מאמר שיטה

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

409 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69562

⸱

10 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

במאמר זה

סיכום

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

תקציר

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hPSC) מהווים מקור מבטיח לטיפול בתאי סוכרת ולמידול מחלות. למרות שנקבעו מספר פרוטוקולי התמיינות, השתלה ב-in vivo נדרשת בדרך כלל כדי לחקור בגרות ותפקוד בהקשר פיזיולוגי. רוב גישות ההשתלה מסתמכות על אתרים כמו קפסולת הכליה או המרחב התת-עורי, שעשויים להוות מגבלות טכניות או פיזיולוגיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלה תוך-שרירית של איי SC לבלב שמקורם ב-hPSC לעכברים חסרי חיסון. אתר זה מאפשר גישה כירורגית פשוטה, הפחתת פולשנות, ושאיבת שתלים אמינה לניתוח עתידי. ההליך מאפשר השתלה תוך-שרירית של איים קטנים שמקורם בתאי גזע ותומך בהתאוששותם להערכת הפרשת האינסולין בהמשך לאחר אתגר גלוקוז אוראלי. הפרוטוקול כולל שלבים להכנת אשכולות ודחיסה, ניתוח השתלה, הפרשת אינסולין מגורה בגלוקוז בגוף (GSIS) ושאיבת שתל לניתוח היסטולוגי, המספק מסגרת ניתנת לשחזור להשתלה תוך-שרירית במודלים פרה-קליניים של עכברים.

מבוא

סוכרת היא הפרעה מטבולית הטרוגנית ששכיחותה הוכפלה בשלושת העשורים האחרונים וצפויה להשפיע על 1.3 מיליארד אנשים עד 2050. בעוד שגורמים סביבתיים, כמו תזונה ואורח חיים, ממלאים תפקיד משמעותי בהופעת סוכרת סוג 2 (T2D), הנטייה הגנטית תורמת גם היא משמעותית לפתוגנזה2. תאי β הלבלב אחראים לסינתזת והפרשה של אינסולין ומשחקים תפקיד מרכזי בפתופיזיולוגיה של סוכרת3. כדי להבין כיצד הסיכון הגנטי תורם לתפקוד לקוי של תאי β, תאי β שמקורם בתאי גזע אנושיים המאורגנים כאשכולות אנדוקריניים תלת-ממדיים (להלן SC-islets)מספקים מערכת מודלים אינפורמטיבית ורלוונטית מאוד. פרוטוקולים עדכניים מנחים ביעילות את התמיינות תאי גזע אנושיים לתאי β המייצרים אינסולין על ידי סיכום שלבי מפתח בהתפתחות הלבלב באמצעות מעכבים ספציפיים וגורמי גדילה 6,7.

מערכות אלו משכפלות באופן אמין אבני דרך התפתחותיות בצורה ניתנת להרחבה וניתנת לשחזור, תוך התגברות על המגבלות של איים שמקורם בתורמים, שאינם תומכים במודלים התפתחותיים ונתונים למגבלות אספקה. מודלים של עכברים סיפקו תובנות חשובות על התפתחות הלבלב, אך לעיתים קרובות אינם מצליחים לשחזר במלואם את התסמינים הפנוטיפיים שנצפואצל מטופלים אנושיים. כתוצאה מכך, השימוש במערכת מבוססת תאי גזע מאפשר אפיון של וריאנטים גנטיים המעורבים בהתפתחות הלבלב האנושי ובדיספונקציה של תאי β8.

למרות ההתקדמות הזו, איי SC שנוצרים במבחנה נשארים לא בוגרים מבחינה טרנסקריפטומית ותפקודית בהשוואה לתאי β בוגרים ילידים. הם מראים הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז לא אופטימלית וחסרים ביטוי של סמנים של תאי β בוגרים כמו MAFA ו-G6PC2 9,10. כדי לגשר על הפער הזה, לעיתים קרובות נעשה שימוש בבגרות in vivo באמצעות השתלה לעכברים חסרי חיסון; בדרך כלל זה משפר הן את דינמיקת הפרשת האינסולין והן את פרופילי ביטוי הגנים6.

מטבוליזם הגלוקוז מוסדר בקפדנות ודורש שילוב של רמזים מערכתיים. איי SC שהושתלו מסוגלים לשלב אותות מאיברים מרובים, ומספקים סביבה פיזיולוגית רלוונטית יותר וחיונית להערכת ההשלכות התפקודיות של שונות גנטית בתאי β אנושיים11.

השתלת אי SC בעכברים בוצעה באתרים אנטומיים שונים. האתר הקונבנציונלי הוא קפסולת הכליה, יעילה לקידום הבשלה של תאי β ולהפוך סוכרת בעכברים שטופלו בסטרפטוזוטוצין(STZ), אך היא כוללת ניתוח פולשני מורכב, שמגביל את יישומו במעבדות13. יתרה מזאת, שיטה זו אינה ניתנת לתרגום קליני לטיפול בחולי סוכרת סוג 1 בשל מגבלות גודל וכלי דם14. דווחו אתרי השתלה חלופיים, כגון רקמת תוך-שרירית, תת-עורית ורקמת שומן, המציעים דרכים פחות פולשניות ויותר קליניות. למרות שהשתלה תוך-שרירית עשויה להוות אתגרים להשגת הבשלה מיטבית בתאי β והפרשת אינסולין לעומת קפסולת הכליה12, היא עדיין יכולה להשיג הפרשת אינסולין יעילה ושמירה על הומאוסטזיס גלוקוז, תוך מתן גישה ניתוחית פשוטה ונגישה יותר15,16.

לכן, בפרוטוקול זה אנו מציגים גישה להשתלה תוך-שרירית המתמודדת עם מספר מגבלות של פרוטוקולים אחרים להשתלות. שיטה זו היא זעירה פולשנית ומספקת אסטרטגיה אמינה ב-vivo להבשלת איי SC ולחקירת וריאנטים גנטיים הקשורים לתפקוד לקוי של תאי β.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שכללו תאי גזע פלוריפוטנטיים (hPSCs) ובעלי חיים במעבדה אושרו על ידי ועדות אתיקה מוסדיות, אזוריות וארציות. קווי hPSC ששימשו כאן נגזרו והופצו במקור בהתאם לאישורים אתיים המתאימים ולנהלי הסכמה מדעת במוסדות המקור. איור 1 מציג את זרימת העבודה הכוללת, החל מתחזוקת hPSC ועד התמיינות מודרכת של שושלת הלבלב והבשלה לאיי SC המתאימים להשתלה.

1. הבחנה בין hPSCs לבין אבות הלבלב

הערה: פרוטוקול זה מתבסס על שני שלבים הכנה חיוניים: 1) תחזוקה והרחבה של hPSCs, ו-2) ההבדלה המכוונת שלהם לעבר שושלת הלבלב האנדוקריני. שני השלבים תוארו בפירוט 7,17. hPSCs נשמרים בלוחות מצופים עם מדיום B8 בהתאם להמלצות Lyria-Leyte ואחרים. קציר hPSCs לצורך התמיינות במהלך גדילה אקספוננציאלית לפני שהם מתאחדים. בצפיפות הזריעה המומלץ, הם אמורים להגיע ל-90-100% מפגש ביום הבא, מוכנים להתחיל בהבדלה. ההבחנה כלפי שושלת הלבלב האנדוקריני מתבצעת בהתאם להליך המתוארת על ידי Barsby ואחרים. פרטים מלאים על המדיה ניתן למצוא בטבלה 1.

  1. ציפו מחדש את לוחות ההתמיינות במטריצה חוץ-תאית שמקורם בממברנה בסיסית.
  2. זרע 0.16-0.19 מיליון תאים/ס"מ 2 ביום 0 (1.7 מיליון תאים בבאר מפלטת 6 בארות). השתמש ב-1.5-2 פעמים נפח B8 + CEPT כדי למנוע דלדול חומרים מזינים (3-4 מ"ל לבאר בפלטת 6 בארות).
    הערה: בעת העברת hPSCs או הזרעת ניסויי התמיינות, אנו מעדיפים להשלים את מדיום B8 עם CEPT, קוקטייל של כרומן 1, אמריקאסן, פוליאמינים וטרנס-ISRIB, במקום מעכב ROCK הקונבנציונלי Y-27632, בשל יכולתו המוכחת לשפר את הישרדות hPSC18. למרות זאת, Y27632 נותר חלופה תקפה לפרוטוקול זה.
  3. בצע שינויים במדיה באמצעות מדיה דיפרנציאציה עונה 1 עד 4 לפי לוח הזמנים הבא: עונות 1 (ימים 1-4), עונה 2 (ימים 4-7), עונה 3 (ימים 7-9), ועונה 4 (ימים 9-11).
    הערה: עיינו בטבלה 1 ליצירות מדיה מלאות; פרטים פרוצדורליים נוספים מתוארים על ידי Barsby ואחרים.

2. יצירת אשכולות תלת-ממדיים והתמיינות לתאים המייצרים אינסולין

הערה: ביום ה-11, תאים ממויינים היו אמורים להתפתח ליוצרים של הלבלב. כדי לקדם עוד יותר התמיינות אנדוקרינית בשלב זה, התאים עוברים מתרבות מישורית לתרבות תלת-ממדית.

  1. הוסיפו 0.5 מ"ל של תמיסת אנטי-היצמדות של 5% (עם וולט) (ראו טבלה 1 לפרטים נוספים) כדי לכסות את תחתית לוח מיקרובאר עם 24 בארות המכיל מיקרובארות פירמידליות הפוכות (קוטר 400 מיקרון). צנטריפוגה בעוצמה של 1,300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: תמיסת האנטי-היצמדות יוצרת משטח אנטי-דביק שמונע מהתאים להידבק לפלסטיק ומעודד הצטברות אחידה.
  2. בדקו את המיקרובארות תחת מיקרוסקופ לאיתור בועות אוויר וצנטריפוגה מחדש לפי הצורך כדי להסיר אוויר כלוא (איור 2A). שאפו את תמיסת האנטי-היצמדות ושטפו פעמיים עם 0.5 מ"ל PBS לבאר. השאירו את הבארות מכוסות ב-PBS עד שיהיו מוכנים לשימוש.
  3. שטוף את התאים ב-1 מ"ל PBS-0.5 mM EDTA, שאוף את ה-PBS-EDTA, וכסה את הבארות בטריפסין (1 מ״ל לבאר עם צלחת 6 בארות). דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 8-12 דקות (עד שהנקישה גורמת לניתוק ניכר).
  4. אל תסיר את הטריפסין; במקום זאת, יש לדלל עם פי 2 נפחים של DMEM-F12 או PBS, ולהחזיר בעדינות את הצינור באמצעות פיפטינג. הנח את המתלה בצינור חרוטי ומיד המשך לשלב הבא.
    הערה: עדיף לדגור זמן ארוך יותר בטריפסין מאשר לבצע טרטורציה מכנית קשה.
  5. צנטריפוגה את המתלה ב-200 גרם למשך 3 דקות ב-RT. שאפו בזהירות את הסופרנטנט ותלו בעדינות את הכדור ב-S4 בינוני מחומם מראש (1.25 מ"ל לכל באר במיקרובאר עם 24 בארות).
  6. שאפו את ה-PBS מצלחות מיקרווול. בעדינות, הוסיפו 1.25 מ"ל מהתאים התלויים לכל באר של לוח המיקרווול.
    הערה: כל באר בלוח 24 מיקרובארים מכיל 1,200 מיקרובארות. צפיפות הזריעה הנדרשת להשגת אשכולות בגודל מתאים היא 1,500 תאים למיקרו-באר, כלומר 1.8 מיליון תאים לבאר. חלופה נוספת היא להשתמש במיקרובארות עם 6 בארות, תוך התאמת נפחים ומספר התאים (כ-8.85 מיליון תאים ב-5 מ"ל של מדיום שלב 4).
  7. צנטריפוגה את הלוח ב-100 גרם למשך 3 דקות ב-RT כדי לפזר את התאים באופן שווה במיקרובארות. העבר בזהירות את לוחות המיקרווול לאינקובטור לח.
  8. בצע החלפות מדיה באמצעות מדיות דיפרנציאציה S5 (D14-D18), S6 (D18-D25) ו-S7 (D25-D46).
    הערה: פרטי ההרכב המלאים מופיעים בטבלה 1, עם פרטים פרוצדורליים נוספים המתוארים על ידי Barsby ואחרים.
    ניתן להשתמש בקוקטייל CEPT בשלב זה במקום מעכב ROCK Y-27632, בשל יכולתו המוכחת לשפר את הישרדות התאים במהלך היווצרות אורגנואידים18. הצטברות מוצלחת מתבטאת ביצירת אשכולות קומפקטיים וכדוריים בתוך 24-48 שעות (ראו איור 2B).

3. השתלת איי SC לשריר המתוח של עכברים חסרי מערכת החיסון

הערה: איי SC הושתלו בשלבים שונים של התמיינות (משלב 4 ועד שלב 7). בעוד שהשתלת איי S7 SC מובחנים מייצגת את האסטרטגיה האופטימלית להערכת תגובתיותגלוקוז 6, השתלת איים אבות בשלבים מוקדמים יותר (S4-S5) או איי SC לא בוגרים (S6) עשויה לסייע בגילוי הבדלים בין התמיינות או בגרות שמוסתרים במבחנה באמצעות תנאי תרבית מוגדרים. עם זאת, השתלת אבות אבות פחות ממוינים טומנת בחובה סיכון מוגבר להיווצרות טרטומה, בעיקר בשל שארית אוכלוסיות תאים לא ממוינות.

  1. דחיסת אשכולות
    1. העבר את כמות האשכולות המתאימה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (ראו הערה).
      הערה: מינון התאים תלוי במטרה הניסויית. בהיסטולוגיה, 0.5-1 מיליון תאים לעכבר מספיקים לשחזור השתל אמין, בעוד שבדיקות פונקציונליות או הפיכת סוכרת בעכברים שטופלו ב-STZ דורשות בדרך כלל מינונים גבוהים יותר, עד 2-5 מיליון תאים. לפני דחיסה, איי SC צריכים להציג מורפולוגיה כדורית אחידה עם קוטר יעד ~150-250 מיקרון (טווח מקובל: 100-300 מיקרון). טווח גודל זה מתאים בערך ל-~10³-4 תאים × 10³ק בכל אשכול, יש להימנע מאגרגטים גדולים מדי (>300-400 מיקרון), שכן הם רגישים יותר לנמק מרכזי. גודל האשכול ואחידות מאומתים לפני הדחיסה באמצעות הדמיה בשדה בהיר או סטריאומיקרוסקופ של בארות מייצגים, ואחריה מדידת קוטר באמצעות תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית.
    2. חבר את המזרק למכלול צינור המחט ומלא אותו במדיום S7.
    3. שאיפת האשכולות לתוך הצינור ישירות מצינור המיקרוצנטריפוגה. קפלו את הצינור לחצי והכניסו את החלק המקופל לקצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר. הכנס את מכלול מחט קצה הצינור לצינור קוני בקוטר 15 מ"ל וקבע את הקצוות לשפת הצינור באמצעות סרט דבק.
    4. צנטריפוגה את הצינור ב-100 גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לדחוס את האשכולות. מיד שים את הצינור על הקרח.
  2. השתלת אשכולות לעכברים
    הערה: כל ההליכים הכירורגיים חייבים להתבצע באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ובהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית ורווחת בעלי החיים המוסדיות. יש לטפל ולהשליך את חומרי ההרדמה והחומרים המדויקים בהתאם לנהלי בטיחות מאושרים.
    1. השרה של הרדמה בעכברי NOD-scid-גמא באמצעות 3-5% איזופלורן.
    2. לגלח את הצד האחורי של הרגל הימנית מתחת לברך ולחטא עם 70% אתנול.
    3. נתק את הצינור מקצה הפיפטה וחבר אותו למזרק. חתוך את הצינור קרוב לאשכולות הדחוסים וחבר אותו לקצה הקהה של המחט. דחוף את הסליין עד שהאשכול הראשון מגיע לקצה המחט.
    4. מקם את העכבר על השכיבה, נשען לצד ימין, והושיט את הרגל הימנית. הכנס את המחט לעומק של 4-5 מ"מ לתא המדיאלי של הירך הימנית, באזור שבין שרירי האדקטור לשרירי הגרציליס.
    5. הזרקו את האשכולות תוך כדי משיכת המחט בעומק ~3 מ"מ. סובב את המזרק והוציא את המחט.
    6. עקוב אחרי העכבר עד שיתאושש לחלוטין מההרדמה.
      הערה: לצורך אפיון פונקציונלי ( כלומר, ב-vivo GSIS, סעיף 4), יש להשתמש באי SC של גנוטיפ יחיד לכל עכבר; השתלה אחת מספיקה. עם זאת, לאפיון היסטולוגי או טרנסקריפטומי של הבשלות לאחר ההשתלה, ניתן להשתמש בשתי הרגליים (למשל, רגל אחת נושאת אשכולות SC שמקורם ב-hPSC המכילים וריאנט גנטי הקשור למחלה, והרגל השנייה עם תוקנת הווריאנט). מתן תוך-שריר תקין אינו ניתן לאשר ישירות ב-vivo מיד לאחר ההזרקה. השתלה מוצלחת מאומת בדיעבד על ידי זיהוי מקרוסקופי של השתל בזמן השליפה (איור 3) ובאמצעות ניתוח היסטולוגי (איור 4).

4. הפרשת אינסולין מונעת גלוקוז בגוף ( GSIS)

הערה: ב-Invivo GSIS באמצעות אתגר גלוקוז דרך הפה מעריך הפרשת אינסולין תפקודית בתגובה לגירוי פיזיולוגי. כל ההליכים חייבים לעמוד בהנחיות טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים. התגובות הפונקציונליות של תאי β שהושתלו משתפרות עם הבשלות in vivo : ניתן לזהות פפטיד C אנושי כבר שבועיים לאחר ההשתלה, בעוד שההפרשה חזקה המגיבה לגלוקוז מושגת בדרך כלל תוך 4 שבועות. לוחות הזמנים הללו יכולים להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של האיים הקטנים בהשתלה

  1. עכברים מהירים במשך 4-6 שעות לפני מתן הגלוקוז, כדי להבטיח גישה למים.
  2. הכינו תמיסת D-(+)-גלוקוז של 20% (ללא v) במים. מעטאים על ידי מעבר דרך פילטר של 0.22 מיקרון וחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. שקלו כל עכבר וחישבו את מינון הגלוקוז הנדרש ב-3 גרם למשקל גוף.
  4. טען את נפח תמיסת הגלוקוז המתאים לתוך מחט גבאז' מעוקלת של 20 גרם המחוברת למזרק של 1 מ"ל.
  5. החזקו בעדינות את העכבר ובצעו את הניתוח דרך הפה, כדי להבטיח הכנסת מחט חלקה למניעת שאיבת קנה הנשימה.
  6. איסוף דגימות דם באמצעות ניקוב תת-לסתית או וריד זנב בבסיס (0 דקות) ו-15 ו-30 דקות לאחר ה-gavage, באמצעות צינורות נימים וצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. אפשרו לדם להיקרש בטמפרטורת החדר למשך כ-15 דקות, ואז שמרו את הצינורות על קרח.
  7. צנטריפוגה את הדגימות ב-1,000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והעבירו את הסרום לצינורות חדשים. אחסן בטמפרטורה של −80°C עד לניתוח על ידי ELISA.
    הערה: נקודות הזמן ניתנות להתאמה בהתאם למודל הניסוי. חשוב להשתמש במבחן המסוגל להבחין בין אינסולין אנושי לעכבר או C-פפטיד כדי להעריך הפרשת אינסולין שמקורו בהשתל במודלים של זנוטרנסרבנטל.

5. שליפת אשכולות מושתלים

  1. הורד את העכבר בהתאם להנחיות מוסדיות לאתיקה של בעלי חיים.
  2. כדי למזער זיהום רקמות בפרווה, רססו אתנול ב-70% (v/v) על הגוף.
  3. הסר את העור כדי לחשוף את שרירי הגפה התחתונה ואתר את האשכולות המושתלים באמצעות זכוכית מגדלת. ברקמה המכילה שתל אקסייז באמצעות מספריים ומלקחיים.
  4. שטוף את הרקמה פעם אחת עם PBS והעבר אותה ל-4% (בלי פרפורמלדהיד) (PFA) על קרח. מקבע את הרקמה ב-4% PFA בטמפרטורה של 4°C למשך 4 שעות עם ניעור עדין.
  5. שטוף את הדגימה ב-PBS במשך שעה עם ניעור עדין. העבר את הרקמה לסוכרוז של 30% (בלי צבע) על PBS ודגר אותו לילה בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: יש להשליך רקמות ביולוגיות, דגימות דם ופסולת כימית (כולל קיבועים ושאריות הרדמה) בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית וניהול פסולת כימית.

6. צביעת צמחים

  1. הטמעת OCT
    1. הטמיעו את הרקמה בתבנית מלאה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
    2. הניחו את התבנית באמבט קרח יבש-איזופרופנול כדי להקפיא את הדגימה. אחסן בטמפרטורה של מינוס 80°C עד לביצוע כריתת קריו.
    3. באמצעות קריוסטט, חתכו מקטעים של 5-7 מיקרון ואחסנו את המחסניות בטמפרטורה של מינוס 80°C.
  2. צביעת חיסון
    1. איזון את השקופיות ב-RT למשך 15 דקות בתוך מיכל כדי למנוע עיבוי.
    2. שטוף את השקופיות עם PBS למשך 3 על 5 דקות.
    3. דגרו כל מקטע ב-100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה/חדירה למשך 30 דקות ב-RT (0.1% סורפקטנט לא-יוני ב-PBS, עם 5% סרום של המין שבו הוגבר הנוגדן המשני).
    4. דגרו כל מקטע ב-50 מיקרוליטר נוגדן ראשוני מדולל בתמיסת חסימה/חדירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
    5. שטוף את השקופיות עם PBS למשך 3 על 5 דקות.
    6. דגרו כל חתך ב-50 מיקרוליטר נוגדן משני מדולל בתמיסת חסימה/חדירה שעה אחת ב-RT.
    7. שטוף את השקופיות עם PBS למשך 3 על 5 דקות.
    8. התקן את המחסניות עם 15 מיקרוליטר של תמיסת התקנה באמצעות DAPI והנחה מכסה. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס בחושך עד להדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות המוצגות תואמות להשתלה תוך-שרירית של איי SC שלב 7 לעכברים חסרי חיסון, וניתוח שבוצע 6 שבועות לאחר ההשתלה. מספר מוגבל של בעלי חיים שנשאו שתלים ייצוגיים נותחו כדי להמחיש את היתכנות ההליך. במחקר זה, תוצאה מוצלחת מוגדרת כהוצאה מקרוסקופית של השתל התוך-שריר, ואחריה אישור היסטולוגי של הישרדות וזהות אנדוקרינית של איי SC שהושתלו. איור 1 ממחיש את תהליך ההתמיינות הכולל, החל מתחזוקת hPSC ועד התמיינות מוקדמת של שושלת הלבלב והבשלה לא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, אנו מתארים השתלת איים תוך-שרירית של איי SC כגישה פשוטה, ניתנת לשחזור ומינימלית פולשנית לבגרות in vivo , עם פוטנציאל להערכה פונקציונלית. למרות שהשתלה מתחת לקפסולת הכליה נחשבת ל"תקן הזהב" להשתלת איים או אי SC במכרסמים, היא דורשת מומחיות טכנית רבה יותר והליך ניתוחי ארוך יותר. לעומת זאת, האתר התוך-שרירי מציע פשטות פרוצדורלית וביצוע מהיר, בהתאם לעקרונות השיפור של מסגרת 3Rs על ידי הפחתת מורכבות ניתוחית ומתח סביב הניתוח. תכונות אלו הופכות את התהליך לאטרקטיבי במיוחד עבור מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים לד"ר דנווי חואנגפו (מרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג, ניו יורק, ארה"ב) על הנדיבות שסיפקה את קווי hPSC ששימשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה במענקים PID2021-122284NA-I00 ו-CNS2023-145179 ממשרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי MICIU/AEI/10.13039/501100011033 ו-Next GenerationEU/PRTR (A.B.), וכן על ידי הקונסורציום CIBER למחקר ביו-רפואי ברשת, CB07/08/0029 ו-PID2023-150719OB-I00 (M.V.), מכון לבריאות קרלוס השלישי (ISCIII). המרכז למחקר ביו-רפואי בסוכרת והפרעות מטבוליות נלוות (CIBERDEM) הוא יוזמה של ISCIII ונתמך חלקית על ידי קרן הפיתוח האזורית האירופית (FEDER).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392תערובת CEPT
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)SyncomCustom productמעכב Gamma-secretase
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396תערובת CEPT
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptCustom product
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich82184בשימוש ב-5% (w/v)
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483תערובת CEPT
RepSoxMedChemExpressHY-13012מעכב Alk5
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGאנלוג T3 חדיר לתאים
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495תערובת CEPT
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301מעכב ROCK
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
נוגדנים
Rat anti-Human C-peptide (insulin)DSHBGN-ID4-sבשימוש ב-150 ng/mL
Mouse anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500

מקורות

  1. Ong, K. L., et al. regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).
  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
  3. Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes. Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).
  4. Xue, D., et al. Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells. Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).
  5. Bartolomé, A. Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction. Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).
  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
  8. Shi, Z. -D., et al. Genome editing in hPSCs reveals GATA6 haploinsufficiency and a genetic interaction with GATA4 in human pancreatic development. Cell Stem Cell. 20 (5), 675-688.e6 (2017).
  9. Fantuzzi, F., et al. In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 10, e967765(2022).
  10. Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Single-cell transcriptome profiling reveals β cell maturation in stem cell-derived islets after transplantation. Cell Rep. 32 (8), 108850(2020).
  11. Lin, H., et al. Glucose metabolism and regulation in establishing human stem cell-derived β cell maturation. Cell Rep. 44 (7), 115892(2025).
  12. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  13. Thévenet, J., Gmyr, V., Delalleau, N., Pattou, F., Kerr-Conte, J. Pancreatic islet transplantation under the kidney capsule of mice: Model of refinement for molecular and ex-vivo graft analysis. Lab Anim. 55 (5), 408-416 (2021).
  14. Scholl, V. G. S., et al. Assessing implantation sites for pancreatic islet cell transplantation: Implications for type 1 diabetes mellitus treatment. Bioengineering. 12 (5), 499(2025).
  15. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), e141553(2021).
  16. Lithovius, V., et al. Non-invasive quantification of stem cell-derived islet graft size and composition. Diabetologia. 67 (9), 1912-1929 (2024).
  17. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  18. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  19. Wells, S. A., Ellis, G. J., Gunnells, J. C., Schneider, A. B., Sherwood, L. M. Parathyroid autotransplantation in primary parathyroid hyperplasia. N Engl J Med. 295 (2), 57-62 (1976).
  20. Kim, H. -I., Yu, J. E., Park, C. -G., Kim, S. -J. Comparison of four pancreatic islet implantation sites. J Korean Med Sci. 25 (2), 203(2010).
  21. Axen, K. V., Pi-Sunyer, F. X. Long-term reversal of streptozotocin-induced diabetes in rats by intramuscular islet implantation. Transplantation. 31 (6), 439-441 (1981).
  22. Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18 (1), 47-54 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים