מאמר שיטה

ניתוח מעקבי איזוטופים יציבים של ויטמין A באמצעות LC-MS/MS

684 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69558

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות בו-זמנית הן רטינואידים מסומנים איזוטופית והן רטינואידים טבעיים בפלזמה אנושית, באמצעות LC-MS/MS, עם מגבלות גילוי של 6 fmol בעמודה. השיטה משלבת הליך חילוץ דגימות פשוט וזמן ריצה אנליטי קצר, המאפשר תפוקה גבוהה של דגימות.

תקציר

שיטת דילול איזוטופ רטינול (RID) מעריכה את סך מאגרי הגוף (TBS) של ויטמין A בבני אדם באמצעות דילול איזוטופים יציב עם מאגר ויטמין A בגוף. לשם כך, חשוב לקבוע במדויק וביעילות את יחס האיזוטופים בפלזמה בין רטינול מסומן לרטינול שאינו מסומן באמצעות ספקטרומטריית מסה. כדי להימנע מהליכי חילוץ ו/או טיהור נרחבים וגוזלי זמן, כגון HPLC הכנה ונגזרות, נעשה שימוש ב-LC-MS/MS לביצוע ניתוח מהיר, רגיש וסימולטני של רטינואידים מסומנים וללא סימנים. השיטה עושה שימוש בשני רמות גילוי: (i) הפרדה ראשונית בין מסה/מטען (m/z) של יוני הור (קדום), ואחריה (ii) גילוי יוני בת (מוצר) מפורקים. זה מוביל לרגישות גבוהה, עם מגבלות גילוי רטינול נמוכות עד 6 fmol על עמודה. למרות היתרונות של ספקטרומטריית מסה טנדם, נדרשת הפרדה כרומטוגרפית נוזלית להפרדת רטינול מאסטרי רטיניל, שכן קבוצות הפונקציונליות הסופיות אובדות במהלך היינון, מה שמוביל לדפוסי פירוק יונים הורים (m/z של 269) ולבת. המאמר מתאר את הבידוד של רטינול אנדוגני ומסומן (13Cאו 2H) מפלזמה באמצעות חילוץ ממיסים, ואחריו כימות באמצעות LC-MS/MS תחת יינון כימי בלחץ אטמוספירי (APCI) במצב יוני חיובי.

מבוא

ויטמין A הוא מזין מסיס שומן וחיוני לבריאות האדם1. מחסור בוויטמין A מגביר את הרגישות לתחלואה זיהומית קשה ולתמותה, ומוערך כי השכיחות העולמית שלו היא 29%, עם רמות גבוהות יותר באפריקה שמדרום לסהרה (48%) ובדרום אסיה (44%)2. תוספי ויטמין A הם אסטרטגיה יעילה להפחתת תמותת ילדים עודפת, במיוחד באזורים בסיכון גבוה כמו אפריקה שמדרום לסהרה3. עם זאת, הכנסת תוספי ויטמין A חצי-שנתיים יחד עם העשרת ויטמין A בקנה מידה גדול של מזונות בסיסיים והפצת אבקת מיקרונוטריינטים, שלעיתים מנוהלים על ידי גופים ציבוריים ופרטיים שונים, עלולה לחשוף אנשים לצריכה מופרזת של ויטמין A 4,5,6,7,8,9,10 . לכן, סמנים ביולוגיים של ויטמין A צריכים להיות מסוגלים לכסות את כל ספקטרום מצב ויטמין A, מחסר ועד רעילות. שיטת דילול איזוטופ רטינול (RID) היא כיום השיטה העקיפה המדויקת ביותר להערכת מאגרי ויטמין A הכוללים בגוף בבני אדם 11,12,13 ואומתה מול ריכוזי ויטמין A בכבד, הנחשבים לסמן הביוכימי הטוב ביותר למצב ויטמין A 14,15. השיטה מבוססת על העיקרון שלפיו מינון מעקב דרך הפה של ויטמין A המסומן באיזוטופ יציב מתערבב עם ויטמין A הלא מסומן (הטרייסה) במאגרי גוף ניתנים להחלפה. מדידת פעילות רטינול ספציפית לפלזמה (כלומר, היחס בין מעקב רטינול מסומן לסך הרטינול בפלזמה (טריסר/טרייס בפלזמה)) בזמן מוגדר לאחר המינון מאפשרת הערכת מצב ויטמין A באמצעות משוואת RID 11,12,13.

כדי לקבוע ריכוזים מדויקים ומדויקים של רטינול וטרייסר בפלזמה, יושמו שיטות שונות לכימות ויטמין A המסומן באיזוטופים יציבים, כולל כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה (GC-MS), ספקטרומטריית מסה ביחס איזוטופים (IRMS) וספקטרומטריית מסה טנדם בכרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26. חשוב לציין כי LC-MS/MS משלב רגישות גבוהה, ספציפיות ופשטות תפעולית עם היכולת למדוד ישירות רטינול טבעי ומסומן במטריצות מורכבות. לכן, כדי להימנע מהכנת דגימות גוזלת זמן, כגון הכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) ל-IRMS או גזירה עבור GC-MS, ניתוח LC-MS/MS הוא בחירה אידיאלית שכן שיטה זו כוללת הליך חילוץ פשוט, מגבלות גילוי נמוכות מאוד לאיזוטופים יציבים, וזמני ריצה קצרים 7,18,19. כאן אנו מציגים שיטת LC-MS/MS מעודכנת עם זמן ריצה קצר יותר, תהליכי עבודה פשוטים בשילוב רגישות גבוהה וסלקטיביות, כשיטה מתאימה מאוד לניתוח מהיר של דגימות מהתערבות אנושית רחבת היקף ומחקרים תצפיתיים, כאשר נדרשת קביעת מאגרי ויטמין A הכוללים בגוף.

פרוטוקול

המחקר אושר על ידי מועצת האתיקה המחקרית של אוניברסיטת הפיליפינים, מנילה (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), ועדת הביקורת המוסדית באוניברסיטת קליפורניה, דייוויס (IRB ID: 903681-2), ונרשם ב-ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). המחקר אושר על ידי ועדת הסקירה האתית של שירותי הבריאות של גאנה (GHS-ERC 012/07/20), והניסוי נרשם ב-https://clinicaltrials.gov כ-NCT04632771.

1. הכנת תקנים פנימיים

  1. תמיסה סטנדרטית פנימית: הכינו את תמיסת המלאי הפנימי בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל רטיניל אצטט באתנול המכיל 0.1% הידרוקסיטולואן בוטילייט (BHT; ללא וייט). חלק את תמיסות המלאי לאליקוטים ואחסן אותם בטמפרטורה של -80°C עד 3 חודשים.
    הערה: בתקן הפנימי, ניתן להשתמש ברטיניל-אצטט שאינו מסומן או באצטט רטיניל מסומן. אם משתמשים בתקן רטיניל-אצטט שאינו מסומן, חיוני להשגת רזולוציה בסיסית של שיאי הרטיניל אצטט ורטינול (ראו איור 1).
  2. פתרון עבודה תקני פנימי: הכינו פתרון עבודה סטנדרטי פנימי על ידי דילול התקן המקורי (1 מ"ג/מ"ל) ל-1 מיקרוגרם/מ"ל. ראשית, מדלל 60 מיקרוליטר מהתקן המקורי ב-300 מיקרוליטר אתנול, ולאחר מכן מדלל 60 מיקרוליטר של תמיסה זו ב-10,000 מיקרוליטר אתנול. לכל דגימה מוסיפים 20 מיקרוליטר מהתמיסה הפנימית התקנית הפועלת, המכילה 20 ng רטיניל-אצטט.
    הערה: פתרונות סטנדרטיים פנימיים יכולים להיאחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך עד שבוע.

2. הכנת תקני כיול

  1. תקן כיול: יש להכין את תמיסות התקן של הכיול בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל רטינול באתנול המכיל 0.1% BHT (w/v) הן עבור הטרייסי והן עבור הטרייסר והמעקב. Aliquot מחזיקים פתרונות ומאחסנים בטמפרטורה של -80°C עד 3 חודשים. השתמש בכל אליקו רק פעם אחת כדי להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה.
  2. תמיסת כיול סטנדרטית לעבודה: הוצא 100 מיקרוליטר מתמיסת הכיול הסטנדרטית ומדלל ב-10,000 מיקרוליטר אתנול בבקבוק נפחי. קבעו את ריכוז תמיסת הכיול המדוללת ב-325 ננומטר בספקטרופוטומטר באמצעות קובטה קוורץ (ראו טבלה 1 לפרטים).
  3. קחו אליקווט של תקן הכיול המדולל וכווננו את הריכוז ל-8 מיקרומולר עבור הטרייס ול-2 מיקרומולר עבור הטרייסר תוך שימוש ב-50% אתנול ו-50% אצטוניטריל/dH2O (70:30 (v/v).
  4. הכינו תקני כיול כפולים בשבעה ריכוזים שונים תוך שימוש ב-50% אתנול ו-50% אצטוניטריל/dH2O (70:30 (v/v). אם מופקים 200 מיקרוליטר פלזמה, תקני הכיול של הטרייס צריכים לנוע בין 6 מיקרומולר ל-0.03 מיקרומון, ותקני כיול הטרייסר צריכים לנוע בין 0.5 מיקרומולר ל-0.004 מיקרומון.
    הערה: לכימות מדויק, אסטרים של רטינול ורטיניל שמסומנים איזוטופי בפלזמה מכוונים באמצעות עקומות כיול 7 נקודותכפולות 27. הנקודה הגבוהה ביותר בעקומת הכיול (כפולה מהריכוז הגבוה ביותר הצפוי של הטרייס והטרייסר בפלזמה) מתחשבת בפקטור הריכוז של התמצית המחודשת מנפח הפלזמה המקורי.

3. חילוץ רטינואידים מפלזמה

  1. הסר דגימות פלזמה ממקפיא בטמפרטורה של -80°C והפשיר בטמפרטורת החדר (כ-30 דקות).
  2. לאחר ההפשרה, יש לסחרר כל דגימה ולסובב לכמה שניות כדי לוודא שלא נשארה פלזמה במכסה. לאחר מכן, הנח דגימות על הקרח.
  3. הפעל צנטריפוגה מקוררת ותן לה להתקרר ל-4 מעלות צלזיוס. תוייג צינורות זכוכית בגודל 15 מ"ל עם פקקי בורג (מזהה נושא ונקודת זמן) ופיפטה של 200 מיקרוליטר מים דה-יוננים (dH2O) לכל צינור דגימה.
  4. מהתמיסה הסטנדרטית הפנימית, פיפטה של 20 מיקרו ליטר מהתערובת הסטנדרטית הפנימית לתוך צינור הזכוכית.
  5. באמצעות פיפטה, משחררים 200 מיקרוליטר פלזמה לצינור המתאים המכיל את התקן הפנימי ואת dH2O.
  6. פיפט 400 מיקרוליטר אתנול לכל צינור דגימה וסובב את הצינור כדי לערבב את האתנול עם הפלזמה. אל תבצע מערבולת כדי למנוע שאריות חלבון להידבק לקיר הזכוכית.
  7. להוצאת ההקסן הראשונה, הוסף 2 מ"ל הקסן לכל צינור והדק היטב את מכסי הצינורות.
  8. הנח את הצינורות במטלטל אורביטלי ונער במהירות של 15,000 סל"ד למשך 30 דקות. העבר צינורות לצנטריפוגה מקוררת וסובב ב-1,800 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  9. באמצעות פיפטות פסטר מזכוכית, העבר את הסופרנטנט לסט נקי של מבחנות זכוכית מסומנות. היזהרו לא להעביר שקיעת חלבון או מים.
  10. הפקת הקסאן שנייה על ידי הוספת עוד 2 מ"ל הקסן לשאריות שנותרו, מהדק היטב את מכסי הצינורות, והנח את הצינורות במנער האורביטלי ונער במהירות של 15,000 סל"ד למשך 15 דקות.
  11. העבר צינורות לצנטריפוגה מקוררת וסובב ב-1,800 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטות פסטר מזכוכית, העבר את הסופרנטנט למבחנה הזכוכית המכילה את הסופרנטנט של הפקת ההקסאן הראשונה (שלב 3.9) עבור כל דגימה, בהתאמה.
  12. אידוי את ממס הפקת הקסאן המשולב (הסופרנטנט הראשון והשני לכל דגימה) תחת זרם עדיןשל N2 במכסה אדים כהה למשך כ-30 דקות. כוון את בלוק החימום ל-35 מעלות צלזיוס.
  13. החזירו את השאריות היבשות ל-50 מיקרוליטר אתנול, מערבולות לזמן קצר, והוסיפו 50 מיקרוליטר של פאזה ניידת (70:30 אצטוניטריל/dH2O (v/v)) ושוב מערבולת.
    הערה: יש לבצע השעיה מחדש של שאריות היבשות באמצעות 100 מיקרוליטר אתנול רק אם המטרה היא לכמת אסטרי רטיניל.
  14. העברו לצינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים בנפח 0.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-16,900 x g למשך 5 דקות.
  15. העבר 80 מיקרוליטר מהשאריות המחודשות לבקבוקי HPLC ענברים עם הכנסות של 300 מיקרוליטר. סגרו מיד את הבקבוקון כדי למנוע אובדן ממס כתוצאה מאידוי.
  16. העבר בקבוקוני זכוכית לתיבת קריו, תייג אותם בשם המחקר, תאריך ההוצאה וזיהוי הדגימות, ואחסן אותם במקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C עד לניתוח.
    הערה: יש לבצע את ניתוח הדגימות המאוחסנות בתוך 3-5 ימים. נפח פלזמה של 200 מיקרוליטר בדרך כלל מספיק לזיהוי מעקב ויטמין A המסומן עד 90 יום לאחר המנה. עם זאת, ניתן לכוון את נפח הפלזמה ל-400 מיקרוליטר אם היחסים בין פלזמה/מים/אתנול נשמרים על 1:1:2 בנפח.

4. הכנת דגימות בקרה סטנדרטיות פנימיות

  1. הכינו את תמיסת אתנול/פאזה ניידת על ידי פיפטינג של 120 מיקרוליטר אתנול לצינור מיקרוצנטריפוגה והוספת 200 מיקרוליטר (70:30) אצטוניטריל/dH2O (v/v) ומערבולת.
  2. לשלושה צינורות נפרדים בנפח 0.6 מ"ל, פיפטה של 20 מיקרוליטר של תמיסת התקן הפנימית הפועלת.
  3. הוסף 80 מיקרוליטר מתמיסת אתנול/פאזה ניידת מוכנה ומערבולת. העבר את שלוש דגימות הבקרה הסטנדרטיות הפנימיות לבקבוקי HPLC ענבר עם תוספות של 300 מיקרוליטר וסגר מיד את הבקבוקונים כדי למנוע אובדן ממס עקב אידוי.

5. תקני בית פלזמה

  1. כדי להכין את דגימות הסטנדרט של הבית, יש להשיג נפח פלזמה מספיק שיאפשר ניתוח של לפחות שלוש דגימות בכל ריצה אנליטית. נפח הפלזמה הכולל הנדרש נקבע לפי מספר הדגימות שיש לנתח.
  2. אליקווט מאחסנים פלזמה סטנדרטית לקריוביאלים קטנים בנפחים הנדרשים לכל הרצה אנליטית ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: חשוב מאוד שתקן הבית יכיל את מעקב רטינול המסומן באיזוטופ המשמש בדגימות הלא ידועות. ניתן להשיג חומר מספק על ידי איחוד דגימות מתנדבים לפריט אחד.
  3. חלץ לפחות שלוש דגימות סטנדרטיות של בית הפלזמה לכל ריצת אנליט באותו נפח כמו דגימות פלזמה לא ידועות, כפי שנעשה בשלב 3.
  4. הנח את תקני בית הפלזמה לאורך מתקן הדגימה עם לפחות 10 דגימות פלזמה לא ידועות ביניהן. השתמש בתקני בית פלזמה כדי לחשב שינויים תוך-יומיים ובין יומיים.

6. דגימות תקן חיצוניות

  1. קבל דגימות תקן חיצוניות מאושרות ואחסן בטמפרטורה של -80°C. תקן חיצוני מוסמך נפוץ הוא התקן NIST Reference Material SRM 968.
  2. להפיק לפחות ארבע דגימות פלזמה חיצוניות סטנדרטיות בכל ניתוח בנפח זהה לדגימות פלזמה לא ידועות באמצעות שלב 3. השתמש בדגימות תקן חיצוניות כדי לאמת את דיוק התוצאות שהושגו.

7. אופטימיזציה ידנית של תרכובות

  1. ודא שמכשיר ה-APCI Heated Nebulizer מותקן במארז המקור של מיקרוסופט. הכינו את תמיסת ההזלפה לכל איזוטופ יציב בקצב של כ-1 מיקרוגרם/מ"ל.
    הערה: התמיסה צריכה להיות דומה לפאזה הניידת וצריכה להכיל חומצה לצורך פרוטונציה. ממס טוב לשימוש יהיה 1:1 אצטוניטריל/dH2O עם 0.1% חומצה פורמית (v/v).
  2. מלאו מזרק המילטון של 1 מ"ל עם תמיסת עירוי, ואז מחברים את המזרק למקור באמצעות צינור PEEK דרך חיבור הארקה. הגדר את קצב הזרימה ל-10 מיקרוליטר לשנייה.
  3. בחר כיוון ידני וודא שהכלי במצב כוונון וכיוול. הפעל את משאבת המזרק ובחר Q1 Scan Type במצב חיובי.
  4. קבע טווח מסה תחתון של 50 דלטון, וטווח מסה עליון של כ-100 דליארון מעל המסה המולקולרית של התרכובת המטרה.
  5. הגדר מחזורים ל-500, קצב סריקה של 200 Da/s. לחץ על Start וצפה באות בחלון ספקטרום המסה.
  6. חכה שהאות יתייצב, ואז בדוק ששיאי ה-m/z הצפויים מופיעים. נבחן את השיאים [M+H]+ ו-[M+2H]2+ מכיוון שה-MS נמצא במצב חיובי.
  7. גובה השיא היעד צריך להיות סביב 1e6. סך זרם היונים (TIC) צריך להיות 1e7-1e9. המשך להזריק עד שהאות יציב, ואז לחץ על עצור. צריך להיות שיא מובחן עם עוצמה גבוהה שנוצר מהתרכובת בתמיסת ההזלפות. מוצג זרם היונים הכולל (TIC), שמציג את סך האות עבור כל היונים יחד.
    הערה: המסה הצפויה של רטינול של 12Cהיא 269 Da, ולכן טווח של 50-300 Da מתאים להראות יוני [M+H]+ ו-[M+2H]2+ .

8. סריקת יוני מוצר (MS2) / בדיקת ספקטרום CE

  1. קבע את מסת ההתחלה במסה נמוכה יותר, למשל 50 דאלטון, ואת מסת הסטופ ממש מעל מסה Q1 (למשל, 269.1 עבור רטינול של 12צלזיוס). הגדר מחזורים ל-5 ושנה את אנרגיית ההתנגשות (CE) ל-10. בדוק את המסה של Q1 כיון מקדים. אם לא מופיעים קטעים קטנים יותר, הגדילו את CE ל-20.
  2. ככל שה-CE גדל, ייווצרו יותר יוני מוצר. המשך להעלות את ה-CE עד שהיוני הקדום בצד ימין של הספקטרום נעלם לחלוטין. הגדל את ה-CE עוד יותר כדי לראות פוטנציאל לפירוק משני.

9. סריקת MRM

  1. מסריקת MS2, בחרו את שלושת היונים המוצריים הנפוצים או המתאימים ביותר להמשיך לאופטימיזציה.
  2. עבור כל יון מכפלה, הזינו את מסת Q1 (קדום) ואת מסות Q3 (מכפלה) שנמצאו. הגדר את זמן השהייה ל-200 מילישניות. תן שם לכל קטע בהתאם (למשל, 12C_Frag_93).
  3. בחר אנרגיית התנגשות וזהה את ערך CE האופטימלי באמצעות תכונת הרמפה. מלא את עמודת CE בערך CE האופטימלי עבור כל קטע.
  4. אופטימיזציה של פוטנציאל דה-אשכולות (DP) שאופטימיזציה לאחר אופטימיזציה של CE כדי למזער הפרעות איזובאריות. אופטימיזציה של פוטנציאל יציאה מתא התנגשות (CXP) למעבר אחד בכל פעם.

10. אופטימיזציה למקור/גז

  1. פרמטרים אלו אינם ניתנים לאופטימיזציה אוטומטית. אם אתה צריך לשפר את עוצמת האות, בצע תהליך אופטימיזציה ידני. שנה פרמטר אחד בכל פעם והשווה אם האות גדל, נשאר זהה או ירד.

11. תנאי כרומטוגרפיה נוזלית

  1. לכרומטוגרפיה, השתמשו בגרדיאנט פאזה ניידת בינארית של חומצה פורמית של 0.1% (v/v) בחומצה פורמית ב-dH2O (A) וחומצה פורמית של 0.1% (v/v) באצטוניטריל (B).
  2. בהתאם למערכת ה-LC המיושמת, יש להשתמש בעמוד ABZ PLUS בגודל 100 מ"מ x 2.1 מ"מ (3 מיקרון) המצויד במחסנית C18 בגודל 4 מ"מ x 2 מ"מ (ל-HPLC), או ב-Premier BEH Shield בגודל 100 מ"מ x 2.1 מ"מ (1.7 מיקרון) המצויד בעמוד RP18 FIT (לכרומטוגרפיה בלחץ גבוה במיוחד (UPLC)) לניתוח רטינול. לשמור על עמודות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס או 50 מעלות צלזיוס, בהתאמה.
  3. הזרקו 10 מיקרוליטר מתמצית הפלזמה על העמודה. האלוט מנתח בקצב זרימה של 0.4 מ"ל לדקה. במערכות HPLC, הגרדיאנט הליניארי הוא: 60% B עד 95% B ב-6.0 דקות; 100% B מ-6.1 דקות עד 13.0 דקות; 100% B עד 60% B בין 13.1 ל-14.0 דקות; ו-60% B בין 14.0 ל-17.0 דקות. במערכות UPLC, הגרדיאנט הליניארי תלוי בשאלה המחקרית. אם רק רטינול נקבע, הגרדיאנט הוא: 40% B עד 60% B ב-1.0 דקה; 60% B עד 95% B מ-1.0 עד 6.0 דקות; 100% B מ-6.5 דקות עד 7.5 דקות; 100% B עד 40% B בין 7.5 ל-7.6 דקות; ו-40% B בין 7.6 ל-8.5 דקות. אם המטרה היא גם לנתח רטיניל-אסטרים לצד רטינול, הגרדיאנט הליניארי הוא: 60% B עד 95% B תוך 3.0 דקות; 100% B מ-3.5 דקות עד 6.5 דקות; 100% B עד 60% B מ-6.5 עד 7.0 דקות; ו-60% B בין 7.0 ל-8.5 דקות.

12. מצבי טרשת נפוצה/טרשת נפוצה

  1. לבצע ניתוח MS/MS תחת יינון כימי בלחץ אטמוספירי (APCI) במצב יונים חיוביים. APCI נבחר על פני יינון אלקטרוספריי, שכן הוא מספק עוצמת אות גבוהה יותר, טווח ליניארי רחב יותר, ורעש רקע נמוךיותר.
  2. עבור מעברי מסה בהתאמה עבור [12C]רטינול, [13C10]רטינול, ו-[2H6]רטינול והאסטרים/אצטט המתאימים שלהם, עם פרמטרי ניטור תגובה (SRM) נבחרים עבור API4000 וספקטרומטר המסה QTRAP 5500, בדוק טבלה 2, טבלה 3 ואיור 2.
    הערה: ניטור יונים נבחר עבור רטינול, אסטרי רטיניל ורטיניל אצטט היה אותו יון מקטע של m/z 269 לכימות APCI, שכן יון זה תואם לאובדן מים, חומצות שומן או חומצה אצטית מהמולקולות הפרוטונליות. מכיוון ש-LC-MS/MS מסוגל להפריד בין פסגות הרטינול לבין האסטרים שלו, הזרקה אחת מאפשרת לקבוע את העשרת האיזוטופים הן בחלקי רטינול והן בחלקי רטיניל-אסטר בדגימה אחת.

13. כימות רטינול

  1. כמת את ריכוזי רטינול [12C], רטינול [2H6] ו-[13C10] רטינול לפי תקני הכיול שלהם.
  2. קבעו אובדני חילוץ באמצעות שחזור הריכוזים התקניים הפנימיים לכל דגימה מול דגימות הבקרה התקנית הפנימית.
  3. לבצע אישור ריכוזי רטינול בפלזמה באמצעות חומר ייחוס תקני (SRM) 968 של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST).

תוצאות

כדי להמחיש את יעילות השיטה האנליטית לניתוח רטינול מסומן איזוטופ יציב במערכות כרומטוגרפיות שונות, אנו מציגים תוצאות משני מחקרים שונים.

לשימוש API4000 עם HPLC מוקדם, דגימות פלזמה מ-111 ילדים פיליפינים בגילאי 12 עד 18 חודשים, שקיבלו מינון אוראלי של 400 מיקרוגרם (1.17 מיקרומול) [13C10] של רטיניל אצטט ביום 0, ואחריו איסוף דגימת דם של 6 מ"ל 4 ימים לאחר המנה, נותחוב-7,28. ריכוזי רטינול כוללים ממוצעים בפלזמה היו 1.1 מיקרומול/ליטר, ורטינול ממוצע [13C10] היה 0.007 מיקרומול/ליטר. מכיוון שרמת רעש הרקע במעבר בין 279 ל-100 הייתה שיא ממוצע של ~50 cps (איור 1), רמת הגילוי (LOD) והכמות (LOQ) של רטינול [13C10] נקבעו על 150 cps ו-500 cps, המתאימים ל-6 fmol ו-19 fmol בעמודה, בהתאמה. מכיוון שהושג רזולוציה בסיסית טובה בין רטינול [12C] לבין התקן הפנימי של רטיניל-אצטט, לא היה צורך להשתמש ברטיניל-אצטט מסומן באיזוטופ יציב.

ניתן להשיג הפרדה כרומטוגרפית מהירה יותר באמצעות UPLC בשילוב עם QTRAP 5500, עם זמני ריצה מתחת ל-10 דקות. בהתאם לשאלת המחקר, ניתן ליישם שתי שיטות הפרדה שונות; (i) אם המטרה היא לקבוע רטינול טבעי ואיזוטופ מסומן המיושם עם תקן פנימי לא מסומן של רטיניל-אצטט, זמני השמירה בין רטינול (4.37 דקות) לרטיניל-אצטט (5.33 דקות) מספקים הפרדה בסיסית טובה (איור 3); (ii) אם המטרה היא להפריד רטינול המקורי והמסומן באיזוטופ לצד רטיניל-אסטרים טבעיים ומסומנים, ניתן להשיג הפרדה טובה בתוך ריצה של 8.5 דקות (איור 4). עם זאת, בשל זמני השמירה הצמודים בין רטינול (2.10 דקות) לרטיניל אצטט (2.43 דקות), מומלץ להשתמש במקום זאת רטיניל אצטט מסומן איזוטופי ([2H4] רטיניל אצטט). בדוגמה זו, דגימות סרום נותחו מ-80 נשים גנאיות בגיל הפוריות שקיבלו מינון שקול של רטינול של 2 מ״ג רטינול [2H6] רטיניל אצטט, ולאחר מכן נלקחו דגימת דם 21 ימים לאחר המנה. ריכוזי רטינול סך הממוצעים בסרום היו 1.89 מיקרומול/ליטר, עם רטינול ממוצע [2H6] של 0.027 מיקרומול/ליטר ורטינול ממוצע [13C10] של 0.025 מיקרומול/ליטר.

השיטה שהוצגה השיגה רמת גילוי נמוכה (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol בעמודה), המדגים רגישות וספציפיות גבוהה לזיהוי רטינול יציב מסומן באיזוטופים עם הפרדה ברורה בין רטינול טבעי לסטנדרטים פנימיים. יתרה מזאת, השיטה עבדה ביעילות עם מערכות HPLC ו-UPLC, למרות הבדלים בזמני השימור. השימוש בתקנים פנימיים מסומנים איזוטופית ([2H4] רטיניל אצטט) הבטיח כימות מדויק בתנאי UPLC מהירים יותר, אם יש צורך לקבוע אסטרי רטיניל. אימות מול תקני ייחוס מוסמכים על ידי NIST אישר דיוק, בעוד שמקדמי השונות התוך-יומיים ובין היום (2.3% ו-4.4%, בהתאמה) הראו דיוק ושחזור מצוינים. ניתוח מוצלח של דגימות פלזמה/סרום משתי אוכלוסיות מובחנות (ילדים פיליפינים ונשים גנאיות) עם פרוטוקולי מינון שונים מראה עמידות ותועלת מעשית במחקרים תזונתיים מגוונים.

figure-results-1
איור 1: כרומטוגרם LC-MS/MS באמצעות ספקטרומטר המסה API4000. הכרומטוגרם של רטינול הסרום התקבל 4 ימים לאחר בליעת 0.4 מ"ג של [13C10] רטיניל אצטט. מעקב תגובה נבחר (SRM) בין m/z 269 ל-93 מראה הפרדה בין רטינול [12C] (RT = 5.06 דקות) ל-[12C] רטיניל אצטט (RT = 5.83 דקות) כסטנדרט פנימי (IS). אות רטינול [13C10] בטווח m/z 279 עד 100 עולה מספיק על גבול הגילוי (LOD) וגבול הכימות (LOQ). תנאים כרומטוגרפיים: (א) גרדיאנט פאזה בינארית של חומצה פורמית 0.1% (v/v) ב-dH2O ו-(B) 0.1% (v/v) חומצה פורמית באצטוניטריל; קצב זרימה של 0.4 מ"ל לדקה עם גרדיאנט ליניארי של: 60% B עד 95% B ב-6.0 דקות; 100% B מ-6.1 דקות עד 13.0 דקות; 100% B עד 60% B בין 13.1 ל-14.0 דקות; ו-60% B מ-14.0 עד 17.0 דקות; עמוד ABZ PLUS בגודל 100 מ"מ x 2.1 מ"מ (3 מיקרומ'), מצויד בתחמושת C18 בגודל 4 מ"מ x 2 מ"מ בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ספקטרום מסה של יונים במכפלת APCI-MS/MS. הזרקת זרימה ספקטרום מסה יונים של מוצר APCI-MS/MS של רטינול (A) m/z 269 [12C], (B) m/z 273 [2H4] רטינול, (C) m/z 275 [2H6] רטינול, ו-(D) m/z 279 [13C10] רטינול במצב יוני חיובי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: כרומטוגרם LC-MS/MS באמצעות ספקטרומטר המסה QTRAP 5500. כרומטוגרמה LC-MS/MS של תמצית טיפוסית מתקן בית פלזמה שנבדקה 21 ימים לאחר בליעה דרך הפה של 1.0 מ"ג של [2H6] רטיניל אצטט ו-90 ימים לאחר בליעה דרך הפה של 1.0 מ"ג של [13C10] רטיניל אצטט. מעקב תגובה נבחר (SRM) של m/z 269→93 מראה את שיא רטינול [12C] (RT = 4.37 דקות) ורטיניל אצטט (RT = 5.33 דקות) כסטנדרט פנימי (IS); הרטינול [2H6] (RT = 4.36 דקות) ב-m/z 275→96; ושיא רטינול [13C10] (RT = 4.38) ב-m/z 279→100. תנאי כרומטוגרפיה: (A) גרדיאנט פאזה בינארית ניידת של 0.1% (v/v) חומצה פורמית ב-dH2O ו-(B) 0.1% (v/v) חומצה פורמית באצטוניטריל; קצב זרימה של 0.4 מ"ל/דקה עם שיפוע ליניארי של: 40% B עד 60% B ב-1.0 דקה; 60% B עד 95% B מ-1.0 עד 6.0 דקות; 100% B מ-6.5 דקות עד 7.5 דקות; 100% B עד 40% B בין 7.5 ל-7.6 דקות; ו-40% B בין 7.6 ל-8.5 דקות; עמוד 100 מ"מ x 2.1 מ"מ (1.7 מיקרון) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT, נשמר בטמפרטורה של 50°C. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור.

figure-results-4
איור 4: כרומטוגרם LC-MS/MS של רטינול ורטיניל-אסטרים באמצעות ספקטרומטר המסה QTRAP 5500. כרומטוגרמה של LC-MS/MS של תמצית טיפוסית מתקן בית פלזמה שנבדקה 6 שעות לאחר בליעת 1.0 מ"ג של [2H6] רטיניל אצטט ו-90 ימים לאחר בליעה דרך הפה של 1.0 מ"ג של [13C10] רטיניל אצטט. מעקב תגובה נבחר (SRM) של m/z 269→93 מראה את שיא רטינול [12מעלות] (RT = 2.10 דקות); אצטט רטיניל [2H4] ב-m/z 273→94 (RT = 2.43 דקות) כסטנדרט פנימי (IS); ההפרדה בין [2H6] רטינול (RT = 2.09 דקות) ו-[2H6]רטיניל פאלמיטט (RT = 5.11 דקות) מגיעה לשיא ב-m/z 275→96; ושיא רטינול [13C10] (RT = 2.10) ב-m/z 279→100. תנאי כרומטוגרפיה: (A) גרדיאנט פאזה בינארית ניידת של 0.1% (v/v) חומצה פורמית ב-dH2O ו-(B) 0.1% (v/v) חומצה פורמית באצטוניטריל; קצב זרימה של 0.4 מ"ל/דקה עם גרדיאנט ליניארי של: 60% B עד 95% B ב-3.0 דקות; 100% B מ-3.5 דקות עד 6.5 דקות; 100% B עד 60% B מ-6.5 עד 7.0 דקות; ו-60% B בין 7.0 ל-8.5 דקות; עמוד 100 מ"מ x 2.1 מ"מ (1.7 מיקרון) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT, נשמר בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

פרמטרים
ספיגת הטוחנת (ɛ) של רטינול באתנול:52,770 M-1 ס"מ-1
גורם דילול:100 (100 מיקרוליטר של כיול סטנדרטי ב-10 מ"ל אתנול)
ספיגה ממוצעת מדודה:0.575
חישוב
ריכוז (mol) של [12C]רטינול באתנול:ריכוז (mol) = בליעה / ɛ x אורך הקובט
= 0.575 / 52770 M-1 ס"מ-1 x 1 ס"מ = 1.09 x 10-5 מ'
תיקון לדילול:1.09 x 10-5 M x 100 = 1.09 x 10-3 M או 1.09 mM

טבלה 1: קביעת ריכוז מלאי רטינול בתקן הכיול.

אנלייטמעברי MRM (m/z)פוטנציאל פירוק אשכולות (V)פוטנציאל כניסה (V)אנרגיית התנגשות (eV)פוטנציאל יציאה מהתנגשות (V)
[12C]-רטינול/אסטרים269→935110276
[2H4] רטיניל אצטט273→945110276
[2H6]רטינול/אסטרים275→965110276
[13C10]-רטינול/אסטרים279→1004110276

טבלה 2: פרמטרי ניטור תגובה (SRM) נבחרים. פרמטרים עבור רטינול [12C], רטינול [13C10] ורטינול [2H 6] והאסטרים שלהם באמצעות API4000

אנלייטמעברי MRM (m/z)פוטנציאל פירוק אשכולות (V)פוטנציאל כניסה (V)אנרגיית התנגשות (eV)פוטנציאל יציאה מהתנגשות (V)
[12C]-רטינול/אסטרים269→939410338
[2H4] רטיניל אצטט273→9454102011
[2H6]רטינול/אסטרים275→966910253
[13C10]-רטינול/אסטרים279→10010210359

טבלה 3: פרמטרי ניטור תגובה (SRM) נבחרים. פרמטרים עבור רטינול [12C], רטינול [13C10] ורטינול [2H6] והאסטרים המתאימים שלהם באמצעות QTRAP 5500

דיון

שיטת LC-MS/MS המוצגת מציעה רגישות גבוהה מאוד, עם מגבלות גילוי נמוכות עד 6 fmol/L, מה שמאפשר לחוקרים להשתמש ב-100 - 200 מיקרוליטר פלזמה19 בלבד. שיטת טנדום טנדום ממוקדת זו חזקה במיוחד לאישור זהות איזוטופולוג רטינואידית כאשר משתמשים גם ביוני תוצר הכמת וגם במוצר המזהה18. עם זאת, מאחר שרטינואידים מסומנים באיזוטופים נמצאים בריכוזים נמוכים משמעותית מאשר רטינואידים פיזיולוגיים שאינם מסומנים, דגימות פלזמה המכילות רטינול ואסטרים מסומנים עשויות לדרוש שלב ריכוז נוסף. הצורך הזה תלוי בגורמים כמו מועד דגימת הדם לאחר המינון, ריכוז המעקב הפה, ורגישות מערכת LC-MS/MS. היסטורית, מינונים גבוהים יותר של יישומים שימשו להתגבר על הרגישות הנמוכה יותר של ספקטרומטרי מסה קודמים, אך התקדמות אחרונה אפשרה את השימוש במינונים נמוכים13. בדוגמאות המוצגות, מינון אוראלי גבוה יותר מעלה את רמת רטינול המסומן באיזוטופ יציב אפילו בנקודות זמן מאוחרות יותר, כלומר ב-21 ימים לעומת 4 ימים.

מכיוון שהקבוצות הפונקציונליות הסופיות של אסטרי רטיניל אובדות במהלך היינון, נצפים דפוסי הורה m/z של 269 ודפוסי פיצול יוני בת דומים עבור אסטרים של רטינול ורטיניל. לכן, הפרדה כרומטוגרפית היא קריטית לקביעת הריכוזים הנפרדיםשלהם 18. יתרה מזאת, בשל השפע הטבעי הגבוה של איזוטופים יציבים של 13C באיזוטופולוגים אנדוגניים של רטינול, מומלץ לשלב יותר משלושה אטומי 13Cבמעקב רטינול כדי להימנע מהצורך לתקן העשרת רטינול טבעית בסיסית של 13Cבפלזמה29 האנושית.

דגימות פלזמה דורשות עיבוד לפני ניתוח איזוטופים בשני שלבים. ראשית, דגימות פלזמה צריכות לעבור דה-חלבון, ולאחר מכן הפקת אסטרים של רטינול ורטיניל באמצעות ממס לא קוטבי, שיוצר מערכת דו-פאזית 18,19,20. למרות שהפרדת פאזה ברורה מתקבלת באמצעות הפרוטוקול הנ״ל, חשוב מאוד שהאינטרפאזה במערכת הביפאזית לא תופרע או תיאסף, שכן הדבר יאריך את זמן הייבוש ויפחית את דיוק הניתוח. לחילופין, הקבוצה שלנו בחנה גם יישום של הליך חילוץ חד-פאזי לרטינואידים20. לשם כך, דגימות פלזמה של 200 מיקרוליטר מוזרמות לצינור מיקרו-צנטריפוגה מפלסטיק בנפח 2 מ"ל, ומופקים רטינואידים באמצעות שילוב של אתנול ואתיל אצטט. יישום פרוטוקול מיצוי זה מאפשר ניתוח של רטינואידים פולריים יותר, כגון איזומרים של חומצה רטינואית, עם התאוששות שווה ערך למיצוי דו-פאזי, והוא גם דומה לשיטת חילוץ אצטוניטריל חד-שלבית של Kane ו-Napoli30.

בהינתן שרטינואידים רגישים לחמצון ואיזומריזציה כאשר הם נחשפים לאור UV וחום, חשוב לבצע את הניתוח במהירות האפשרית, ויש לנקוט אמצעי זהירות כלליים במהלך איסוף, טיפול ואחסון פלזמה30. שיטות מסורתיות לניתוח רטינואידים מסומנים באיזוטופים יציבים משתמשות בבידוד ו/או נגזרות גוזלות זמן רב. ניתוח GC-MS דורש בידוד חלק הרטינול מהסרום האנושי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), ולאחר מכן הגזירת רטינול22. למרות שאין צורך בגזירת רטינול עבור GC-C-IRMS, מומלץ הפרדה מוקדמת של רטינול באמצעות שני שלבי טיהור HPLC נפרדים 17,25,31, ונדרש גם קביעת העשרת רטינול טבעית בסיסית של 13Cבפלזמה האנושית באוכלוסיית המדגם17,32. לעומת זאת, לשיטת LC-MS/MS המוצגת יש מספר יתרונות. הוא נמנע מהליכי חילוץ ו/או טיהור נרחבים וגוזלי זמן, ומאפשר ניתוח מהיר, רגיש וסימולטני של אסטרי רטיניל ורטינול חופשי 16,18,26,32. יתרה מזאת, השיטה יעילה כי היא מספקת דיוק גבוה עם שונות נמוכה וניתנת להתאמה למערכות LC-MS/MS שונות.

גילויים

למחברים אין מה להצהיר.

תודות

תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי קרן ביל & מלינדה גייטס (מספר פרויקט: OPP1115464) והסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית (IAEA) בווינה (פרויקט מספר E4.30.30).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזקים>ממסים
דרגת HPLC אבסולוטית לאתנולפישר10428671
דרגת HPLC אצטוניטרילפישר10660131
הקסן 95% n-הקסן עבור HPLC מאושרפישרH/0406/17
דרגת HPLC איזופרופנולVWR20880.32
דרגת HPLC איזופרופנולVWR20880.32
מתנול 99% 2.5 ליטרתרמו-סיינטיפיק11367996
<חזקים>תקנים/איזוטופים
רטינול מלא-טרנסBioXtra95144
רטיניל אצטטסיגמאPHR1236
איזוטופ יציב המסומן רטינול:ReseaChem/Buchem BV
איזוטופ יציב המסומן כרטיניל אצטט:ReseaChem/Buchem BVלא זמיןניתן להשתמש במגוון איזוטופים יציבים בשיטת RID. רשימה של איזוטופים מסחריים שונים מוצגת בטבלה 1. 
ויטמין A  (19,19,19,20,20,20-D6)
ויטמין A  (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
אצטט ויטמין A (10,19,19,19-D4)
אצטט ויטמין A (19,19,19,20,20,20-D6)
אצטט ויטמין A (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
<חזק>ציוד
מתקן ממס מתכוונן בנפח 5 מ"לסיגמא-אלדריץ'Z627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
משקלים אנליטיים פישר13592970
בוכנות קפילריות (קצות פיפטה) CP100 10x96 TIPACKגילסוןFD148314
בוכנות קפילריות CP250ST 6x96גילסוןF148714
ארון עשן
Microman E M100E פיפט (תזוזה חיובית)גילסוןFD10004
Microman E M250E Pipette (תזוזה חיובית)גילסוןFD10005
פיפטמן P100, 10-100 אולור, פלט מתכתגילסוןF114057M
Pipetman P1000, 100-1000 אולטר, מפיץ מתכתגילסוןF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, מפיץ מתכתגילסוןF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
צנטריפוגה מקוררת 5810 Rאפנדורף
אמבט מים סוניקיVWRUSC100T
ספקטרופוטומטרתרמו פישר סיינטיפיקA51119600C
מרכז דגימה של טקנה ובלוק חום.VWR
Vibrax VXR Basic Shakerאיקה0002819002
מערבל Vortex; MS3 basic IKAפישרMPR-555-050L
חיבור מבחנה VX2 - סוג werke VX2איקה0000568900
<חזק>מוצרי צריכה
צינורות מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"לפישרFB74323
100 מ"מ x 2.1 מ"מ (1.7 & mu; m) עמודת AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FITמים186009498
100 מ"מ x 2.1 מ"מ (3 ומיקרו; m) עמודת סופלקוסיל ABZ PLUSסופלקו57917
קצות פיפטות 1000 אולרסטארלאבS1122-1830
בקבוקי נפח של 100 מ"לפישר11323644בקבוק זכוכית בורוסיליקט מסוג Pyrex Class A מוסמך לבקבוק נפחי מוסמך
קצות פיפטה 200 אולרסטארלאבS1120-8810
קליע 4 מ"מ x 2 מ"מ SecurityGuard C18פנומנקסAJ0-4286
בקבוקי נפח של 50 מ"לפישר11313644בקבוק זכוכית בורוסיליקט מסוג Pyrex Class A מוסמך לבקבוק נפחי מוסמך
בקבוקי זכוכית ענבר בקוטר 9 מ"מ עם תוספותפישר11583680
פקקי הברגת בקבוקון 9 מ"מפישר13206419
קרקופסת קרטוןסטארלאבA9623-8181
קוורץ UV של Hellma cuvetteSLSCEL1600
גז חנקן (טוהר גבוה וללא חמצן)BOC
פסטר פיפטפישר11546963
צינורות תרבית פירקס 100x16 מ"מקורנינגCLS9944916
פקקי בורגים, ציפוי PTFE 16 מ"מקורנינגCLS999815
פקקי PTFE מזכוכית ענבר 2 מ"לפישר11573542
פקק בורג בקבוקון 9 מ"מ סיליקון לבן/אדום PTFEThermo 13206419

מקורות

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  2. Stevens, G. A., et al. Trends and mortality effects of vitamin A deficiency in children in 138 low-income and middle-income countries between 1991 and 2013: a pooled analysis of population-based surveys. Lancet Global Health. 3 (9), E528-E536 (2015).
  3. Baye, K., et al. Estimates of child mortality reductions attributed to vitamin A supplementation in sub-Saharan Africa: scale up, scale back, or refocus. Am J Clin Nutr. 116 (2), 426-434 (2022).
  4. Bielderman, I., Vossenaar, M., Melse-Boonstra, A., Solomons, N. W. The potential double-burden of vitamin A malnutrition: under- and overconsumption of fortified table sugar in the Guatemalan highlands. Eur J Clin Nutr. 70 (8), 947-953 (2016).
  5. Brown, K. H., Engle-Stone, R., Kagin, J., Rettig, E., Vosti, S. A. Use of Optimization Modeling for Selecting National Micronutrient Intervention Strategies: An Example Based on Potential Programs for Control of Vitamin A Deficiency in Cameroon. Food Nutr Bull. 36 (3 Suppl), S141-S148 (2015).
  6. Bruins, M. J., et al. Maximizing the benefits and minimizing the risks of intervention programs to address micronutrient malnutrition: symposium report. Matern Child Nutr. 12 (4), 940-948 (2016).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Engle-Stone, R., et al. Weighing the risks of high intakes of selected micronutrients compared with the risks of deficiencies. Ann New York Acad Sci. 1446 (1), 81-101 (2019).
  9. Raiten, D. J., et al. Perspective: Integration to Implementation (I-to-I) and the Micronutrient Forum-Addressing the Safety and Effectiveness of Vitamin A Supplementation. Adv Nutr. 11 (2), 185-199 (2020).
  10. van Stuijvenberg, M. E., et al. South African preschool children habitually consuming sheep liver and exposed to vitamin A supplementation and fortification have hypervitaminotic A liver stores: a cohort study. Am J Clinical Nutr. 110 (1), 91-101 (2019).
  11. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among Equations Used for Retinol Isotope Dilution in the Assessment of Total Body Stores and Total Liver Reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  12. Green, M. H., Green, J. B., Ford, J. L. Better Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method Are Possible with Deeper Understanding of the Mathematics and by Applying Compartmental Modeling. J Nutr. 150 (5), 989-993 (2020).
  13. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  14. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  15. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  16. Fleshman, M. K., Riedl, K. M., Novotny, J. A., Schwartz, S. J., Harrison, E. H. An LC/MS method for d8-β-carotene and d4-retinyl esters: β-carotene absorption and its conversion to vitamin A in humans. J Lipid Res. 53 (4), 820-827 (2012).
  17. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  18. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  19. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  20. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Meth Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  21. Parker, R. S., et al. Study of beta-carotene metabolism in humans using 13C-beta-carotene and high precision isotope ratio mass spectrometry. Ann N Y Acad Sci. 691, 86-95 (1993).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  23. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. G., Russell, R. M. Short-term (intestinal) and long-term (postintestinal) conversion of beta-carotene to retinol in adults as assessed by a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 78 (2), 259-266 (2003).
  24. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  25. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats with C-13(4)-retinyl acetate and gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. J Nutr. 130 (11), 2844-2849 (2000).
  26. van Breemen, R. B., et al. Development of a method for quantitation of retinol and retinyl palmitate in human serum using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry. J Chromatogr A. 794 (1-2), 245-251 (1998).
  27. Fu, Y., Li, W., Flarakos, J. Recommendations and best practices for calibration curves in quantitative LC-MS bioanalysis. Bioanalysis. 11 (15), 1375-1377 (2019).
  28. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  29. van Lieshout, M., West, C. E., van Breemen, R. B. Isotopic tracer techniques for studying the bioavailability and bioefficacy of dietary carotenoids, particularly beta-carotene, in humans: a review. Am J Clinical Nutr. 77 (1), 12-28 (2003).
  30. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  31. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84, 30-39 (2014).
  32. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

A
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.