ניבל סופריור-ברזיל (CAPES) ומקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP, 2023/18389-3). חוסה א. יונס קיבל מלגת פרודוקטיביות מהמועצה הלאומית לפיתוח טכנולוגי ומדעי (CNPq, 308399/2021-8). עבודה זו נתמכה במימון מחקר ממשרד הבריאות הברזילאי על ידי תוכנית PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקון 2.0 מ"ל עם מבחן בורגאספקת זרימה8-2400שימש עם תוספות זכוכית עם קפיץ (5 x 29 מ"מ) מאותה חברה (קטגוריה 5-29015)
בקבוקון 2.0 מ"ל עם מבחן בורגאספקת זרימה8-2400שימש עם תוספות זכוכית עם קפיץ (5 x 29 מ"מ) מאותה חברה (קטגוריה 5-29015)
אצטוניטרילמרק (סיגמא-אלדריץ')100030
אצטוניטרילמרק (סיגמא-אלדריץ')24010152
AIM Vתרמו פישר סיינטיפיק12055091
מערכת כרומטוגרפית ACQUITY UPLC H-Classווטרס קו.https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
רוזנת 3 פלורידהתרמו פישר סיינטיפיקA49892
DMSOמרק (סיגמא-אלדריץ')D 8418
פאלקון 50 מ"לסארסטדט62.547.254
חומצה פורמיתמרק (סיגמא-אלדריץ')F0507
בקבוק זכוכיתמרק (סיגמא-אלדריץ')41121800
חממהPHCBIMCO-50M-PE
מתנולמרק (סיגמא-אלדריץ')34860
מיקרוטיוב 1.5 מ"לאפנדורף41121702
מיקרוטיוב 2.0 מ"לאפנדורף30120094
PBSמרק (סיגמא-אלדריץ')PPB006
ספיבאק miVacפישר סיינטיפיק56340
התוכנה לרכישת נתוניםווטרס קו.MassLynx
ספקטרומטר מסה משולש עם קוודרופול Xevo TQ-S microווטרס קו.https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
אולטרסוני סוניקטורקימיסQ335D
וינבלסטין 1 מ"ג/מ"לליבסhttps://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/וינבלסטין סולפט
וינקריסטיןקיימן כימיקלים11764

מקורות

  1. Inaba, H., Pui, C. H. Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).
  2. Pui, C. H., et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration. J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).
  3. Gaudichon, J., et al. Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues. Blood Rev. 36, 40-56 (2019).
  4. Dhyani, P., et al. Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine. Cancer Cell Int. 22, 206(2022).
  5. Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations. Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).
  6. Chien, H. C., et al. Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells. Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).
  7. Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).
  8. Richter, M., et al. From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines. Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).
  9. Borgmann, A., et al. Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  10. Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia. J Vis Exp. (224), e68797(2025).
  11. Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid. J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).
  12. Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).
  13. Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations. Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

וינקריסטין תוך-תאיכימות תרופהקסנוגרפטים ממקור חולהשיקיעת חלבוניםסטנדרט פנימילוקמיה פדיאטריתבדיקת מהלך זמן
פיתוח וסטנדרטיזציה של מיקרושיטה אקס-ויבו לכימות תוך-תאי של וינקריסטין בתאי ALL ראשוניים באמצעות LC-MS/MS
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.