פרוטוקול זה נועד להקים ולייעל שיטת LC-MS/MS לכימות יחסי של הצטברות וינקריסטין בתאי ALL ראשוניים בילדים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פיתוח וסטנדרטיזציה של מיקרושיטה אקס-ויבו לכימות תוך-תאי של וינקריסטין בתאי ALL ראשוניים באמצעות LC-MS/MS
במאמר זה
סיכום
תקציר
כימות וינקריסטין תוך-תאי (VCR) בתאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה ראשונית (ALL) בילדים הוא חיוני להבנת ההבדלים הספציפיים בדגימה בקליטת תרופות ולתמיכה במחקרים ניסיוניים המשתמשים בחומר נדיר של מטופלים. כאן, אנו מציגים מיקרושיטה יעילה של LC-MS/MS, מותאמת במיוחד לתאי ראשוניים ALL שהושגו באמצעות קסנוגרפטים שמקורם במטופלים (PDX), תוך התמודדות עם אתגרים מרכזיים כמו זמינות מוגבלת של תאים, גודל תאים קטן וצורך בהתאוששות שחזורית לאחר שלבי שטיפה מרובים. בדיקות מסלול זמן שנעו בין 1 ל-5 שעות הראו שתקופת דגירה של 3 שעות מניבה את רמות ה-VCR התוך-תאי הגבוהות והעקביות ביותר, עם שונות נמוכה יותר בין השכפולים. אופטימיזציה של השיטה גם קבעה ששימוש ב-2.5 ×-106 תאים לכל תנאי משפר את החוסן האנליטי בהשוואה ל-1 ×-10תאים 6, שהראו פיזור גבוה יותר בניסויים חוזרים. שיפורים קריטיים נוספים כללו שימוש במתנול קר לשיפור יעילות המשקעים בחלבון ושילוב תקן פנימי לניטור ומזעור שונות פרוצדורלית. השיטה מאפשרת כימות רגיש ומדויק של וידאו תוך-תאי בטווחי ריכוז רלוונטיים, אם כי המינון הנמוך ביותר שנבדק (0.01 מיקרומון) לא היה ניתן לכימות לאחר דגירה של 3 שעות. בסך הכול, מיקרושיטה זו מספקת גישה מעשית, ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה למדידת וידאו תוך-תאי בדגימות ראשוניות של ALL. העיצוב שלו תומך בניתוחים השוואתיים, אימות מודלים ex-vivo ויישומים מתודולוגיים עתידיים שמטרתם לשלב כימות תרופות תוך-תאיים בהערכות פרמקולוגיות רחבות יותר.
מבוא
לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) מהווה כ-25% מכלל סוגי סרטן הילדים ונשארת הממאירה השכיחה ביותר בילדים 1,2. למרות שההתקדמות בטיפול שיפרה משמעותית את שיעורי ההישרדות, שכעת עוברים 90% – המורכבות הביולוגית של ALL ממשיכה להניע מאמצים לפתח כלים שמאפיינים טוב יותר את המחלה ברמההתאית 3.
אלקלואידים של וינקה, במיוחד וידאו, הם רכיבים מרכזיים בכל פרוטוקולי הטיפול4. מכיוון ש-VCR מפעיל את השפעותיו הציטוטוקסיות בתוך התא, הבנת קליטה והצטברות בתאי לוקמיה היא יסודית למחקרים העוסקים בתגובה לתרופות, פרמקודינמיקה והתנהגות תא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות הלוקמיה ששימשו במחקר זה נאספו מבקבוקים ביו-מקוריים של מטופלים שטופלו ב-Centro Infantil Boldrini, שאפשרו להשתמש בתאים שלהם באמצעות טופס הסכמה מדעת. הפרויקט אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית (CAAE 34601120.7.0000.5376). הפרוטוקולים ליצירת PDX בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות ולהנחיות האתיות של ועדת האתיקה לבעלי חיים (Comissão de Ética no Uso de Animais) של מרכז אינפנטיל בולדריני (CEUA/Boldrini 0011-2020).
1. הכנת דגימות ודגירה לתרופות (יום 1)
- הכנת מלאי ופתרונות עובדים
- שקלו 2.5 מ"ג וינקריסטין סולפט (משקל מולקולרי: 923 גרם למולול) והמסו ב-2.0 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (DMSO) במיקרוצינור בנפח ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאות כרומטוגרפיות מייצגות שהושגו לאחר בדיקות הצטברות תוך-תאית באמצעות כל תאי PDX ראשוניים שדגרו עם VCR ו-VINB מוצגות באיור 1. הדגימות הוכנו באמצעות 2.5 ×-106 תאים לכל תנאי. בתנאים הכרומטוגרפיים שתוארו, הווידאו נשמר בעקביות על 2.85 דקות עם אפקט מטריצה מינימלי, וצורת השיא הייתה סימטרית וברורה היטב. פרופילים אלו ממחישים את ההתנהגות הכרומטוגרפית הצפויה של VCR ו-VINB כאשר הפרוטוקול מבוצע כראוי.
לפני יישום פרוטוקול זה על תאי לוקמיה ראשוניים, בוצעו בדיקות רא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הערכה מדויקת של רמות התרופות התוך-תאיות בתאי לוקמיה ראשוניים חיונית להבנת טיפול בתרופות ברמה התאית ולתמיכה בפיתוח בדיקות פונקציונליות שמשלימות את הפרופיל המולקולרי. גישות אנליטיות קיימות דורשות לעיתים מספר רב של תאים, כוללות שלבי עיבוד ארוכים, או מסתמכות על קריאות עקיפות שאינן משקפות את הזמינות התוך-תאית האמיתית של תרופות כימותרפיות 5,6. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בשיטות מהירות, רגישות וניתנות להרחבה המסוגלות לכמת הצטברות תרופות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
תודות
אנו מודים למרכז אינפנטיל בולדריני ולכל המטופלים שתרמו את הדגימות שלהם למחקר. אדרילי ס. סוארס קיבל מלגה מהקוורדנאסאו דה אפרפייסואמנטו דה פסואל דה ניבל סופריור-ברזיל (CAPES) ומקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP, 2023/18389-3). חוסה א. יונס קיבל מלגת פרודוקטיביות מהמועצה הלאומית לפיתוח טכנולוגי ומדעי (CNPq, 308399/2021-8). עבודה זו נתמכה במימון מחקר ממשרד הבריאות הברזילאי על ידי תוכנית PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בקבוקון 2.0 מ"ל עם מבחן בורג | אספקת זרימה | 8-2400 | שימש עם תוספות זכוכית עם קפיץ (5 x 29 מ"מ) מאותה חברה (קטגוריה 5-29015) |
| בקבוקון 2.0 מ"ל עם מבחן בורג | אספקת זרימה | 8-2400 | שימש עם תוספות זכוכית עם קפיץ (5 x 29 מ"מ) מאותה חברה (קטגוריה 5-29015) |
| אצטוניטריל | מרק (סיגמא-אלדריץ') | 100030 | |
| אצטוניטריל | מרק (סיגמא-אלדריץ') | 24010152 | |
| AIM V | תרמו פישר סיינטיפיק | 12055091 | |
| מערכת כרומטוגרפית ACQUITY UPLC H-Class | ווטרס קו. | https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW | |
| רוזנת 3 פלורידה | תרמו פישר סיינטיפיק | A49892 | |
| DMSO | מרק (סיגמא-אלדריץ') | D 8418 | |
| פאלקון 50 מ"ל | סארסטדט | 62.547.254 | |
| חומצה פורמית | מרק (סיגמא-אלדריץ') | F0507 | |
| בקבוק זכוכית | מרק (סיגמא-אלדריץ') | 41121800 | |
| חממה | PHCBI | MCO-50M-PE | |
| מתנול | מרק (סיגמא-אלדריץ') | 34860 | |
| מיקרוטיוב 1.5 מ"ל | אפנדורף | 41121702 | |
| מיקרוטיוב 2.0 מ"ל | אפנדורף | 30120094 | |
| PBS | מרק (סיגמא-אלדריץ') | PPB006 | |
| ספיבאק miVac | פישר סיינטיפיק | 56340 | |
| התוכנה לרכישת נתונים | ווטרס קו. | MassLynx | |
| ספקטרומטר מסה משולש עם קוודרופול Xevo TQ-S micro | ווטרס קו. | https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW | |
| אולטרסוני סוניקטור | קימיס | Q335D | |
| וינבלסטין 1 מ"ג/מ"ל | ליבס | https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/ | וינבלסטין סולפט |
| וינקריסטין | קיימן כימיקלים | 11764 |
מקורות
- Inaba, H., Pui, C. H. Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).
- Pui, C. H., et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration. J Clin Oncol.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
