תקנון מודל MCAO תוך-לומינלי של עכברוש: פרוטוקול מפורט עם אמצעי בקרת איכות

סיכום

פרוטוקול זה מדגים טכניקת חסימה מיטבית של 60 דקות של עורק מוחי אמצעי (MCAO) בעכברים. הפרוטוקול מאומת באמצעות גישות רב-מודליות, עם שיעור הצלחה של 87.5% עם תמותה מינימלית, ומניב תוצאות ניתנות לשחזור של אוטם והתנהגות למחקר שבץ.

תקציר

מודל חסימת העורק המוחי האמצעי (MCAO) של עכברוש נותר הסטנדרט הייחוס להבהרת פתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי ולאימות טיפולים נוירופרוטקטיביים. עם זאת, סטיות כירורגיות עדינות יכולות לשנות באופן עמוק את נפח האוטם ואת תוצאות ההתנהגות. באמצעות מסגרת של "המחשה-אז-מערכת", בחנו מחדש כל שלב בהקמת המודל ובאימות שלו. בוצע תיעוד צילום מפורט של נקודות ציון כירורגיות מרכזיות ושלבים קריטיים כדי לתקן את הכיוון האנטומי ומיקום הסיבים. צביעת 2,3,5-טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC) שימשה למיפוי מדויק של נפח וטופולוגיה של אוטמים ב-24 שעות ו-72 שעות לאחר הרפוזיה. ליקויים נוירולוגיים דורגו באמצעות סולמות זיאה-לונגה, בדרסון, וסולמות גרסיה מותאמים. עשרים וארבעה זכרים של חולדות ספרג-דולי עברו MCAO חולף של 60 דקות; נפח האוטמת וציוני העצב הוערכו ב-24 שעות ו-72 שעות. כ-87.50% מהחיות השיגו חסימת זרימת דם מוחית מוצלחת (זיאה-לונגה ≥ 1 ואינקרט חד-משמעי שהוגדר על ידי TTC), עם תמותה כוללת של 12.50%, מה שמעיד על הדיוק הגבוה של המודל. פרוטוקול סטנדרטי זה מספק בסיס טכני משוכלל וניתן לשחזור למחקר פרה-קליני של שבץ, ומקל על עקביות בין-מעבדתית במחקרים החוקרים פתופיזיולוגיה של שבץ והתערבויות טיפוליות.

מבוא

שבץ הוא הגורם השני בשכיחותו למוות והשלישי בגודלו לנכות בעולם ^1,2. שבץ משפיע באופן לא פרופורציונלי על מדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית, כאשר הוא מתרחש, בממוצע, 15 שנים מוקדם יותר מאשר במדינות בעלות הכנסה גבוהה¹. שני הסוגים העיקריים הם שבץ איסכמי (85%) ודימום תוך-מוחי (15%)³. שבץ איסכמי, האחראי לרוב המכריע של השבץ, נגרם מחסימת זרימת דם מוחית, המובילה למוות תאים ואוטם מוחי⁴. המפל האיסכמי כולל אירועים ביוכימיים מרובים, כולל תהליכים פרו-חמצניים משמעותיים ^5,6.

למרות מאמצים פרה-קליניים וקליניים נרחבים, רק מספר קטן של טיפולים — ובעיקר תרומבליזה תוך-ורידית עם מפעיל פלזמינוגן רקמתי וכריתת תרומבקטומיה מכנית — הוכיחו את יעילותם, וטיפולים אלו מוגבלים על ידי חלונות טיפולים צרים וקריטריונים מחמירים לבחירת מטופלים. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף להבהיר את המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס פגיעה איסכמית, תיקון נוירו-וסקולרי והחלמה לאחר שבץ. מודל בעלי חיים שניתן לשכפול ורלוונטי קלינית הוא חיוני להשגת מטרה זו.

מודל חסימת העורק המוחי האמצעי (MCAO) משמש באופן נרחב לחקר שבץ איסכמי במכרסמים ^7,8. שיטת החסימה התוך-לומינלית של חוט היא אחת הטכניקות הקלאסיות והנפוצות ביותר של MCAO⁹. טכניקה זו יכולה למודל סתירות קבועות וחולפות ללא צורך בכריתת גולגולת. טכניקה טרנספמורלית חדשה יותר המשתמשת בחוטים אנדווסקולריים הראתה פוטנציאל ליצירת MCAO חולף בעכברים, ומציעה תוצאות עקביות יותר¹⁰. מודל זה כולל חסימת העורק המוחי האמצעי, בדרך כלל באמצעות טכניקת חוט תוך-לומינלי¹¹. MCAO גורם להיפופרפוזיה מוקדית במוח, המובילה לאיסכמיה ולפגיעה ברפרפוזיה¹².

בעוד ש-MCAO בעל ערך לחקר פתופיזיולוגיה של שבץ וטיפולים אפשריים, הוא יכול לייצר נפחי נגעים משתנים^. לכן, שיפורים במודל MCAO — כגון שיפור טכניקות רפורפוזיה, קביעת פרוטוקולי הפעלה סטנדרטיים ופיתוח קריטריונים מאוחדים להערכה — יכולים להפחית שונות במיקום ובנפח האוטמים, ובכך לשפר את השימושיות שלו במחקר שבץ איסכמי.

פרוטוקול זה דורש עקומת למידה של כ-10–15 ניתוחים כדי^{להשיג תוצאות} עקביות. שיעורי ההצלחה עשויים להשתנות בהתאם לניסיון המפעיל ולזן העכברים¹⁴. המודל מתאים לחקר שבץ איסכמי חריף אך עשוי שלא לשחזר באופן מלא מחלות נלוות אנושיות כמו יתר לחץ דם או סוכרת^. בהתאם לכך, ניסינו לפתח ולאמת בקפדנות פרוטוקול MCAO אופטימלי שמטרתו להפחית שונות ניסיונית באמצעות הליכים סטנדרטיים ואמצעי בקרת איכות מחמירים. ארבעה חידושים משלימים שולבו להשגת התקדמות כפולה בסטנדרטיזציה ובאמינות הנתונים: (1) הערכת אורך דו-נקודה בזמן — ציונים נוירולוגיים מסולמות Zea-Longa, Bederson ו-Modified Garcia הושגו במקביל לנפחי אוטם שמקורם ב-2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) ב-24 שעות ו-72 שעות לאחר הפרפוזיה, ומגדירים את הקשר הזמני בין פתרון בצקת להחלמה פונקציונלית; (2) אימות צולב בקנה מידה משולש—ניקוד עיוור, חוקר כפול עם כיול משולש בקנה מידה משולב העלה משמעותית את הרגישות והדיוק של הערכת ההתנהגות; (3) חתך מהיר היפותרמי לאורך כל הקורס—נוהל תקני (SOP) של "חילוץ אמבט קרח בשנות ה-90 ואחריו חיתוך קורונלי חד-שלבי בקוטר 2 מ"מ בתבניות מקוררות מראש" הוקם כדי למזער אוטוליזה וטעויות אנוש, ולהבטיח מדידות נפחיות בדיוק גבוה; (4) מסגרת משולבת לבקרת איכות — SOP מקיף הכולל צום טרום-ניתוח, בקרת עומק הרדמה, ויסות חום לפני ניתוח ומניעת זיהום צולב, נבנתה כדי לספק הליך תקני MCAO שניתן לשחזור ולהעביר בקלות, ולהניח יסוד איתן לעקביות בין-מעבדתית ולהשוואה בין מחקרים.

פרוטוקול

הניסוי אושר ופיקח על ידי ועדת הניסויים המוסדיים בבעלי חיים ורווחת בעלי החיים הניסיוניים של אוניברסיטת קפיטל לרפואה. כל הפרוטוקולים עומדים במדריך NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (NIH Publ. 80-23, 1996 release), ונדרשים ציוד סטרילי וטכניקות אספטיות.

1. בחירת בעלי חיים

1. השתמש בזכרים של חולדות ספרג-דולי (בגיל 6–8 שבועות, משקל 240–270 גרם) שהושגו מספק בעלי חיים במעבדה מוסמך (מספר רישיון. SCXK (בייג'ינג) 2021-0011) כדי להקים מודל של MCAO.
2. לאחסן את בעלי החיים באופן קונבנציונלי עם אוכל ומים חופשיים; כל ההליכים פעלו לפי קוד האתיקה הבינלאומי.
3. השתמשו בקריטריונים הבאים המבוססים על משקל גוף בעלי החיים לבחירת גודל החוטים כדי להבטיח סתימה עקבית:
   - 220–250 גרם: קוטר 0.33–0.35 מ"מ
   - 250–280 גרם: קוטר 0.35–0.38 מ"מ
   - 280–310 גרם: קוטר 0.38–0.40 מ"מ
   הערה: מפרטים אלו מתחשבים בעלייה בקוטר כלי הדם בהתאם לגיל ומפחיתים את שכיחות SAH או סתימה לא שלמה¹³.

2. גודל המדגם

1. חשב גודל מדגם באמצעות תוכנת חישוב גודל מדגם. בהתבסס על נתונים ראשוניים המראים נפח אוטם צפוי של 35% ± 10% (ממוצע ± SD) בקבוצת MCAO לעומת 0% ±-2% בקבוצת SHAM, ההערכה של גודל ההשפעה (d) של כהן. למבחן Mann-Whitney U דו-זנבי (חלופה לא-פרמטרית למבחן t), עם α = 0.05 והספק (1-β) = 0.80, יש לחשב גודל מדגם מינימלי.
   הערה: גודל ההשפעה הוערך כ-3.5 וגודל המדגם המינימלי היה 6 בעלי חיים בכל קבוצה.
2. כדי לקחת בחשבון תמותה צפויה (12.5%) ושיעור ההדרה (5–10%), כלול 24 חולדות בקבוצת MCAO ו-6 חולדות בקבוצת SHAM, מה שמספק הספק מספק (>0.90) לנקודת הקצה הראשית (נפח אוטם ב-24 שעות).

3. קריטריונים להכללה והחרגה

1. כלול את בעלי החיים אם הם עומדים בקריטריונים הבאים: (1) זכרים של עכברי ספרג-דולי, 240–270 גרם, בני 6–8 שבועות; (2) היעדר ליקויים נוירולוגיים קיימים מראש (ציון נוירולוגי טרום-ניתוחי = 0); (3) השראה מוצלחת של הרדמה ללא סיבוכים.
2. להוציא בעלי חיים מהניתוח אם הראהו: (1) דימום תת-עכבישי (SAH) הנראה בנתיחה; (2) מוות מוקדם (<24 שעות לאחר ריפרפוזיה) שאינו קשור להתערבות ניסויית; (3) כישלון בהסתרה (ציון נוירולוגי = 0 והיעדר פרק מוגדר על ידי ה-TICKET); (4) כשל כירורגי טכני (למשל, קרע ב-CCA).
   הערה: קריטריונים אלו נקבעו מראש לפני תחילת המחקר כדי למזער הטיית בחירה.
3. מדיניות החלפת בעלי חיים: החלפת בעלי חיים בלבד שהוחרגו עקב כשל טכני בניתוח או מוות תוך כירורגי כדי לשמור על עוצמה סטטיסטית. אל תחליפו בעלי חיים במידול לא מוצלח (כישלון בהסתרה), אלא דווחו עליהם כחלק מחישוב שיעור ההצלחה כדי למנוע הפחתה מלאכותית של שונות.

4. הכנות טרום-ניתוחיות

1. הכינו כלים עם אוטוקלב, חוט סטרילי ושדה מכוסה.
2. אין צורך בצום שגרתי; בעת הצורך, הגביל את משך הצום ל-2–4 שעות. השרה הרדמה עם איזופלורן (3–4%) ושמרו על 1.5–2% ב-30–40% O₂ במהלך ההליך. אשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן הרפלקס המתקין וצביטת האצבע.
3. שמרו על טמפרטורת גוף של 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום מבוקרת משוב עם ניטור טמפרטורת רקטל.
4. תגלח את הצוואר והקרקפת, ואז תנקה את האזור עם פובידון-יוד, ואחר כך 70% אתנול.
5. מתן בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג, תת-עורי) 30 דקות לפני הניתוח וכל 12 שעות לאחר הניתוח למשך 48 שעות, או מלוקסיקאם (1 מ"ג/ק"ג, תת-עורי) פעם ביום במשך 3 ימים^ו-16. הערכת כאב על ידי מעקב אחר התנהגות טיפוח, יציבה ופעילות ספונטנית; לספק הקלה נוספת אם סימני אי הנוחות נמשכים.

5. סתירת ה-MCA

1. הניחו את העכברוש בשכיבה גבית עם הראש מושך בעדינות כדי לחשוף את הצוואר התחתון.
2. בצע חתך צוואר הרחם במרכז (1.5–2.0 ס"מ) באמצעות מספריים של איריס.
3. מפריד באופן ישיר את שרירי הסטרנומסטויד והאומוהיואיד באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לחשוף את הפיצול של עורק הקרוטיד השמאלי.
4. לחבר את עורק הקרוטיד החיצוני (ECA) מרחוק עם תפר משי קבוע 4-0 ומקרוב עם קשורה זמנית. צור חתך קטן בין שתי הקשורות של ECA באמצעות מיקרוסיסרים.
5. חסימו זמנית את ה-CCA ועורק התרדמה הפנימי (ICA) באמצעות מהדקים מיקרווסקולריים (לחץ 60 גרם).
6. הכנס מונופילמנט מצופה סיליקון 4-0 (קוטר 0.35–0.40 מ"מ) דרך חתך ECA. קדם אותו רטרוגרדית ל-CCA, ואז הפנה אותו ל-ICA מעבר לפיצול ה-CCA.
   הערה: ודאו שהחוט נכנס ל-ICA לכיוון בסיס הגולגולת, ולא לעורק הפטריגופלטין (PPA) שמתפצל לרוחב. אם נתקלים בהתנגדות ב-<10 מ"מ, משוך את החוט, סובב את ראש החיה 30° לכיוון הצד הנגדי, והתקדם מחדש כדי להפנות אותו מעבר למקור ה-PPA.
7. קדימו את החוט 18–20 מ"מ מהפיצול של ה-CCA עד שהתנגדות קלה מצביעה על חסימה של מקור ה-MCA. אמת את העומק באמצעות קו ההתייחסות המסומן מראש על החוט (ממוקם במרחק 2 מ"מ קרוב לפקק הסיליקון), הנמדד עם קליפר מנקודת החדרת הגדם של ECA. שחרר את מהדק ה-CCA ברגע שהפילמנט במקומו.

6. רפרפוזיה

1. לאחר 60 דקות של חסימה, פותחים מחדש את החתך ומרפים את קשירת ECA הזמני.
2. משכו בעדינות את החוט עד שהקצה שלו עובר את גזע ה-ECA, ובכך מחזירים את זרימת הדם. הניחו מיד רצועת קשורה קבועה פרוקסימלית לגדם כדי למנוע דימום גב. סגור את הפצע בשכבות.
3. העבר את העכבר לכלוב התאוששות מחומם למעקב רציף.

7. ניתוח מזויף

1. הכינו את בעל החיים בהתאם לאותו הליך שתואר לעיל עבור MCAO (צום, הרדמה, שליטה בטמפרטורה, כיסוי סטרילי).
2. בצע חתך צוואר הרחם וחשיפה לביפרקציית CCA כפי שציינתי קודם.
3. נתח וחשוף את הכלי. אל תכניס את הפילמנט.
4. שהעורקים יישארו פטנטים; אין לגרום לאיסכמיה מוחית.
5. סגור את החתך בשכבות אחרי 10 דקות חשיפה. העבר את החיה לכלוב התאוששות מחומם למעקב.

8. ציונים נוירולוגיים לאחר ניתוח

1. הערכה ב-24 שעות ו-72 שעות לאחר הרפרפוזיה, מיד לפני הקרבה למדידת נפח האוטם.
2. להרגיל את החיה בחדר שקט, 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. שני חוקרים עצמאיים עיוורים להקצאת קבוצות. שכל חוקר ירשום ציונים בדפי נפרד ללא התייעצות; כל הבדל בין המערכים ≥נקודה אחת מעורר הערכה מחודשת.
4. סולמות (לפי סדר ההעברה): ביצוע ציונים של Zea-Longa¹⁷ (טבלה 1), Bederson¹⁸ (טבלה 2), ו-Modified Garcia¹⁹ (טבלה 3), בהתאם לפרוטוקולים העדכניים ביותר שפורסמו לקריטריונים עקביים.
5. השתמשו בממוצע של שני הצופים לניתוח סטטיסטי. החריגו נתונים מכל בעל חיים אם ממוצע הציונים שונים ב->10% והחליפו בנבדק חדש.

9. מדידת נפח אוטם המוח

1. ב-24 שעות ו-72 שעות לאחר הרפרפוזיה, הרדימו עמוק חולדות עם 5% איזופלורן. ודאו הרדמה עמוקה על ידי אובדן רפלקס ישרוני ותגובת צביטת האצבעות, יחד עם נשימה יציבה, לפני הפעלה.
2. הסר במהירות את המוח בתוך 90 שניות מאישור הרדמה עמוקה, שטוף עם PBS קר כקרח, וחתוך לפרוסות קורונליות של 2 מ"מ באמצעות מטריצת מוח עכברוש מקוררת. במהלך החיתוך, יש להקפיד על אמצעי הזהירות הבאים
   1. שמרו על כל ההליך על הקרח בטמפרטורה של 0–4 מעלות צלזיוס; קצור את המוח בתוך 90 שניות ומקם אותו שטוח במטריצה מקוררת מראש.
   2. השתמשו בלהב חד כדי לבצע חיתוכים חדים ומדויקים לחתכים קורונליים מדויקים בקוטר 2 מ"מ, ואסוף כל פרוסה בסדר רוסטרו-קאודלי ל-PBS קר כקרח.
   3. נקה מיד את המטריצה והלהב עם 75% אתנול בין בעלי החיים כדי למנוע זיהום צולב.
3. לאחר חימום מוקדם של 2% ניסיון להריון ל-37 מעלות צלזיוס, טבלו את הפרוסות במלואן ודגרו בחושך למשך 20 דקות, תוך סיבוב עדין כל 5 דקות ב-20 דקות.
4. עצרו מיד את התגובה על ידי שטיפה שלוש פעמים עם PBS של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מקבע 4% פרפורמלדהיד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
5. ב-300 dpi, תצלמו את שני הצדדים של כל פרוסה פעם אחת.
   1. השתמש בתאורה קבועה על רקע לבן כדי להסיר צללים והשתקפויות.
   2. הנח פרוסות שטוחות ללא חפיפה, וכללו פס סולם ותווית זיהוי בכל פריים. החזק את המצלמה בניצב לחלקים ושמור על אורך המוקד ואיזון הלבן קבועים לאורך כל הדרך.
6. כמת נפח האימפרקט באמצעות ImageJ.
   1. ייבא את תמונת 300 dpi (פורמט RGB) והמיר לגווני אפור של 8 ביט (תמונה > Type > 8 ביט).
   2. הפעילו את הסף האוטומטי של Otsu (תמונה > כוונן > סף אוטומטי > בחר Otsu) כדי להפריד את האוטם (לבן) מהרקמה הקיימת (אדום).
   3. השתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לתאר את גבול חצי הכדור האיפסילטרלי.
   4. מדוד את השטח (ניתוח > מדידה) והקלט את ספירת הפיקסלים.
   5. חשב נפח האימפרקט: Σ (שטח האימפרקט × עובי הפרוסה [2 מ"מ]) × (נפח חצי הכדור הנגדי/נפח חצי הכדור השני), המובע כאחוז מהחצי הכדור הנגדי.

10. ניתוח סטטיסטי

1. הצג את הנתונים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) או כטווח חציוני [טווח בין-רבעוני] לפי הצורך.
2. בצע השוואות בין קבוצות באמצעות מבחן הסטודנט הלא מזווג או מבחן Mann-Whitney U עבור נתונים שאינם מבוזרים נורמלית.
3. קבע מובהקות סטטיסטית ל-P < 0.05. בצע את כל הניתוחים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית מתאימה.

תוצאות

בעלי החיים הוקצו באקראי לקבוצות הישרדות של 24 שעות (n = 10) או 72 שעות (n = 10) לאחר ריפרפוזיה עבור צביעת TTC סופית. עוד 4 חולדות עברו MCAO אך מתו לפני נקודת הסיום המתוכננת (שיעור תמותה 12.5%). קבוצת SHAM כללה n = 6. לכן, מספר בעלי החיים הכולל היה 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

חולדות עברו MCAO של 60 דקות כדי לגרום לאיסכמיה מוחית (איור 1). הרפרפוזיה החלה על ידי הסרת הסיב התוך-לומינלי ושחרור הליגטורה הפרוקסימלית ב-ECA. מתוך 24 חולדות MCAO, 3 מתו בתוך 72 שעות; אחד מהם הראה אוטם נרחב לאחר המוות לאחר המשך 24 שעות, בעוד שהשני מת מסיבות לא ידועות בתוך 72 שעות. שני חולדות נוספות הוצאו מהמחקר עקב מידול כושל (הציונים הנוירולוגיים לא עמדו בקריטריונים, והצביעה ב-TTC לא גילתה שאין פרקט). לכן, שיעור התמותה של 72 שעות היה 12.50%. הגדרנו הקמת מודל מוצלחת כהישרדות של 24 שעות בתוספת ציון לונגה של 1–3, ושיעור המודלים המוצלח הגיע ל-87.50%.

התפקוד הנוירולוגי הוערך ב-24 שעות ו-72 שעות לאחר תחילת השבץ (לפני מדידת נפח האוטם). שלושה סולמות נפוצים ביותר שדווחו בספרות — זיאה-לונגה, בדרסון וגרסיה מותאמת — שימשו כדי לספק הערכה מקיפה (איור 2). ב-24 שעות, העכברים (n = 20) קיבלו 2.02 ± 0.41 בסולם זיאה-לונגה, 2.80 ± 0.41 בסולם בדרסון, ו-8.15 ± 1.18 בסולם גרסיה המותאם; פערים אלו נותרו בולטים ב-72 שעות (זיאה-לונגה: 1.65 ± 0.59; בדרסון: 1.93 ± 0.38; גרסיה משודרגת: 11:00 ± 1.34). נפח האוטפקט, המובע כאחוז מההמיספרה הנגדית, היה 37.61 ± 2.81% ב-24 שעות לאחר MCAO וירד ל-28.32 ± 4.18% ב-72 שעות.

איור 1: תרשים סכמטי של פיזיולוגיית העורקים הצווארי-מוחיים השמאליים ותסחיף העורק המוחי האמצעי בעכברוש. דיאגרמה סכמטית של (א) אנטומיה עורקית-מוחית צווארית, (ב) לפני הכנסה, (ג) לאחר ההכנסה, ו-(ד) מיקום מוטעה של חוט לעורק הפטריגופלטין. CCA: עורק קרוטיד נפוץ; ICA: עורק הקרוטיד הפנימי; ECA: עורק הקרוטיד החיצוני; PPA: עורק פטריגופלטין; MCA: עורק מוחי אמצעי. "משולש שחור": אתר החתך; קו כחול: הפילמנט. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: מדידת נפח האוטם והערכה נוירולוגית התנהגותית לאחר חסימת עורק מוחי בעכברים. (א) צביעת RETC בחלקי מוח. (ב) נפח האימפרקט ב-72 שעות קטן יותר מזה של 24 שעות. (C,D) ציוני זיאה-לונגה וציוני בדרסון ב-72 שעות נמוכים מאלו של 24 שעות. (ה) ציוני גרסיה המתוקנים ב-72 שעות גבוהים מאלו של 24 שעות. ****P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

התגלמות	ניקוד / נקודות
אין ליקוי נוירולוגי	0
הגפה הקדמית הנגדית התכופפה והתקרבה במהלך תליית הזנב (ליקוי נוירולוגי קל)	1
סיבוב ספונטני לכיוון הצד הנגדי בזמן זחילה (ליקוי נוירולוגי בינוני)	2
נפילה לצד הנגדי בעת עמידה או הליכה	3
(ליקוי נוירולוגי חמור)
אין תנועה ספונטנית מלווה במודעות לקויה	4

טבלה 1: תוצאה של זיאה-לונגה^.

התגלמות	תוצאה/נקודות
אחוז בזנב החיה והרם אותו כך שהגוף תלוי 10 ס"מ מעל הספסל. בעכברים רגילים, שתי הגפיים הקדמיות נשארות מתוחות לכיוון הרצפה. חולדות עם ליקויים נוירולוגיים עשויות להפגין את ההתנהגויות הבאות:
אין ליקוי נוירולוגי	0
הגפה הקדמית הפרטית מתכופפת ומוחזקת קרוב לבטן, בעוד שהגפה הלא מושפעת נמשכת לכיוון הספסל	1
בנוסף להתנהגות המתוארת ב-1, ההתנגדות לדחיפה צדדית לכיוון הצד הפרטי פוחתת משמעותית כאשר החיה מונחת על הספסל	2
בנוסף להתנהגויות המתוארות ב-1 ו-2, החיה מסתובבת לכיוון הצד הפרטי בזמן הליכה	3

טבלה 2: ניקוד ^{בדרסון.}

פריט	התגלמות	תוצאה/נקודות
א) תנועה ספונטנית	פעילות רגילה	3
(צפו בפעילות העכברוש בכלוב הביתי שלו במשך 5 דקות)	מעט פגוע	2
	פגיעה בינונית	1
	אין תנועה ספונטנית	0
ב) תנועת גפה סימטרית	יציבה סימטרית	3
	יציבה אסימטרית	2
	המיפלגיה	1
ג) מתיחה של הגפה הקדמית	סימטרי	3
(אחז בזנב והביא את הגפיים הקדמיות לקצה השולחן; צפה במתיחה של כף הרגל הקדמית)	מעט אסימטרי	2
	א-סימטרי בולט	1
	המיפלגיה	0
ד) יכולת אחיזה וטיפוס	מטפס בחוזקה עם אחיזה יציבה	3
	נצפה גירעון חד-צדדי	2
	לא מסוגל לטפס או להסתובב במעגלים	1
ה) רפלקס מישושי דו-צדדי בגוף	סימטרי משני הצדדים	3
	תגובה איטית מצד אחד	2
	אין תגובה מצד אחד	1
ו) תגובת מגע של ויבריסות דו-צדדיות	סימטרי	3
	אסימטרי	2
	אין תגובה	1

טבלה 3: ציון גרסיה המתוקן. סך כל התוצאה: 0–18 נקודות; ציונים גבוהים יותר מעידים על תפקוד נוירולוגי טוב יותר.

דיון

חשוב להבהיר שהמטרה העיקרית של מחקר זה הייתה תקינה מתודולוגית ולא גילוי ביולוגי. פיתוח פרוטוקול MCAO סטנדרטי חיוני להפחתת שונות בין-מעבדתית ולשיפור השחזוריות במחקר שבץ איסכמי. פרוטוקול זה משפר את השקיפות הפרוצדורלית באמצעות אמצעי בקרת איכות מחמירים ומתמודד עם ליקויים טכניים נפוצים במידול MCAO, כולל הכנסת פילמנט סטנדרטית, ויסות טמפרטורה ועיבוד היסטולוגי.

בעוד שהירידה הנצפית בנפח האונם מ-24 שעות ל-72 שעות וההתאוששות הנוירולוגית החלקית מייצגות תופעות פתופיזיולוגיות צפויות ב-MCAO חולף, תרומת המחקר טמונה בקביעת אמינות זמנית של נקודות קצה אלו באמצעות הליך סטנדרטי קפדני. על ידי מתן מסגרת טכנית מפורטת ומדורגת, פרוטוקול זה מבטיח שמחקרים מכניים עתידיים — בין אם חוקרים מפלים נוירודלקתיים, מסלולי אפופטוזה או התערבויות טיפוליות — מבוססים על נתוני בסיס ניתנים לשחזור והשוואה. אנו ממקמים את העבודה הזו במפורש כמקור טכני התואם את תחום JoVE, ומספק בסיס למחקר טרום-קליני סטנדרטי במקום קידום תובנות מכניות.

מספר שלבים בפרוטוקול זה חשובים במיוחד להבטחת איסכמיה וריפרפוזיה עקביים. ראשית, קידום מדויק של קו החסימה עד להרגשת התנגדות קלה הוא חיוני להשגת MCAO שניתן לשחזר, שכן סטייה קלה בעומק ההחדרה עלולה להוביל לסתימה לא שלמה או לדימום תת-עכבישי^20,21. שנית, שמירה על טמפרטורת גוף תקינה קפדנית במהלך הניתוח (37 ± 0.5 מעלות צלזיוס) וניהול טמפרטורה לאחר הניתוח היא קריטית, שכן טמפרטורה נמוכה מדי או גבוהה מדי עלולה לשנות משמעותית את אזור האוטם ואת התוצאה הנוירולוגית^12,22. שלישית, הסרה מהירה של המוח בתוך 90 שניות וביצוע קירור באמבט קרח יכולים למזער את האוטוליזה ולשמור על שלמות הרקמות, ובכך להבטיח דיוק של צביעת TTC וניתוח נפח²³. אם ניתן ליישם צעדים אלה באופן עקבי, הם ישפרו משמעותית את נאמנות המודלים ואת ההשוואה בין המחקרים.

שיפרנו את שיטת MCAO המסורתית כדי לשפר את השחזוריות והנוחות בשימוש שלה. השימוש בתבניות פרוסות מוח מקוררות מראש ובפרוטוקולי חיתוך סטנדרטיים הפחית טעויות אנוש וחפצי פרוסה. בנוסף, אימוץ הערכת תפקוד נוירולוגית בשלושה סקאלה (זיאה-לונגה, בדרסון, וגרסיה מותאמת) על ידי שני חוקרים עיוורים הגדיל את החוסן והרגישות של ההערכה התפקודית 17,18,19. באמצעות נהלי פעולה סטנדרטיים מפורטים המכסים כל שלב תוכנית, היא מסייעת לזהות בעיות נפוצות כגון מיקום לקוי של חוטים, ריפרפוזיה מוקדמת או היפותרמיה לאחר הניתוח. הנחיות לפתרון תקלות לסיבוכים נפוצים כוללות: (1) קו חסימה מוטעה (כניסת PPA), שמזוהה על ידי חוסר עמידות ב-10–12 מ"מ ושיפור נוירולוגי מיידי—אם נתקלים בו, משיכת החוט מיד, סובבת את ראש החיה 30° לכיוון הצד הנגדי, והתקדמה מחדש בזווית מדיאלית קלה לכיוון בסיס הגולגולת; (2) רפווזיה מוקדמת, המצביעה על ידי שיפור נוירולוגי פתאומי במהלך החסימה—ודאו שהפקק הסיליקון מקובע היטב בגדם ה-ECA, ודאו שקוטר החוט תואם לגודל העורק (0.35–0.40 מ"מ לחולדות במשקל 240–270 גרם), ולשקול להשתמש בחוט ארוך יותר (הגדלת ציפוי הסיליקון ב-0.5 מ"מ) אם ההזזה נמשכת; ו-(3) היפותרמיה לאחר ניתוח (טמפרטורת רקטלי <36ºC)—העלאת טמפרטורת כרית החימום ל-38 מעלות צלזיוס, הנחת מנורת חימום 30 ס"מ מעל בעל החיים, ומתן תמיסת מלח סטרילית חמה (0.5 מ"ל, תוך-פריטוניאלית, 37ºC).

למרות ההתקדמות הזו, לפרוטוקול זה יש מספר מגבלות. ראשית, הטכניקה דורשת עקומת למידה משמעותית (10–15 ניתוחים) כדי להשיג שיעורי הצלחה עקביים, והשינויים האישיים באנטומיה של כלי הדם של העכברים עשויים להשפיע על מיקום הסיבים^21,24. שנית, הפרוטוקול הנוכחי מתבסס על אימות לאחר מכן (ניקוד נוירולוגי וצביעת TRYC) במקום על ניטור זרימת דם מוחית תוך ניתוחית (LDF או LSCI), מה שמגביל את בקרת האיכות במהלך הניתוח ומונע הוצאה מוקדמת של בעלי חיים עם חסימה לא שלמה²⁵. שלישית, האימות הוגבל לזכרים צעירים של חולדות ספרג-דולי, מה שהגביל את ההכללה לנקבות, בעלי חיים מבוגרים ומודלים נלווים^26,27. מחקרים עתידיים צריכים לכלול: (1) שני המינים כדי להתייחס למין כמשתנה ביולוגי; (2) חולדות מבוגרות (12–18 חודשים) עם מחלות נלוות וסקולריות; ו-(3) ניטור CBF בזמן אמת לשיפור השחזוריות במחקרי התערבות תרופתית.

שיטה זו חשובה במיוחד בסקר תרופות פרה-קליני, שכן העקביות והרלוונטיות התרגומית של תוצאותיה חשובות מאוד. הפרוטוקול הסטנדרטי המתואר במאמר זה טומן בחובו הבטחה רבה לשיפור הקפדנות והשחזוריות של מחקר שבץ איסכמי. יישומים עתידיים של פרוטוקול זה כוללים: (1) סקר פרה-קליני של חומרים נוירופרוטקטיביים שניתנו במהלך חלון הפרפוזיה; (2) מחקרים מכניים של פגיעות איסכמיה-רפווזיה באמצעות נקודות הזמן של 24 שעות ו-72 שעות; (3) חקירת נוירופלסטיות לאחר שבץ והתאוששות פונקציונלית; ו-(4) אימות מטרות טיפוליות בשילוב עם התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות. באמצעות מתן SOP מפורט ונתמך בווידאו, מטרתנו היא להקל על אימוץ נרחב של שיטה זו במעבדות ברמות מקצועיות שונות, ובסופו של דבר לתרום למחקר פרה-קליני אמין ורלוונטי יותר בתחום שבץ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2% TTC staining solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/bottle, ≥98 % purity
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL ready-to-use
Absorbable suture	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 teeth, 12 cm
Dumont curved forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm length, 0.05 mm fine tip
Feedback heating pad	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0.3 °C closed loop
ImageJ	National Institutes of Health	version 1.53k
Iris scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Curved tip, 10 cm
Micro-vascular clips	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1.5 cm curved clip
Non-absorbable silk	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Black silk thread
PASS software	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	version 15.0	Sample size calculation software
Rat brain matrix	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	2 mm coronal slots
Silicone-coated nylon filament	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0.35 mm OD, 30 mm silicone tip, EO-sterile
Small-animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Isoflurane vaporizer, induction chamber & mask included
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	version 26.0	Statistical analysis software
Vannas micro-scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Curved tip, 8 cm