Method Article

מבחן פרופיל תרומבוס: פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה לאפיון מקיף של תרומבוגנזה ביומכנית

DOI:

10.3791/69555

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מתארת בדיקה מיקרופלואידית המשתמשת במאמץ גזירה כדי להפעיל יצירת קרישי דם בדם ומאפיינת את הקריק באמצעות ממדים מרובים של קריאה. הבדיקה יכולה למדוד את הנטייה הפרותרומבוטית של דגימות דם, ולכן היא שימושית באבחון מחלות, גילוי תרופות, וכן במחקרים מכניים בסיסיים הקשורים לטרומבוזיס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרומבוזיס היא מצב פתולוגי המתאר הצטברות לא תקינה של טסיות וגורמי קרישה בכלי דם. בעוד שרבות מהעבודות התמקדו בהפעלת טסיות על ידי אגוניסטים מסיסים כמנגנון בסיסי לקרישה, לעיתים קרובות התעלמו מכך שזרימת הדם גם מקלה על היווצרות קרישי דם. במיוחד, בעורקים, טרומבוזה קשורה בדרך כלל להיצרות עורקית, שמגבירה את עומס הגזירה בזרימת הדם ומקלה על תהליך הטרומבוגנזה, תופעה הנקראת טרומבוגנזה ביומכנית. זמן רב לא הייתה ביואסאית זמינה לספק תובנות מקיפות ומפורטות על תהליך הטרומבוגנזה הביומכנית. כדי להתמודד עם זה, פותחה מבחן פרופיל קרישי דם על ידי שילוב מיקרופלואידיקה עם הדמיית פלואורסצנציה רב-צבעונית, המאפשרת אפיון מקיף של התרומבוגנזה הביומכאנית עם שבעה קריאות המכסות את גודל והרכב הקרקע וכן את רמת הפעלת הטסיות. מבחן פרופיל קרישי דם זה יכול לשמש להערכת הנטייה הפרותרומבוטית בבני אדם ואת יעילות התרופות האנטי-טרומבוטיות, והוא גם שימושי להבנה מעמיקה יותר של המנגנונים שמאחורי טרומבוזה עורקי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרומבוזה היא גורם עיקרי למחלות לב וכלי דם, ואחראית למיליוני מקרי מוות ברחביהעולם מדי שנה. נכון להיום, אין ביואסיי זמין בסביבות קליניות סטנדרטיות להערכת סיכוני טרומבוזיס. מבין הבדיקות המסחריות למעבדה ובנקודת טיפול, בדיקות קרישה קונבנציונליות ואגרגומטריה הוכחו כבלתי אמינות בחיזוי קרישה או אירועים קרדיווסקולריים שליליים משמעותיים 2,3,4. בדיקות קרישה גלובלית5, PFA-100/2006, ובדיקות קרישה גלובלית 7,8,9,10,11 גם הן כוללות נתונים מוגבלים התומכים בביצועיהם.

בהתבסס על ההבנה הנוכחית, תהליך התרומבוגנזה מתבצע בעיקר על ידי שלושה מנגנונים. מלבד שני המנגנונים המקובלים, כלומר הצטברות וקרישה ביוכימית של טסיות, מנגנון שלישי שנחקר מספיק ולעיתים מוערך פחות הוא הצטברות טסיות מונעת על ידי גזירה, שכונתה גם "הצטברות בטסיות ביומכניות"12,13. באגרגציה ביומכנית של טסיות, מאמץ גזירה גבוה וגרדיאנט גזירה משמשים כמנוע העיקרי לקישור צולב של טסיות באמצעות גורם GPIbα-פון וילברנד (VWF), אינטגרין αIIbβ-3-VWF, ואינטגרין αIIbβאינטראקציות 3-פיברינוגן. בקריחת דם עורקי, הצטברות טסיות ביומכנית היא ככל הנראה המנגנון החיוני ביותר, בהתחשב בכך שהיא מחוזקת מאוד על ידי זרימת גזירה גבוהה הנגרמת מהיצרות עורקית. לכן, תרומבוגנזה המונעת על ידי הצטברות טסיות ביומכנית נקראה 'תרומבוגנזה ביומכנית'12,14.

בעבודות קודמות, שיטה נפוצה לצפייה ניסויינית בהצטברות טסיות ביומכנית היא מבחן היצרות מיקרופלואידי, שבו אתר של היצרות חמורה מוטמע בערוץ ישר. כאשר דם נזרם מעל התעלה תחת מאמץ גזירה פיזיולוגי, נוצר מתח גזירה פתולוגי גבוה סביב האתר הסטנוטי, שמניע הצטברות טסיות ליצירת קרישה. עם זאת, עבודות קודמות השתמשו רק בקריאה אחת (לטסיות, המשקפת את גודל הקרקע) 15,16,17,18,19, או לכל היותר שתיים (אחת לטסיות ואחת לסמן ביולוגי אחר) 13,20, ולכן אינן מצליחות להשיג אפיון מקיף של הקרקש.

לאחרונה פותחה בדיקת פרופיל קרישי דם, המשלבת הדמיית פלואורסצנציה רב-צבעונית במבחן ההיצרות המיקרופלואידי, ומשיגה מעקב בזמן אמת אחרי 7 סמנים ביולוגיים (טסיות, רמת פיברינוגן, רמת פקטור פון וילברנד, רמת ביטוי P-סלקטין, רמת חשיפה לפוספטידילסרין, אינטגרין מורחב αIIbβ רמת ביטוי3 , אינטגרין פעיל מלא αIIbβ3 רמת הבעה) בקריק, שמציבה את הבסיס לאפיון מקיף של התרומבוגנזההביומכנית 21. בעבודה זו מסופקים פרוטוקולים מפורטים על הכנה וביצוע מבחן פרופיל קרישי דם וכן ניתוח הנתונים הנלווים. החומרה הנדרשת לבדיקה כוללת מיקרוסקופ פלואורסצנציה רב-צבעוני הפוך ומערכת מיקרופלואידית. הבדיקה משתמשת בכמות יחסית קטנה של דם מלא של אדם (פחות מ-2 מ"ל), בעלת עלות גבוהה (~$12 לדגימה), ומקבלת תוצאות תוך 30 דקות. הבדיקה יכולה לזהות במדויק את הפרעות הפרותרומבוטיות הרב-ממדיות של הפרט ולהעריך את השפעות התרופות האנטי-תרומבוטיות בשינוי גודל, הרכב ומצב הפעלת הטסיות של הדם, מה שמאשר את יישומה הנרחב הן למטרות מחקר והן למטרות קליניותבעתיד. ראוי לציין כי הבדיקה חייבת להשתמש בדם הפריטיני שנאסף זה עתה. אחסון הדם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או מעל 6 שעות או שימוש בנוגדי קרישה אחרים מלבד הפארין ימנעו היווצרות קרישי דם או יגרום לתוצאות לא מדויקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עומד בהנחיות ואושר על ידי ועדת האתיקה למחקר אנושי של סניף הרפואה של אוניברסיטת טקסס. מערכת החומרה הניסיונית כוללת מכשיר מיקרופלואידי, רכיבי פרפוזיה (מחברים, צינור, מזרק ומשאבת מזרק), ומיקרוסקופ הפוך עם רכיבים אופטיים המאפשרים דימות פלואורסצנציה בשדה בהיר ורב-צבעוני. בית תאורה רב-LED וקוביית פילטר רב-מעברים משמשים במיקרוסקופ לפיצול 4 ערוצים פלואורסצנטיים עם מינימום דליפה הדדית: עירור: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, ופליטה: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. ללבש ציוד מגן אישי, כולל כפפות, מגן עיניים ומעיל מעבדה, לכל הליך ניסיוני. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת מכשיר מיקרופלואידי

  1. תכנן תבנית ראשית שתכלול תעלות מלבניות (רוחב 200 מיקרון × 50 מיקרון גובה) שכוללות אתר של הצמצמות אור של 80%. לכל ערוץ יש פתחים ויציאות ייעודיים לחיבורי צינורות (איור 1; ראו קובץ משלים 1 לקובץ התכנון המקורי).
  2. בהתבסס על העיצוב, יש להשתמש בווייפר סיליקון לייצור תבנית מאסטר SU-8 פוטוריסט באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית. הדביקו את התבנית בתחתית צלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ (איור 2A).
  3. הכינו תערובת PDMS על ידי ערבוב בסיס הפרה-פולימר וסוכן הקיבוש בערכת האלסטומר הסיליקוני ביחס משקל של 10:1. שפוך את התערובת על תבנית הראשית (איור 2B).
  4. הניחו את הפלטה המכילה תערובת PDMS במייבש ואקום כדי להסיר גזים ולהסיר בועות אוויר כלואות.
    הערה: שמרו על הפלטת בוואקום למשך לפחות שעתיים עד שהבועות מוסרות לחלוטין.
  5. מקבצים תרמית את תערובת PDMS על ידי דגירה בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  6. חתכו בזהירות את ה-PDMS המקובשים מהתבנית הראשית (איור 2C,D) וחתכו אותו ליחידות שבב נפרדות.
  7. צור את הכניסה והיציאה על ידי ניקוב חורים במיקומים המיועדים באמצעות מחט בדיקה (איור 2E).
    הערה: השתמשו במסנן אבק אוויר דחוס כדי להסיר שאריות מהחורים המחוררים. כדי למזער זיהום פני שטח, נקה את מכשירי ה-PDMS באמצעות סרט דבק לפני ההדבקה.
  8. במכסה כימיקלים, רססו 75% אתנול על מגבון משימה, והשתמשו במגבון המשימה הרטוב כדי לנקות ולנקות מחסניות זכוכית. תשאיר את מחסניות הזכוכית להתייבש.
  9. במכסה כימיקלים, יש לטפל בגלילי הזכוכית ובשבבי PDMS עם גנרטור בתדר גבוה למשך 30 שניות ו-20 שניות, בהתאמה, ואז ליישר כל שבב עם סלייד זכוכית. לחץ בעדינות את השבב על משטח הזכוכית כדי שניתן יהיה לקשור אותו.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה כימי כי הגנרטור בתדר גבוה מייצר אוזון במהלך השימוש, מה שמזיק לבריאות.
  10. קשור תרמית את המכשירים על ידי דגירה בטמפרטורה של 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הקירור, המכשירים יהיו מוכנים לשימוש (איור 2F).
  11. אחסן את המכשירים בטמפרטורת החדר בתנאים ללא אבק.
  12. השתמש בצבת כדי להסיר את החלק הפלסטי של מחטי הגלאי, וכופף את צינורות המתכת ל-90°. צינורות אלו ישמשו כמחברים למכשירים המיקרופלואידיים.

2. הכנת חיישן פלואורסצנטי

הערה: הניסוי משתמש בסך הכל ב-7 חיישנים פלואורסצנטיים: SZ22-FITC, פיברינוגן-אלקסה פלור 405, 2.2.9-אלקסה פלור 555, AK4-אלקסה פלור 647, אנקסין V-פסיפיק כחול, MBC 370.2-אלקסה פלור 555, PAC-1-אלקסה פלור 647. ביניהם, פיברינוגן, 2.2.9 ו-MBC 370.2 זמינים מסחרית רק בצורה לא מצורפת וצריכים להיות מצומדים פלואורסצנטי במעבדה.

  1. כדי לקשר בין פיברינוגן לאלקסה פלואר 405:
    1. תכין בופר ביקרבונט נתרן טרי של 0.1 מיליון, pH של 8.5.
    2. מדלל את מלאי הפיברינוגן ל-1 מ"ג/מ"ל במי מלח מפוזר (PBS; 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4, 1.8 מ"מ KH2PO4, pH 7.4).
    3. הוסיפו 1/10 נפח של בופר נתרן ביקרבונט לתמיסת הפיברינוגן.
    4. מערבבים 1 מ"ל פיברינוגן עם 1 מ"ג אלקסה פלור 405 NHS-אסטר ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר על סיבוב. להגן מפני אור.
    5. הסר את בופר האחסון מעמודת טיהור על ידי צנטריפוגה של העמודה ב-1,100 × גרם למשך 2 דקות, והשליך את ה-flow-through. טעין את תמיסת התגובה על העמוד, התקן את העמודה על בקבוקון איסוף תואם, וצנטריפוגה ב-1,100 × גרם למשך 5 דקות כדי לאסוף את הפיברינוגן-אלקסה פלור 405.
    6. השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את הספיגה באורך גל של 280 ננומטר (A280; אות חלבון) ו-405 ננומטר (A405; אות צבע). חשב את ריכוז החלבון ויחס F/P (פלואורסצנציה: יחס מולר חלבון).
      הערה: יחס ה-F/P צריך להיות בטווח של 8-10.
    7. אחסן פיברינוגן-אלקסה פלואר 405 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  2. כדי לקשר נוגדנים 2.2.9 ו-MBC 370.2 עם Alexa Fluor 555:
    1. תכין בופר ביקרבונט נתרן טרי של 0.1 מיליון, pH של 8.5.
    2. לדלל את מלאי הנוגדנים ל-1 מ"ג/מ"ל בבופר ללא אמינים.
    3. הוסף 1/10 נפח של בופר נתרן ביקרבונט לתמיסת הנוגדנים.
    4. מערבבים נוגדנים של 100 מיקרוליטר עם בקבוקון אחד (100 מיקרוגרם) של Alexa Fluor 555 NHS-ester ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר על סיבוב. להגן מפני אור.
    5. הסר את בופר האחסון מעמודת טיהור על ידי צנטריפוגה של העמודה ב-1,100 × גרם למשך 2 דקות, והשליך את ה-flow-through. טעין את תמיסת התגובה על העמוד, התקן את העמודה על בקבוקון איסוף תואם, וצנטריפוגה ב-1,100 × גרם למשך 5 דקות כדי לאסוף את ה-2.2.9 או MBC 370.2-Alexa Fluor 555.
    6. השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את הספיגה באורך גל של 280 ננומטר (A280; אות חלבון) ו-555 ננומטר (A555; אות צבע). חישבו ריכוז נוגדנים ויחס F/P (פלואורסצנציה: יחס מולר של נוגדנים).
      הערה: יחס ה-F/P צריך להיות בטווח של 1-1.5.
    7. חנות 2.2.9- ו-MBC 370.2-Alexa Fluor 555 ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
      הערה: הימנעו מתיוג יתר - יחס F/P גבוה עלול לפגוע בתפקוד הביולוגי.

3. איסוף דם מנבדקים אנושיים

הערה: הליך זה חייב להתבצע על ידי צוות רפואי מוסמך (למשל, אחיות מוסמכות, פלבוטומיסטים מוסמכים). כמו כן, קבל הסכמה מדעת בכתב מהמשתתפים במחקר.

  1. הכינו את המזרק על ידי שאיבת 500 מיקרוליטר של בופר טירוד (12 מ"מ NaHCO3, 10 מ"מ הפז, 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 5.5 מ"מ D-גלוקוז, 0.5% אלבומין סרום בקר, pH 7.4) המכיל 0.32 U/mL הפארין ל-10 מ"ל דם שיש לאסוף.
  2. איסוף דם באמצעות ורידים. השתמש במזרק ריק כדי לאסוף את 2 מ"ל הדם הראשונים ולהשליך. לאחר מכן, עברו למזרק המכיל הפארין כדי לאסוף את דגימת הדם. משוך את המזרק לאט כדי למזער את הפעלת הטסיות.
  3. העבר את הדם שנאסף לצינור צנטריפוגה בקוטר 15 מ"ל ושמור על טמפרטורה מתחת ל-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש להשתמש בדגימות דם לניסויים תוך 6 שעות מהאיסוף.

4. בדיקת פרופיל תרומבוס

הערה: מומלץ לבצע את כל ההליכים הכוללים טיפול בדם בארון בטיחות ביולוגית ככל האפשר כדי למנוע שפיכות דם על הניסוי. אם זה לא אפשרי, השתמש במגן מתזה על הספסל.

  1. לדלל מונומר VWF ל-2 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS. ציפוי מראש את המכשירים המיקרופלואידיים במונומבר VWF ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  2. דגרו את דגימת הדם עם חיישן פלואורסצנטי סט 1 או 2 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר:
    1. סט 1: SZ22-FITC (0.5 מיקרוגרם/מ"ל), פיברינוגן-אלקסה פלאור 405 (60 מיקרוגרם/מ"ל), 2.2.9-אלקסה פלור 555 (1 מיקרוגרם/מ"ל), AK4-אלקסה פלואור 647 (1 מיקרוגרם/מ"ל).
    2. סט 2: SZ22-FITC (0.5 מיקרוגרם/מ"ל), Annexin V-Pacific Blue (1 מיקרוגרם/מ"ל), MBC 370.2-אלקסה פלור 555 (1 מיקרוגרם/מ"ל), PAC-1-אלקסה פלור 647 (1 מיקרוגרם/מ"ל).
      הערה: מכיוון שיש להשתמש בשני סטים של חיישנים בנפרד, כל דגימת דם צריכה להיבדק לפחות פעמיים (פעם עם סט חיישנים 1 ופעם עם סט חיישנים 2) כדי לקבל מערך נתונים מלא.
  3. חבר מכשיר מיקרופלואידי עם מחברי כניסה ויציאה וצינורות. חבר את הקצה השני של מחבר הכניסה עם צינור המכיל PBS, ואת הקצה השני של מחבר היציאה עם מזרק. התקן את המזרק על משאבת מזרק. התקן המיקרופלואיד על מיקרוסקופ הפוך, ומניע ידנית את השלב כדי למצוא את אתר ההיצרות תחת המיקרוסקופ (איור 3A).
  4. מלאו את ערוץ המיקרופלואיד והצינור ב-PBS באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 0.5 מ"ל לדקה. ודא שאין בועות אוויר באזור ההיצרות.
  5. חבר את צינור הכניסה לדגימת הדם, והעבר את דגימת הדם דרך תעלת המיקרופלואיד באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 0.018 מ"ל/דקה (איור 3A).
  6. הגדר את זמן החשיפה והרווח של כל ערוץ פלואורסצנציה. בצע הדמיה פלואורסצנטית רב-צבעונית בזמן אמת על ידי החלפה בין ארבעת הערוצים, תוך הפעלת סוג פלואורופור אחד בכל פעם. בינתיים, מצא את מישור המיקוד של הקרומבוס והקלט אותות באתר ההיצרות, בדרך כלל נמשך 15-30 דקות (איור 4).
    הערה: יש לכוונן את זמן החשיפה של כל ערוץ כך שאות הפלואורסצנטי יהיה קל לזיהוי תוך הימנעות מרוויה (איור 4). במערכת הנוכחית, דגימות דם של נבדקים בריאים מציגות בדרך כלל את טווח עוצמת האות הבא בתוך הקרישה שנוצרה: SZ22-FITC, 70-110; פיברינוגן-אלקסה פלואר 405, 60-100; 2.2.9-אלקסה פלואר 555, 70-110; AK4-אלקסה פלואר 647, 45-75; Annexin V-Pacific Blue, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-אלקסה פלואר 647, 10-30. עם זאת, ראוי לציין שחלק קטן מהנבדקים הבריאים היה מציג קריאה לא טיפוסית. לכן, מומלץ לבדוק לפחות דגימות דם של 5 נבדקים בריאים כדי לוודא שזמן החשיפה לכל ערוץ נבחר כראוי.

5. ניתוח נתונים

  1. פתח את קובץ הנתונים באמצעות ImageJ 1.53 (פיג'י, המכונים הלאומיים לבריאות).
    הערה: כל קובץ צריך להכיל בסך הכל 4 סרטונים מ-4 ערוצים שונים. ההליך הבא חל בדרך כלל לכל נקודת זמן שהמשתמש מעוניין לנתח.
  2. השתמשו בערוץ SZ22-FITC לזיהוי קווי המתאר של הקרקע, והשתמשו ב'בחירות פוליגונים' כדי לבחור בערך את אזור הקרקע (איור 5A,B).
  3. לכל ערוץ, השתמש בתמונה -> Adjust -> Threshold כדי לבטל את הרקע (איור 5C), ואז השתמש ב-Analyze -> Measure כדי למדוד את שטח ועוצמת האות הממוצעת בתוך הקרישה.
    הערה: SZ22-FITC מכתים טסיות ולכן משקף את גודל הקרם. בסט 1, פיברינוגן-אלקסה פלאור 405 משקף את רמת העשרת הפיברינוגן, 2.2.9-אלקסה פלור 555 משקף את רמת ההעשרה של גורם פון וילברנד (VWF), ו-AK4-Alexa פלואור 647 משקף ביטוי P-סלקציה. בסט 2, Annexin V-Pacific Blue משקף חשיפה לפוספטידילסרין (PS), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 משקף את האינטגרין αIIbβ3 לקונפורמציה המורחבת (E+ αIIbβ3), ו-PAC-1-Alexa Fluor 647 משקף הפעלה מלאה של אינטגרין αIIbβ3 (Act αIIbβ3)21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת פרופיל הקרישה מעבירה דם דרך ערוץ צר כדי לאפשר היווצרות קרישים מונעים על ידי גזירה, ומבצעת הדמיה פלואורסצנטית רב-צבעונית בזמן אמת לאיסוף מידע רב-ממדי על הקרישה שנוצרה. על ידי ביצוע ניסויים באמצעות חיישני סט 1 וסט 2, ניתן לאפיין את הקרקע בהיבטים הכוללים גודל, העשרת חלבונים מקשרים (פקטור פון וילברנד, פיברינוגן), וכן רמת הפעלת טסיות (המשתקפת בביטוי P-סלקציה, חשיפה ל-PS, ואינטגרין αIIbβ3 )21.

הנתונים שנאספו מכל ני...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי שילוב מבחן היצרות מיקרופלואידי עם הדמיית פלואורסצנציה רב-צבעית, מבחן פרופיל הקרישה מספק גישה נוחה ועוצמתית לחקר תרומבוגנזות ביומכניות ומכנוביולוגיה של טסיות. בינתיים, הבדיקה שימושית במגוון רחב של יישומים. לדוגמה, ניתן להשתמש בו לסינון סוכנים אנטי-טרומבוטיים שמעכבים במיוחד הצטברות טסיות ביומכניות, כאשר ניתן להסיק את המטרה המולקולרית ומנגנון הפעולה מברקוד האפקט21. ניתן להשתמש בו גם לחקר הנטייה הפרותרומבוטית באוכלוסיות מסוימות לזהות ולאפיין את השפעת גורמי הסיכ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הקשור למאמר זה ולפיתוח מבחן פרופיל הקרישים במעבדת צ'ן נתמך על ידי מענק המכון הלאומי ללב, ריאות ודם R00HL153678 (Y.C.), המכון הלאומי להזדקנות, פרס מרכז העצמאות למבוגרים על שם קלוד ד. פפר #P30-AG024832 (Y.C.), פרס המחקר המדעי של צוות UTMB (Y.C.), מלגת פוסט-דוקטורט של אגודת הלב האמריקאית 20POST35080023 (Y.C.), ופרס פרויקט טרנספורמציה של אגודת הלב האמריקאית 25TPA1471420 (Y.C.). עבודה זו בוצעה בחלקה ב-San Diego Nanotechnology Infrastructure (SDNI) של UCSD, חברה בתשתית המתואמת הלאומית לננוטכנולוגיה, הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (Grant ECCS-2025752).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מזרקים בנפח 10 מ"להנקה סאס וולף5100-X00V0איסוף דגימות דם
צינורות פלקון בנפח 15 מ"לג'נסי סיינטיפיק28-101אחסון דגימת דם
מזרק זכוכית אטום בנפח 1 מ"להמילטון81331הרכבת חומרה
2.2.9MERU VasImmuneצביעת תרומבוס
מחטי בדיקה 20X1/2מקמאסטר-קארM919ייצור מכשירי PDMS
מזרקים בנפח 20 מ"להנקה סאס וולף5200-X00V0איסוף דגימות דם
70% אתנולסיגמא-אלדריץ'EX0281-1חיטוי מזרקים אטומים לגז וניקוי שקופיות זכוכית
AK4-אלקסה פלואר 647ביולג'נד304918צביעת תרומבוס
אלקסה פלור 405 NHS אסטרInvitrogenA30000סימון פיברינוגן
ערכת תיוג נוגדנים של Alexa fluor 555InvitrogenA88065תיוג MBC 370.2 ו-2.2.9
אנספין V-פסיפיק בלוInvitrogen501121505צביעת תרומבוס
ניקוי דאסטרמחסן המשרדים911245ייצור מכשירי PDMS
סט סכיני תחביב מלאכה עם קופסה מעץלהבי אקסל44282ייצור מכשירי PDMS
מים דה-יוניים  ThermoFisher Scientific 751-628שטיפת מזרקים אטומים לגז
דסיקטורבל ארטF420270000הסרת גזים של PDMS
מרית מעבדה רב-תכליתית חד-פעמיתלבגו17211ערבוב בסיס האלסטומר הסיליקוני עם חומר הקיבוש  
עמוד סיבוב להסרת צבע וביוטיןזבהA44296Sסימון פיברינוגן
פיברינוגןמחקר חדשניIHUFBG25MGצביעת תרומבוס
משאבת מזרק פיוז'ן 200-XChemyx Inc.0720Xהרכבת חומרה
הפארין סיגמא-אלדריץ'H3149אנטי-קרישה בדגימת דם
מחולל בתדר גבוהElectro-technic product Inc.BD-20ייצור מכשירי PDMS
מונומר VWF אנושיסינו ביולוגיה בע"מ.10973-H08Cציפוי מיקרופואידי
תוכנת Image J v1.53פיג'י, המכון הלאומי לבריאותניתוח נתונים
מיקרוסקופ הפוךלייקהDM IL LED; קוביית סינון: Leica DFT51010; מגדלור: LED5הרכבת חומרה
קימווייפסקימברלי- קלארק פרושיונל34120ניקוי שקופיות זכוכית
כובעי מנעול לוארתעשיות רפואיות בינלאומיות, בע"מ.57100Bאיסוף דגימות דם
MBC 370.2קראפסטEBW104צביעת תרומבוס
זכוכית כיסוי מיקרוסקופפול מריאנפלד GmbH & פלוגה KGES0107222ייצור מכשירי PDMS
מגרד להבי מיני-סכיןסטנלי28-100ייצור מכשירי PDMS
ספקטרופוטומטר UV-Vis NanoDrop 2000תרמו-סיינטיפיקND-2000ריכוז חלבון ומדידת יחס F/P
תנורמכשירי קו המעבדה3512ייצור מכשירי PDMS
PAC-1-אלקסה פלואר 647ביולג'נד362806צביעת תרומבוס
פלסטיקThermoFisher Scientific S04589ערבוב בסיס האלסטומר הסיליקוני עם חומר הקיבוש  
SU-8 פוטוריסט מאסטר  עובשמתקן חדר ניקוי ננו-פבריקציה ל-UC San Diegoייצור מכשירי PDMS
ערכת סיליקון אלסטומר Sylgard 184קריידן דאוDC4019862PDMS
SZ22-FITC בקמן קולטרIM 1756Uצביעת תרומבוס
צינורותחברת קול-פאלמר אינסטרומנט06422-01הרכבת חומרה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lindstrom, M., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risks collaboration, 1990-2021. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2372-2425 (2022).
  2. Lim, H. Y., O'malley, C., Donnan, G., Nandurkar, H., Ho, P. A review of global coagulation assays - is there a role in thrombosis risk prediction. Thromb Res. 179, 45-55 (2019).
  3. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: A comparative review. Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).
  4. Zhang, Y., Jiang, F., Chen, Y., Ju, L. A. Platelet mechanobiology inspired microdevices: From hematological function tests to disease and drug screening. Front Pharmacol. 12, 779753(2021).
  5. Gorog, D. A., et al. First direct comparison of platelet reactivity and thrombolytic status between Japanese and Western volunteers: Possible relationship to the "Japanese paradox". Int J Cardiol. 152 (1), 43-48 (2011).
  6. Gorog, D. A., Becker, R. C. Point-of-care platelet function tests: Relevance to arterial thrombosis and opportunities for improvement. J Thromb Thrombolysis. 51 (1), 1-11 (2021).
  7. Lopez-Jaime, F. J., et al. Clot stiffness measured by seer sonorheometry as a marker of poor prognosis in hospitalized COVID-19 patients. Clin Appl Thromb Hemost. 28, 10760296221112085(2022).
  8. Bochsen, L., Wiinberg, B., Kjelgaard-Hansen, M., Steinbruchel, D. A., Johansson, P. I. Evaluation of the TEG platelet mapping assay in blood donors. Thromb J. 5, 3(2007).
  9. Lipets, E. N., Ataullakhanov, F. I. Global assays of hemostasis in the diagnostics of hypercoagulation and evaluation of thrombosis risk. Thromb J. 13 (1), 4(2015).
  10. Thromboelastography loinc code 67790-6. , LOINC Committee. (2022).
  11. Volod, O., Viola, F. The quantra system: System description and protocols for measurements. Methods Mol Biol. 2663, 743-761 (2023).
  12. Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nature Medicine. 15 (6), 665-673 (2009).
  13. Chen, Y., et al. An integrin alphaiibbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nat Mater. 18 (7), 760-769 (2019).
  14. Li, M., Hotaling, N. A., Ku, D. N., Forest, C. R. Microfluidic thrombosis under multiple shear rates and antiplatelet therapy doses. PLoS One. 9 (1), e82493(2014).
  15. Colace, T. V., Diamond, S. L. Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).
  16. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  17. Brazilek, R. J., et al. Application of a strain rate gradient microfluidic device to von Willebrand's disease screening. Lab Chip. 17 (15), 2595-2608 (2017).
  18. Tovar-Lopez, F. J., et al. A microfluidics device to monitor platelet aggregation dynamics in response to strain rate micro-gradients in flowing blood. Lab Chip. 10 (3), 291-302 (2010).
  19. Kim, D. A., Ku, D. N. Structure of shear-induced platelet aggregated clot formed in an in vitro arterial thrombosis model. Blood Adv. 6 (9), 2872-2883 (2022).
  20. Receveur, N., et al. Shear rate gradients promote a bi-phasic thrombus formation on weak adhesive proteins, such as fibrinogen, in a vwf-dependent manner. Haematologica. 105 (10), 2471-2483 (2020).
  21. Din, M., et al. Multi-parametric thrombus profiling microfluidics detects intensified biomechanical thrombogenesis associated with hypertension and aging. Nat Commun. 15, 9067(2024).
  22. Stein, P. D., Sabbah, H. N. Measured turbulence and its effect on thrombus formation. Circ Res. 35 (4), 608-614 (1974).
  23. Mahalingam, A., et al. Numerical analysis of the effect of turbulence transition on the hemodynamic parameters in human coronary arteries. Cardiovasc Diagn Ther. 6 (3), 208-220 (2016).
  24. Thomson, E. E., et al. Gigapixel imaging with a novel multi-camera array microscope. Elife. 11, e74988(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thrombus ProfilingBiomechanical ThrombogenesisMicrofluidic DevicesPlatelet ActivationFluorescence ImagingArterial ThrombosisVon Willebrand FactorProthrombotic TendencySyringe PumpImageJ Analysis

Related Articles