הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פתולוגיה סטריאטלית שנגרמה על ידי לנטריאלי כמודל פרה-קליני של אטקסיות תפינוצרבלריות פוליגלוטמין

426 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69550

⸱

13 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

במאמר זה

סיכום

אטקסיות של פוליגלוטמין ספינוצרבלריות נגרמות על ידי התפשטות CAG המייצרת חלבונים המועדים להצטברות. פרוטוקול זה מתאר ייצור וקטורים, מסירה סטריאוטקסית וניתוח הכללות ואובדן סמנים נוירונים, ומספק פלטפורמה מבוקרת לחקר מנגנונים ולהערכת טיפולים ממוקדים למחלות ניווניות עצביות.

תקציר

אטקסיות פוליגלוטמין ספינוצרבלריות הן קבוצה של שש מחלות ניווניות נוירודגנרטיביות הנגרמות על ידי מוטציה במסלול CAG של טרינוקלאוטידים באזור המקודד של כל גן גורם. מוטציה זו מובילה למתיחה מורחבת באופן חריג של פוליגלוטמין בחלבון, מה שהופך אותו לרגיש להצטברות ומוביל להיווצרות הכללות תוך-נוירונליות, שהן סימן ההיכר של מחלות אלו. המנגנונים המולקולריים שמאחורי הפתוגנזה של מחלות אלו מורכבים ואינם מובנים במלואם. עד כה, מחלות אלו נותרו חשוכות מרפא. הבנת המנגנונים המולקולריים באזורים פגיעים במוח חיונית להתפתחות טיפולית. נדרשות פלטפורמות ניסוי גמישות וספציפיות לאזור כדי לבדוק במהירות מנגנונים והתערבויות ללא הזמן והעלות של יצירת מספר קווים טרנסגניים, אף על פי שאינן מטפלות בפגיעות סלקטיבית. בשנים האחרונות, אנחנו ואחרים פיתחנו מספר מודלים מבוססי לנטיבירל לחקר השפעת ביטוי חלבוני מורחב באזורים מסוימים במוח. מודלים אלו מציגים תכונות נוירופתולוגיות והתנהגותיות המדמות תכונות מחלות, ומדגישות את חשיבותם בהבנת הפתוגנזה ובפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות. במאמר זה אנו מתארים את פיתוח מודל סטריאטלי באמצעות SCA2 כדוגמה. אנו מדגישים את התפתחות וייצור וקטורים לנטיויראליים, ואת ההזרקה הסטריוטקסית של הוקטורים המבטאים את הצורה המורחבת של אטקסין-2 (החלבון הגורם למחלה). לבסוף, אנו מאפיינים שני סימנים נוירופתולוגיים עיקריים: היווצרות הכללות ואובדן סמנים נוירונליים. על ידי מתן פלטפורמה מבוקרת המשחזרת את התכונות הפתולוגיות המרכזיות הללו, מודל זה מציע כלי חשוב לניתוח מנגנוני ניוון נוירודגנרטיביים ספציפיים לאזור ולהערכת התערבויות טיפוליות ממוקדות.

מבוא

אטקסיות פוליגלוטמין ספינוצרבלריות (polyQ SCAs) הן קבוצה של שישה הפרעות נוירודגנרטיביות אוטוזומליות דומיננטיות הנגרמות על ידי התרחבות חוזרות של טרינוקלאוטידים ב-CAG בגנים גורמים שונים, מה שמוביל למסלולי פוליגלוטמין רעילים (polyQ) בתוך חלבונים מקודדים1. ביניהם, ה-SCA הפוליקיו השכיחים ביותר הם SCA3/מחלת מאצ'אדו-ג'וזף ו-SCA22. הפרעות אלו משפיעות בעיקר על תאי עצב באזורים מסוימים במוח, כולל המוחון וגזע המוח, וכן על הסטריאטום ואזורים נוספים. כתוצאה מכך, הן גורמות לאי-תיאום מוטורי מתקדם, הפרעות בהליכה, ניוון נוירודגנרטיבי חמור ומוות מוקדם3.

פותחו מספר מודלים של בעלי חיים לחקר SCAs פוליQ ולבדיקת גישות טיפוליות. עכברים טרנסגניים, קווי הכניסה, ומודלים של עכברים עם ביטוי מותנה שימשו להבהרת הבסיס המולקולרי של התקדמות המחלה והמסלולים התאיים המעורבים 4,5. עם זאת, יצירת מודל חדש של בעלי חיים למחלה היא תהליך גוזל זמן ויקר, ולעיתים קרובות אינה מתאימה לחקר מעורבות אזורית של המוח בפתוגנזה של מחלה6.

מודלים מבוססי עכברים מבוססי Lentiviral (LV) מציעים חלופה משלימה למודלים קונבנציונליים, עם עלות מופחתת ואפשרות לחקור אזורים ספציפיים במוח 7,8. וקטורי לנטי-וירוס מאפשרים העברת גנים טרנסג'נדרים גדולים (עד 8 קילובייטים), מה שמוביל להזרמת פתולוגיה מהירה באזורים מוגדרים במוח ללא צורך בשינוי קו הנבט, וניתן להשתמש בהם בבעלי חיים בגילאים שונים. הזרקה ישירה של וקטורים לנטי-ויראליים לאזור המוח המטרה יכולה להשיג ביטוי ספציפי לאזור של גנים פתוגניים או טיפוליים עם אימונוגניות מופחתת בהשוואה לווקטורים ויראליים אחרים4. יתרה מזאת, לידה לאחר הלידה נמנעת מפיצוי התפתחותי כדי לחקור מנגנוני מחלה בתנאים הדומים יותר להתחלה אנושית9. רמות הביטוי יכולות להיות מוגדלות על ידי התאמת מינון הוויראל, יצירת פנוטיפים של חומרה מבוקרת והקלה על מידול התקדמות מחלה מדורגת. בנוסף, שיטה זו מאפשרת ביטוי ספציפי לסוג תא התלוי במקדם 4,7 שנבחר.

מספר מחקרים הראו את הפרקטיות והיעילות של מודלים מבוססי LV לעכברים למידול SCAs פוליQ 10,11,12,13. אנחנו ואחרים פיתחנו מודלים מבוססי LV ל-SCA11, SCA212, SCA311,12 ו-SCA714, המהווים פלטפורמות לביטוי מהיר או השתקה אזורית של גנים של מחלות תוך שכפול היבטים מרכזיים של נוירופתולוגיה.

לסיכום, הגישה הלנטיוויראלית המתוארת כאן מספקת כלי גמיש ויעיל למידול הפתוגנזה של SCAs פוליקיורי. על ידי התגברות על חלק מהחסרונות המרכזיים של מודלים בעלי חיים עכשוויים, שיטה זו מאיצה מחקרי הוכחת מושג ומספקת שליטה רבה יותר על הופעת, מיקום המחלה וחומרת המחלה – תכונות שהופכות אותה למתאימה מאוד לסינון טיפולי ולימוד מנגנונים מולקולריים. כאן, אנו מתארים שיטה ניתנת לשחזור ליצירת ואפיון מודל לנטיוויראלי סטריאטלי של אטקסיה פוליגלוטמין-ספינוצרבלרית, המאפשרת ניתוח מפורט של אירועים פתוגניים מוקדמים והערכת טיפולים מועמדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) ולמדריך המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. המחקר הנוכחי אושר על ידי מנהל המחקר הגרעיני של האלימנטאסאו והוטרינריה (DGAV). עכברים מסוג C57BL/6J שימשו במחקר זה והוכנסו לקבוצה בכלובים סטנדרטיים במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, כאשר אוכל ומים סופקו לפי החופשיות.

הערה: החומרים המשמשים בפרוטוקול זה מתוארים בהרחבה בטבלת החומרים.

1. אריזת וקטורים לנטיויראליים

הערה: כל ההליכים הכוללים וקטורי לנטי-ויראליים חייבים להתבצע במעבדת BSL-2 בהתאם להנחיות הבטיחות של המוסד. השתמשנו במערכת הטרנספקציה 4-פלסמידית בשל הבטיחות הביולוגית הגבוהה יותר שלה בהשוואה למערכות אחרות המייצרות לנטיווירוס (ראו איור 1 לפרטים על פלסמיד ההעברה).

  1. הפשרו תאי HEK 293T באמבט מים וזרעו אותם בבקבוק T75 באמצעות Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין, 10% FBS ו-1% Pen-Strep. מדיום DMEM מלא זה שימש בכל שלבי הפרוטוקול. השתמשו בתאים במספר המעבר ≤10 כדי להבטיח טיטרים ויראליים גבוהים ותוצאות עקביות.
    הערה: תמיד בדוק זיהום במיקופלסמה לפני הממשיכים.
  2. כאשר התאים מגיעים ל-80%-90% קונפלוס, הרחיב אותם לשני בקבוקי T175 על ידי חלוקת התרבית הראשונית ביחס 1:2. זרעו 20 צלחות תרבית בגודל 100 מ"מ עם 3.8 x 10,6 תאים בכל צלחת (נפח סופי 10 מ"ל) ודגרו אותן במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂. ספירת תאים לפי החרגת טריפאן בלו באמצעות המוסציטומטר של נויבאואר.
    הערה: שקלו להוציא את Pen-Strep מהמדיום כדי להפחית את הלחץ התאים, ובכך למקסם את העברת התאים.
  3. למחרת, הכינו את תערובת הטרנספקציה כפי שמתואר בטבלה 1. מערבולת ומסתובבת לזמן קצר כדי להומגן. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10–20 דקות כדי לאפשר יצירת קומפלקסים של DNA: PEI.
  4. לאחר ה-DNA: PEI קומפלקסים הורשו להיווצר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, התאימו את התערובת ל-5 מ"ל עם DMEM מלא.
    הסר 5 מ"ל מדיום מכל כלי תרבית (חצי מנפח סך הכלל) והחלף אותו בתערובת של 5 מ"ל של טרנספקציה. זה שומר על נפח התרבית הסופי של 10 מ"ל במהלך הטרנספקציה.
  5. העברו את התאים עם שלושת הפלסמידים האריזה ופלסמיד ההעברה כפי שמתואר בטבלה 1.
    הערה: כל הפלסמידים המשמשים לייצור לנטיווירוס צריכים להיות מוכנים באמצעות ערכות טיהור נטולות אנדוטוקסין. יתרה מזאת, יש לאמת את שלמות הפלסמיד באמצעות ניתוח אנזימי הגבלה כדי לאשר את נכונות אזורי ה-LTR ושל קלטת הטרנסגן לפני ההעברה.
  6. הוסף 5 מ"ל מתערובת הטרנספקציה לכיוון הטיפה לכל צלחת ודגרה במשך 6 שעות. שאפוף את כל המדיום והחלף אותו ב-10 מ"ל מדיום טרי. דגרו במשך 48 שעות.
    הערה: כדי להעלות את המדיום הוויראלי, אספו את המדיום ב-48 שעות, הוסיפו 10 מ"ל מדיום טרי לכל צלחת, ואספו שוב לאחר 24 שעות. המדיום שנאסף קודם ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 24 שעות. זה יאפשר ריכוז כפול מהנפח ויגדיל את הטיטר הוויראלי.
  7. סנן את כל התווך המותנה המכיל וקטורים לנטיויראליים באמצעות יחידת סינון של 0.22 מיקרון.

2. טיהור וטיטרציה של וקטורים לנטיוויראליים

  1. העבר את הסופרנטנט המסונן לצינורות אולטרה-צנטריפוגה חרוטיים מתאימים ולצנטריפוגה בעוצמה של 65,000 x גרם למשך שעה ו-30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, תוך שימוש, למשל, ברוטור דלי מתנדנד.
  2. השליכו בזהירות את הסופרנטנט ותחזירו כל כדור ב-400 מיקרוליטר של 1% BSA מדולל ב-1x PBS, תוך הימנעות מהיווצרות בועות. דגרו על הקרח לפחות שעה.
  3. לאחר שעה של דגירה, מערבבים בעדינות כל צינור כדי לוודא שהכדורים תלויים לחלוטין והומוגניים, ואז אגידו את כל הכדורים התלויים לצינור אחד.
  4. מלא את הצינור ב-1% BSA/PBS עד לפחות שני שלישים מלאים כדי למנוע קריסה במהלך הצנטריפוגה.
  5. צנטריפוגה שוב ב-65,000 x גרם למשך שעה ו-30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לפרוק את וקטורי הלנטיויראליים. זרקו בזהירות את הסופרנטנט וייבשו את שפת הצינור בנייר סטרילי.
  6. החזירו את הכדור המכיל את הוקטורים הלנטיויראליים ב-45 מיקרוליטר של 1% BSA/PBS, תוך הימנעות מבועות. אטום את הצינור עם סרט שקוף ודוגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  7. ביום הבא, יש להכין 10 מיקרו-ליטר אליקוטים של וקטורי הלנטיויראליים. שמור על 10 מיקרו-ליטר לטיטרציה: 5 מיקרוליטר לערכת ה-p24 ELISA ו-2 מיקרוליטר לערכת qPCR. יש להטיל את וקטורי הלנטיויראל באמצעות ELISA ו-qPCR לפי הוראות היצרן.
    הערה: בחירת שיטת הטיטרציה תלויה בצרכי הניסוי, לדוגמה, הערכה מהירה או כימות מדויק של יחידות זיהומיות. ELISA המבוסס על p24 מכמת את חלבון הקפסיד ולכן מודד את סך החלקיקים הפיזיקליים; הוא מהיר, זול יותר משיטות אחרות, וניתן לשכפול גבוה. עם זאת, הוא אינו מבדיל בין חלקיקים מדבקים לחלקיקים לא זיהומיים, מה שעלול להוביל להערכת יתר של הטיטר הפונקציונלי. הטיטרציה המבוססת על qPCR מודדת את מספר הגנומים הוויראליים (vg) הארוזים בחלקיקים, ומספקת הערכה מדויקת יותר של ויריונים המכילים גנום ומאפשרת השוואה ישירה בין הכנות וקטוריות. עם זאת, הוא עדיין לא יכול להעריך את ההדבקה האפקטיבית של חלקיקי הווירוס. לבסוף, בדיקות מבוססות זיהום, כגון ציטומטריית זרימה לווקטורים פלואורסצנטיים או יצירת מושבות עמידות לאנטיביוטיקה, מודדות ישירות יחידות טרנסדוקציה פונקציונליות (TU/ml) והן הרלוונטיות ביותר מבחינה ביולוגית, אם כי הן עתירות עבודה, תלויות בסוג תאים, גוזלות זמן ויקרות יותר15,16.

3. ניתוח סטריאוטקסי למשלוח לנטיוויראלי דו-צדדי בטריאטום העכבר

  1. הכנה לבעלי חיים
    1. שקלו את החיה וחשבו את מינון ההרדמה הנדרש. מתן הרדמה תוך-פריטונית במינון של 10 מיקרוליטר/גרם במשקל גוף באמצעות תמיסה מוכנה. תמיסה זו מוכנה על ידי שילוב של 7.5 מ"ל של 0.9% NaCl, 500 מיקרוליטר מדטומידין (1.0 מ"ג/מ"ל), 1.0 מ"ל מידזולם (5.0 מ"ג/מ"ל), ו-1.0 מ"ל פנטניל (0.05 מ"ג/מ"ל), לנפח סופי של 10 מ"ל. יש לאפשר כ-10 דקות לאינדוקציה מלאה של הרדמה.
    2. אשר עומק ההרדמה (למשל, רפלקס צביטה של האצבעות). מרחו משחה עינית על שתי העיניים וגלחו את הקרקפת.
    3. הנח את החיה במסגרת הסטריאוטקסית על כרית חימום. מקם את הראש באמצעות מוטות האוזניים ומוט הנשיכה.
      הערה: מספר בעלי החיים שיש להזריק ולציר הזמן תלויים בניסוי ויש לקבוע אותם באמצעות ניתוח כוח סטטיסטי מראש בהתבסס על ההשערות הספציפיות וגודל ההשפעה הצפוי. לדוגמה, במחקר הקודםשלנו 12, המוחות שהוזרקו נותחו בשבועות 4, 8 ו-12 שבועות לאחר ההזרקה כדי להעריך את התקדמות השינויים הנוירופתולוגיים.
  2. הכנת מזרק וטעינה ויראלית
    1. השתמש במחט המילטון הסטנדרטית לטעינה ובמחט קהה 26G להזרקה. טעין 2 מיקרוליטר של תמיסת וקטור לנטיוויראלית לתוך המזרק. ודאו שהמינון הוויראלי לכל אתר הזרקה הוא 400 ng של p24 אנטיגן למ"ל, או 5 x 109 IU/mL 10,12,17.
    2. התקן את המזרק במשאבת המיקרו-הזרקה האוטומטית (למשל, סטולטינג). הכניסו את המזרק למצב עירוי עד שטיפה נוזלית מופיעה בקצה המחט. ודא שהשיפוע פונה קדימה.
    3. הגדר את פרמטרי המשאבה - מהירות: 0.25 מיקרוליטר/דקה, נפח לחצי כדור: 2 מיקרוליטר, סוג מזרק: מתאים למה שנעשה בו שימוש.
      הערה: הנפח להזרקה תלוי במין המכרסם ובאזור המוח המטרה שיש לעבור. הזרקות של 1 מיקרוליטר יובילו לביטוי מוקד, בעוד שנפחים כוללים גדולים יותר (עד 10 מיקרוליטר) דורשים קצב הזרקה איטי מאוד ונושאים סיכון גבוה יותר להפרעה ברקמה או ריפלוקס.
  3. מיקוד והזרקה סטריאטלית
    1. חטא את הקרקפת עם 70% אתנול. בצע חתך בקו האמצע (~1–1.5 ס"מ) באמצעות להב סקלפל סטרילי שבין האוזניים לעיניים.
    2. חשפו ונקו את הגולגולת, הסרו את הפריוסטאום באמצעות מטליות כותנה. אתר את ברגמה והקלט את נקודת האפס הסטריאוטקסית (ידנית או דיגיטלית).
    3. קבעו קואורדינטות הזרקה ביחס לברגמה (לעכבר בגיל 8-12 שבועות עם כ-18-20 גרם): אנטרו-אחורי (AP) +0.6 מ"מ; מידיולטרלי (ML) ±1.8 מ"מ; הגב-בטן (DV): –3.3 מ"מ.
    4. תרגל בזהירות בקואורדינטות המסומנות של AP/ML. המשיכו לאט כדי להימנע מחדירה למוח. חלופה נוספת היא להפסיק כאשר העצם מדוללת מספיק – הדבר מתבטא בהצגת כלי הדם בדורה מאטר דרך הגולגולת. נקב בזהירות את הדורה מאטר עם מחט קטנה.
    5. בדוק שהחור במיקום הנכון על ידי הורדת מחט ההזרקה. בדוק אם מחט סותמת על ידי הזרקת חלק מהתמיסה עד שטיפה נראית בבירור.
    6. הורידו את מחט ההזרקה לאט לקואורדינטת ה-DV. הזרקו 2 מיקרוליטר של תמיסה ויראלית לכל חצי כדור בקצב של 0.25 מיקרוליטר/דקה. לאחר ההזרקה, המתינו 5 דקות לפני משיכת המחט לאט כדי למנוע ריפלוקס.
    7. הזרקת לנטי-וירוס מקודד לחלבון מסוג פראי (ATXN2WT או ATXN3WT) לחצי כדור אחד, ולנטי-וירוס המקודד לחלבון המוטנטי/המורחב (ATXN2MUT או ATXN3MUT) לצד הנגדי (אקראי או מוגדר מראש)12,13.
      הערה: באמצעות אטלס מוח העכבר18, כמעט כל אזורי המוח יכולים להיות מכוונים סטריאוטקסית מעבר לסטריאטום, כולל הקורטקס, ההיפוקמפוס, הסובסטנטיה ניגרה והמוחון. מכיוון שהמוחון הוא האתר העיקרי לפתולוגיה ב-SCAs, הוא מהווה יעד רלוונטי במיוחד להעברת וקטורים. לפיתוח מודל עכבר SCA3 זה במוחון, השתמשנו בקואורדינטות 1.6 מ"מ רוסטרל למבדה, 0 מ"מ מהקו האמצעי ו-1 מ"מ וונטרלי לפני הגולגולת, כאשר מוט הפה מוגדר על −3.3, מה שמבטיח מיקוד מדויק לקורטקס המוחון12,15.
  4. מעקב במהלך ניתוח
    1. לעקוב אחרי תנועות שפם ורפלקסים. אם נצפית תנועה, יש לתת מנת הרדמה משלימה (שליש מהנפח ההתחלתי).
  5. סגירת הפצע והחלמה
    1. סגור את החתך עם תפרי ניילון 5-0 שנקטעו 3–5. ניתן לתערובת תרופות אנטגוניסטיות תת-עורית במינון של 10 מיקרוליטר/גרם משקל גוף כדי להפוך את השפעות ההרדמה הראשונית. תמיסה זו מוכנה על ידי שילוב של 1.5 מ"ל של 0.9% NaCl, 500 מיקרו-ליטר אטיפמזול (5.0 מ"ג/מ"ל), 5.0 מ"ל פלומאזניל (0.1 מ"ג/מ"ל), ו-3.0 מ"ל נלוקסון (0.4 מ"ג/מ"ל), לנפח סופי של 10 מ"ל.
    2. הכניסו את החיה לכלוב נקי להתאוששות מעל כרית חימום ועקבו אחריו ללילה.
      הערה: חדר ההזרקה צריך להיות מצויד בארון בטיחות ביולוגי לטיפול בווקטורים. החוקרים חייבים ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות והגנה לעיניים. כל הפסולת (למשל, מחטים, מזרקים וחומרים מזוהמים) חייבת להיות מושלכת במיכלי ביו-סיכון בהתאם לתקנות מוסדיות וארציות.

4. איסוף, הכנה ועיבוד רקמות

  1. הכנה
    1. הכינו את כל מכשירי הניתוח והתמיסות הנדרשות להמתת חסד בעכברים ולאיסוף רקמות (למשל, הרדמה, 4% פאראפורמלדהיד [PFA] ב-PBS).
    2. הכין 4% PFA מראש, שמור אותו קפוא, והפשיר לא יותר מ-24 שעות לפני השימוש. ודאו שהתמיסה מקוררת היטב לפני הזרימה.
      אזהרה: PFA הוא רעיל. לטפל רק בתוך מכסה אדים עם ציוד מגן אישי (PPE) והדרכה מתאימים.
    3. מתן מינון קטלני של פנטוברביטל (100–200 מ"ג/ק"ג, תוך-פריטוני) כדי להרדים את בעל החיים. לאשר הרדמה עמוקה בהיעדר רפלקס צביטת האצבעות; אם הרפלקס נמשך, תנו מנה נוספת.
  2. פרפוזיה טרנסקרדיאלית
    1. מיקום ואבטח את החיה במכשיר הניתוח. באמצעות מלקחיים, הרימו את עור הבטן ובצעו חתך אנכי עולה עם מספריים (איור 2A, חץ ורוד).
    2. הרימו את הפאשיה השטחית ובצעו חתך עליון עד שהכבד נראה לעין, וכך נמנעים מפגיעה באיברי הבטן.
    3. חתוך את הסרעפת אופקית, ואז האריך את החתך לכיוון האקסילה (איור 2A, חץ לבן). תחזיר את עצמך ותסגור את דופן החזה.
    4. הכנס מחט פרפוזיה לקצה החדר השמאלי, כדי לוודא שהיא לא חודרת את דופן החדר הפנימי. בצע חתך קטן באטריום הימני עם מספריים דקים (איור 2B).
    5. התחל בפרפוזיה טרנסקרדיאלית באמצעות 50 מ"ל פאראפורמלדהיד 4% קרח (PFA) בקצב זרימה של 1-2 מ"ל לדקה.
      הערה: לעיתים קרובות, התמיסה הקרה גורמת לכיפוף הזנב ולעוויתות שרירים, מה שמצביע על פרפוזיה טובה.
  3. ניתוח מוחי
    1. הכינו צינור עם כמות מספקת של PFA 4% כדי להטביע את המוח במלואו. ערפו את ראש העכבר עם מספריים גדולים. השליכו את הגופה בשקית ביולוגית אטומה לשריפות.
    2. השתקף את הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת. זהה את הפורמן מגנום והתחל להסיר את הגולגולת על ידי חיתוך צדדי עם מספריים דקים, במקביל למוח (איור 2C).
    3. חזור על הפעולה בצד הנגדי, ואז חתך את הגולגולת בין העיניים מעל פקעות הריח.
    4. הרם את הגולגולת מהמוחון לכיוון פקעות הריח כדי לחשוף את המוח. באמצעות מרית, הסר בזהירות את המוח מאחורי לקדמי וטבול אותו ב-4% PFA למשך לא יותר מ-24 שעות בטמפרטורה של 4°C.
    5. החלף את תמיסת ההטמעה ב-20%-30% סוכרוז ב-PBS ודגר בטמפרטורה של 4°C עד להשלמת החדירה. המוח יצוף בתחילה ואז ישקע ברגע שהוא חודר במלואו, בדרך כלל בתוך 24 שעות. אם הוא נשאר צף, האריך את הדגירה עד שהיא מתיישבת בתחתית הצינור.
      הערה: שלב ההגנה הקריוגנרית הזה מפחית ארטיפקטים של הקפאה על ידי הפחתת תכולת המים ברקמות.
      ייבשו בעדינות את המוח והצינור, ואז שמרו בטמפרטורה של מינוס 80°C עד לשימוש נוסף.
  4. קריוסקציה ואיסוף רקמות צפות חופשיות
    1. לפני החיתוך, כוון את הקריוסטט ל-20 מעלות צלזיוס ובעובי הרצוי.
      הערה: עבור הסטריאטום, חתכים קורונליים בעובי של 20-25 מיקרון מציעים פשרה אידיאלית בין שימור מבני לחדירת נוגדנים, ומייצרים חתכים עמידים מספיק לטיפול תוך שמירה על איכות צביעה ורזולוציה מרחבית גבוהה. תנאי הקריוסקציה צריכים להיות מוגדרים גם לאזורים אחרים במוח, שכן העובי האופטימלי יכול להשתנות בהתאם לארכיטקטורה ציטו. למוחון, בדרך כלל מומלץ לחתכים סגיטליים בגודל 25–35 מיקרון, שכן עובי זה שומר על הארגון השכבתי של הקורטקס המוחון.
    2. העבירו את המוח על קרח יבש ותנו לו להתאזן בתוך הקריוסטט למשך 5-10 דקות. שלב זה חשוב למניעת נזק לרקמות.
    3. הסר את פקעות הריח עם סכין מנתח; הן צריכות להיות רכות וקלות לחיתוך שלהן. הניחו טיפה בגודל אפונה של O.C.T. טרייה על דיסק הדגימה והניחו את המוחון במגע (איור 1D). מקם את המוח לחתך קורונלי. לאחר ההקפאה, מוסיפים O.C.T. נוסף כדי להטמיע את כל המוח.
      הערה: O.C.T. שקוף בטמפרטורת החדר והופך ללבן אטום כאשר הוא קפוא לחלוטין; אם הוא נשאר מבריק, אפשר יותר זמן הקפאה בקריוסטט.
    4. התקן את דיסק הדגימה במחזיק וגזם עד שהסטריאטום (שני עיגולים לבנים בכל חצי כדור) נראה. אם ההמיספרות קיבלו טיפולים שונים, דקרו חצי כדור אחד עם מחט כדי לשמור על הכיוון. תרשום זאת לניתוח מאוחר יותר.
    5. עברו למצב חתכים ואספו חלקים צפים בפלטת 48 בארות באמצעות מברשת דקה או פיפטת פסטר מזכוכית מלוטשת באש.
      הערה: שיטת הציפה החופשית משפרת את חדירת הנוגדנים, מפחיתה את הרקע, מאפשרת אחסון ארוך טווח ומבטיחה מקטעים מרווחים באופן שווה לכיסוי סטריאטלי מלא.
    6. מלא בארות ב-PBS המכיל 0.05% נתרן אזיד.
      אזהרה: נתרן אזיד הוא רעיל - יש לטפל בו בציוד מגן אישי ולהיפטר מהפסולת בצורה נכונה.
    7. הניחו את הקטע הראשון בבאר A1, את השני ב-A2, והמשיכו ברצף. כאשר הלוח מלא, המשיכו בלוח חדש או חזרו לבאר A1 וממשיכים עד שכל הכריכה נחתכת (~3 לוחות מלאים עם 48 בארים). אטום לוחות עם סרט שקוף ואחסן בטמפרטורה של 4°C עד השימוש.
      הערה: לניתוח סטריאטום שלם, בחירת עמודה אחת מהצלחת מניבה חתכים מרווחים שווים המייצגים את כל האזור.

5. אימונוהיסטוכימיה עם צביעת DAB

  1. שטוף מקטעים 3 פעמים ב-PBS כדי להסיר שאריות נתרן אזיד. דגרו בתמיסת פנילהידרזין (0.2 - 0.3 מ"ג/מ"ל ב-PBS) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    אזהרה: פנילהידראזין הוא חומר מסרטן - בצע את השלב הזה במכסה אדים והשליך פסולת כמסוכנת.
  2. שטוף 3 פעמים ב-PBS ל-5 דקות, 10 דקות, 10 דקות ברצף. חסום את הרקמה למשך שעה ב-RT ב-PBS המכיל 10% סרום עזים תקין (NGS) ו-0.1% טריטון X-100.
  3. דגרו לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני בדילול המומלץ (למשל, אנטי-אטקסין-2 בעכבר, 1:1000 בתמיסת חסימה) תחת ערבוב עדין. שטוף 3 פעמים ב-PBS ל-5 דקות, 10 דקות, 10 דקות ברצף.
  4. דגרו עם נוגדן משני ביוטינילטיבי (1:200 בתמיסת חסימה) למשך שעתיים ב-RT תחת ערבוב עדין. שטוף 3 פעמים ב-PBS ל-5 דקות, 10 דקות, 10 דקות ברצף.
  5. דגרו במתחם ABC למשך 30–40 דקות ב-RT. שטפו 3 פעמים ב-PBS במשך 5 דקות, 10 דקות, 10 דקות ברצף.
  6. הכינו תמיסת DAB טרייה: עבור 2.5 מ"ל מים אולטרה-טהורים, הוסיפו בופר טיפה אחד ומערבולת אחת; להוסיף 2 טיפות DAB ו-Vortex; הוסף 1 טיפה H₂O₂ ושוב מערבולת.
    אזהרה: DAB הוא חומר מסרטן - לטפל במכסה אדים ולהשליך פסולת כראוי.
  7. פתח חתכים בתמיסת DAB בנפרד עד שמגיעים לעוצמת הצביעה הרצויה (בדרך כלל 1–10 דקות). עצור את התגובה מיד על ידי העברה ל-PBS.
    הערה: תגובתיות DAB פוחתת עם הזמן; לעבוד ביעילות. אם יש יותר מחלק אחד בבאר בו זמנית, ודא שהם אינם במגע, שכן זה ישפיע על תהליך הצביעה.
  8. שטוף 3 פעמים ב-PBS ל-5 דקות, 10 דקות, 10 דקות ברצף. התקן חלקים על מגלשות מצופות ג'לטין ותן להם להתייבש לחלוטין. אל תתייג שקופיות בעיפרון גרפיט, כי זה עלול להפריע להדמיה.
  9. ייבוש, ניקוי ו-coverslip כדלקמן: טבלו במים מזוקקים במשך 30 שניות, ייבשו באמצעות סדרת אתנול: 75%, 96%, 100% (3 דקות כל אחד). שקה בתחליף קסילן ל-5 דקות וייבש באוויר. מרח כיסוי באמצעות מדיום התקנה מהיר ומאפשר לו להתייבש בתוך מכסה האדים לפחות 24 שעות לפני ההדמיה או האחסון.

6. כימות נפח מדולדל DARPP-32 בסטריאטום העכבר באמצעות FIJI (ImageJ)

  1. רכישת תמונה
    1. לצלם תמונות של חתכי קורונל במוח המשתרעים על כל הסטריאטום (בערך ברגמה +1.0 עד –0.5 מ"מ). שמור על תאורה, הגדלה עקבית (למשל, 10x) ורזולוציה. שמור תמונות בפורמט TIFF עם שמות קבצים עוקבים (למשל, Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. הכנת תמונות בפיג'י
    1. פתח כל תמונה בפיג'י. כיייל את גודל הפיקסלים: עבור לנתח > להגדיר קנה מידה. השתמש בקנה מידה ידוע ממיקרומטר או מטא-דאטה של התמונה (למשל, 1 פיקסל = 1 מיקרון).
    2. המרת תמונות ל-8 ביט: תמונה > Type > 8 ביט. כוון את הבהירות/הניגודיות אם צריך כדי להמחיש את השטח המדולדל בצורה מיטבית (הימנע מסף בשלב זה).
  3. בחירת תשואה (ROI) של אזורים מדוללים
    1. השתמשו בכלי Polygon, Freehand או Brush כדי לתאר את האזור המדולדל מ-DARPP-32 (בדרך כלל עם כתמים בהירים או ללא כתמים בסטריאטום). עבור לניתוח > מדידה כדי לתעד את השטח במיקרומטר2.
    2. שמור את ה-ROI על ידי כניסה ל-ROI Manager > להוסיף > עוד > לשמור או להשתמש בפונקציית Multi-measure לניתוח אצווה.
    3. חזור על זה בכל חלקי המוח הרלוונטיים.
  4. חישוב נפח מדולדל
    1. הכפל את השטח המדולדל בכל חתך במרחק בין החתכים (בדרך כלל 120–240 מיקרון, תלוי בעובי החתך ובמרחק).
      נפח לחתך (מ"מ 3) = שטח מרוקן (מ"מ 2) × מרווח חתך (מ"מ)
    2. סכם את הכרך בכל החלקים:
      נפח מדולדל כולל (מ"מ 3) = Σ (שטח × מרווח)
    3. אופציונלי: שכבה לוויזואליזציה. השתמש בתמונה > Overlay > From ROI כדי להמחיש את האזורים המדולדלים בין החלקים. ייצא תמונת סיכום או אנימציה עבור הדמויות.
  5. תמיד בדוק יישור עם אטלס מוח העכבר למיפוי רוסטרו-קאודלי מדויק. נתחו כל חצי כדור בנפרד כדי להבחין בין השפעות חד-צדדיות (למשל, הזרקת WT לעומת הזרקה מוטנטית).

7. כימות אגרגטים חלבונים בסטריאטום העכבר

  1. כימות ידני באמצעות FIJI
    1. טען וכייל את התמונה. פתח את התמונה בפיג'י. כייל את גודל הפיקסל (דלג על השלב הזה אם משתמשים בתמונות עם מטא-דאטה).
    2. עבור לנתח > קנה מידה, הזן את המרחק הידוע (למשל, 1 פיקסל = 0.5 מיקרון). בפיג'י, עבור לתוספים > לנתח > מונה תאים > מונה תאים. לחץ על אתחול, ואז בחר את התמונה.
    3. בחר סוג סמן (למשל, סוג 1) עבור אגרגטים. לחצו ידנית על כל אגרגט נראה כדי לתייג אותו. נתוני רשומה: FIJI תציג את הספירה בפאנל Cell Counter. ספירת רשומות לכל תמונה/חלק. ייצוא ספירות ידנית או השתמש במאקרו כדי לקמפל תוצאות.
  2. כימות חצי-אוטומטי באמצעות IHCAggreCount
    1. העלה ומעבד תמונות. פתח את IHCAggreCount ולחץ על העלאת תמונה (איור משלים 1).
      הערה: יישום IHCAggreCount פותח במעבדתנו ככלי מדעי עצמאי שנועד לייעל ולתקן את הכימות של אגרגטים תאים מתמונות מיקרוסקופיה. התוכנה נבנתה כולה בפייתון באמצעות ארכיטקטורה מודולרית שמפרידה בין טיפול בתמונה, עיבוד, תיקוני בחירה, חישוב מדידה ואחרים. IHCAggreCount תואם במלואו ל-Windows 10 ו-Windows 11, וכן ל-macOS 13 Ventura ו-macOS 14 Sonoma, ונבדק בהצלחה בשתי הפלטפורמות. בהשוואה לשיטות בדיקה ידניות מסורתיות, התוכנה מספקת יתרונות אנליטיים משמעותיים: היא מפחיתה את הסובייקטיביות של המשתמש, מבטלת שלבים ידניים חוזרים, מאיצה עיבוד תמונה, מבטיחה מדידות שחזוריות, מאפשרת חילוץ עקבי באזור העניין, ומאפשרת עיבוד אצווה בסביבות מרובות. בסך הכל, היישום מספק זרימת עבודה מהירה, אובייקטיבית וחזקה יותר לזיהוי וכימות גלובוליות מאשר הגישה הידנית המסורתית. הבקשה זמינה מהמחברים לפי בקשה סבירה.
    2. התמונה תופיע בתצוגת התמונה המקורית. עבר ללשונית העיבוד. החלו את HiLo כדי לשפר את האגרגטים/ניגודיות הרקע (ראו איור משלים 2). החלו סף בהירות על סינון אגרגטים מהרקע (איור משלים 3). השתמש במסנן הגודל המינימלי להסרת חלקיקים קטנים (רעש) (איור משלים 4). באופן אופציונלי, ניתן להחיל את סף העגול כדי להוציא צורות שאינן מצטברות (איור משלים 5).
    3. לזיהוי אגרגטים של IHC, גש ללשונית כללית ולחץ על חישוב סך אגרגטים וחישוב שטח מצטבר. כל האגרגטים שזוהו מסומנים ומופיעים בטבלת המטריצות (מזהה, שטח, גודל ממוצע; איור משלים 6).
  3. תיקונים ידניים (אופציונלי)
    1. עבור ללשונית התיקון, השתמש ב-Smart Add כדי לזהות אוטומטית אגרגטים באזורים נבחרים (איור משלים 8). השתמש בתוספת ידנית כדי לתייג אגרגטים ידנית. השתמש ב-Smart Delete כדי להסיר תוויות לא רצויות. (אגרגטים מודגשים מוצגים לבדיקה ויזואלית; איור משלים 7).
  4. יצוא תוצאות
    1. לחץ על ייצוא CSV כדי לייצא את נתוני התמונה הנוכחיים. לחץ על ייצוא הכל כדי לייצא נתונים באצווה מתוך מספר תמונות שנותחו. תמיד נתח תמונות תחת אותן הגדרות בהירות/ניגודיות ופרמטרים אחרים (למשל, סף) בין קבוצות ניסוי ב-IHCAggreCount.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקר זה זיהה בהצלחה את הביטוי של אטקסין-2 ו-DARPP-32 באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. לאחר הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים לנטיויראליים לסטריאטום של עכברי C57BL/6J, זוהה ביטוי חזק של אטקסין-2 מסוג פראי ומוטנטי לאחר 12 שבועות. הראינו בעבר12 שהמבנים הללו ייחודיים לנוירונים, ובפועל ממירים בממוצע 20,000 נוירונים למ"מ 3. בתנאי הניסוי שלנו, צביעת חיסון לאטקסין-2 חשפה התפלגות ציטופלזמית מפוזרת של אטקסין-2 מסוג פראי , מבלי ליצור הכללות נפרדות (22Q;

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתאר את יצירת מודל עכבר לנטיוויראלי סטריאטלי עבור SCA פוליQ. הוא גם מתאר את ייצור וקטורים לנטיויראליים בעלי טיטר גבוה המקודדים את הצורה הפראית והמורחבת של החלבון הגורם לצורה, ואת ההזרקה הדו-צדדית של ה-LVs לסטריאטום העכבר באמצעות ניתוח סטריאוטקסי. בנוסף, הוא מתאר את תהליך איסוף המוח, העיבוד ההיסטולוגי וכימות מבוסס תמונה של סימני ההיכר של המחלה. ביחד, שיטות אלו מאפשרות יצירת מודל עכבר SCA מסוג לנטיוויראלי polyQ המראה אגרגטים חלבונים ואובדן סמנים נוירונליים בסטריאטום, שניתן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

המעבדה של קלביו נוברגה ממומנת על ידי פרויקט Cure CSB, על ידי אגודת וילים ג'וליאן לילדים עם מחלות נדירות (סלובניה), ועל ידי מכון המחקר של מרכז הביו-רפואי אלגרווה (ABC-Ri). חלק מחברי מאמר זה מחזיקים במלגת דוקטורט במימון קרן המדע והטכנולוגיה (FCT), עם המקורות הבאים: טיאגו מוריירה-גומס (2022.11008.BD), אינס ט' אפונסו (2022.10161.BD), ורפאל ג'י קוסטה (2022). 11973.BD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% NaClספק מקומי—משמש להכנת תערובות הרדמה ואנטגוניסטים
צלחות תרבית רקמות 100 ממSPL Life Sciences11090
ערכת ABC (Avidin-Biotin Complex)VECTASTAIN Elite
Atipamezole (5.0 מ"ג/מ"ל)ספק מקומי—אנטגוניסט של מדטומידין
צנטריפוגה שולחן עבודה--
תא בטיחות ביולוגית, Class II (תואם BSL-2)--
נוגדן משני ביואטין--
אלבומין בקר (BSA)NZYTechMB47002
חלקי מוח (למשל, 30–40 µm חתכים קורונליים) שנצבעו ל-DARPP-32--
תוסף Cell Counter (FIJI)Built-in / ImageJ—כלי לספירה ידנית של אגרגטים
חממת CO2 (37 °C, 5% CO2, מאווררת)--
תחנת עבודה מחשבספק מקומי—משמש לעיבוד תמונות וביצוע תוכנה
צינורות אולטרה-צנטריפוגה חרוטייםBeckman Coulter358126
מטליות כותנהספק מקומי—משמש להסרת פריוסטיאום
קריו-סטט עם מחזיק דיסק דגימה--
DAB (דיאמינו-בנזידין)--
קורא קואורדינטות סטריאוטקסי דיגיטליStoelting/WPI51725תצוגה דיגיטלית למדידת קואורדינטות
מדיום דולבקו שונה (DMEM, גלוקוז גבוה)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
אתנול 70, 96 ו-100%--
אתנול, 70%ספק מקומי—להחטאת קרקפת
פנטניל (0.05 מ"ג/מ"ל)ספק מקומי—מרכיב הרדמה
סרום עוברי בקר (FBS), מחוסן בחוםGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (תפוצת ImageJ)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/תוכנה בקוד פתוח לכימות ידני של אגרגטים
מלקטות עדינות (לצביטת אצבעות)ספק מקומי—להשגחה על עומק הרדמה
פלומזיניל (0.1 מ"ג/מ"ל)ספק מקומי—אנטגוניסט של מידזולאם
מלקטות ומחט ניתוחספק מקומי—להסרת פריוסטיאום וחשיפת גולגולת
מזרקי מיקרוליטר/מזרקי גז חסינים של Hamilton 700/1700 SeriesHamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203להטעינת תמיסה ויראלית
מחטים הניתנות להסרה של Hamilton Small Hub (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205למסירה ויראלית
משטח חימום (למכרסמים)Kent Scientific / SOMNIלמשל 04-777-177לשמירה על טמפרטורת הגוף
תאי HEK 293T (≤ מעבר 10, ללא מיקרופלזמה)ATCC או מקבילCRL-3216
מי חמצן--
תוכנת IHCAggreCountמסופקת לפי דרישהN/Aתוכנה ביתית קניינית לזיהוי וכימות חצי-אוטומטי של אגרגטים
מיקרוסקופ הפוך (לצפיפות תאים)--
מערבל וורטקס מעבדתי--
ווקטורים לנטי-ויראליים (WT ומטאנטים)ביתית / מתקן מרכזיN/Aתמיסה ויראלית להזרקה
L-גלוטמין (200 מ"מ)Gibco/Thermo Fisher25030081
מיקרוסקופ אופטי עם מצלמה (שדה בהיר)--
מדטומידין (1.0 מ"ג/מ"ל)ספק מקומי—מרכיב הרדמה
מקדחה מיקרוסקופית (תואמת סטריאוטקסי)Stoelting / ספק מקומי—לקרניאוטומיה
משאבת מיקרו-הזרקה (למשל, Stoelting)Stoelting/WPI53210משאבה אוטומטית להזרקות ויראליות
מיקרו-פיפטות (P1000, P200, P10) וטיפים--
תמונות מיקרוסקופ (חתכי IHC)נוצרו בביתN/Aתמונות אימונוהיסטוכימיות לניתוח
להבי מיקרוטום (פרופיל נמוך, חד-פעמיים)--
מדאזולאם (5.0 מ"ג/מ"ל)ספק מקומי—מרכ

מקורות

  1. Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias. Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).
  2. Durr, A. Autosomal dominant cerebellar ataxias: polyglutamine expansions and beyond. Lancet Neurol. 9 (9), 885-894 (2010).
  3. McIntosh, C. S., Li, D., Wilton, S. D., Aung-Htut, M. T. Polyglutamine Ataxias: Our Current Molecular Understanding and What the Future Holds for Antisense Therapies. Biomedicines. 9 (11), 1499(2021).
  4. Henriques, C., et al. Viral-based animal models in polyglutamine disorders. Brain. 147 (4), 1166-1189 (2024).
  5. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The Construction of Transgenic and Gene Knockout/Knockin Mouse Models of Human Disease. Transg Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  6. Tello, J. A., Williams, H. E., Eppler, R. M., Steinhilb, M. L., Khanna, M. Animal Models of Neurodegenerative Disease: Recent Advances in Fly Highlight Innovative Approaches to Drug Discovery. Front Mol Neurosci. 15, 883358(2022).
  7. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. Development of a gene therapy with lentiviral vectors for spinocerebellar ataxias. Methods Mol Biol. 2974, 215-225 (2026).
  8. Parr-Brownlie, L. C., et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 8, 14(2015).
  9. Zwi-Dantsis, L., Mohamed, S., Massaro, G., Moeendarbary, E. Adeno-Associated Virus Vectors: Principles, Practices, and Prospects in Gene Therapy. Viruses. 17 (2), 239(2025).
  10. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. From the disruption of RNA metabolism to the targeting of RNA-binding proteins: The case of polyglutamine spinocerebellar ataxias. J Neurochem. 168 (8), 1442-1459 (2024).
  11. Matsuzaki, Y., Oue, M., Hirai, H. Generation of a neurodegenerative disease mouse model using lentiviral vectors carrying an enhanced synapsin I promoter. J Neurosci Meth. 223, 133-143 (2014).
  12. Marcelo, A., et al. Autophagy in Spinocerebellar ataxia type 2, a dysregulated pathway, and a target for therapy. Cell Death Dis. 12 (12), 1117(2021).
  13. Alves, S., et al. Striatal and nigral pathology in a lentiviral rat model of Machado-Joseph disease. Human Mol Genet. 17 (14), 2071-2083 (2008).
  14. Alves, S., et al. Lentiviral vector-mediated overexpression of mutant ataxin-7 recapitulates SCA7 pathology and promotes accumulation of the FUS/TLS and MBNL1 RNA-binding proteins. Mol Neurodegenerat. 11 (1), 58(2016).
  15. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6 (1), 34(2006).
  16. Arrasate, A., et al. Establishment and Characterization of a Stable Producer Cell Line Generation Platform for the Manufacturing of Clinical-Grade Lentiviral Vectors. Biomedicines. 12 (10), 2265(2024).
  17. Nóbrega, C., et al. Overexpression of Mutant Ataxin-3 in Mouse Cerebellum Induces Ataxia and Cerebellar Neuropathology. Cerebellum. 12 (4), 441-455 (2013).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Compact Second Edition, Gulf Professional Publishing. (2004).
  19. Bateup, H. S., et al. Distinct subclasses of medium spiny neurons differentially regulate striatal motor behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14845-14850 (2010).
  20. Nóbrega, C., et al. Molecular hallmarks of neurodegeneration in polyglutamine spinocerebellar ataxias. Cell Death Dis. 16 (1), 826(2025).
  21. Murakami, Y., et al. AAV-based gene therapy ameliorated CNS-specific GPI defect in mouse models. Mol Ther Meth Clin Dev. 32 (1), 101176(2024).
  22. Wada, H., et al. AAV-based gene therapy ameliorates neurological deficits in a mouse model of childhood-onset neurodegeneration with cerebellar atrophy. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 33 (11), 5829-5839 (2025).
  23. Konno, A., Shinohara, Y., Hirai, H. Production of Spinocerebellar Ataxia Type 3 Model Mice by Intravenous Injection of AAV-PHP.B Vectors. Int J Mol Sci. 25 (13), 7205(2024).
  24. Jansen-West, K., et al. Plasma PolyQ-ATXN3 Levels Associate With Cerebellar Degeneration and Behavioral Abnormalities in a New AAV-Based SCA3 Mouse Model. Front Cell Dev Biol. 10, 863089(2022).
  25. Nóbrega, C., Mendonça, L., Matos, C. A. A Handbook of Gene and Cell Therapy. , Springer International Publishing. Cham. (2020).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Ther. 24 (2), 132-142 (2013).
  28. de Almeida, L. P., Ross, C. A., Zala, D., Aebischer, P., Déglon, N. Lentiviral-Mediated Delivery of Mutant Huntingtin in the Striatum of Rats Induces a Selective Neuropathology Modulated by Polyglutamine Repeat Size, Huntingtin Expression Levels, and Protein Length. J Neurosci. 22 (9), 3473-3483 (2002).
  29. Fisher, E. M. C., Bannerman, D. M. Mouse models of neurodegeneration: Know your question, know your mouse. Sci Transl Med. 11 (493), eaaq1818(2019).
  30. Bii, V. M., Collins, C. P., Hocum, J. D., Trobridge, G. D. Replication-incompetent gammaretroviral and lentiviral vector-based insertional mutagenesis screens identify prostate cancer progression genes. Oncotarget. 9 (21), 15451-15463 (2018).
  31. Alves-Cruzeiro, J. M. D. C., Mendonça, L., Pereira de Almeida, L., Nóbrega, C. Motor Dysfunctions and Neuropathology in Mouse Models of Spinocerebellar Ataxia Type 2: A Comprehensive Review. Front Neurosci. 10, 572(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Ataxin 2
פתולוגיה סטריאטלית שנגרמה על ידי לנטריאלי כמודל פרה-קליני של אטקסיות תפינוצרבלריות פוליגלוטמין
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.