מאמר שיטה

יצירה ואפיון מתווך CRISPR/Cas9 של זן Ent2*/CyO דרוזופילה מלנוגסטר

DOI:

10.3791/69546

⸱

7 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נשא נוקלאוזיד מאוזן 2 (ENT2) הוא חלבון שמור בממברנה המעורב בהעברת נוקלאוזידים ובמטבוליזם תאי. במחקר זה, הוקם תהליך עריכת גנום מבוסס CRISPR/Cas9 ליצירת אלל ממוקד Ent2 בדרוזופילה מלנוגסטר. קו הטרוזיגוטי יציב של Ent2*/ CyO נבנה ותוחזק באמצעות אסטרטגיית כרומוזום מאזן. עבודה זו מתארת את העיצוב, היצירה והאימות המולקולרי של קו המוטנטים, וכן את האפיון הפנוטיפי שלו בתנאי טמפרטורה שונים. זרימת העבודה והזן המוטנטי שנקבעו מספקים מסגרת מעשית לחקר גנים עם פנוטיפים קטלניים הומוזיגוטיים ולחקר שונות פנוטיפית הקשורה לטמפרטורה בדרוזופילה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, שימשה גישה לעריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 כדי להכניס מוטציות בגן נשא הנוקלאוזיד המאוזן 2 (Ent2) ב-Drosophila melanogaster. RNA מדריך המיועד לאזור הקידוד של Ent2 תוכנן והוזרק יחד עם mRNA של Cas9 לעוברי w1118. אללים מוטנטים זוהו באמצעות ריצוף סנגר ונשמרו כקו הטרוזיגוטי יציב של Ent2*/CyO באמצעות כרומוזום מאזן. בהמשך הערכנו את משקל הגוף, יכולת הטיפוס, שיעור ההישרדות ופעילות הסופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) וקטלז (CAT) בזבובי פירות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-25 מעלות צלזיוס, בהתאמה. התוצאות מצביעות על כך שבשני הטמפרטורות של 22 ו-25 מעלות צלזיוס, אורך הגוף והמשקל של זבובי הפירות Ent2*/CyO ירדו משמעותית בהשוואה ל-w 1118, והתפתחותם התעכבה. ב-22 מעלות צלזיוס, תוחלת החיים הכוללת של זבובי Ent2*/CyO הייתה מעט ארוכה יותר מזו של ה-w 1118, בעוד שב-25 מעלות צלזיוס לא נצפה הבדל משמעותי. לגבי יכולת התנועה, ביצועי הטיפוס של זבובים הטרוזיגוטיים היו נמוכים משמעותית מאלו של זבובים הטרוזיגוטיים בשני הטמפרטורות, כאשר הזכרים נפגעו בצורה חמורה יותר. בנוסף, פעילות האנזימים נוגדי החמצון של CAT ו-SOD בזבובי Ent2*/CyO ירדה משמעותית, מה שמעיד על פגיעה ברורה בקיבולת נוגדי החמצון. תוצאות אלו מתארות את הפרופיל הפנוטיפי של קו מוטנטי Ent2 שנוצר על ידי CRISPR ומדגימות את ההיתכנות של שילוב עריכת גנום עם אסטרטגיות כרומוזומי איזון בדרוזופילה. מחקר זה מספק מסגרת מתודולוגית ומשאב גנטי לחקירות עתידיות של גנים הקשורים למטבוליזם ותגובות סביבתיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרוזופילה מלנגסטר נותרה אחת מהאורגניזמים המודל הנפוצים ביותר לגנטיקה וביולוגיה התפתחותית1. הוא מאופיין במחזור חיים קצר, רבייה מהירה, כלים מבוססים למניפולציה גנטית, וגנום עם הערות מלאות 2,3. מין זה מיושם באופן נרחב במחקרים של תפקוד גנים, ויסות מטבולי והסתגלות סביבתית 4,5. נוקלאוזידים ונגזרותיהם כגון ATP הם מרכזיים ביצירת אנרגיה תאית, סינתזת חומצות גרעין והעברת אותות בדרוזופילה, המשקפים ויסות מטבולי משומר בין מטזואנים6. מסלולי איתות פורינרגיים בדרוזופילה, התלויים במנגנוני הובלה חוץ-תאיים של אדנוזין ונוקלאוזידים, מדגישים את התפקיד הפונקציונלי של תנועת נוקלאוזידים דרך ממברנות בתיאום תגובות אנרגיה והעברת אותות7. מבין התהליכים הללו, העברת הנוקלאוזידים דרך קרום הציטופלזמה מתווכת בעיקר על ידי משפחת נשאי הנוקלאוזידים המאוזנים (ENT), כאשר DmENT2 מציג פעילות הובלה פונקציונלית בדרוזופילה8.

משפחת ENT כוללת מספר תת-סוגים, ביניהם ENT2 הוא נשא נוקלאוזידים טרנסממברנלי שנחקר בהרחבה9. הוא מקל על ההובלה הטרנסממברנית הבלתי תלויה באנרגיה של נוקלאוזידים פורינים ופירימידיניםשונים 10,11. ביונקים, ENT2 הוא נשא דו-כיווני המובע באופן נרחב, המקל על קליטת נוקלאוזידים ונוקלאובזים של פורין ופירימידין תאי. פעילות ההובלה הזו תורמת להצלת נוקלאוטידים ומסייעת לשמור על הומאוסטזיס מטבולי תאי12. ENT2 גם מתווך את הובלת מגוון תרופות שמקורן בנוקלאוזידים, ומרחיב את הרלוונטיות התפקודית שלו מעבר לתנועת נוקלאוזידים אנדוגנית, ומדגיש את חשיבותו הפיזיולוגית והקלינית הרחבהיותר 13. יתרה מזאת, ENT2 היה מעורב בהפרעות נוירולוגיות14, מטבוליזם גידולים15, תפקוד לקוי וסקולרי16, ומטבוליזם אנרגיה תאית בבני אדם17. עם זאת, מחקרים העוסקים בתפקידים ברמת האורגניזם של Ent2 בדרוזופילה נותרו מוגבלים.

תפקידי ENT2 בצמיחה והתפתחות, מטבוליזם אנרגיה, ביצועי תנועה ויכולת נוגדי חמצון בתנאי טמפרטורה משתנים טרם נחקרו במלואם. הטמפרטורה משפיעה באופן משמעותי על קצב חילוף החומרים הבסיסי ותוחלת החיים בדרוזופילה, כאשר טמפרטורות גידול גבוהות בדרך כלל מגבירות את הפעילות המטבולית ומקטינות את אורך החיים19. שינויים אלו התלויים בטמפרטורה בביטוי גנים יכולים להשפיע על מסלולים פיזיולוגיים ולכן עשויים לשנות את ההשפעות הפנוטיפיות של מוטציות גנטיות ספציפיות20.

Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Protein 9 (CRISPR/Cas9) יושם רבות בדרוזופילה לפעולות שינוי גנומי שונות כגון הוצאה ספציפית למקום, מחיקה, החלפה והכנסת תגיות, ומדגים את יעילותו ואמינותו 21,22,23. ההתקדמות האחרונה מצביעה על כך שעורכי בסיסים שמקורם ב-CRISPR יכולים לשמש גם לשינויים מדויקים יותר בבסיס ספציפי לאתר בדרוזופילה, ומספקים כלי חדש למוטציות נקודתיות ולבקרה פנוטיפית מדויקת24. שיטות מוטגנזה מסורתיות, כולל מוטגנזה כימית וקרינתית וכן מסכים המתווכים על ידי טרנספוזונים, יכולות ליצור מוטציות גנטיות25. גישות אלו מוגבלות לעיתים קרובות על ידי יעילות נמוכה ואקראיות גבוהה באירועי המוטציה. כתוצאה מכך, החוקרים חייבים לסנן מספר רב של פרטים כדי לבודד אללים ספציפייםשמעניינים 26. CRISPR/Cas9 מאפשר חיתוך מונחה RNA מתוכנת (gRNA) ברצפי DNA מסוימים. ההפסקות הכפולות המתקבלות מתוקנות באמצעות חיבור קצוות לא הומולוגי או תיקון מונחה הומולוגיה, מה שיוצר מוטציות מוגדרות ותורשתיות ומפחית משמעותית מוטציות רקע שעלולות לבלבל את הניתוח הפנוטיפי27,28. אללים מוטנטיים הנוצרים באמצעות CRISPR/Cas9 יכולים להישמר במצב הטרוזיגוטי על ידי קישור לכרומוזומים מאזנים, כגון Curly O (CyO)29. אסטרטגיה זו הוכחה כמונעת ביעילות אובדן אללים קטלניים בצורה הומוזיגוטית בגנטיקה של דרוזופילה. כתוצאה מכך, היא תומכת בהערכה פנוטיפית ארוכת טווח ושיטתית, כולל מחקרים פונקציונליים בטמפרטורות או תנאי סביבה משתנים29,30. העיצוב הפשוט והיעילות הגבוהה של CRISPR/Cas9 קיצרו משמעותית את מחזור בניית הזנים והעלו את יציבות הרקע הגנטי. זה חשוב במיוחד לחקר גורמים סביבתיים ארוכי טווח כגון תגובת טמפרטורה והומאוסטזיס התפתחותי.

בהתבסס על יסוד זה, גן Ent2 בדרוזופילה מלנוגסטר הוצא באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, והוקם זן מוטנטי הטרוזיגוטי של Ent2*/CyO שקיבל באופן יציב. מחזור ההתפתחות, משקל הגוף, יכולת התנועה והפעילות של האנזימים נוגדי החמצון SOD ו-CAT הוערכו באופן שיטתי. על ידי השוואת פנוטיפים רב-ממדיים של w1118 וזבובים מוטנטיים בתנאי טמפרטורה משתנים, מחקר זה שואף להציג אסטרטגיה שחזרה ליצירת ושימור קווים מוטנטיים שמקורם ב-CRISPR ולספק תיאור תיאורי של הפנוטיפים המתקבלים. עבודה זו מציעה מסגרת מתודולוגית ומשאב גנטי שימושי למחקרים עתידיים החוקרים גנים המעורבים במטבוליזם ובתגובות סביבתיות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עיצוב מטרות CRISPR/Cas9 לגן Ent2

  1. בחרו אתרי CRISPR מועמדים באקסונים 2 ו-5 של Ent2 (מזהה FlyBase: FBgn0263916) באמצעות CHOPCHOP (v3)31 ו-CCTop (v1.0)32.
  2. הגנום הייחוס הוגדר כ-Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (גישת RefSeq: GCF_000001215.4). לאחר מכן זוהו אתרי gRNA מועמדים. לבסוף, האתרים שזוהו סיננו כדי לקבל את ה-gRNA המיטביים.
  3. סיננו מטרות לפי ציון ספציפיות של MIT ≥ 80 (CHOP), ציון CFD ≤ 0.1 (CCTop), תוכן GC 40%–60%, ומרחק PAM מינימלי.
  4. דרגו מטרות עם ציון משוקלל (יעילות 50%, ספציפיות 30%, אופטימיזציה של GC 20%) ובחרו שני gRNA.
  5. מוסיפים "G" אחד לקצה 5′ של כל gRNA כדי לעמוד בדרישת המקדם T7. השתמש באוליגונוקלאוטידים הקדמיים הספציפיים ל-gRNA הבאים ליצירת תבנית השעתוק המלאה של sgRNA באמצעות PCR:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. רצף הפיגום הנותר של sgRNA מסופק על ידי האוליגונוקלאוטיד ההפוך האוניברסלי במהלך PCR.

2. הכנת תבניות תעתיק sgRNA

  1. הכנת תבניות שעתוק sgRNA
    1. הרכיבו תערובת תגובה PCR של 60 מיקרוליטר באמצעות שיטת חישול כפול-אוליגונוקלאוטיד–PCR33 לפי הוראות היצרן. משלבים את האוליגונוקלאוטיד הקדמי הספציפי ל-gRNA (Ent2-sg1-F או Ent2-sg2-F) עם אוליגונוקלאוטיד הפוך אוניברסלי המקודד את הפיגום sgRNA לקבלת תבנית dsDNA מלאה לשעתוק במבחנה.
    2. תכנן את התרמחזור: 95 °C 3 דקות; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס 20 שניות; לאחר מכן 72°C 10 דקות; להחזיק ב-12 מעלות צלזיוס.
  2. טיהור תבנית התמלול
    1. הוספת 100 מיקרוליטר אצטט אמוניום (ראו טבלת חומרים) למוצר PCR של 60 מיקרוליטר; ערבב. הוסף 400 מיקרוליטר אתנול חסר מים; הפוך לערבוב ודגרה בטמפרטורה של -20°C למשך 20 דקות.
    2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 20,000 x גרם למשך 15 דקות; להשליך סופרנטנט.
    3. ייבשו את הכדור באוויר כשהצינור פתוח למשך 10 דקות. החזירו את הכדור לתלות ב-10 מיקרוליטר ddH₂o ללא נוקלאז.
  3. שעתוק במבחנה של gRNA
    1. הקם תגובת שעתוק במבחנה של 10 מיקרוליטר T7 בהתאם להוראות הערכה (ראו טבלת חומרים).
    2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות. הוסיפו 0.5 מיקרוליטר DNase I (המסופק בערכת השעתוק) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. Purify gRNA
    1. דיללו את תערובת השעתוק ל-60 מיקרוליטר עם ddH₂O ללא נוקלאז. הוסיפו 60 מיקרוליטר פנול/כלורופורם רווי במים (ראו טבלת חומרים); מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 16,000 x g למשך 5 דקות.
    2. העבר 45 מיקרוליטר מהפאזה המימית לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל ללא RNase. הוסף 5 מיקרוליטר נתרן אצטט; מיקס.
    3. הוסיפו 125 מיקרוליטר אתנול ללא מים מקורר מראש; מערבבים ודגרו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 20–30 דקות. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 20,000 x גרם למשך 15 דקות; להשליך סופרנטנט.
    4. שטוף את הכדור עם 200 מיקרוליטר של 70% אתנול (ללא RNase); צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 20,000 x גרם למשך 5 דקות; הסר את הסופרנטנט.
    5. ייבשו את הכדור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהאתנול מתאדה לחלוטין. להחזיר תלות ב-20 מיקרוליטר ddH₂O; העלות ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    6. מדוד את ריכוז ה-gRNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop וכיוון את הריכוז ל-250 ng/μL להזרקה. להבטיח את טוהר ה-gRNA עם יחס A260/A280 של כ-2.0.
      הערה: אנו מדגישים כי יש ללבוש כפפות לאורך כל התהליך להגנה מפני RNase. כל הצרכנים, כולל צינורות צנטריפוגה מקוררים מראש ללא RNase וקצות פיפטה, חייבים להיות בשימוש עקבי במהלך ההליך. פסולת תגובת אורגנית הנוצרת במהלך הפעולה חייבת להיאסף בנפרד במיכלי פסולת ייעודיים לפי סוג, ולהובל באופן קבוע למתקן סילוק פסולת מסוכנת מוסמך לטיפול נכון.

3. הכנת ה-mRNA של Cas9

  1. הכנת תבנית התמלול
    הערה: השתמש בקצוות ובצינורות ללא RNase לאורך כל השלבים הקשורים ל-RNA.
    1. הפשיר את MLM3613 הפלסמיד הביטוי Cas9 (ראו טבלת חומרים) על הקרח. בצינור ללא RNase, יש לשלב DNA פלסמיד של 20 מיקרוגרם, בופר הגבלה של 7.5 מיקרוליטר 10x, 1 מיקרוליטר PmeI (10,000 U/mL), ו-ddH₂O ללא נוקלאז ל-75 מיקרוליטר.
    2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בדוק את הליניאריזציה המלאה על ידי טעינת 5 מיקרוליטר על ג'ל אגרוז 1% ב-120 וולט למשך 30 דקות.
  2. טיהור תבניות השעתוק
    1. הוסף 23 מיקרוליטר נתרן דודציל סולפט (SDS, ראו טבלת חומרים לפרטים) ו-0.5 מיקרוליטר פרוטנאאז K (ראו טבלת חומרים לפרטים) ל-70 מיקרו-ליטר של העיכול; דגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. הוסף 45 מיקרוליטר כלורופורם ו-45 מיקרוליטר פנול רווי טריס; מערבולת לרגע; צנטריפוגה 13,800 x G, 5 דקות.
    3. העבר פאזה מימית של 90 מיקרוליטר לצינור חדש. הוסף 10 מיקרוליטר נתרן אצטט (המסופק על ידי הערכה) ו-200 מיקרוליטר אתנול אנהידרוסי מקורר מראש; מיקס; דגירה בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס, 30 דקות.
    4. צנטריפוגה 20,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, 15 דקות; להשליך סופרנטנט. שטוף את הכדור פעמיים עם 100 מיקרוליטר 70% אתנול; צנטריפוגה 20,000 x גרם, 2 דקות כל אחת; יבש באוויר.
    5. המיס DNA ב-20 מיקרוליטר ddH₂O, ללא נוקלאז; אשר >500 ng/μL.
  3. תמלול חוץ-גופי עם קו-קאפינג
    1. הגדר את התגובה באמצעות ערכת שעתוק במבחנה T7 עם כיסוי (ראו טבלת חומרים) לפי הוראות היצרן.
    2. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ליצירת mRNA מסוג Cas9 מוגבל.
    3. לאחר סיום תגובת השעתוק, הוסף 1 מיקרוליטר DNase (המסופק בערכה, בריכוז 2 U/μL), ערבב היטב ודגר בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות כדי לפרוק את תבנית ה-DNA.
  4. הוספת זנב פולי(A)
    1. הביאו את ה-RNA ל-14 מיקרוליטר ddH₂O.
    2. הוסף 2 מיקרוליטר 10x E. coli Poly(A) פולימראז, 2 מיקרוליטר ATP (10 mM), מעכב 1 מיקרוליטר RNase ו-1 מיקרוליטר פולי(A) פולימראז.
    3. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  5. לטהר את ה-mRNA
    1. החלו את התגובה על ערכת RNA כוללת בעמודת ספין (ראו טבלת חומרים). טעין את הדגימה על עמוד ספין ממברנת סיליקה בגודל 2 מ"ל; צנטריפוגה 8,000 x G, 15 שניות; זריקת זרימה דרך הדרך.
    2. הוסף 500 מיקרוליטר של בופר RPE לעמוד RNeasy, צנטריפוגה ב-8000 x g למשך 15 שניות, והשליך את הנוזל שנותר. חזור על השלב הזה פעם אחת, ואז צנטריפוגה במשך 2 דקות והשליך את הנוזל שנותר.
    3. הניחו את עמודת RNeasy בצינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. הוסיפו 30 מיקרוליטר ddH₂O, צנטריפוגה ללא RNase, בעוצמה 8000 x g למשך דקה אחת כדי להוציא את ה-RNA. כוון את ריכוז ה-mRNA ל-500 ng/μL לצורך הזרקה. אחסן את ה-RNA המשוחרר בטמפרטורה של -80°C.

4. הזרקת מיקרו לעוברי דרוזופילה

  1. הכנת דגימות הזרקה
    1. מערבבים 15 מיקרוגרם mRNA של Cas9 עם 7.5 מיקרוגרם gRNA דו-גדילי ביחס נפח של 2:1.
    2. כוונן ל-30 מיקרוליטר עם מים ללא RNase מטופלים ב-DEPC; תשמור על הקרח.
  2. גידול דרוזופילה
    1. העבר את זן דרוזופילה שהוזרק עם1118 לצינורות מזון גדולים לצורך הגברה. זבובי W1118 שימשו כבקרת ייחוס לייצוג המצב הפיזיולוגי הבסיסי ללא השפעות הקשורות למאזן.
    2. שמרו את הזבובים בתא אקלים מלאכותי בטמפרטורה של 25°C עם לחות של 60%–70% ומחזור בהיר-חושך של 12:12 למשך 14 ימים.
    3. בשעה 17:00 ביום שלאחר תקופת הגידול בת 14 הימים (יום 15), אספו זבובים בוגרים לסנכרון הטלת עוברים בזמן. זמן האיסוף הספציפי הזה מבטיח שהעוברים המשמשים להזרקה נמצאים בשלב התפתחותי עקבי. שליטה בשעת היום חשובה למזעור השפעות הקצב הצירקדי על התפתחות העובר והתנהגות הרבייה, ובכך להבטיח שחזוריות ניסויית ולהפחית שונות פיזיולוגית בין קבוצות.
  3. מיקרוהזרקה לדרוזופילה
    1. אסוף זבובים בוגרים להזרקה לכלובי זבובים, עם כ-400 בוגרים בכל כלוב. לאסוף עוברים על לוחות אגר מצופים שמרים; אספו עוברים בתוך 60 דקות מהטלת הביצים ושוטפים אותם על כיסויי כיסוי. לא בוצעה דכוריון לפני ההזרקה.
    2. יישר את העוברים על כיסויי כיסוי כאשר העמודים האחוריים שלהם פונים החוצה, מסודרים בצורה מסודרת מלמעלה למטה. ודאו שמחט ההזרקה חודרת לקוטב האחורי לעומק מתאים (כשליש מאורך העובר) לצורך משלוח ציטופלזמי עקבי. בסך הכול נעשה שימוש ב-300 עוברים במחקר זה.
    3. מתחת למיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ, למקד את קצה המחט והעובר באותו מישור.
    4. באמצעות מכשיר ההזרקה, נקב את הקוטב האחורי והזריק 0.001 מיקרוליטר מהתערובת לכל עובר.
    5. העברת עוברים שהוזרקו לבקבוקי מזון; דגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, ~70% לחות יחסית (RH) כדי להשיג יצירת P₀ (הבוגרים שהוזרקו ששרדו להוליד צאצאים).

5. בניית זני ביטוי יציבים בדרוזופילה

  1. הצלב P₀ סגור עם זבובי Bc/CyO .
    1. הזרקת מיקרו תערובת של gRNA המיועדת לגן המעניין וחלבון Cas9 ל-300 עוברים בזן W1118 Drosophila . לאחר ההזרקה, יש להשיג סך של 30 בוגרים פוריים ובריאים מסוג P0. הצלבו כל בוגר P0 (פסיפס) בנפרד עם זבובים מזן w1118 , ומניבים 16 הכלאות זוגיות (8 בקבוקונים עם זכרים P0 שהוצלאו לנקבות בתוליות ו-8 בקבוקים עם נקבות P0 עם זכרים). לשמור על כל הצלבים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בתנאי תרבית קבועים.
    2. לאחר הופעת זחלי F1, יש להסיר את זבובי ההורים P0. להוציא DNA גנומי מצאצאי F1 ולעבור ניתוח PCR כדי לקבוע את הגנוטיפים הבוגרים של F1 (Ent2/+).
    3. לייצר צאצאי F2 על ידי הכלאות בודדות בין זבובי Bc/CyO . בחר בוגרים בודדים מ-F2 וגנוטיפ אותם כדי לזהות זבובים עם הגנוטיפ של Ent2/CyO .
    4. Intercross F3 טס (Ent2/CyO) כדי להעריך את נוכחותם של מוטנטים הומוזיגוטיים. אם לא נמצאו זבובים הומוזיגוטיים, זבובי Ent2/CyO משולבים לדור נוסף כדי לקבוע עוד אם הגנוטיפ ההומוזיגוטי קטלני.
  2. חילוץ DNA גנומי של דרוזופילה
    1. אסוף זבובים בוגרים אחד או שניים לתוך צינור EP בנפח 1.5 מ"ל והוסף 110 מיקרוליטר של Plant DNA Extraction Buffer PA.
    2. הומוגניזציה יסודית של דגימות באמצעות מטחנת רקמות למשך לפחות 3 דקות.
    3. דגרו את ההומוגנטים באמבט מתכת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך לא פחות מ-30 דקות.
    4. הוסיפו 100 מיקרוליטר כלורופורם, הפכו בעדינות את התערובת לערבוב, ומערבלים במשך 10 שניות. צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. העבר בזהירות כ-65 מיקרוליטר (או יותר) מהסופרנטנט לצינור חדש, הוסיף שני נפחים של אתנול אבסולוטי מקורר מראש (דגור מראש ב-4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 10 דקות), הפוך בעדינות לערבוב, ודגר בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 15 דקות.
    6. דגימות צנטריפוגות במהירות 14,000 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו בזהירות את הסופרנאנט.
    7. ייבשו באוויר את כדור ה-DNA בטמפרטורת החדר או באינקובטור עד שייבשו לחלוטין, ואז החזירו את הכדור בנפח מתאים של בופר PB. לדגימות נקבות (נקבה), הוסף 50 מיקרוליטר של בופר PB, בעוד שלדגימות זכריות (מ) הוסף 15 מיקרוליטר.
  3. הגברת PCR וריצוף סנגר
    1. בצע הגברה של PCR באמצעות פריימרים ספציפיים שנועדו למקף את האזורים העליונים והתחתונים של אתר היעד של gRNA.
    2. טהרו את מוצרי ה-PCR וחשפו אותם לריצוף סנגר. לנתח את כרומטוגרמות הריצוף באמצעות תוכנת SnapGene34 וליישר את רצף הייחוס מסוג פראי לניתוח השוואתי.
    3. בדקו את גרפים השיא ליד אתר היעד של gRNA לפסגות חופפות המעידות על מוטציות אינדל. לבצע פיצול שיא כדי לפתור אותות מעורבים ולאשר את סוג המוטציה, כולל הוספות או מחיקות באתר היעד.
    4. חזרה לזכרים עם BC/CyO במשך 4 דורות כדי לבסס את Ent2/CyO.
      הערה: נצפה כי Ent2*/Ent2* ו-CyO/CyO קטלניים בשלבים מוקדמים של ההתפתחות; לכן, הטרוזיגוטים של Ent2*/CyO נשמרים.
  4. לאחר הקמת ההטרוזיגוטים של Ent2*/CyO , אספו דגימות מאותה אצווה של הטרוזיגוטים של Ent2*/CyO תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  5. בחר באקראי 20 זבובים בוגרים, ושוקל אותם באמצעות איזון מדויק ברזולוציה של 0.001 גרם. צלם את הדגימות כדי לתעד את המאפיינים הפנוטיפיים.

6. אפיון פנוטיפי תיאורי

  1. מאחור 120 זכרים ו-120 נקבות (בדקו שלושה בקבוקונים לכל קבוצה, כאשר כל בקבוקון מכיל 20 זבובים) כל אחד מ-Ent2*/CyO ו-W 1118 בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-25 מעלות צלזיוס.
  2. תעד את מספר המתים שבועית ותשרטט את עקומות ההישרדות.
  3. הקמת 30 זוגות הזדווגות אקראיים בכל קבוצה; אפשר הזדווגות 24 שעות;
  4. להעביר את הבוגרים לצינורות טריים; צאצאים מגדלים.
  5. ב-7 ימים לאחר ההסרה, העריכו את הצלחת הטיפוס (≥8 ס"מ בתוך 30 שניות) עם שישה שכפולים בכל קבוצה.
  6. כל התצפיות נרשמו כמאפיינים תיאוריים של קו המוטנטי ולא שימשו להסקת תפקוד הגן.

7. למדוד פעילות אנזימי נוגדי חמצון

  1. אספו 300 זכרים ו-300 נקבות בוגרות (בדקו שלושה בקבוקונים לכל קבוצה, כאשר כל בקבוקון מכיל 100 זבובים) Ent2*/CyO ו-w 1118 זבובי ביקורת ב-5 ימים לאחר האקלוזיה כדי להבטיח בגרות פיזיולוגית וגיל דומה.
  2. להעביר זבובים לצינורות ריקים ללא אוכל ולהתרעב במשך שעתיים כדי לתקן את מצב המטבוליזם לפני בדיקות ביוכימיות.
  3. הוסף חרוז/צינור פלדה אחד; הומוגניזציה ב-60 הרץ, 2 דקות.
  4. צנטריפוגה 4°C, 161 x g, 10 דקות; אסוף את הסופרנטנט.
  5. מדדו את כל הסופר-אוקסיד דיסמוטאז (SOD, ראו טבלת חומרים לפרטים) וקטלז (CAT, ראו טבלת החומרים ) לפי הוראות הערכה.

8. סטטיסטיקות וניתוח נתונים

  1. מבטאים את כל הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (figure-protocol-1± SEM).
  2. השתמש ב-ANOVA חד-כיווני להשוואת נתוני פעילות אנזימים; הפעילו ANOVA תלת-כיווני (גורמים: גנוטיפ, טמפרטורה, מין) עבור משקל גוף, יכולת טיפוס ואורך גוף. בצע את בדיקת ה-HSD הפוסט-הוק של טוקי כשזה מתאים35.
  3. הגדר מובהקות כ-P < 0.05 בכל המבחנים הסטטיסטיים.
  4. לנתח נתוני תוחלת חיים באמצעות עקומות הישרדות ולבצע את מבחן ה-log-rank (Mantel-Cox), שמעריך האם קיימים הבדלים משמעותיים במסלולי ההישרדות בין קבוצות ניסוי36.
  5. בצע את כל הניתוחים והגרפים בתוכנת GraphPad Prism 9.5.0 בהתאם להנחיות התוכנה37.
  6. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו רק להשוואה תיאורית ולא כדי לקבוע קשרים סיבתיים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכנון וניתוח אימות יעילות של אתרי מיקוד בגנים Ent2
אתרי יעד מועמדים לגן Ent2 תוכננו באמצעות פלטפורמות CHOPCHOP ו-CCTop (איור 1). שני gRNA המיונים לאזורי אקסון 2 ואקסון 5 נבחרו על פי קריטריוני ספציפיות ויעילות. כדי לאמת עריכת גנום מוצלחת, DNA גנומי של פרטים שנבחרו באקראי מקו Ent2*/CyO המוכר הוגבר ונחשף לריצוף סנגר. כרומטוגרמות ריצוף הראה שיאים חופפים שמתחילים בקרבת אתר היעד, בהתאם למוטציות של הכנסה/מחיקה (indel). ניתוח רצף נוסף חשף מוטציות בהזזת מסגרת שהובילו לקודוני עצירה מוקדמים (איור 2). תוצאות אלו מאשרות שמערכת CRISPR/Cas9 הצליחה להכניס מוטציות באתר Ent2 המיועד ומדגימות את היתכנות תהליך עריכת הגנום.

figure-results-1
איור 1. הדיאגרמה הסכמטית של אתר ההדחפה של גן Ent2 ומיקום פריימר הגילוי בגנום. סכמטיקה זו ממחישה את המבנה הגנומי של לוקוס Ent2, ומדגיש את קודוני CDS (ירוק), קודוני התחלה ועצירה (אדום), מוטיב PAM של gRNA (אפור), רצף יעד gRNA (כחול) ורצף פריימר הגברת gRNA (צהוב). אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2. גרף השיא של תוצאות הרצף של צאצאי דרוזופילה של Ent2*/CyO, שהתרבה בעצמם בקו יציב. כרומטוגרמת ריצוף המאשרת את הגנוטיפ של הצאצאים שהושגו מהכלאה עצמית של קו ההטרוזיגוטי היציב Ent2*/CyO . אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תצפיות מורפולוגיות תיאוריות של קו Ent2/CyO
הבחינו בהבדלים בצורת הגוף בין שני הגנוטיפים של זבובי פירות בין מגדרים מתחת ל-22°C ו-25°C באמצעות סטריאומיקרוסקופ (איור 3). בשני תנאי הטמפרטורה, גם זבובי הפירות הזכרים וגם הנקבות הציגו צורת גוף טיפוסית של "ציר ארוך". הבטן הנקבית הייתה רחבה ובצורת ציר, עם קצות כנפיים שהתרחבו מעט מעבר לקצה הבטן. המפגש בין החזה לבטן אצל זכרים היה מוגדר בבירור, והפיגמנטציה הכהה בקצה הבטן — תכונה מובחנת של זכרים — הייתה נראית. הכנפיים של זבובי w1118 משני המינים היו שקופים עם ורידים מוגדרים בבירור, ולא נצפו עקמומיות בקצה הכנף או שבירת ורידים. לעומת זאת, הטרוזיגוטים של Ent2*/CyO הראו כיפוף בסיס כנף ועקמומיות בולטת בקצוות הכנף. בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, ללא קשר למגדר, אורך הגוף של זבובי הפירות היה גדול משמעותית מזה של אותו גנוטיפ בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. בנוסף, אורך הגוף של הנשים היה גדול משמעותית מזה של גברים באותה טמפרטורה. יתרה מזאת, גם בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס וגם 25 מעלות צלזיוס, גודל הגוף של ההטרוזיגוטים של Ent2*/CyO היה קטן יותר מזה של זבובי w1118 המקבילים. כדי לחקור את הבסיס המורפולוגי, מדדנו בו-זמנית את אורך גוף הזבובים (איור 3E, טבלה 1). ANOVA תלת-כיווני חשף השפעות עיקריות משמעותיות של גנוטיפ (F(1,16)=230.1, P<0.0001), טמפרטורה (F(1,16)=19.50, P=0.0004), ומין (F(1,16)=166.9, P<0.0001). נצפו גם אינטראקציה משמעותית בין גנוטיפ x מין (F(1,16)=14.96, P=0.0014) ואינטראקציה תלת-כיוונית משמעותית בין גנוטיפ x טמפרטורה x מין (F(1,16)=6.231, P=0.0239).

figure-results-3
איור 3. מורפולוגיית הביקורת של מבוגרים w1118 ו-Ent2*/CyO . תמונות מייצגות המציגות מאפייני יציבה של דרוזופילה נקבית (A, C) וזכרית (B, D) בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-25 מעלות צלזיוס, יחד עם השוואה כמותית של אורך הגוף (E). ** עמוד < 0.01. פס קנה מידה: 1 מ"מ. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

ניתוח הישרדות בתנאי טמפרטורה שונים
ניתחנו סטטיסטית את עקומות ההישרדות של הטרוזיגוטים של Ent2*/CyO ושל זבובי w1118 בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-25 מעלות צלזיוס (איור 4). התוצאות הראו כי עקומת ההישרדות של נקבות הטרוזיגוטיות מסוג Ent2*/CyO הייתה הגבוהה ביותר, כאשר שני פרטים נותרו בחיים בשבוע ה-14. כל 1118 הנשים מתו עד השבוע ה-14. כל הזכרים ההטרוזיגוטים של Ent2*/CyO מתו עד השבוע ה-12, בעוד שכל הגבריםעם 1118 מתו בשבוע ה-11. ממצאים אלו מצביעים על כך שבטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, תוחלת החיים הכוללת של הנקבות ארוכה מזו של זכרים, ובאותו מין, יכולת ההישרדות של הטרוזיגוטים מסוג Ent2*/CyO מעט חזקה יותר מזו של סוג w1118.

בתנאים של 25 מעלות צלזיוס, תקופת ההישרדות הכוללת התקצרה משמעותית. עקומות ההישרדות של w 1118 נקבות ושל זכרים הטרוזיגוטים מ-Ent2*/CyO ירדו לאפס עד השבוע העשירי. עקומות ההישרדות של נקבות הטרוזיגוטיות מסוג Ent2*/CyO ושל1118 זכרים w ירדו ל-1–2 פרטים בשבוע השמיני והגיעו לאפס בשבוע התשיעי. ההבדל בין המוטנט ל-w1118 לא היה מובהק סטטיסטית (P > 0.05). תצפיות אלו מתארות את מאפייני ההישרדות של קו המוטנטים בתנאי סביבה שונים.

figure-results-4
איור 4. עקומות הישרדות של דרוזופילה בתנאי טמפרטורה שונים. ניתוח הישרדות המשווה את תוחלת החיים של Ent2*/CyO ו-w1118 טסים ב-22 מעלות צלזיוס ו-25 מעלות צלזיוס. n=3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הערכת פעילות מוטורית
יכולות הטיפוס של זבובי הפירות w1118 ו-Ent2*/CyO הושוו בשני תנאי טמפרטורה: 22°C ו-25°C (איור 5, טבלה 2). התוצאות מראות שבטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס (איור 5A), 98.15% מתוך נשים עם W 1118 טיפסו בהצלחה יותר מ-8 ס"מ בתוך 30 שניות, בעוד שאחוז זה ירד ל-89.74% בנשים הטרוזיגוטיות של Ent2*/CyO (P < 0.05). כל הזכריםw 1118 הצליחו לטפס יותר מ-8 ס"מ, בעוד ששיעור ההצלחה בטיפוס בזכרים הטרוזיגוטיים מסוג Ent2*/CyO היה 98.14% (P < 0.05). בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (איור 5B), כל 1118 הנקבות (100%) טיפסו יותר מ-8 ס"מ בתוך 30 שניות, אך שיעור זה ירד ל-91.31% בנקבות הטרוזיגוטיות מסוג Ent2*/CyO (P < 0.05). מבין w 1118 גברים, 77.28% טיפסו בהצלחה מעל 8 ס"מ (P < 0.01), בעוד שרק 63.57% מהזכרים ההטרוזיגוטים Ent2*/CyO השיגו זאת (P < 0.01). כדי להעריך את ביצועי המנוע המנועים יותר, נותח שיעור הזבובים שטיפסו מעל 15 ס"מ (איור 5C). אנובה תלת-כיוונית חשפה השפעות עיקריות משמעותיות מאוד של מין (F(1,16) = 201.7, P < 0.0001) וטמפרטורת גידול (F(1,16) = 72.60, P < 0.0001) על ביצועי הטיפוס. עם זאת, ההשפעה העיקרית של הגנוטיפ לא הייתה מובהקת (F(1,16) = 0.59, P = 0.4545). תוצאות אלו מצביעות על כך שביצועי המנוע משתנים בהתאם לתנאי הניסוי ועשויים להשתנות בין קבוצות בהתאם להקשר.

figure-results-5
איור 5. השוואת יכולת הטיפוס של דרוזופילה בטמפרטורות שונות. כימות ביצועי הטיפוס ב-22 °C (A) ו-25 °C (B) וסטטיסטיקות לפרטים עם מרחק טיפוס > 15 ס"מ (C). ** P < 0.01. n=3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מדידת משקל גוף
משקל הגוף נמדד בזבובי הפירות ההטרוזיגוטיים w1118 ו-Ent2*/CyO בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-25 מעלות צלזיוס (איור 6). התוצאות שלנו מראות שבהשוואה ל-w 1118 זבובים, משקל ההטרוזיגוטים של Ent2*/CyO ירד באופן משמעותי הן ב-22 °C והן ב-25 מעלות צלזיוס (P < 0.05 או P < 0.01). שמנו לב שמשקל הזכרים עם1118 זבובים היה נמוך משמעותית מזה של נקבות עם1118 זבובים (P < 0.01). באופן דומה, משקל ההטרוזיגוטים הזכרים מסוג Ent2*/CyO היה נמוך משמעותית מזה של הטרוזיגוטים של נקבות Ent2*/CyO (P < 0.01). ביצענו אנובה תלת-כיוונית להערכת ההשפעות העצמאיות והאינטראקטיביות של גנוטיפ, טמפרטורת גידול ומין על משקל הגוף בדרוזופילה. הניתוח הראה השפעות עיקריות משמעותיות של הגנוטיפ (F(1,16) = 32.38, P < 0.0001), טמפרטורה (F(1,16) = 23.31, P = 0.0002), ומין (F(1,16) = 25.52, P = 0.0001) (איור 6; טבלה 3). בנוסף, הייתה אינטראקציה דו-כיוונית משמעותית בין טמפרטורה למין (F(1,16) = 24.76, P = 0.0001), מה שמעיד שהשפעת הטמפרטורה על משקל הגוף שונה לפי מין. עם זאת, לא נמצאו אינטראקציות משמעותיות בין הגנוטיפ לטמפרטורה (F(1,16) = 0.40, P = 0.538), הגנוטיפ והמין (F(1,16) = 1.31, P = 0.269), או האינטראקציה התלת-כיוונית (גנוטיפ x טמפרטורה x מין: F(1,16) = 0.48, P = 0.497), מה שמרמז כי תגובת מוטנטים של Ent2*/CyO לטמפרטורה ולמין הייתה דומה לזו של הסוג הפראי.

בהינתן הטמפרטורה המשמעותית × אינטראקציה מין, ביצענו ניתוח השפעות פשוט כדי להבהיר את הדפוס הספציפי שלה. התוצאות הראו כי אצל נקבות זבובים, אנשים שגודלו בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס היו בעלי משקל גוף גבוה משמעותית לעומת אלו שגודלו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (P = 0.0012); עם זאת, אצל גברים לא היה הבדל משמעותי במשקל הגוף בין שתי הטמפרטורות (P > 0.9999). דבר זה מצביע על כך שהורדת הטמפרטורה מ-25–22 מעלות צלזיוס העלתה במיוחד את משקל הגוף של נקבות הזבובים, אך ללא השפעה משמעותית על זכרים.

למרות שלא היו אינטראקציות משמעותיות בין הגנוטיפ לגורמים אחרים, ההשפעה העיקרית החזקה של הגנוטיפ הצביעה על כך שלמוטנטים של Ent2*/CyO היו משקל גוף נמוך יותר בכל התנאים בהשוואה לסוג פראי. השוואות לאחר מכן חשפו כי בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, נקבות מסוג בר (נשים עם1118:22 מעלות צלזיוס) היו בעלות משקל גוף גבוה משמעותית מכל קבוצות המוטנטים (P < 0.0001), ובאותה טמפרטורה, שני הגנוטיפים הראו דו-צורתיות מינית משמעותית (נקבות > זכרים, P < 0.01). בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, ההבדל במשקל הגוף בין סוג הבר למוטנטים הראה מגמה דומה אך לא הגיע למובהה סטטיסטית. ממצאים אלה מתארים את מאפייני משקל הגוף של קו המוטנטים בתנאים סביבתיים וביולוגיים שונים.

figure-results-6
איור 6. השוואת משקל הגוף בדרוזופילה בטמפרטורות שונות. מדידות משקל גוף ב-22 מעלות צלזיוס ו-25 מעלות צלזיוס. ננושות > 0.05 , * < 0.05, ** < 0.01. n=3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פעילות אנזימי נוגדי חמצון
פעילות האנזימים נוגדי החמצון של w1118 ו-Ent2*/CyO הטרוזיגוטית דרוזופילה הושוו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (איור 7). התוצאות שלנו הראו שבהשוואה לזבובי w 1118, גם זכרים וגם נקבות של הטרוזיגוטים מסוג Ent2*/CyO הראו ירידה משמעותית בפעילות קטלז (CAT) וסופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) (P < 0.01). מצאנו גם שפעילות CAT ו-SOD ב-w 1118 זבובים זכרים היו גבוהות משמעותית מאלו של w 1118 נקבות (P < 0.05 או P < 0.01). באופן דומה, פעילות האנזימים של נוגדי חמצון בזכרים הטרוזיגוטים מסוג Ent2*/CyO הייתה גבוהה משמעותית מזו של נקבות הטרוזיגוטיות מסוג Ent2*/CyO (P < 0.01).

figure-results-7
איור 7. השוואת קיבולת נוגדי החמצון של דרוזופילה בטמפרטורת האכלה אופטימלית. בדיקות פעילות אנזימטיות מראות פעילות CAT (A) ו-SOD (B) בזבובי Ent2/CyO בהשוואה ל-w1118 זבובים. * P < 0.05, ** P < 0.01. n=3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

SSDFMSF (DFn, DFd)ערך P
גנוטיפ0.802610.8026F (1, 16) = 230.1P<0.0001
טמפרטורה0.0680310.06803F (1, 16) = 19.50P=0.0004
מגדר0.582210.5822F (1, 16) = 166.9P<0.0001
גנוטיפ x טמפרטורה0.00579810.005798F (1, 16) = 1.662P=0.2156
גנוטיפ x מין0.0521810.05218F (1, 16) = 14.96P=0.0014
טמפרטורה x מין0.0132310.01323F (1, 16) = 3.793P=0.0692
גנוטיפ x טמפרטורה x מין0.0217310.02173F (1, 16) = 6.231P=0.0239
שארית0.05581160.003488

טבלה 1: ניתוח שונות של מדידות אורך גוף בדרוזופילה.

טבלת ANOVASSDFMSF (DFn, DFd)ערך P
מגדר0.148310.1483F (1, 16) = 201.7P<0.0001
גנוטיפ0.000431910.0004319F (1, 16) = 0.5877P=0.4545
טמפרטורה0.0533610.05336F (1, 16) = 72.60P<0.0001
מגדר x גנוטיפ0.0141810.01418F (1, 16) = 19.30P=0.0005
מגדר x טמפרטורה0.00713410.007134F (1, 16) = 9.708P=0.0067
גנוטיפ x טמפרטורה0.013510.0135F (1, 16) = 18.37P=0.0006
מגדר x גנוטיפ x טמפרטורה0.00590310.005903F (1, 16) = 8.032P=0.0120
שארית0.01176160.0007349

טבלה 2: ניתוח שונות של יכולת טיפוס (> 15 ס"מ) בדרוזופילה.

SSDFMSF (DFn, DFd)ערך P
גנוטיפ4.363E-0714.363E-07F (1, 16) = 32.38P<0.0001
טמפרטורה3.141E-0713.141E-07F (1, 16) = 23.31P=0.0002
מגדר3.439E-0713.439E-07F (1, 16) = 25.52P=0.0001
גנוטיפ x טמפרטורה5.333E-0915.333E-09F (1, 16) = 0.3958P=0.5381
גנוטיפ x מין1.765E-0811.765E-08F (1, 16) = 1.310P=0.2692
טמפרטורה x מין3.336E-0713.336E-07F (1, 16) = 24.76P=0.0001
גנוטיפ x טמפרטורה x מין6.513E-0916.513E-09F (1, 16) = 0.4834P=0.4968
שארית2.156E-07161.347E-08

טבלה 3: ניתוח שונות של מדידות משקל גוף בדרוזופילה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ent הוא חלבון שמור אבולוציונית ומשפיע על מספר תהליכים ביולוגיים38. כאשר הוא מתבטא בביציות Xenopus laevis, Ent2 מציג פעילות הובלת נוקלאוזידים8. מחקרים הראו שהמוטנט ההומוזיגוטי של Ent2 קטלני במהלך שלב הזחל המאוחר או המוקדם של הגולם10. במחקר הנוכחי, הוקם תהליך עריכת גנום מבוסס CRISPR/Cas9 ליצירת אללים ממוקדי Ent2 בדרוזופילה מלנגסטר. הקטלניות הנצפית של מוטנטים הומוזיגוטיים במהלך הקמת הזן תואמת את הדיווחים הקודמים, ותומכת בתוקף אסטרטגיית עריכת הגנום. במסגרת זו, הקו ההטרוזיגוטי Ent2*/CyO שנוצר במחקר זה מספק מודל לתיעוד מאפיינים פנוטיפיים הקשורים לאובדן חלקי של Ent2. בתנאים הניסיוניים שנבדקו, נצפו הבדלים בגודל הגוף, משקל הגוף, פעילות תנועה ורמות אנזימי נוגדי חמצון בין זבובי Ent2*/CyO ל-w 1118 . תצפיות אלו מתארות את הפרופיל הפנוטיפי של קו המוטנטים הקיים.

מבחינת התפתחות וגודל גוף, פרטים הטרוזיגוטיים של Ent2*/CyO היו קטנים משמעותית מזבובי w1118 בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-25 מעלות צלזיוס. הבדל זה עשוי להיות מיוחס לירידה ביעילות ההובלה של נוקלאוזידים הנובעת מהיעדר גן Ent2, אשר בתורו משפיע על יציבות חילוף החומרים של האנרגיה וויסות האקדיזון. יתרה מזאת, ההשפעות השליליות הפכו לבולטות יותר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. מחקרים הראו כי תוחלת החיים של בעלי חיים מושפעת מקצב חילוף החומרים, מושג הידוע כתיאוריית קצב המטבוליזם19. ממצאי המחקר מצביעים על כך שקצב המטבוליזם הגבוה של זבובי הפירות בטמפרטורות גבוהות עשוי להיות קשור קשר הדוק לחסרים תזונתיים ולעיכובים בהתפתחות הנובעים מפגיעה במטבוליזם של נוקלאוזידים. עם זאת, בהתחשב בשימוש באלל יחיד שמקורו ב-CRISPR, יש לפרש ממצאים אלו כתצפיות תיאוריות ולא כהוכחה ישירה לתפקוד הגנים.

שונות תלויה בטמפרטורה הייתה גם ניכרת במספר קריאות פנוטיפיות. המוטנט מציג הארכת חיים מתונה בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, במיוחד אצל נקבות, ממצא התואם למחקרים קודמים39,40. לעומת זאת, ב-25 מעלות צלזיוס, הפרש תוחלת החיים פוחת או אפילו נעלם. כאורגניזמים פואיקילותרמיים, זבובי הפירות מציגים קצב חילוף חומרים גבוה יותר ולכן תוחלת חיים קצרה יותר בטמפרטורות גבוהותשל 41,42, דבר תואם את ממצאי המחקר הזה. בהקשר זה, הדפוסים הנצפים עשויים לשקף תגובות פיזיולוגיות כלליות לטמפרטורה.

הביצועים המוטוריים ופעילות האנזימים נוגדי החמצון השתנו גם הם בין גנוטיפים, מינים ותנאי טמפרטורה. נצפו ירידה בביצועי טיפוס ופעילות SOD ו-CAT נמוכה יותר בזבובי Ent2/CyO בתנאים מסוימים. מחקרים קודמים קישרו בין נשאי נוקלאוזידים למטבוליזם של NAD⁺, לתפקוד המיטוכונדריאלי ולוויסות לחץ חמצוני 17,43,44,45,46,47. בעוד שדיווחים אלו מספקים הקשר ביולוגי אפשרי, הנתונים הנוכחיים מוגבלים לאפיון פנוטיפי ואינם יוצרים קשרים מכניים בין Ent2 למסלולים אלו.

התוצאות שלנו מראות גם שבתנאים דומים, זבובי הפירות הזכרים בדרך כלל מפגינים פעילות אנזימטית נוגדי חמצון גבוהה יותר מזו נקבותזבובי פרי 39,48. משמעות הדבר היא שגורמים הקשורים למגדר עשויים לווסת את תגובת נוגדי החמצון דרך מסלולי איתות שונים. גורמי שעתוק הקשורים לתגובות נוגדי חמצון, כגון Nrf2/CncC והגנים המטרה שלהם במורד הזרם, מראים הבדלים בביטוי בין מגדרים שונים, ובכך משפיעים על קיבולת נוגדי החמצון הכוללת49. תצפית זו תואמת דיווחים על הבדלים מגדריים בעמידות ללחץ חמצוני ובהגנות נוגדי חמצון בדרוזופילה, שם הנקבות בדרך כלל שומרות על רמות ROS נמוכות יותר ופעילות אנזימי נוגדי חמצון בסיסית גבוהה יותר ביחס לגברים, מה שעשוי לתרום להבדלים בעמידות ללחץ ובאריכות ימים בין המינים50. תצפיות אלו מדגישות עוד יותר את החשיבות של התחשבות במשתנים ביולוגיים כמו מין בעת אפיון פנוטיפים מוטנטיים.

מבחינה מתודולוגית, מחקר זה מתאר תהליך עבודה שניתן לשחזור ליצירת ואימות מוטציות בתיווך CRISPR/Cas9 בדרוזופילה. תכנון ובחירה מדויקים של gRNA הם חיוניים, שכן gRNA יעילים קובעים את יעילות הפיצול הממוקד על ידי Cas9 וממזערים שינויים לא צפויים21,51. הזרקה מיקרו-מדויקת של רכיבי Cas9 ו-gRNA לעוברים היא גם קריטית, שכן הזרקות לא יעילות עלולות להוביל לשיעורי עריכה נמוכים או לפסיפסיזם52. אישור גנוטיפ יסודי באמצעות ריצוף מבטיח שקיימות עריכות מיועדות ומוציאה עריכות לא מדויקות או לא שלמות, ובכך מחזקת את שלמות המודל53. ראוי לציין כי השימוש בכרומוזום מאזן CyO היה חיוני לשמירה על האלל המוטנטי של Ent2 בשל הקטלניות של מוטנטים הומוזיגוטיים. גישה זו משמשת באופן נרחב בגנטיקה של דרוזופילה לשימור מוטציות מזיקות ולאפשר ניתוחים בהמשך. המחקר הנוכחי מדגים את היישום המעשי של אסטרטגיה זו במסגרת עריכה של CRISPR/Cas9.

יש להכיר בכמה מגבלות. ראשית, בוצעו ניתוחים פנוטיפיים באמצעות קו מוטנטי יחיד שמקורו ב-CRISPR. ידוע היטב כי עריכת CRISPR/Cas9 יכולה לייצר אללים הטרוגניים, ומומלץ בדרך כלל ניתוח של קווים בלתי תלויים מרובים לחיזוק המסקנות הגנטיות. לכן, הממצאים המדווחים כאן צריכים להתפרש כאפיון ראשוני של אלל מוטנטי אחד. מחקרים עתידיים שיכללו אללים נוספים של Ent2 שנוצרו באופן עצמאי יהיו נחוצים לשיפור עמידות המסקנות... שנית, קו המוטנט נשמר באמצעות כרומוזום המאזן CyO, בעוד שקבוצת הביקורת (w1118) אינה נושאת כרומוזום מאזן. מכיוון שכרומוזומי האיזון עצמם יכולים להשפיע על תכונות התפתחותיות ופיזיולוגיות, היעדר בקרה מותאמת-מאזן מהווה מקור פוטנציאלי לבלבול. מגבלה זו צריכה להילקח בחשבון בעת פרשנות הבדלים פנוטיפיים בין גנוטיפים. שלישית, תנאי הסביבה כמו לחות, מחזור אור ותזונה נשמרו תחת הגדרות מעבדה סטנדרטיות אך לא היו מגוונים באופן שיטתי. מכיוון שגורמים אלו יכולים להשפיע על חילוף החומרים ותגובות ללחץ, מחקרים עתידיים שיכללו גרדיאנטים סביבתיים מבוקרים יספקו הערכה מקיפה יותר של אינטראקציות בין פנוטיפ לסביבה.

לסיכום, מחקר זה קובע תהליך עבודה מבוסס CRISPR/Cas9 ליצירת ושימור אללים מוטנטיים של Ent2 בדרוזופילה מלנגסטר ומספק תיאור תיאורי של הקו ההטרוזיגוטי שנוצר בתנאים סביבתיים שונים. התוצאות מדגישות את היישום של גישה זו לחקר גנים עם פנוטיפים קטלניים ומדגישות את חשיבות שיקולי עיצוב הניסוי, כולל רקע גנטי, כרומוזומי מאזן ומשתנים סביבתיים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכל המחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמכו במחקר זה על ידי תוכנית פיתוח המדע והטכנולוגיה של מחוז ג'ילין (פרויקט מס' 20230505044ZP).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ammonium acetateSigma A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Dodecyl sulfateSigmaL3771
Injection deviceEppendorf FemtoJet 4i
Linearized plasmid: MLM3613Addgene42251
MicroscopeOLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kitThermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitThermo FisherAM1344
PmeI restriction enzymeNEB R0560S
Poly(A) polymeraseNEBM0276S
Protease KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini KitQIAGEN74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromega P1320
T7 RiboMAX KitPromega P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroformSigmaP2069

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tolwinski, N. S. Introduction: Drosophila-A Model System for Developmental Biology. J Dev Biol. 5 (3), (2017).
  2. Ogienko, A. A., et al. Drosophila as a Model Organism to Study Basic Mechanisms of Longevity. Int J Mol Sci. 23 (19), (2022).
  3. Lu, T. C., et al. Aging Fly Cell Atlas identifies exhaustive aging features at cellular resolution. Science. 380 (6650), eadg0934(2023).
  4. Koyama, T., Texada, M. J., Halberg, K. A., Rewitz, K. Metabolism and growth adaptation to environmental conditions in Drosophila. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4523-4551 (2020).
  5. Moraes, K. C. M., Montagne, J. Drosophila melanogaster: A Powerful Tiny Animal Model for the Study of Metabolic Hepatic Diseases. Frontiers in Physiology. 12, 2021(2021).
  6. Chatterjee, N., Perrimon, N. What fuels the fly: Energy metabolism in Drosophila and its application to the study of obesity and diabetes. Sci Adv. 7 (24), (2021).
  7. Volonté, C., Alberti, F., Vitale, G., Liguori, F. Delineating Purinergic Signaling in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 15196(2022).
  8. Machado, J., Abdulla, P., Hanna, W. J., Hilliker, A. J., Coe, I. R. Genomic analysis of nucleoside transporters in Diptera and functional characterization of DmENT2, a Drosophila equilibrative nucleoside transporter. Physiol Genomics. 28 (3), 337-347 (2007).
  9. Ho, H. T., Xia, L., Wang, J. Residue Ile89 in human plasma membrane monoamine transporter influences its organic cation transport activity and sensitivity to inhibition by dilazep. Biochem Pharmacol. 84 (3), 383-390 (2012).
  10. Knight, D., et al. Equilibrative nucleoside transporter 2 regulates associative learning and synaptic function in Drosophila. J Neurosci. 30 (14), 5047-5057 (2010).
  11. Sidorov, R., Kucerova, L., Kiss, I., Zurovec, M. Mutation in the Drosophila melanogaster adenosine receptor gene selectively decreases the mosaic hyperplastic epithelial outgrowth rates in wts or dco heterozygous flies. Purinergic Signal. 11 (1), 95-105 (2015).
  12. Naes, S. M., Ab-Rahim, S., Mazlan, M., Abdul Rahman, A. Equilibrative Nucleoside Transporter 2: Properties and Physiological Roles. Biomed Res Int. 2020, 5197626(2020).
  13. Boswell-Casteel, R. C., Hays, F. A. Equilibrative nucleoside transporters-A review. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 36 (1), 7-30 (2017).
  14. Wu, K. C., Lee, C. Y., Chou, F. Y., Chern, Y., Lin, C. J. Deletion of equilibrative nucleoside transporter-2 protects against lipopolysaccharide-induced neuroinflammation and blood-brain barrier dysfunction in mice. Brain Behav Immun. 84, 59-71 (2020).
  15. Rattray, Z., et al. ENT2 facilitates brain endothelial cell penetration and blood-brain barrier transport by a tumor-targeting anti-DNA autoantibody. JCI Insight. 6 (14), (2021).
  16. Chiang, H. L., et al. The Critical Role of Equilibrative Nucleoside Transporter-2 in Modulating Cerebral Damage and Vascular Dysfunction in Mice with Brain Ischemia-Reperfusion. Pharm Res. 40 (11), 2541-2554 (2023).
  17. Chen, M., et al. SLC29A1 and SLC29A2 are human nicotinamide cell membrane transporters. Nat Commun. 16 (1), 1181(2025).
  18. Bajgar, A., et al. Extracellular adenosine mediates a systemic metabolic switch during immune response. PLoS Biol. 13 (4), e1002135(2015).
  19. Mołoń, M., et al. Effects of Temperature on Lifespan of Drosophila melanogaster from Different Genetic Backgrounds: Links between Metabolic Rate and Longevity. Insects. 11 (8), (2020).
  20. Chen, J., Nolte, V., Schlötterer, C. Temperature-Related Reaction Norms of Gene Expression: Regulatory Architecture and Functional Implications. Mol Biol Evol. 32 (9), 2393-2402 (2015).
  21. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Curr Protoc Mol Biol. 111, 31.32.31-31.32.20 (2015).
  22. Bassett, A., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 mediated genome engineering in Drosophila. Methods. 69 (2), 128-136 (2014).
  23. Port, F., Muschalik, N., Bullock, S. L. Systematic Evaluation of Drosophila CRISPR Tools Reveals Safe and Robust Alternatives to Autonomous Gene Drives in Basic Research. G3 Genes|Genomes|Genetics. 5 (7), 1493-1502 (2015).
  24. Clark, M., et al. Expanding the CRISPR base editing toolbox in Drosophila melanogaster. Communications Biology. 7 (1), 1126(2024).
  25. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  26. Port, F., Boutros, M. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Springer US. 157-176 (2022).
  27. Liao, H., Wu, J., VanDusen, N. J., Li, Y., Zheng, Y. CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair for precise gene editing. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (4), 102344(2024).
  28. Shumega, A. R., et al. CRISPR/Cas9 as a Mutagenic Factor. International Journal of Molecular Sciences. 25, 823(2024).
  29. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. PLoS Genet. 15 (11), e1008421(2019).
  30. Muron, S., Kucera, S., Oliver, B., Benner, L. Creation of a new Drosophila melanogaster X chromosome balancer, First Multiple 8 ( FM8 ), using the CRISPR/Cas9 gene-editing system. MicroPubl Biol. 2022, (2022).
  31. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  32. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  33. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  34. Wang, H., Zheng, S., Yu, X., Wu, K., Zhao, M. Clinical characteristics and genotypes of patients with Congenital fibrinogen disorders. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 42 (3), 264-273 (2025).
  35. Chotcomwongse, P., et al. The Impact of Various Surface Treatments on Adhesion Between Co-Cr Alloy and Acrylic Teeth. Int J Dent. 2026, 2199689(2026).
  36. Prakash, S., Havard, M., Hodges, E., Agrawal, A., Ahuja, S. In the artificial intelligence age, is Oswestry spinal risk index still useful? an external validation of Oswestry spinal risk index applied to radiotherapy patients and its relevance. Br J Neurosurg. , 1-9 (2026).
  37. Anaya-Ayala, J. E., et al. Analysis of Inflammatory and Angiogenic Activities in Patients with Abdominal Aortic Aneurysms with the Radiotracers (99m)Tc-HYNIC-CCR2-L and (99m)Tc-RGD with Single-Photon Emission Computed Tomography. Ann Vasc Surg. 124, 312-317 (2026).
  38. Rose, J. B., Coe, I. R. Physiology of nucleoside transporters: back to the future. Physiology (Bethesda). 23, 41-48 (2008).
  39. Niveditha, S., Deepashree, S., Ramesh, S. R., Shivanandappa, T. Sex differences in oxidative stress resistance in relation to longevity in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology B. 187 (7), 899-909 (2017).
  40. Carvalho, G. B., et al. The 4E-BP growth pathway regulates the effect of ambient temperature on Drosophila metabolism and lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9737-9742 (2017).
  41. Martelli, F., Alves, A. N., Yang, Y. T., Batterham, P., Wedell, N. Genotype and sex affect the combined impact of temperature and low-dose insecticide exposure on insect survival. Insect Sci. , (2024).
  42. Goh, G. H., Blache, D., Mark, P. J., Kennington, W. J., Maloney, S. K. Daily temperature cycles prolong lifespan and have sex-specific effects on peripheral clock gene expression in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 224 (10), (2021).
  43. Robillard, K. R., Bone, D. B. J., Hammond, J. R. Hypoxanthine uptake and release by equilibrative nucleoside transporter 2 (ENT2) of rat microvascular endothelial cells. Microvasc Res. 75 (3), 351-357 (2008).
  44. Kropotov, A., et al. Equilibrative Nucleoside Transporters Mediate the Import of Nicotinamide Riboside and Nicotinic Acid Riboside into Human Cells. Int J Mol Sci. 22 (3), (2021).
  45. Katsyuba, E., et al. De novo NAD(+) synthesis enhances mitochondrial function and improves health. Nature. 563 (7731), 354-359 (2018).
  46. Suman, R., et al. Deregulation of mitochondrial reverse electron transport alters the metabolism of reactive oxygen species and NAD+/NADH and presents a therapeutic target in Alzheimer's disease. Ageing Neur Dis. 4 (1), 4(2024).
  47. Pérez, S. E., Gooz, M., Maldonado, E. N. Mitochondrial Dysfunction and Metabolic Disturbances Induced by Viral Infections. Cells. 13 (21), (2024).
  48. Ballard, J. W., Melvin, R. G., Miller, J. T., Katewa, S. D. Sex differences in survival and mitochondrial bioenergetics during aging in Drosophila. Aging Cell. 6 (5), 699-708 (2007).
  49. Yi, Y., Xu, W., Fan, Y., Wang, H. X. Drosophila as an emerging model organism for studies of food-derived antioxidants. Food Res Int. 143, 110307(2021).
  50. Tiberi, J., et al. Sex differences in antioxidant defence and the regulation of redox homeostasis in physiology and pathology. Mechanisms of Ageing and Development. 211, 111802(2023).
  51. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  52. Yan, Y., Schetelig, M. F. Protocol for genetic engineering in Drosophila suzukii using microinjection. STAR Protocols. 5 (3), 103248(2024).
  53. Aguilar, G., et al. Seamless knockins in Drosophila via CRISPR-triggered single-strand annealing. Developmental Cell. 59 (19), 2672-2686.e5 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

234234

מאמרים קשורים