מאמר שיטה

בידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II מריאות עכבריות יילודים, צעירים ובוגרים המתאימים לסביבות ניסוי זיהומי

772 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69581

⸱

19 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לבידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II (AECII) חיוניים מריאות עכבריות יילודים, צעירות או בוגרות (נגועים או לא נגועים). גישה זו מאפשרת מחקרים מולקולריים ו/או פונקציונליים במורד התהליך של AECII לזהות את תפקידם במהלך דלקת וזיהום בריאותיים.

תקציר

תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II (AECII) תורמים באופן קריטי לוויסות החיסון בריאה ולכן הם מרכיבים מרכזיים המארגנים את ההומאוסטזיס הריאתי. פונקציות אלו הופכות את AECII לרלוונטי במיוחד בהקשר של זיהום בווירוסי נשימה, המכוונים את האפיתל התחתון של דרכי הנשימה ומפריעים לשלמות האלוואולה. מודלים פרה-קליניים בעכברים הם כלים חיוניים להבהרת תפקידי AECII בהקשר של דלקת ריאה ו/או זיהומים. פרוטוקול זה מציג צינור מפורט וניתן לשחזור לבידוד AECII בריא ומטוהר מאוד מריאות עכברים בשלבים יילודים, צעירים ובוגרים. המתודולוגיה משלבת דיסוציאציה מכנית, עיכול אנזימטי ומיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) ליצירת אוכלוסיות AECII מועשירות מאוד שהוכחו כמתאימות לניתוחים מולקולריים ותפקודיים במורד הזרם. ליישומים הכוללים וירוסים פתוגניים, הפרוטוקול כולל שלב קיבוע אופציונלי של פאראפורמלדהיד (PFA), המאפשר טיפול בטוח בתנאי בטיחות ביולוגית נמוכה יותר מבלי לפגוע בשלמות ה-RNA. עם התאוששות תאים אופטימלית בשלבי התפתחות, המניבה עד 1.0 ×-106 תאי AECII לכל ריאה בוגרת, פרוטוקול זה תומך במחקרים פרה-קליניים של, למשל, פתוגנזה ויראלית, תפקוד אפיתל ויכולת רגנרציה.

מבוא

בשל תפקידיהם הרב-ממדיים בהתפתחות הריאות, הפיזיולוגיה, החיסון ותהליכי התיקון, תאי אפיתל אלוואולרי מסוג II (AECII) תורמים באופן חיוני לתחזוקה ולשיקום ההומאוסטזיס לאחר פגיעה בריאותית. מכיוון ש-AECII הם מטרות תאיות עיקריות של וירוסי מגפה כמו וירוס שפעת A (IAV) או SARS-CoV-2, גורלם ותפקודם היו במרכז המחקר בביולוגיה של זיהומים. בהקשר זה, מחקרים קודמים דיווחו כי רמזים פנימיים (למשל, סטטוסגנטי 1, גיל 2,3) וגם חיצוניים (למשל, גירויים מיקרוביאליים4) משפיעים משמעותית על פנוטיפים של AECII ועל תגובתם לטריגרים סביבתיים כגון פתוגנים באוויר. ראוי לציין כי דלקת ריאתית הוכחה כמשאירה שינויים מתמשכים בסטטוס הטרנסקריפטומי, הפרוטאומי והאפיגנטי של AECII 5,6. האינטראקציות התאיות המורכבות של AECII בתוך הריאה, כמו גם התרומה של גורמים ביוטיים ואביוטיים שונים לביולוגיה של AECII, מדגישים את חשיבות המודלים המתאימים ב-vivo המאפשרים לבחון תאים אלה לעומק רב יותר.

FACS מייצגת את הטכניקה הסטנדרטית הנוכחית להעשרה וטיהור של תאים ראשוניים מרקמות אדם ובעלי חיים, שכן היא מאפשרת יישום סימולטני של בחירה רב-פרמטרית (או החרלה) ומייצגת את השיטה היחידה שבה ניתן לשלב באופן אמין תכונות פנימיות של תא כמו גודל, גרנולריות או אוטופלואורסצנציה בתהליך הבחירה/ההדרה. עד כה, כמה פרוטוקולים שפורסמו מספקים מתודולוגיות לבידוד מבוסס FACS של עכברים ראשוניים AECII. סינה ולואל דיווחו על שיטה לבידוד AECII מעכברים בוגרים המתאפיינת בתהליך עיבוד רקמות וזרימת עבודה של ציטומטריית זרימה דומה, וכללה העשרת AECII לפני FACS על ידי התרוקנות מגנטית מבוססת חרוזים על תאים לא-מטרה7. פרוטוקול נוסף מתאר שימוש בבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי ריאה חיוביים ל-EpCAM או שימוש בעכברים טרנסגניים שאפשרו בידוד מבוסס FACS של AECII בהתבסס על זיהוי תאי SPC חיוביים (GFP+) באמצעות מודל עכבר מדווח מותנה8. בעוד שביטוי SPC מזהה באופן אמין את AECII בריאות עכברים, שיטה זו מתאימה רק בשילוב עם זן דיווח עכברי ייעודי ולכן מונעת בידוד AECII מעכברים מסוג פראי, למשל. חשוב לציין שלמרות שדווחו תפוקות וטוהר דומים של AECII, אף אחד מהפרוטוקולים הללו לא סיפק התאמות לבידוד AECII ממארחים יילודים, צעירים או נגועים.

לשם כך, הפרוטוקול הנוכחי כולל סט של זרימות עבודה מותאמות לבידוד של AECII טהור ובר קיימא מעכברים באמצעות עיכול אנזימטי בשילוב עם FACS. המתודולוגיה המתקדמת הזו מבוססת על פרוטוקול בידודAECII 9 שפותח בעבר מבוסס FACS, ומכילה שיפורים חשובים המשפרים את טוהר ה-AECII באמצעות הוספת סימני זיהוי והחרגה נוספים. חשוב לציין שהפרוטוקול המעודכן הזה כולל שליפת AECII באמצעות אסטרטגיות מיון "נגעו" ו"לא נגעו". יתרה מזאת, מאחר שהתפתחות הריאות לאחר הלידה קשורה לשינויים משמעותיים בהרכב התאים ובארגון מחדש מבני, פרוטוקול זה כולל התאמות לאופטימיזציה של שחזור AECII מריאות יילודים, צעירים ובוגרים. דבר זה מאפשר לבחון את הביולוגיה של AECII במהלך אונטוגניה, לדוגמה, בהקשר של בשלה ריאתית או מחקרי ביולוגיה של זיהומים. גישה זו יכולה לשמש להשגת AECII יעיל לגידול אקס ויבו ולזיהום ב-IAV. בנוסף, פרוטוקול זה כולל הליך קיבוע באמצעות הכימי הקיבעוני פאראפורמלדהיד (PFA). שלב זה מצדיק השבתת פתוגנים נשימתיים שונים (למשל, SARS-CoV-2, IAV) בתספי תאי ריאה, מה שמאפשר טיפול בדגימות מאוחר יותר (כולל בידוד AECII מבוסס FACS) במתקנים עם אמצעי זהירות ביולוגיים נמוכים יותר. בעוד שהקיבוע המבוסס על PFA מונע גידול AECII ex vivo נוסף למחקרים פונקציונליים, הוא מאפשר שליפת כמויות משמעותיות של RNA שלם לפרופילינג טרנסקריפטומי של AECII כדי להבהיר את תפקידם הביולוגי בהקשר של זיהומים בדרכי הנשימה.

פרוטוקול

כל בעלי החיים גודלו והוחזקו במתקן בעלי החיים במרכז הלמהולץ למחקר זיהומים בתנאים ללא פתוגנים ספציפיים (SPF) ובהתאם להנחיות לאומיות ומוסדיות. המתת חסד של עכברים נאיביים לצורך בידוד AECII מאוחר יותר בוצעה בהתאם להנחיות הלאומיות של האגודה למדעי בעלי החיים המעבדי (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). עכברים זכרים עם רקע גנטי C57BL/6 בגיל יומיים (יילודים), 3 שבועות (צעירים) או 8-12 שבועות (מבוגרים) שימשו. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת ריאת העכבר

  1. להקריב את העכבר (הפרוטוקולים המאושרים על ידי המוסד הבא):
    1. לעכברים בוגרים וצעירים : מתן מנת יתר של הרדמה (למשל, קטמין/זילאזין) באמצעות הזרקה תוך-הצפקית.
    2. לעכברים יילודים : לערוף ראש.
      הערה: יש להימנע מפריקת צוואר הרחם בעכברים בוגרים וצעירים, שכן הליך זה עלול לפגוע בקנה הנשימה.
  2. חטא את פרוות העכבר עם 70% אתנול (v/v).
    אזהרה: נוזל דליק. מגרה בעין. תתרחק מהחום. שמור על המיכל סגור היטב, ועשה חתך באמצע הבטן כדי לחשוף איברים פנימיים.
  3. הסירו בזהירות את העור והפריטונום.
  4. יש להוציא דם מהעכבר על ידי חיתוך הורידים הצוואריים והווריד הנבוב, מה שמאפשר לדם להתנקז מהגוף.
  5. הסר בזהירות את הסרעפת כדי לחשוף את הלב והריאות.
    הערה: היזהרו לא לפגוע בריאות. ניקוב רקמת הריאה יפגע משמעותית ביעילות העיכול המתווך על ידי אנזימים של רקמת הריאה לאחר מכן.
  6. פתח את כלוב הצלעות עם מספריים.
  7. הכנס קנולה לחדרון הימני של הלב ומזרן עם מי מלח קר (PBS) עד שהדם שנותר מהריאה מתרוקן ורקמת הריאה הופכת לחיוורת:
    1. לעכברים בוגרים : השתמש בקנולה של 26 גרם ופרפיוז את הריאה עם 10 מ"ל PBS.
    2. לעכברים יילודים : השתמשו בקנולה של 30 גרם ופרכו את הריאה ב-1 מ"ל PBS.
      הערה: אין לפרפיוז את ריאות העכברים הצעירים כדי למנוע קרע במבנה האלוואולרי עקב לחץ יתר בכלי דם ריאתיים. הפרפוזיה עשויה להיות פחות יעילה בריאות דלקתית, והשינוי בצבע ברקמת הריאה עשוי להיות פחות בולט. במידת הצורך, ניתן לבצע שטיפה ברונכואלוואולרית לפני השלב הבא בעכברים בוגרים וצעירים.

2. עיכול אנזימטי של רקמת הריאות

  1. עכברים בוגרים וצעירים:
    1. חשיפת קנה הנשימה על ידי הסרת בלוטות הרוק והשריר הסובב.
    2. הכנס קנולה במשקל 22 G לתוך קנה הנשימה, הסר את המחט והזז את הקטטר הפלסטי לכיוון הריאות.
    3. קשור היטב חתיכת חוט סביב קנה הנשימה והקטטר כדי להחזיק אותו במקום.
    4. הכינו את רקמת הריאה על ידי השראת דיספאז.
      זהירות: עלולה לגרום לאלרגיה או לתסמיני אסתמה או לקשיי נשימה אם נשאפים. הימנע מנשימת אבק. תשתמש בהגנה נשימתית. להשליך תכולה/מיכל למפעל פינוי פסולת מאושר.) דרך הקטטר שמוכנס לקנה הנשימה:
      1. לעכברים בוגרים : הכנס 2 מ"ל דיספאזה.
      2. לעכברים צעירים : הכנס 500 מיקרו ליטר דיספאזה.
        הערה: השתמש במזרק עם חיבור לואר סליפ כדי להקל על החלפת המזרקים בין שלבים 2.1.4 ל-2.1.5. כדי להבטיח עיכול אנזימטי יעיל של רקמת הריאה, חיוני למלא אנזימים מלאים במרחבי הברונכואלואולר.
    5. החלף את המזרק וחזר על החזרה עם אגרוז נמס נמוך (1% (w/v), 45 °C) לשמירה על מבנה במהלך העיבוד.
      1. לעכברים בוגרים : השתמשו ב-500 מיקרוליטר של אגרוז בעל התכה נמוכה.
      2. לעכברים צעירים : השתמשו ב-200 מיקרוליטר של אגרוז נמוך.
        הערה: כדי למנוע זרימה חזרה של הנוזלים, השאר את המזרק מחובר.
        הערה: לפני השימוש: המיס אגרוז במצב נמס נמוך בחום (95 מעלות צלזיוס), תן לתמיסת האגרוז להתקרר ל-45 מעלות צלזיוס, למשל בתרמובלוק.
    6. כסו את הריאה בנייר טישו מעבדה והוסיפו קרח כדי לאפשר לאגרוז להתקשות למשך 2 דקות.
    7. הסר קרח, נייר טישו, מזרק וקטטר.
    8. קשור את החוט כדי לסגור את קנה הנשימה כדי לשמור על האנזים בדרכי הנשימה התחתונות.
    9. הסר את הלב והתימוס.
    10. חתכו את קנה הנשימה מעל החוט והסירו את הריאה השלמה מהחזה.
    11. העבר את הריאה לצינור של 15 מ"ל המכיל דיספאז מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) ודגר את רקמת הריאה במצב דיספזה למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס).
      1. לעכברים בוגרים : דגרו את הריאה במרחק של 2 מ"ל.
      2. לעכברים צעירים : דגרו את הריאה ב-1.5 מ"ל דיספאזה.
  2. עכברים יילודים
    1. אספו וטחנו אונות ריאה בודדות באמצעות מספריים עדינות במכסה של צינור של 2 מ"ל.
    2. הוסיפו 500 מיקרו-ליטר דיספזה, סגרו את המכסה והפכו את הצינור כדי לוודא שכל הרקמה מכוסה בדיספזה.
    3. דגרו את רקמת הריאה במצב של דחיפה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.

3. הכנת רקמת הריאה

  1. לעכברים בוגרים וצעירים:
    1. הסר את הריאה מהדיספזה ונתח את האונות מהגבעול הברונכיאלי.
    2. הניחו את אונות הריאות בצלחת פטרי (קוטר: 8.5 ס"מ) המכילה 7 מ"ל DMEM + HEPES, 1 מיקרוגרם/מ"ל (ריכוז סופי) נוגדן חוסם נגד CD16/32 ו-100 מיקרו-ליטר DNAse (ריכוז סופי ~600 יחידות קוניץ).
      זהירות: עלולה לגרום לאלרגיה או לתסמיני אסתמה או לקשיי נשימה אם נשאפים. הימנע מנשימת אבק. תשתמש בהגנה נשימתית. להשליך את התכולה/המיכל למפעל פינוי פסולת מאושר.
    3. פירקו את רקמת הריאה באמצעות מלקחיים.
      הערה: כדי להבטיח עיכול אנזימטי יעיל של רקמת הריאה, חשוב להבטיח פירוק יסודי של רקמות מכניות.
    4. דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנוד עדין ב-200 סל"ד.
      הערה: ניתן לאחסן את מתלה התא בטמפרטורה של 4°C עד לשלב הבא, במידת הצורך.
  2. לעכברים יילודים:
    1. העבירו את הדיספאז, כולל הרקמה המעכלת, לצלחת פטרי (קוטר: 5.4 ס"מ) המכילה 3 מ"ל DMEM + HEPES, 1 מיקרוגרם/מ"ל (ריכוז סופי) נוגדן חוסם אנטי-CD16/32 ו-100 מיקרו-ליטר DNAse (ריכוז סופי ~ 600 יחידות קוניץ).
    2. דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנוד עדין ב-200 סל"ד.
      הערה: ניתן לאחסן את מתלה התא בטמפרטורה של 4°C עד לשלב הבא, במידת הצורך.
  3. המשך לכל קבוצות הגיל:
    1. סינן את תליית התא דרך סדרת מסננות תאי ניילון עם גודל נקבובית קטן (100 מיקרון - 70 מיקרון - 40 מיקרון) להסרת פסולת וחומרים גדולים.
    2. שטוף בזהירות מסנני תאים וצינורות כדי למזער אובדן תאים. במקרה שדגימות מאוחסנות, ניתן להעביר תליות תאים של עכברים מאותה קבוצה דרך אותם מסנני תאים.
      הערה: במקרה של סתימה, החלף את מסנני התאים.
    3. בהתאם לנפח, העבר את מתלי התא המסונן לצינור אחד או יותר של 15 מ"ל וצנטריפוגה את מתלי התא למשך 12 דקות בטמפרטורה של 140 x g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. השליך את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא לבופר פירוק אריתרוציטים (בופר ACK).
      1. לעכברים בוגרים וצעירים : השתמשו ב-2 מ"ל של בופר ליזיס אדומות ודגרו במשך 2 דקות.
      2. לעכברים יילודים : השתמשו ב-3 מ"ל של בופר לליזיס אריתרוציטים ודגרו במשך 3 דקות.
    5. עצרו את ניתוק האריתרוציטים על ידי מילוי צינור 15 מ"ל ב-DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS וצנטריפוגה שוב למשך 12 דקות ב-140 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

4. צביעת נוגדנים למיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה

  1. החזירו את התאים לתמיסת צביעת נוגדנים המכילה אנטי-F4/80, אנטי-CD93, אנטי-CD11c, אנטי-CD19, אנטי-CD31, אנטי-CD11b, אנטי-CD16/32, אנטי-CD45, אנטי-CD24 ואנטי-CD326 המשולבים בפלואורוכרום שהוכנו ב-DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
    הערה: לתוצאות צביעה מיטביות, השתמשו רק בנוגדנים מוקדמים. אם נדרש AECII ללא נגיעה לצורך מיון תאים, אין לכלול אנטי-CD326 בתמיסת הצביעה של נוגדנים.
    1. לעכברים בוגרים : השתמשו בתמיסת נוגדנים של 600 מיקרוליטר לכל ריאה.
    2. לעכברים צעירים : השתמשו בתמיסת נוגדנים של 400 מיקרוליטר לכל ריאה.
    3. לעכברים יילודים : השתמשו בתמיסת נוגדנים של 200 מיקרוליטר לכל ריאה.
  2. דגרו את תליית התא עם הנוגדנים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  3. לאחר הדגירה, שטפו את התאים על ידי מילוי הצינור ב-DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
  4. צנטריפוגה ל-12 דקות בטמפרטורה של 140 x g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. להחזיר את התאים DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS:
    1. לעכברים בוגרים : להחזיר ל-300 מיקרוליטר לכל ריאה.
    2. לעכברים צעירים : השעתי מחדש ב-200 מיקרוליטר לכל ריאה.
    3. לעכברים ניאונטליים : להשעות מחדש 100 מיקרוליטר לכל ריאה.

5. מיון של AECII

הערה: הכנת מכשירים: התקן פיה של 100 מיקרון למיון AECII באמצעות התקן FACS.

  1. ישירות לפני המיון, מסננים תאים דרך מסננת תאים בגודל 50 מיקרון. שטוף את מסננת התאים ב-DMEM בתוספת HEPES ו-10% (v/v) FBS כדי למנוע אובדן תאים מופרז:
    1. עכברים בוגרים: שטפו את מסננת התאים ב-300 מיקרוליטר לכל ריאה.
    2. עכברים צעירים: שטפו את מסננת התאים ב-200 מיקרוליטר לכל ריאה.
    3. עכברים יילודים: שטפו את מסננת התאים ב-100 מיקרוליטר לכל ריאה.
  2. תשהי מחדש את התאים על ידי מערבולת ישירות לפני המיון.
  3. Gate ל-AECII על ידי זיהוי אירועים שבהם I) עם פיזור צד גבוה (SSChigh), II) שליליים לפלואורוכרומים מהשושלת, ו-III) חיוביים לפלואורוכרום CD326 בשילוב עם נוגדן אנטי-CD326.
    הערה: השתמש בפלואורוכרומים עם מדדי בהירות גבוהים עד מאוד גבוהים (כגון APC, PE ו-BV785) כדי להקל על הבחנה בין לא AECII ל-AECII. בגישת מיון לא נגעה בה (ללא אנטי-CD326 בתמיסת הצביעה), AECII מזוהים כשליליים-שושלתיים, גבוהים ב-SSC, ותאים אוטופלואורסצנטייםחיוביים/גבוהים . ניתן לזהות אוטופלואורסצנציה של AECII בגלאי אור ירוק, לדוגמה, גלאי FITC או GFP.
  4. החריגו דאבלטים או אגרגטים באמצעות גובה פיזור קדמי לעומת שטח (FSC-H לעומת FSC-A) וגובה פיזור צדדי לעומת אזור (SSC-H לעומת SSC-A).
  5. אסוף את התאים הממוינים לצינור המכיל DMEM בתוספת HEPES ו-10% (v/v) FBS וצנטריפוגה לניתוח נוסף או תרבית.

6. בידוד RNA מ-AECII קבוע עם PFA (אופציונלי)

הערה: במקרה ש-AECII יבודדו מעכברים שנדבקו, למשל, בפתוגנים ויראליים נשימתיים, יש לבצע בידוד AECII בתנאי BSL2 או BSL3, בהתאם לפתוגן. אם לבודק אין גישה למיון תאים בתנאי בטיחות מתאימים, ניתן לתקן AECII מבודד לפי הפרוטוקול שתואר לעיל באמצעות PFA לאחר צביעת נוגדנים. שלב זה משבית פתוגנים10,11 ולכן מיון AECII בציטומטרי זרימה יכול להתבצע בתנאי BSL1. למרות שהתאים אינם יכולים לשמש עוד לבדיקות פונקציונליות בשל תהליך הקיבוץ, הם מתאימים לניתוחים מולקולריים.

  1. לצורך השבתת וירוסים, יש לתקן תסעיפים חד-תאיים מסומנים בנוגדנים ב-500 מיקרוליטר של 4% (ללא v) PFA.
    אזהרה: מוצק דליק. מזיק אם נבלע או שואף אותו. גורם לגירוי בעור, נזק חמור לעיניים. עלול לגרום לתגובה אלרגית בעור, גירוי נשימתי וסרטן. חשוד בגרימת פגמים גנטיים. תתרחק מהחום. אם נבלע: תתקשר למרכז רעל/רופא אם אתה מרגיש לא טוב. אם נשאפים: הוציאו את האדם לאוויר צח ושמרו עליו נוח לנשימה. תתקשר למרכז רעלים/רופא אם אתה מרגיש לא טוב. אם בעיניים: שטוף בזהירות עם מים במשך מספר דקות. הסירו עדשות מגע, אם קיימות וקל לביצוע. המשיכו לשטוף. אם נחשפת או מודאגת: קבל ייעוץ רפואי/תשומת לב.
    הערה: בהתאם להנחיות 3R, נעשה שימוש ב-AECII מעכברים לא נגועים במחקר זה. AECII היו קבועים ל-10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לבדוק את משך הקיבוע בנפרד עבור כל פתוגן שמסכן את בני האדם והסביבה. מיון מאוחר יותר בתנאי S1 דורש אימות מוקדם במעבדה של BSL2 או BSL3 שאין וירוס שניתן לשכפול לאחר קיבוע PFA.
  2. לאחר הקיבוע לשטוף תאים עם DMEM וצנטריפוגה במשך 15 דקות בעוצמה של 140 x g.
  3. החזירו את התאים ל-300 מיקרוליטר DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS והעבירו את תליית התא דרך מסננת תאים של 100 מיקרון.
  4. שטוף את מסננת התאים עם מדיום FBS נוסף של 300 מיקרולטר DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS כדי למנוע אובדן תאים מופרז.
  5. מיין תאים כפי שמתואר בשלב 5. "מיון של AECII".
    הערה: לאחר אימות ניסויי חובה שכל וירוס הושבת בטיפול ב-4% (ללא PFA), ניתן למיין את AECII בתנאי BSL1.
  6. לבידוד RNA מתאי PFA קבועים, השתמשו בערכת RNeasy FFPE.
    אזהרה: ערכה זו מכילה כימיקלים מסוכנים. עקבו אחרי ההוראות של היצרן. שימו לב לגיליון הנתונים הבטיחותי המצורף, עם ההתאמות הבאות:
    1. לאחר המיון, צנטריפוגה את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 140 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. החזירו את התאים ל-150 מיקרוליטר Buffer PKD והעבירו לצינור בנפח 1.5 מ"ל.
    3. הוסיפו 10 מיקרוליטר של פרוטינאז K ודגרו בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואחריהם דגירה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך עד 15 דקות, בהתאם למספר התאים (ראו טבלה 1).
  7. המשך בתהליך בידוד ה-RNA בהתאם לפרוטוקול, כולל טיפול ב-DNase, שלבי שטיפה ושחרור סופי במים ללא RNase של 30 מיקרוליטר.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה אופטימלית ומפורטת לבידוד וניתוח AECII מרקמת ריאות של עכבר בשלבים שונים של התפתחות, החל מיילודים ועד עכברים צעירים ובוגרים. המתודולוגיה כוללת דיסוציאציה מכנית ואנזימטית של הריאות, בשילוב עם זרימת עבודה אופטימלית למיון תאי זרימה, תוך שימוש בפרוטוקולים מותאמים המתאימים לעיבוד דגימות מבעלי חיים נגועים למיון זרימה מאוחר יותר בתנאי BSL1.

הנתונים הניסיוניים חשפו יעילות גבוהה של הליך הבידוד הזה (מסוכם באיור 1) בייצור אוכלוסיות AECII ברות קיימא וטהורות מאוד (>95%). מיון זרימה יצר אוכלוסיות AECII טהורות, כאשר ניתוח לאחר המיון אישר כמעט 100% ספציפיות לסמנים תאיים מבוססים (איור 2). כימות דגימות תאים לאחר המיון הצביע על תפוקות גבוהות בין 0.15 × 10.6 AECII ברי קיימא בריאות יילודים ו-1.0 ×-106 תאים מדגימות בוגרות לכל תכשיר ריאה שלם (איור 3A). AECII מבודדים שמרו על מורפולוגיה טיפוסית (איור 3B) ושלמות תאית לאורך כל תהליך הבידוד (איור 3C). בנוסף, היישום של הפרוטוקול למחקרים פונקציונליים אושר באמצעות זיהום חיצוני מוצלח באמצעות IAV מותאם לעכבר (H1N1, זן A/Puerto Rico/8/34) המבטא את חלבון mCherry (IAV-mCherry12), עם הדגמה של יכולת התאים לתמוך בשכפול וירוס (איור 4).

כדי לתמוך בתהליכי עבודה ניסיוניים המחייבים קיבוע דגימה, הפרוטוקול כולל גישה מיוחדת לחילוץ RNA באמצעות קיבוע PFA. בדיקה מעמיקה של איכות ה-RNA מ-AECII קבוע ב-PFA בנקודות זמן עיבוד שונות הראתה כי ניתן להפיק RNA איכותי המתאים לניתוחים מולקולריים במורד הזרם ניתן להפיקו באופן אמין מדגימות קבועות (טבלה 1). איכות ה-RNA המופק הראתה קשר ישיר עם משך הטיפול התרמי בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס במהלך תהליך החילוץ, והציעה הנחיות אופטימיזציה ברורות המבוססות על צרכים ניסיוניים מסוימים (טבלה 1, איור 5). אימות באמצעות ניתוח PCR (qRT-PCR) כמותי עם שעתוק הפוך הראה הגברה מוצלחת של גני ניקיון (חלבון ריבוזומי S9, Rps9) וסמנים ספציפיים ל-AECII (חלבון סורפקטנט C, Sftpc) באמצעות דגימות קבועות ל-PFA ותכשירים בקרה טריים (איור 6).

figure-results-1
איור 1: תהליך עבודה סכמטי לבידוד AECII מריאות עכברים יילודים, צעירים ובוגרים באמצעות עיכול רקמות אנזימטיות ומיון תאי זרימה. התרשים ממחיש את העיבוד השיטתי של ריאות עכברים מקבוצות גיל שונות. המתת חסד בעכברים והוצאת ריאות מלווה בעיכול אנזימטי רב-שלבי עם ניתוח פירוק רקמות. לאחר הפרעה מכנית, התאים מטוהרים באמצעות סדרת שלבי סינון עם קטנת גודל הנקבוביות. כתוצאה מכך, האריתרוציטים עוברים פירוק. העשרה ספציפית של AECII מושגת באמצעות סלקציה שלילית באמצעות תיוג נוגדנים נגד סמנים המטופואטיים (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), סמן אנדותליאלי CD31, סמן טסיות CD93 וסמן תאי אפיתל ברונכיאלי CD24, בחירה חיובית של תאי אפיתל באמצעות סימון נוגדנים מול CD326 ומיון ציטומטרי זרימה בהתאםלרמת SSC הגבוהה האופיינית פרופיל של AECII גרגרי. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של AECII ראשוניים טהורים מאוד (≥ 95%) לניתוחים פונקציונליים ומולקולריים במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: אסטרטגיית שער ייצוגית המשמשת לבידוד AECII מעכברים בוגרים. (א) תליות תא בודד של הריאות צובעו בנוגדנים נגד האנטיגנים הבאים: F4/80, CD93, CD11c (מקושר ל-APC), ו-CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (מקושר ל-PE), ו-CD326 (מחובר ל-BV785). (ב) ניתוח מחדש (א) לניתוח טוהר. AECII הממוינות נותחו מחדש כדי לאשר טוהר של AECII ב-97.2%. (ג) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנציה מייצגות של AECII לאחר מיון. הגרעינים צוברו ב-DAPI (כחול). צביעה תוך-תאית בוצעה באמצעות נוגדן אנטי-SPC ראשוני (מין: ארנב), והצביעה המשנית בוצעה באמצעות IgG אנטי-ארנב לעזים בשילוב עם Alexa 594 (אדום). AECII צובעו ב-DAPI ובנוגדנים משניים בלבד, וטחולים שצוברנו בנוגדנים ראשוניים ומשניים שימשו כביקורת רלוונטית, מה שמעיד על קישור ספציפי של אנטי-SPC וכן אנטי-ארנבאלקסה 594. פסי קנה מידה: 20 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: תפוקה, מורפולוגיה וחיוניות של AECII לאחר מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה. (א) מספר כולל של AECII בריאים לכל ריאה שנלקח מעכברים יילודים, צעירים ובוגרים. (B) תמונת מיקרוסקופ אור של מיון AECII לאחר מיון. פס סולם: 75 מיקרומטר. (C) קיימות AECII נצפתה על ידי צביעת כחול טרייפן לאחר המיון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: זיהום מחוץ לחי של AECII מסודר עם IAV-mCherry. תאי AECII שבודדו מעכברים בוגרים גודלו מחוץ לחיים בלוחות תרבית רקמה מצופים במטריג'ל במהלך הלילה כדי לאפשר הצמדות. לאחר מכן, התאים נדבקו ב-IAV-mCherry (ריבוי זיהום 2) במשך 8 שעות. נצפתה עלייה תלויה בזמן בעוצמת אות mCherry. פס קנה מידה: 200 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

figure-results-5
איור 5: שלמות RNA מ-4% PFA קבוע AECII. פרופילי RNA מייצגים של PFA קבעו ומיינו AECII לאחר בידוד RNA באמצעות ערכת RNeasy של Qiagen FFPE עם שינויים. שיאים ספציפיים ל-18S ו-28S rRNA, יחד עם מספר האיכות של ה-RNA (RQN), מייצגים את שלמות ואיכות ה-RNA עבור RNA מבודד שלם מ-PFA קבוע AECII. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: עקומות הגברה של גן הניקיון Rps9 והגן הספציפי ל-AECII Sftpc מ-AECII קבוע (לא מטופל) ו-4% PFA קבוע AECII. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דוגמהזמן דגירה ב-80 מעלות צלזיוס28S/18SRQNRNA conc. [ng/μ]
שליטה 0.5x106-2105.8
Control 1x106-1.91012.3
PFA קבוע 0.5x106526.45.5
PFA קבוע 0.5x106101.98.13.7
PFA קבוע 0.5x106151.88.22.76
PFA קבוע 1 x106528.26.26
PFA קבוע 1 x106101.18.45.12
PFA קבוע 1 x106150.98.55

טבלה 1: איכות ה-RNA המבודד מ-4% PFA קבוע AECII - השפעת זמני קיבוע שונים. RNA מ-AECII בודד לפי פרוטוקול היצרן (FFPE RNeasy Kit) עם שינויים שתוארו בשלב 6. התאים הקבועים הוקמו בטמפרטורה של 80°C למשך 5 דקות, 10 דקות או 15 דקות כדי להוציא את ה-RNA מהדגימה. שלמות ה-RNA נקבעה באמצעות מנתח הקטעים של Agilent

דיון

הפרוטוקול האופטימלי המתואר כאן מספק גישה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד וניתוח של AECII מרקמת ריאה של עכבר בגילאים יילודים, צעירים ובוגרים. יתרה מזאת, הוא מספק שלב קיבוע PFA אופציונלי לפני המיון, שמאפשר למיין את AECII מעכברים בתנאי BSL1, גם אם הם נדבקו בעבר בפתוגנים נשימתיים. באמצעות שילוב של חשיפה מדויקת לריאות ופרפוזיה, ולאחר מכן החדרה תוך-קנה של אנזימים ואגרוז בהתכה נמוכה לריאה, מבנה הרקמה נשמר, מה שמאפשר השחזור של תללים חד-תאיים איכותיים לניתוח במורד הזרם. הוספת מיון ציטומטרי זרימה על תכונות פיזור צדדי, גייטינג שלילי שושלת ובחירה חיובית לתאים חיוביים ל-CD326 הובילה לאוכלוסיות טהורות במיוחד של AECII. טוהר כזה חשוב במיוחד בהבטחת כך שבדיקות מולקולריות ופונקציונליות במורד הזרם מייצגות את הביולוגיה הטבועה של AECII ולא יבלבלו על ידי זיהום של סוגי תאים, מה שמשפר את יכולת הפרשנות של ביטוי גנים ומחקרי אינטראקציה בין וירוס למארח.

הפרוטוקול שהוזכר לעיל כולל הוצאה של נוגדנים שאינם AECII באמצעות מגוון רחב של נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית, המכוונים נגד אנטיגנים לויקוציטיים ולא-לויקוציטיים, ובחירה חיובית של AECII באמצעות תכונות פיזור צד וביטוי של המולקולה הספציפית לתאי האפיתל CD326. למרות שהוכח ששיטה זו הובילה לאוכלוסיות AECII טהורות מאוד (באמצעות SPC, סמן AECII), עד כה ניתן היה לאשר את טוהר האוכלוסיות שהושגו רק באמצעות צביעה תוך-תאית לאחר המיון. פרוטוקול זה יכול לשמש לבידוד AECII מהריאות הנגועות בנגיף SARS-CoV-2 ו-Influenza, שבהן AECII ממוקדים בעיקר על ידי הנגיף ומציגים התאמות תאיות מובחנות. עם זאת, שיטה זו עשויה שלא להתאים לבידוד AECII של עכברים בהקשר של מחקרי ביולוגיה של סרטן הריאות, שכן EpCAM (CD326) מתבטא גם בתאי סרטן ריאה בעכברים ובבני אדם13. למחקרים אלו, השימוש בזני עכברים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים תחת שליטה שעתוקית של פרומוטר ה-Spc עשוי לספק גישה מתאימה יותר לבידוד אמין של AECII ראשוני.

תפוקה של 0.15 × 106 AECII ברי קיימא לכל ריאה ניאונטלית ועד 1.0 ×-106 תאים לריאה בוגרת ממחישה את היעילות והיכולת להרחבת הפרוטוקול. מכשול מרכזי לבידוד מוצלח של כמויות גדולות של AECII הוא עיכול אנזימטי לא יעיל ופירוק מכני של רקמת הריאה. לכן, חשוב להבטיח מילוי מלא של החללים הברונכואלוואולריים באנזים בשלב 2.1.4 ולבצע בזהירות פירוק רקמתי מכני בשלב 3.1.3. עיכול אנזימטי יעיל מניב תליית תא עכור עם תרומה מינימלית של אגרגטים נראים לעין, שלרוב ניתן לפירוק באמצעות פומפה בשלבי הסינון הבאים. אגרגטים גדולים יותר שאינם יכולים לעבור דרך מסננת התא בדרך כלל נוצרים כתוצאה מעיכול אנזימטי לא מספק. יש לשים לב שלא מומלץ להאריך את זמני העיכול האנזימטיים, שכן הדבר עלול להשפיע לרעה על צביעת החיסון14 שלאחר מכן ועל הדיוק של בידוד AECII מבוסס FACS.

מלבד יעילות התפרקות הרקמות האנזימטית והמכנית, הרקע הגנטי עשוי להשפיע על תפוקת ה-AECII. לפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכברים על רקע C57BL/6. בהתאם להבדלים ספציפיים ספציפיים להתפתחות15,16 ואימונולוגית 17,18,19, ניתן להעלות על הדעת ששימוש בזני עכבר מעבדה אחרים (כגון BALB/c, DBA) עשוי לגרום לתפוקות AECII שונות. יתרה מזאת, תפוקת AECII מריאות מודלקות (זיהומיות או לא זיהומיות) יכולה להיות מופחתת משמעותית. זה יכול להיות תוצאה של מוות תאי עקיף (דלקתי) או ישיר (מתווך פתוגן) של AECII, המייצגים מטרות עיקריות לדוג' IAV 20,21 ו-SARS-CoV-2 22,23,24.

שימור שלמות התא במהלך דיסוציאציה מכנית, עיכול אנזימטי ומיון זרימה הוא מפתח נוסף לניתוחים מולקולריים ו/או פונקציונליים במורד הזרם. לכן, הערכה של הקיימות ותפקוד התאים של AECII לאחר המיון. AECII היו מסוגלים להיצמד למטריג'ל ולשמור על מורפולוגיה עשירה בגוף למלרית אופיינית למשך לפחות 24 שעות, מה שמעיד על יכולת פונקציונלית לאחר בידוד והתאמה לתרבות אקס-ויבו (כולל מודלים של זיהום).

הזיהום היעיל של AECII הממויין בנגיף IAV-mCherry reporter12 והתצפית על שכפול ויראלי חזק מאשרים מערכת זו כפלטפורמה איתנה להבהרת תגובות אנטי-ויראליות אפיתליאליות-פנימיות. מכיוון ש-AECII מווסת תהליכים מרכזיים המעורבים בביוסינתזה של סורפקטנטים, רגנרציה אלוואולרית וחסינות מולדת25,26, היכולת לבחון קינטיקה של שכפול IAV ותגובות שעתוק של מארח באוכלוסיות AECII מטוהרות תספק תובנות שלא ניתן להשיג בתכשירים של תאים מעורבים.

חידוש מרכזי בפרוטוקול זה הוא הכללת הליך קיבוע (fixation), המאפשר ניתוח צמוד של דגימות טריות ומושבתות. קיבוע ה-PFA ותהליכי חילוץ ה-RNA המותאם של FFPE שומרים על שלמות RNA במידה שתואמת לניתוחים טרנסקריפטומיים במורד הזרם, כפי שניתן לראות בהצלחה של PCR (qPCR) כמותי הפוך.

זמני קיבוע PFA עשויים להשפיע על איכות הצביעה וכך על התאוששות AECII על ידי FACS. יתרה מזאת, התפוקה והאיכות של RNA מושפעות בדרך כלל מתהליכי קיבוע. בהתאם למודל הזיהום בחיים שבו נעשה שימוש, יש לקחת בחשבון היבטים אלה לתכנון ניסוי. מומלץ להימנע מזמן קיבוע ממושך ובמקום זאת למקסם את משך הטיפול ב-PFA כך שישמש הזמן המינימלי הנדרש, דבר שהוכח בניסויים כמבטיח השבתה מוחלטת של הנגיף הרלוונטי.

הערכת שפע ה-RNA הריבוזומי (rRNA) באמצעות מכשיר מיקרופלואידיקה משמשת כתחליף להערכת איכות ה-mRNA בדגימות ביולוגיות. פרוטוקול הקיבוץ/בידוד ה-RNA של AECII המתואר מאפשר בידוד RNA שלם באיכות מספקת לניתוחים טרנסקריפטומיים במורד הזרם, כפי שניתן לראות ביחס 28S/18S rRNA >1 וערכי מספר איכות RNA (RQN) >8. חשוב לציין כי שלב הדגירה של 80 מעלות צלזיוס מפחית באופן קריטי את תפוקת ה-RNA ואיכותו. התאמה של זמני טיפול תרמי יכולה לשמש באופן אופציונלי להגדלת תפוקת ואיכות ה-RNA ליישומים במורד הזרם.

ביחד, שיפורים מתודולוגיים אלו מספקים ערכת כלים נרחבת ללימוד ביולוגיית AECII בהקשר של בריאות, מחלות זיהומיות והתפתחות (מתינוקות ועד מבוגרים). התפוקה הגבוהה והטוהר של AECII המבודדים בגישה זו מאפשרים פרופילינג רב-אומי, הכולל בדיקות נגישות טרנסקריפטומיות, פרוטאומיות וכרומטין, וכן בדיקות פונקציונליות (למשל, זיהום אקס ויבו) לפענוח עוד יותר את המנגנונים הרלוונטיים של AECII ב-vivo.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

המחברים רוצים להודות לטטיאנה הירש ופרידריקה קרוזה על הסיוע הטכני המומחה שלהן, לליסה הוניקה וג'סטין סמוט על הדיונים המועילים, וליושיהירו קוואוקה על מתן וירוס הכתבים IAV-mCherry. מחקר זה מומן על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - TRR 359 - מספר פרויקט 491676693 (ל-D.B. ו-J.H.), יוזמת COVIPA (KA1-Co-02, אגודת הלמהולץ; ל-D.B.), ומענק מקרן המחקר הגרמנית (BO 7036/1-1; ל-J.D.B.). אנו מודים בתמיכה מקרן הפרסום בגישה פתוחה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת אוטו-פון-גריקה במגדבורג.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בופר ACK--8.29 גרם NH4Cl, 1 גרם KHCO3, 200 ומיקרו; L של 0. 5 M EDTA, הוסף 1000 מ"ל Milli-Q, כוון pH ל-7.2 ל-7.4
CD11b נגד עכברמדעי הביולוגיה האלקטרוניים12-0112-83שיבוט M1/70; PE מקושר
אנטי-עכבר CD11cביולג'נד117310שיבוט N418; APC מחובר
אנטי-עכבר CD16/32BD ביוסיינסס553141שיבוט 93; מטוהר
אנטי-עכבר CD16/32BD ביוסיינסס561727שיבוט 2.4G2; PE מקושר
אנטי-עכבר CD19ביולג'נד115508שיבוט 6D5; PE מקושר
אנטי-עכבר CD24ביולג'נד101808שיבוט M1/69; PE מקושר
CD31 נגד עכברביולג'נד102408שיבוט 390; PE מקושר
אנטי-עכבר CD326ביולג'נד118245שיבוט G8.8; BV785 מחובר
אנטי-עכבר CD45BD ביוסיינסס553081שיבוט 30-F11; PE מקושר
אנטי-עכבר CD93מדעי הביולוגיה האלקטרוניים17-5892-82שיבוט AA4-1; APC מחובר
אנטי-עכבר F4/80ביולג'נד123116שיבוט BM8; APC מחובר
אנטי-עכבר SPC אבקאםAB211326מיני פונדקאי: ארנב; שיבוט: EPR19839; מטוהר
אריה-פיוז'ןBD ביוסיינססמיון תאים
Aria-II SORPBD ביוסיינססמיון תאים
לוחית ביוזים אגרוזביוזים8401011% (בלי וי) ב-H2O
מסננת תאים (100 ומיקרו; M, 70 ומיקרו; גבר, 40 ומיקרו; m)BD פלקון352360, 352350, 352340
CellTrics (50 ומיקרו; m)Sysmex04-004-2327
דאוקסיריבנוקלאז I מלבלב בקר, 2000 יחידות קוניץ/בקבוקוןסיגמא-אלדריץ'D4263תכולה טרייה של בקבוקון אחד ב-330 ומיקרו; L DMEM
דיספאזה, 100 מ"ל (5000 יחידות קזינוליטיות)קורנינג354235לבצע סינון סטרילי (גודל נקבוביות 0.22 ומיקרו; m), הכין אליקוטים של 4 מ"ל בצינורות של 15 מ"ל, אחסון ב-20 ו-°ג; C
DMEMגיבקו31885-049סוכר נמוך, עם פירובאט, מוסיפים HEPES (ריכוז סופי של 25 מ"מ)
דיווית FACSBD ביוסיינססתוכנת מיון
FlowJoתוכנת הערכה לנתוני FACS
אנטי-ארנב עזיםאלקסה 594 מחובר
קנולה פנימית Introcan 22Gבראון4252098B
ערכת RNeasy FFPEקיאגן73504
סימפוניה עונה 6 SEBD ביוסיינססמיון תאים

מקורות

  1. Stegemann-Koniszewski, S., et al. Alveolar type II epithelial cells contribute to the anti-influenza A virus response in the lung by integrating pathogen- and microenvironment-derived signals. mBio. 7 (3), (2016).
  2. Kumova, O. K., et al. Severity of neonatal influenza infection is driven by type I interferon and oxidative stress. Mucosal Immunol. 15 (6), 1309-1320 (2022).
  3. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single-cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 10 (1), 963(2019).
  4. Cleaver, J. O., et al. Lung epithelial cells are essential effectors of inducible resistance to pneumonia. Mucosal Immunol. 7 (1), 78-88 (2014).
  5. Boehme, J. D., et al. Epigenetic changes and serotype-specific responses of alveolar type II epithelial cells to Streptococcus pneumoniae in resolving influenza A virus infection. Cell Commun Signal. 23 (1), 278(2025).
  6. Worrell, J. C., et al. Lung structural cells are altered by influenza virus leading to rapid immune protection following re-challenge. Nat Commun. 16 (1), 7061(2025).
  7. Sinha, M., Lowell, C. A. Isolation of highly pure primary mouse alveolar epithelial type II cells by flow cytometric cell sorting. Bio Protoc. 6 (22), (2016).
  8. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells to study type II to type I cell differentiation. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  9. Gereke, M., et al. Flow cytometric isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells for functional and molecular studies. J Vis Exp. (70), e4322(2012).
  10. Avelin, V., Sissonen, S., Julkunen, I., Österlund, P. Inactivation efficacy of H5N1 avian influenza virus by commonly used sample preparation reagents for safe laboratory practices. J Virol Methods. 304, 114527(2022).
  11. Jureka, A. S., Silvas, J. A., Basler, C. F. Propagation, inactivation, and safety testing of SARS-CoV-2. Viruses. 12 (6), (2020).
  12. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nat Commun. 6, 6600(2015).
  13. Hanssen, A., Loges, S., Pantel, K., Wikman, H. Detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 5, 207(2015).
  14. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  15. Soutiere, S. E., Mitzner, W. Comparison of postnatal lung growth and development between C3H/HeJ and C57BL/6J mice. J Appl Physiol. 100 (5), 1577-1583 (2006).
  16. Alberts, R., et al. Gene expression changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12 (4), 309-318 (2010).
  17. Kida, K., Fujino, Y., Thurlbeck, W. M. A comparison of lung structure in male DBA and C57 black mice and their F1 offspring. Am Rev Respir Dis. 139 (5), 1238-1243 (1989).
  18. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  19. Soutiere, S. E., Tankersley, C. G., Mitzner, W. Differences in alveolar size in inbred mouse strains. Respir Physiol Neurobiol. 140 (3), 283-291 (2004).
  20. Koerner, I., Matrosovich, M. N., Haller, O., Staeheli, P., Kochs, G. Altered receptor specificity and fusion activity of the haemagglutinin contribute to high virulence of a mouse-adapted influenza A virus. J Gen Virol. 93 (Pt 5), 970-979 (2012).
  21. Weinheimer, V. K., et al. Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung. J Infect Dis. 206 (11), 1685-1694 (2012).
  22. Youk, J., et al. Three-dimensional human alveolar stem cell culture models reveal infection response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 27 (6), 905-919.e10 (2020).
  23. Ziegler, C. G. K., et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell. 181 (5), 1016-1035.e19 (2020).
  24. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904.e8 (2020).
  25. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: Defender of the alveolus revisited. Respiratory Res. 2 (1), 33(2001).
  26. Mason, R. J. Biology of alveolar type II cells. Respirology. 11 (Suppl), S12-S15 (2006).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

IICRT PCR
בידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II מריאות עכבריות יילודים, צעירים ובוגרים המתאימים לסביבות ניסוי זיהומי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.