הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת אורגנידים גידוליים, פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה, ופיברובלסטים מקבילים מאותו מטופל סרטן וושט

532 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69548

⸱

3 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד בו-זמנית של אורגנואידים סרטניים, פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה (CAFs), ופיברובלסטים (CFs) שאינם קשורים לגידולים מאותו מטופל עם קרצינומה של תאי קשקש הוושט (ESCC). שימוש בחומרים המותאמים למטופלים הללו יכול למנוע בעיות של שונות בין-מטופלת ולספק פלטפורמה ניסויית מתאימה למחקר ESCC.

תקציר

בקרצינומה של תאי קשקש הוושט (ESCC), רכישת עמידות לטיפול והישנות הגידול נותרות אתגרים קליניים מרכזיים. פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה (CAFs), רכיבים מרכזיים במיקרוסביבה של הגידול, ידועים כמשפיעים על התקדמות ESCC ותגובת טיפול. עם זאת, היבטים רבים של תפקידי CAFs בממארות גידולים נותרו לא ידועים, ככל הנראה בשל שונות בין-מטופלת אצל מטופלי ESCC. קווי תאים שונים של ESCC אנושיים הזמינים למחקר נחשבים כמחקים חלקית את טבע קרצינומה אנושית. הם גם מתרבים במבחנה במשך שנים ועשורים בצלחת פטרי, מה שמוביל להסתגלות לתנאי התרבות. יתרה מזאת, קווי התאים האנושיים של ESCC מכילים שינויים גנטיים ואפיגנטיים שונים בין המטופלים המקוריים, מה שמוביל לשונות בין מטופלים. עם זאת, קווי תאי סרטן מתורבתים לטווח ארוך שימשו ברוב המחקרים הקודמים לניסויים עם CAFs לא תואמים למטופלים. שונות בין מטופלים בכל קו תאים סרטני ובין תאי סרטן ל-CAFs עלולה לגרום לכן לירידה בשחזוריות ובאמינות התוצאות. כדי לבטל שונות בין מטופלים, בודדו שלושה סוגי תאים מובחנים מאותו מטופל: אורגנואידים סרטניים ו-CAFs מאזור ESCC שנחתך בניתוח, ופיברובלסטים מקבילים (CFs) מאזור סמוך שאינו גידולי כאמצעי ביקורת ספציפיים למטופל עבור CAFs. מוצג פרוטוקול מפורט שמאפשר בידוד סימולטני של אורגנואידים סרטניים, CAFs ו-CFs. האורגנואידים הסרטניים גדלו היטב בתנאים תלת-ממדיים. CAFים ו-CFs צובעו באופן חיובי עבור וימנטין, אחד מסמני הפיברובלסטים, התומך בהעשרת תאים אלה בקושי פיברובלסטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר לנו להקים אורגנואידים ESCC ופיברובלסטים מותאמים למטופלים, ומספק פלטפורמה ניסיונית חשובה שמוציאה שונות בין מטופלים לחקר אינטראקציות בין גידול לסטרומה.

מבוא

סרטן הוושט קשור לשיעורי שכיחות ותמותה גבוהים ברחבי העולם1. הוא מסווג באופן כללי לשני תת-סוגים היסטולוגיים עיקריים: קרצינומה של תאי קשקשי הוושט (ESCC) ואדנוקרצינומה של הוושט (EAC)2. ESCC נפוץ יותר מ-EAC, עם שכיחות גבוהה במיוחד במזרח אסיה ואפריקה3. אסטרטגיות הטיפול ל-ESCC מבוססות יחסית 4,5. בנגעים בשלבים מוקדמים המוגבלים לשכבת הרירית, כריתה אנדוסקופית מוצהגת כאופציה ריפוי ומינימלית פולשנית. אצל מטופלים עם מחלה מקומית מתקדמת אך ניתנת לכריתה, השילוב של כימותרפיה רדיוקריתית נאו-אדג'ובנטית ואחריה הוושט הוכיח יעילות קלינית. במקרים שאינם ניתנים לכריתה או גרורתיים, כימותרפיה מערכתית נשארת עמוד התווך של הטיפול. עם זאת, עמידות טיפולית והישנות מחלה ממשיכות להוות אתגרים קליניים משמעותיים.

הגידולים מורכבים לא רק מתאי סרטן, אלא גם ממיקרוסביבה מורכבת הכוללת סוגים שונים של תאי סטרומל. ביניהם, פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה (CAFs), רכיבים תאיים מרכזיים במיקרו-סביבת הגידול, הוכחו כממלאים תפקידים קריטיים בהתקדמות הגידול ובתגובה הטיפולית 6,7,8,9. ב-ESCC, דווח יותר ויותר על מעורבות CAFs במלמאיריות גידול ועמידות לטיפול 10,11,12. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים של CAFs שמאחורי הממאירות של ESCC נותרו ברובם לא ברורים.

ברוב המחקרים הקודמים, השפעות CAFs על תאי סרטן הוערכו באמצעות קווי תאים שונים של ESCC שהתפשטו בצלחות פטרי במשך שנים רבות, ואף עשורים. קווי תאים כאלה יסתגלו לתנאי התרבית ואינם דומים לגידולים המקוריים13. יתרה מזאת, קווי תאים של ESCC נגזרים ממטופלים שונים ומכילים שינויים גנטיים ואפיגנטיים שונים, אשר ברורים שהם שונים בתאי ESCC הרלוונטיים, המשמשים כשונות בין מטופלים. תוצאות ניסוי מקו תאי סרטן אחד עשויות לעיתים קרובות להיות לא עקביות עם אלו של קו תאים סרטן אחר. לכן, ניסויים המשתמשים בקווי תאים שונים של ESCC וב-CAFs הלא תואמים למטופלים עלולים לגרום לקושי בטיפול מדויק באינטראקציות בין תאים אלו בצורה שחזורית ואמינה.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פותח פרוטוקול לבידוד אורגנואידים של גידול, CAFs ופיברובלסטים (CFs) תואמים למטופלים בו-זמנית מאותו דגימה ניתוחית של ESCC. אורגנואידים שמקורם במטופל בדרך כלל משחזרים תכונות ארכיטקטוניות ופנוטיפיות מרכזיות של גידולים ראשוניים תוך שמירה על הטרוגניות מולקולרית. האורגנואידים המבוססים יצרו ספרואידים בתנאי תרביות תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) והפגינו יכולת רבייה יציבה. גם CAFs וגם CFs אושרו כמועשרים באוכלוסיות תאי פיברובלסטיות החיוביות לוימנטין, סמן פיברובלסטים.

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים וניתנים לשחזור לעיבוד רקמות, דיסוציאציה אנזימטית, זריעה אורגנואידית, בידוד CAF/CF, מעבר ושימור קריופרטי. כדי לסייע לחוקרים להעריך את היישום לפני היישום, נכלול מידע מעשי: אורגנואידים בדרך כלל נוצרים תוך 3–5 ימים, מגיעים למוכנות למעבר תוך 7–10 ימים, וניתן להרחיב אותם באופן יציב ליותר מעשרה מעברים. CAFים ו-CF יכולים לעבור לפחות שמונה דורות. אורגנואידים ופיברובלסטים יכולים להיות מוקפאים בתוך כ-20 יום. שיעורי ההצלחה בהקמה מגיעים לכ-70% עבור אורגנואידים וכ-80% עבור CAFים ו-CFs. יתרה מזאת, נכלול מבחן מדיום מותנה מאומת המשתמש במדיום מותנה ב-CAF או CF, המספק גישה איתנה להערכת ההשפעות הפרקריניות של תאי סטרומל על התנהגות אורגנואידים של גידול. ביחד, פלטפורמת הגידול האורגנואידית-סטרומלית הזו מציעה מודל נגיש לניסוי ורלוונטי ביולוגית לחקר אינטראקציות גידול-סטרומליות ESCC ולתמיכה בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות מדויקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים רקמת אדם חייבים להתבצע תחת אישורי בטיחות ביולוגית מוסדית מתאימים ובארון בטיחות ביולוגית מוסמך. המטופל סיפק הסכמה מדעת בכתב, והפרויקט אושר על ידי ועדת האתיקה המחקרית של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת חונטנדו. סקירה של ההליך מהפרוטוקולים 2 עד 6 מוצגת באיור 1. הרכב וריכוזי כל רכיב בתווך האורגנואידי של ESCC (Eso_v1) נקבעו בהתבסס על קיג'ימה ואח' 14 ומחקרים נוספים 15,16,17 עם שינויים קלים בלבד. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. חומרים והכנת רקמות

  1. הכינו חומרים וציוד.
    1. חטא את כל הכלים, כולל מספריים, מלקחיים ופיפטות, לפני תחילת ההליך.
    2. הכינו 10 מ"ל של מלח מפוזר פוספט (PBS) בצינור של 15 מ"ל.
    3. הכינו צינורות 15 מ"ל עם חיבור נמוך ותייגו אותם לפי מקור הדגימה (למשל, צינור שטיפת גידול (A), צינור עיכול גידול (B), צינור שטיפה לא-גידולי (C), צינור עיכול לא-גידולי (D)).
    4. פיפטות העובדות על ציפוי על ידי שאיפת ומתן של סרום בקר עוברי (FBS) 2–3 פעמים כדי להפחית את ההידבקות התאים במהלך העיבוד.
      הערה: ציפוי FBS מונע מחלקי רקמה להידבק למשטחים פלסטיים במהלך דיסוציאציה מכנית.
  2. הכנת תמיסות אנזימים
    1. הכינו את תמיסת האנזים I לעיכול הגידול על ידי ערבוב 2.7 מ"ל מדיום Modified Eagle's Medium (DMEM) של Dulbecco עם 10% FBS ו-1x פניצילין–סטרפטומיצין (PS) (להלן DMEM/10% FBS), 0.3 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל קולגנאז, 0.15 מ"ל של 10000 PU/mL דיספאז, ו-0.03 מ"ל של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B. חם עד 37 מעלות צלזיוס.
    2. הכינו את תמיסת האנזים II לעיכול לא-גידולי על ידי ערבוב 2.7 מ"ל DMEM/10% FBS, 0.3 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז, ו-0.03 מ"ל של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B. חם ל-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: קולגנאז ודיספאזה מסייעים לפירוק רקמת הגידול.
  3. הכינו מדיום תרבית אורגנואידים
    1. הכינו מדיום אורגנואידי ESCC (Eso_v1 מדיום) המכיל 60% מדיום בסיסי אורגנואיד, 40% מדיום מותאם ל-L-WRN18 (ראה שלב 1.4), 50 ng/mL EGF (גורם גדילה), 1 מ"מ N-אצטיל-L-ציסטאין (נוגד חמצון), 5 מ"מ ניקוטינמיד (ויטמין מסיס במים), 500 ננומטר A83-01 (מעכב TGF-βR (מונע צמיחת פיברובלסטים)), 1x B-27 (תוסף תרבית ללא סרום), 1x N-2 (תוסף תרבית ללא סרום), ו-10 מיקרומום Y-27632 (מעכב סלע).
    2. איזון את הטמפרטורה הבינונית ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
      הערה: מדיום מותנה ב-L-WRN (סופרנטנט מתאי L-WRN) מספק אותות WNT, R-ספונדין ונוגין החיוניים להתחלת אורגנואידים. Y27632 נמצא במדיום לאורך כל תקופת התרבות.
  4. הכינו מדיום מותאם ל-L-WRN
    1. הפשיר בקבוקון של תאי L-WRN וזרע אותם על צלחת בעובי 100 מ"מ עם 10 מ"ל DMEM/10% FBS ותרבות למשך יום–יומיים.
    2. החלף את המדיום ב-10 מ"ל DMEM/10% FBS המכיל G418 (500 מיקרוגרם/מ"ל אחרונים) והיגרומיצין B (500 מיקרוגרם/מ"ל אחרונים), ותרביד עד שהתאים מגיעים ל-80% מפגש מתאים.
    3. העבר את התאים לשני צלחות בגודל 100 מ"מ עם 10 מ"ל DMEM/10% FBS (עם G418 והיגרומיצין B) ותרבית עד שהתאים מגיעים ל-100% מפגש משותף.
    4. להעביר את התאים לחמש צלחות בגודל 150 מ"מ עם 20 מ"ל DMEM/10% FBS (ללא אנטיביוטיקה) לכל מנה ותרבית עד למפגש של 100%.
    5. שואף והשליך את המדיום מכל צלחת 150 מ"מ.
    6. הוסף 25 מ"ל לכל צריח של מדיום איסוף (מדיום בסיסי אורגנואידי בתוספת 5% FBS).
    7. דגרה ל-24 שעות.
    8. אסוף את המדיום מכל חמש המנות (25 מ"ל × 5 = 125 מ"ל) לבקבוק זכוכית סטרילי.
    9. חזור על שלבים 1.4.6–1.4.8 לסך כולל של 8 אוספים (נפח יעד מאוחד: ~1,000 מ"ל).
    10. סנן סטרילי את ה-CM המאוגד באמצעות מסנן על פני הבקבוק.
    11. Aliquot 40 מ"ל ל-25 צינורות סטריליים של 50 מ"ל.
    12. אחסן אליקווט בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
  5. הכינו מדיום תרבית פיברובלסטים
    1. הכינו פיברובלסטים בינוניים-1.
    2. איזון את הטמפרטורה הבינונית ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  6. הכינו מנות טיפול בטישו
    1. שפוך כמה טיפות (שלוש עד חמש) של FBS עם קצה P1000 על שני צלחות בגודל 100 מ"מ ליצירת ציפוי (צלחת T לרקמת גידול, צלחת N לרקמה שאינה גידולית).
      הערה: ציפוי FBS מקדם טחינה מכנית חלקה יותר ומונע היצמדות של שברי רקמה קטנים לפני הצלחת.
  7. טיפול ברקמות וזיהוי דגימה
    1. אשר כי דגימות גידול ולא גידוליות מועברות על קרח.
    2. הנח את הרקמות על צלחת בגודל 60 מ"מ המכילה כמות קטנה של DMEM/10% FBS ואחסן על קרח עד השימוש. התחל את העיבוד תוך 16 שעות מהניתוח כדי לשמור על חיוניות.
    3. זהה את רקמת הגידול לפי המרקם המוצק שלה והמורפולוגיה הלא סדירה של פני השטח, השונים מאלו של הרקמה הלא-גידולית.

2. עיבוד רקמות, שטיפה ועיכול אנזימטי

הערה: שלב זה מתבצע לעיכול גידול טחון וחתכי רקמה שאינם גידוליים באמצעות תמיסות אנזימים שונות.

  1. טחון את הגידול ואת הרקמות הלא-גידוליות
    1. העבר כל דגימת רקמה (כ-5 מ"מ × 5 מ"מ) לצלחת המצופה FBS המתאימה (צלחת T לרקמת הגידול וצלחת N לרקמה שאינה גידולית).
    2. טחנו כל רקמה לחתיכות ~0.5 מ"מ באמצעות סכין סטרילית.
      הערה: מקטעים קטנים יותר מגבירים את הנגישות האנזימטית ומשפרים את יעילות העיכול.
  2. שטוף את הטישו הטחוץ.
    1. ציפוי פיפטה של 10 מ"ל ב-FBS כדי למנוע היצמדות רקמה.
    2. הוסף 5 מ"ל PBS לכל צלחת באמצעות פיפטה מצופה FBS ותלה בעדינות את הרקמה הטחונה.
    3. העבר את המתלה לצינור שטיפת הגידול המתאים (צינור A) או לצינור שטיפת שטיפת לא-גידולי (צינור C).
    4. חזור על שלבים 2.2.2 ו-2.2.3 (נפח כולל: 10 מ"ל).
    5. אפשר לצינורות לעמוד 2 דקות בטמפרטורת החדר; הסרת הסופרנטנט תוך השארת כ-0.5–1 מ"ל של PBS ורקמה בתחתית.
    6. הוסף 10 מ"ל PBS טרי עם פיפטה חדשה; לאחר ציפוי הפיפטה ב-FBS, יש פיפט על המתלה בעוצמה תוך הימנעות מהיווצרות בועות.
      הערה: פיפטינג חזק מסייע בניתוק מכני ובהסרת דם וריר. הימנעות מבועות מונעת פירוק תאים שנגרם מגזיר. כל שלבי הכביסה נועדו להסיר לכלוך.
    7. אפשר לצינורות לעמוד 2 דקות בטמפרטורת החדר; הסרת הסופרנטנט תוך השארת כ-0.5–1 מ"ל של PBS ורקמה בתחתית.
    8. חזור על תהליך הכביסה (שלבים 2.2.6 ו-2.2.7) פעמיים, לסך הכל שלוש שטיחות.
  3. העבר רקמות לצינורות העיכול.
    1. הוסף 10 מ"ל PBS טרי עם פיפטה חדשה; לאחר ציפוי הפיפטה ב-FBS, מעבירים את רקמת הגידול לצינור העיכול (צינור B) ואת הרקמה הלא-גידולית לצינור העיכול הלא-גידולי (צינור D).
    2. תן לצינורות לעמוד 2 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את הסופרנטנט תוך השארת כ-0.5 מ"ל PBS ורקמה בתחתית.
  4. בצע עיכול אנזימטי.
    1. עיכול רקמת הגידול
      1. הוסף את כל נפח תמיסת האנזים I (קולגנאז + דיספאז) לצינור העיכול של הגידול (צינור B).
      2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עם סיבוב עדין.
    2. עיכול רקמות שאינן גידולי
    3. הוסף את כל נפח תמיסת האנזים II (קולגנאז בלבד) לצינור העיכול הלא-גידולי (צינור D).
      1. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות עם סיבוב עדין.
    4. המשך לשלב 3 (עיבוד דגימת גידול) או לשלב 6 (זריעת פיברובלסטים מקבילה), בהתאם למקור הדגימה.
      הערה: סוגי האנזימים ששימשו לעיכול רקמות גידול ולא-גידוליות, וכן זמני העיבוד, נקבעו בהתבסס על אופטימיזציה ניסיונית קודמת. רקמות הגידול מכילות לעיתים קרובות מטריצה חוץ-תאית צפופה; דיספאזה בשילוב עם קולגנאז משפר את יכולת העיכול.

3. עיבוד דגימות גידול לבידוד אורגנואיד ו-CAF

הערה: שלב זה מתבצע לבידוד תאי גידול אפיתליאליים לצורך היווצרות אורגנואידים ופיברובלסטים סטרומליים (CAFs) מאותם דגימות גידול מעוכלות.

  1. לסנן ולאסוף תאים שמקורם בגידולים.
    1. הניחו מסננת תאים של 100 מיקרון על צינור קוני של 50 מ"ל.
    2. הרטיב מראש את המסננת על ידי העברת 3 מ"ל DMEM/10% FBS דרכה.
      הערה: הרטבה מוקדמת מפחיתה אובדן תאים על ידי מניעת היצמדות לסיבי רשת יבשה.
    3. העבר את כל תכולת צינור העיכול (צינור B) למסננת באמצעות קצה P1000 מצופה FBS להסרת שברי רקמה לא מעוכלים.
    4. הוסיפו עוד 6 מ"ל DMEM/10% FBS כדי לשטוף אשכולות שאריתיים דרך המסננת.
    5. הסר את המסננת והחזיר את הסינון לצינור B (ניתן להשתמש גם בצינור חדש בנפח 15 מ"ל עם חיבור נמוך).
  2. שטוף ורכז את הסינון.
    1. צנטריפוגה את הצינור ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה חד-פעמית.
    3. מוסיפים 10 מ"ל DMEM/10% FBS, מערבבים בעדינות באמצעות היפוך, וצנטריפוגה שוב ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
    4. שאפו בזהירות את הסופרנטנט תוך שמירה על הכדור.
    5. הפחת את הנפח הנותר ל-40 מיקרוליטר באמצעות פיפטת P200.
  3. הקצה תאים לתרבות אורגנואידים ותרבות CAF.
    1. הקצה 30 מיקרוליטר לזריעה אורגנואידית.
    2. הקצה 10 מיקרו ליטר לזריעת CAF.
      הערה: יחס זה מספק באופן אמפירי אוכלוסיות אפיתליות ופיברובלסטים מספקות להתרחבות מקבילה.

4. זריעה אורגנית (תרבית תלת-ממדית)

הערה: שלב זה מתבצע כדי לבסס אורגנואידים של ESCC מתוך השעיה תאי שמקורו בגידול.

  1. הכינו כיפות מטריצת ממברנה במרתף.
    1. חממו מראש צלחת סטנדרטית עם 24 בארות ל-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: חימום מוקדם של הלוח מאיץ את ההתמצקות של כיפות מטריצת ממברנת הבסיס.
    2. מערבבים 30 מיקרוליטר של ההשעיה שמקורה בגידול עם 90 מיקרוליטר של מטריצת ממברנת בסיס קרח (יחס של 1:3).
    3. יש להניח 30 מיקרוליטר לכל כיפה על ארבע בארות.
    4. תן לכיפות להתגבש במשך 15 דקות באינקובטור CO₂.
  2. הוסף מדיום תרבית אורגנואיד
    1. הכינו מדיום אורגנואידי עם תוספים מעורבים מראש (FGF10, SB202190 ואנטיביוטיקה, כגון 1× אמפוטריצין B ו-100 מיקרוגרם/מ"ל פרימוסין, אם משתמשים בו).
      הערה: באר 1: Eso_v1; באר 2: Eso_v1 + 10 מיקרומום SB202190; באר 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; באר 4: Eso_v1 + 10 מיקרומולר SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (ריכוזים סופיים).
    2. הוסיפו בעדינות 1 מ״ל מדיום לכל באר לאורך הקיר.
    3. דגירה בתנאי תרבית CO₂ סטנדרטיים.
    4. החלף בינוני כל 3–5 ימים.
      הערה: ערבוב מוקדם של התוספים מונע את הצורך לפיפט נפחים קטנים ישירות על כיפות מטריצת ממברנה שבריריות. אנטיביוטיקה מוסיפה רק במהלך 6 הימים הראשונים לאחר היווצרות האורגנואיד. תנאי התרביות (FGF10 +/-, SB202190 +/-) נקבעים על בסיס קצב גדילה ומורפולוגיה (רצוי כדורי).
  3. לעקוב אחרי היווצרות אורגנואידים.
    1. צפו בכיפות מדי יום באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
      הערה: מורפולוגיה צפויה: ימים 3–5 → ספרואידים נראים לעין; ימים 7–10 → ספרואידים צפופים מוכנים למעבר מהיר.
    2. מעבר האורגנידים כאשר הם מגיעים לגודל של כ-100–200 מיקרון או מראים צפיפות כיפה של 90% או יותר.

5. זריעת CAF

הערה: שלב זה מתבצע כדי להקים CAFs מהתלות תא שמקורו בגידול.

  1. זרעי CAF על צלחת מצופה קולגן.
    1. הכן צלחת מצופה קולגן בקוטר 60 מ"מ המכילה 1.5 מ"ל של פיברובלסטים בינוניים-1.
    2. הוסף 10 מיקרוליטר מסונון הגידול שהוקצה לזריעת CAF.
    3. הוסיפו אנטיביוטיקות כמו 1× אמפוטריצין B ו-100 מיקרוגרם/מ"ל פרימוסין.
    4. דגירה בתנאי תרבית CO₂ סטנדרטיים.
    5. החלף בינוני כל 3–5 ימים.
      הערה: מבחינה אמפירית, פיברובלסטים מדיום-1 מתאימים לעיתים קרובות יותר ממדיה אחרת להתבססות וצמיחה ראשונית של CAFים ו-CFs. אנטיביוטיקה מוסיפה רק במהלך ששת הימים הראשונים.
  2. מעקב אחר גידול ה-CAF
    1. עקבו אחרי מראה של מורפולוגיית הציר דמוית פיברובלסטים החל מימים 3–5.
    2. פיברובלסטים במעבר בחיבור של 90%–100%.
      הערה: אם מתרחש זיהום בתאי האפיתל, ניתן לבודד את הפיברובלסטים באופן סלקטיבי על ידי התאמת משך הטריפסיניזציה, שכן פיברובלסטים מתנתקים מהר יותר מתאי אפיתל במהלך המעבר.

6. סידור CF

הערה: שלב זה מתבצע לקבלת CFs מותאמים למטופלים מרקמות לא גידוליות סמוכות.

  1. שטוף והכין את העיכול הלא-גידולי.
    1. צנטריפוגה את צינור העיכול הלא-גידולי (צינור D) ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
    2. הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה חד-פעמית.
    3. הוסף 10 מ"ל DMEM/10% FBS, ערבב בעדינות באמצעות היפוך, וצנטריפוגה שוב ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
    4. שאפו בזהירות את הסופרנטנט, תוך שמירה על הכדור.
    5. חזור על שלבים 6.1.3 ו-6.1.4 שוב.
  2. זרעי CF על צלחת מצופה קולגן
    1. העבר את כל המתלה לצלחת מצופה קולגן בקוטר 60 מ"מ המכילה 1.5 מ"ל פיברובלסטים בינוניים-1.
    2. הוסיפו אנטיביוטיקות כמו 1× אמפוטריצין B ו-100 מיקרוגרם/מ"ל פרימוסין.
    3. דגירה בתנאי תרבית CO₂ סטנדרטיים.
    4. החלף בינוני כל 3–5 ימים.
      הערה: אנטיביוטיקה מתווספת רק במהלך 6 הימים הראשונים.
  3. לעקוב אחרי צמיחת CF.
    1. התבוננו במורפולוגיה של ציר דמוי פיברובלסטים החל מ-3–5 ימים.
    2. פיברובלסטים במעבר בחיבור של 90%–100%.

7. מעבר אורגנואידים ושימור בקירור

  1. מעבר אורגנואידי.
    הערה: מטרת שלב זה היא להרחיב אורגנואידים ברגע שהם מגיעים לצפיפות מתאימה.
    1. שאפו את המדיום הישן ושטפו כל באר עם 1 מ״ל PBS.
    2. הוסיפו 0.5 מ"ל טריפסין מחומם מראש לאורגנואיד לכל באר.
    3. פיפט בעוצמה עם קצה P1000, תוך שימוש בקצה הקצה כדי לשבש את כיפת מטריצת ממברנת הבסיס.
      הערה: גזירה מכנית מסייעת לפרק את מטריצת ממברנת הבסיס הצפופה, ומשפרת את הגישה האנזימטית.
    4. דגרו במשך 10–15 דקות באינקובטור CO₂ עד שכל גושי הג'ל מתמוססים. מפרקים אורגנואידים ל-20–50 גושים של תאים.
      הערה: הימנעו מפירוק תא יחיד מלא, שכן זה מפחית את החיוניות.
    5. אסוף את המתלה לתוך צינור 15 מ"ל עם חיבור נמוך.
    6. שטוף את הבאר ארבע פעמים עם 0.5 מ"ל DMEM/10% FBS והעבר את כל השטיפות לאותו צינור חיבור נמוך.
    7. צנטריפוגה את הצינור ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
    8. הסר את הסופרנטנט ותשהה את הכדור במצב מינימלי DMEM/10% FBS; כוונן את נפח המתלים ל-80 מיקרוליטר.
    9. מערבבים 80 מיקרוליטר מהמתלה האורגנואידי עם 240 מיקרוליטר של מטריצת ממברנת בסיס קרח (יחס 1:3).
    10. הצלחו את התערובת על צלחת עם 6 בארות (37 מעלות צלזיוס), עם 4–6 כיפות בכל באר.
    11. אפשר לכיפות להתגבש במשך 15 דקות, ואז להוסיף 3 מ"ל של Eso_v1 מדיום (ההרכב שהיה אופטימלי בתרבית הראשונית בשלב 4.2) לכל באר.
    12. החלף בינוני כל 3–5 ימים.
      הערה: אורגנואידים עוברים כאשר הם מגיעים לקוטר של כ-100–200 מיקרון או כאשר צפיפות הכיפה עולה על 90%. ספירת תאים אינה מתבצעת. בתת-תרביות שגרתיות, אורגנואידים מחולקים ביחס של 1:4 ל-1:10. צפוי שינוי מהיר של הספרואידים בתוך 48–72 שעות.
  2. שימור אורגנואידי בהקפאה
    1. שטוף כל באר עם 3 מ"ל PBS.
    2. הוסיפו 1.5 מ"ל טריפסין לאורגנואיד לכל באר, פיפטו בעוצמה ודגרו במשך 10 דקות.
    3. אסוף את כל המתלים לצינור נמוך של 15 מ"ל ושוטף את הבאר ארבע פעמים.
    4. צנטריפוגה את הצינור ב-300 × גרם למשך 5 דקות והסר את הסופרנטנט.
    5. תלה מחדש את הכדור ב-2 מ"ל של 90% FBS/10% DMSO.
    6. אליקווט 0.5 מ"ל לכל קריוביאל.
    7. הניחו את הבקבוקים במיכל קפוא ואחסנו בטמפרטורה של −80°C במהלך הלילה.
    8. העבר בקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
      הערה: אורגנואידים מאוחסנים כאשר הם מגיעים לקוטר של כ-100–200 מיקרון או כאשר צפיפות הכיפה עולה על 90%.
  3. השבת אורגנואידים קפואים
    1. הפשיר את הקריוביאלית במהירות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
    2. העבר את התוכן ל-5 מ"ל DMEM/10% FBS בצינור של 15 מ"ל.
    3. צנטריפוגה את הצינור ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
    4. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדור לתלות ב-40–60 מיקרוליטר DMEM/10% FBS.
    5. מערבבים את המתלים עם מטריצת ממברנת הבסיס הקרה ביחס של 1:3.
    6. הצלחו את התערובת על צלחת עם 6 בארות מחוממות מראש (37 מעלות צלזיוס) כ-4–6 כיפות לכל באר.
    7. אפשר לכיפות להתגבש במשך 15 דקות, ואז להוסיף 3 מ"ל של Eso_v1 מדיום (ההרכב שהיה אופטימלי בתרבית הראשונית בשלב 4.2) לכל באר.

8. מעבר פיברובלסטים ושימור קריופרט

  1. CAF ו-CF במעבר מעבר
    הערה: מטרת שלב זה היא להרחיב את הפיברובלסטים לאחר שהם מגיעים לצפיפות מתאימה.
    1. שטפו את הכלי עם 2 מ"ל PBS.
    2. הוסף 0.4 מ"ל של 0.25% טריפסין.
    3. דגרו במשך 5 דקות באינקובטור CO₂, תוך ניטור ההיפרדות תחת מיקרוסקופ.
    4. נטרל את הטריפסין עם DMEM/10% FBS והעבר את כל תליית התא לצלחת 100 מ"מ המכילה 10 מ"ל מדיום.
      הערה: פיברובלסטים עוברים כאשר הם מגיעים לחיבור של 90%–100%. בתת-תרבויות שגרתיות, הן מחולקות ביחס של 1:3. אמפירית, התרבות פיברובלסטים מאטה או מפסיקה כאשר צפיפות התא נמוכה.
  2. שימור הקפאה בפיברובלסטים
    1. שטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS.
    2. הוסיפו 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, ואז דגרו במשך 5 דקות בתנור CO₂.
    3. לנטרל את הטריפסין עם DMEM/10% FBS ולהעביר את כל תליית התא לצינור של 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
    5. תשתה מחדש את כדור התא ב-2 מ"ל של 90% FBS/10% DMSO.
    6. אליקווט 0.5 מ"ל לכל קריוביאל.
    7. הניחו את הבקבוקים במיכל קפוא ואחסנו בטמפרטורה של −80°C במהלך הלילה.
    8. העבר את המבחנות לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.

9. מבחן מדיום מותנה

הערה: מטרת שלב זה היא להעריך את ההשפעות הפרקריניות של פיברובלסטים על אורגנואידים של גידולי ESCC באמצעות מדיום מותנה (CM). בדיקה זו מספקת מודל אינטראקציה שכפול בין סטרומל לגידול כאשר הקוקולטורה הישירה עדיין לא אופטימלית.

  1. הכנת מדיום מותנה ב-CAF/CF
    1. גידול את אותו מספר של CAFs או CFs ב-3 מ"ל DMEM/10% FBS על צלחות 60 מ"מ עד ל-80%–90% קונפלינק.
    2. שטוף תאים פעם אחת עם 2 מ"ל של PBS.
    3. תוסיף 3 מ"ל DMEM/2% FBS.
    4. דגרו במשך 48 שעות בתנור CO₂.
    5. אסוף את הסופרנטנט לתוך צינור של 15 מ"ל.
    6. צנטריפוגה ב-2000 × גרם למשך 5 דקות להסרת פסולת תאית.
    7. אסוף 2.5 מ"ל של הסופרנטנט לצינור חדש בנפח 15 מ"ל.
    8. מחלקים את המדיום המותאם למנות של 100–500 מיקרו-ליטר ואחסנים בטמפרטורה של -80°C.
  2. הכנת מדיום מבחן אורגנואידי
    1. הכינו את מדיום האורגנואיד ESCC כפי שמתואר בשלב 1.3.
    2. מערבבים את המדיום האורגנואידי והמדיום המותאם ביחס של 1:1 (50% v/v).
  3. תרבית של אורגנואידים סרטניים באמצעות מדיום הבדיקה האורגנואידית.
    1. לאחר מעבר אורגנואידים כפי שמתואר בשלב 7, אורגנואידים זרעים לתוך כיפה מטריציית ממברנת בסיס של 20 מיקרוליטר לכל באר על פלטת 48 בארות מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס).
    2. לאחר התמצקות הכיפה, הוסף 0.3 מ"ל מדיום אורגנואיד לכל באר.
    3. החלף את מדיום הבדיקה האורגנואידי כל 3–7 ימים.
    4. העריך את המורפולוגיה והגודל של האורגנואידים הסרטניים.
      הערה: כל החומרים שמקורם בבני אדם מטופלים כבעלי פוטנציאל לדבק. ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מסכות ומשקפי מגן, תמיד נלבש. קולגנז, דיספאז ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) עלולים לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובנשימה; לכן, נמנעים ממגע ושאיפה ישירים. כל ההליכים האנזימטיים הכוללים רקמות אנושיות מתבצעים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות. פסולת נוזלית המכילה רקמה אנושית נאספת במיכלים אטומים לביו-סיכון ומאוטוקלבת לפני ההשלכה. פסולת כימית, כולל DMSO ותמיסות אנזימים, מושלכת בהתאם להנחיות מוסדיות לפסולת מסוכנת. כל הכלים הרב-פעמיים נשטפים ב-70% אתנול ומאוטוקלבים לפני השימוש החוזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דגימות רקמה נאספו מאזור הגידול ומאזור סמוך שאינו גידולי, במרחק 3 ס"מ מהגידול, שנלקח בניתוח מחולה עם ESCC שלא קיבל כימותרפיה נאו-אדג'ובנטית. אורגנואידים סרטניים ו-CAFs בודדו מאזור הגידול, בעוד ש-CFs בודדו מהאזור הלא-גידולי. רקמות ניתוח פורקו לחתיכות בגודל של כ-0.5 מ"מ (איור 2A), לאחר מכן טופלו אנזימטית, ולאחר מכן אורגנואידים ופיברובלסטים מסרטן בודדו בנפרד. אורגנואידים ופיברובלסטים נדרשו כ-18–21 ימים לגדול ולהיות מוכנים לשימור קירור כמאגרי תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הדוחות הקודמים השתמשו באורגנואידים של סרטן וב-CAFs התואמים למטופלים כדי לחקור את תפקיד ה-CAFs בהתרבות ועמידות לתרופות בסרטן המעי הגס, השד, הלבלב וסרטן הראש והצוואר האנושיים 20,21,22,23,24. מחקרים אלו הראו כי CAFs משפיעים על התפשטות ועמידות לתרופות. מצד שני, לפי מיטב הידע הנוכחי, אין דוחות שפורסמו המתארים את השימוש באורגנואידים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרס החוקר הצעיר של אוניברסיטת חונטנדו (2024 ו-2025) ל-P. Z. ומענקי סיוע למחקר מדעי ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן (23K07362, 21K08693). אנו רוצים להודות לכל חברי מחלקות הפתולוגיה והאונקולוגיה, וכן לניתוחי וושט וגסטרואנטרולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 100 מ"מTPP93100
100x פניצילין-סטרפטומיצין (PS)נקלאי26253-84
צינור 15 מ"לFastGeneFG2001
לוח תרבית תאים עם 24 באריםTPP92024
לוח תרבית תאים עם 48 בארותTPP92448
צינור 50 מ"לFastGeneFG2004
צלחת 60 מ"מTPP93060
לוח תרבית תאים באורך 6 בארותTPP92006
A83-01קיימן9001799
DMEM/F12 מתקדם גיבקו12634010מדיום בסיסי אורגנואידי = DMEM/F12 מתקדם + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 נגד עכבר IgGInvitrogenA11029
אמפוטריצין Bתרמופישר15290018
נוגדן אנטי-וימנטין (V9)סנטה קרוזSC-62601/500 דילול לשימוש
B-27תרמופישר17504044
מסנן על גבי הבקבוקסארטוריוס180F15
מסננת תאים, 100 ומיקרו; נקבובBD פלקון352360
קולגנאז, סוג IסיגמהC0130
דיסק 60 מ"מ מצופה קולגןאיוואקי4010-010
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)וואקו043-07216
Dispase Iגודו שוסיי386-02271
ה-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbeccoנקלאי08459-64
ECLIPSE Ti2ניקון
סרום בקר עוברי (FBS)סרנהS-FBS-CO-015
מדיום צמיחה פיברובלסטים 2פרומוסלC-23020מדיום פיברובלסטים-1 = מדיום גדילה של פיברובלסטים 2
G418אינויווגןAnt-GN-1
GlutaMAX גיבקו35050061
HFDM-1KSK87-160פיברובלסטים בינוני-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 x PS
Hoechst33342 נקלאי04929-82
היגרומיציןאינויווגןאנט-HG-1
מערכת IncuCyteאסן ביוסיינס
תאי L-WRNATCCCRL-3276
מטריג'לקורנינג354234מטריצת ממברנת הבסיס = חומר
N2תרמופישר17502048
N-אצטיל-L-ציסטאיןוואקו017-05131
ניקוטינאמידTCIN0078
מלח זרחן (PBS)נקלאי14249-24
פרימוסיןאינויווגןאנט-PM-05
EGF אנושי רקומביננטיPEPROTECHAF-100-15
FGF-10 האנושי רקומביננטיPEPROTECHPEP-100-26
SB202190סלקS1077
סכין מנתח, מספר 11נוצה8-3086-02
STEMFULLבקליט סומיטומוMS-90150צינור 15 מ"ל עם חיבור נמוך = STEMFULL
TrypLE Expressגיבקו12605028טריפסין עבור אורגנואיד = TrypLE Express
טריפסיןנקלאי35556-44
Y-27632סלקS1049

מקורות

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Abbas, G., Krasna, M. Overview of esophageal cancer. Ann Cardiothorac Surg. 6 (2), 131-136 (2017).
  3. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  4. Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
  5. Lordick, F., et al. Oesophageal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 27 (suppl 5), v50-v57 (2016).
  6. Chhabra, Y., Weeraratna, A. T. Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity. Cell. 186 (8), 1580-1609 (2023).
  7. Caligiuri, G., Tuveson, D. A. Activated fibroblasts in cancer: Perspectives and challenges. Cancer Cell. 41 (3), 434-449 (2023).
  8. Mezawa, Y., Orimo, A. The roles of tumor- and metastasis-promoting carcinoma-associated fibroblasts in human carcinomas. Cell Tissue Res. 365 (3), 675-689 (2016).
  9. Mezawa, Y., Orimo, A. Phenotypic heterogeneity, stability and plasticity in tumor-promoting carcinoma-associated fibroblasts. FEBS J. 289 (9), 2429-2447 (2022).
  10. Qiu, L., et al. Cancer-associated fibroblasts: An emerging target against esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 546, 215860(2022).
  11. Xue, M., Tong, Y., Xiong, Y., Yu, C. Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 13, 1257266(2023).
  12. Dunbar, K. J., Wong, K. K., Rustgi, A. K. Cancer-associated fibroblasts in esophageal cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 17 (5), 687-695 (2024).
  13. Pimkhaokham, A., et al. Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: Possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res. 91 (11), 1126-1133 (2000).
  14. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  15. Fuchino, T., et al. Characterization of residual cancer by comparison of a pair of organoids established from a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy. Hum Cell. 37 (2), 491-501 (2024).
  16. Shen, S., et al. Advancing precision medicine in esophageal squamous cell carcinoma using patient-derived organoids. J Transl Med. 22 (1), 1168(2024).
  17. Zhang, S., Wang, C. Protocol to establish patient-derived xenograft and organoid for radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma. STAR Protoc. 5 (4), 103273(2024).
  18. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  19. Mashima, Y., et al. KIF24 depletion induces clustering of supernumerary centrosomes in PDAC cells. Life Sci Alliance. 5 (11), e202201470(2022).
  20. Hogstrom, J. M., et al. Simultaneous isolation of hormone receptor-positive breast cancer organoids and fibroblasts reveals stroma-mediated resistance mechanisms. J Biol Chem. 299 (8), 105021(2023).
  21. Schuth, S., et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 312(2022).
  22. Farin, H. F., et al. Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses. Cancer Discov. 13 (10), 2192-2211 (2023).
  23. Zapatero, M. R., et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 187 (25), 7335-7349 (2024).
  24. Rademaekers, M., Johansson, E. O., Johansson, E., Roberg, K., Wiechec, E. Tumor-matched and unmatched cancer associated fibroblasts exhibit differential effect on proliferation and FMOD and MMP9 gene expression in head and neck squamous cell carcinoma cells when co-cultured in spheroids. Cancer Cell Int. 24 (1), 190(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אורגנואידים של ESCCמיקרו-סביבת גידולסמני פיברובלסטיםפיברובלסטים תואמי-מטופלתרבית תלת-ממדיתאינטראקציות בין הגידול לסטרומה
הקמת אורגנידים גידוליים, פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה, ופיברובלסטים מקבילים מאותו מטופל סרטן וושט
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.