הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים של מורפולוגיית אקסון חושי במגע בעור עכבר

846 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69589

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג גישת הדמיה דו-פוטונית ב-in vivo להמחשת המבנים של טרמינלי אקסון בעלי סף נמוך (LTMR) בעור כף הרגל הקדמית של עכברים. באמצעות דימות חוזר ברזולוציה גבוהה של אקסונים בודדים, שיטה זו מספקת פלטפורמה חדשה לחקר מבנה ותפקוד המעגל החישי העור במהלך ההתפתחות ובמבוגרים.

תקציר

קולטני מכאנורגיה בעלי סף נמוך (LTMRs) הם נוירונים סומטוסנסוריים שמזהים גירויים תמימים במגע קל כגון רטט, סטיית שיער ולחץ. הם יוצרים טרמינלים אקסונליים ספציפיים לתת-סוג בפריפריה ומקרינים אקסונים במרכז חוט השדרה כדי להעביר מידע מישושי. ההבנה הנוכחית של פיתוח וארגון LTMR מגיעה מרקמות קבועות שאינן יכולות לחשוף את התהליכים הדינמיים והזמן של חיווט אקסונלי ועיצוב מחדש. כאן מוצגת שיטת הדמיה בשני פוטונים להמחשת מורפולוגיית אקסון LTMR בכף הרגל הקדמית של העכבר במהלך ההתפתחות ובבוגרים. מיקרוסקופ דו-פוטוני יכול להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה בתוך עור שלם, ומאפשר הדמיה חוזרת של אותם טרמינלים אקסונים בנקודות זמן לאחר הלידה. ניתן לשלב הדמיה בשני פוטונים עם כלים גנטיים חדשים לעכברים כדי לחשוף התפתחות אקסונים עם ספציפיות לתת-סוג. הדמיה כרונית של LTMR מאפשרת מחקרים של הרכבת ותיקון מעגלים לאחר פציעה. גישות אלו מספקות מערכת in vivo שתספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים התאיים המווסתים את התפתחות והתחדשות אקסונים סומטוסוסוריים.

מבוא

המגע הוא החוש המוקדם ביותר שהתפתח ומשחק תפקיד מרכזי באופן שבו אורגניזמים חווים ומגיבים לעולם הפיזי. מגע מזוהה על ידי מכאנוצפטורים בעלי סף נמוך (LTMRs), שהם תת-סוגים של נוירוני שורש השורשים (DRG) שמזהים גירויים מכניים תמימים, כולל שקע, רטט וסטיית שיער 1,2. LTMRs הם פסאודו-יוניפולריים ומרחיבות אקסונים היקפיים אל הרקמות ההיקפיות ליצירת טרמינלים ספציפיים לתת-סוג. האקסונים המרכזיים שלהם מעבירים מידע מישושי למערכת העצבים המרכזית על ידי יצירת קשרים סינפטיים עם נוירוני חוט השדרה3. עם זאת, האופן שבו מעגלי מגע נקבעים ומתוחזקים אינו מובן היטב.

מחקרים יסודיים מוקדמים על חתולים בשנות ה-60 וה-70 זיהו לראשונה את הקולטנים המכניים השונים מבחינה פונקציונלית ואת תכונות התגובה שלהם בעור שעיר 4,5. תת-הסוגים של LTMR מסווגים לפי המורפולוגיה הייחודית שלהם, מהירות ההולכה ותכונות תגובה2. תת-הסוגים העיקריים של LTMR הם Aβ מסתגלים במהירות (RA) ומסתגלים לאט (SA) LTMRs, Aδ-LTMRs ו-C-LTMRs 2,6,7. Aβ RA-LTMRs, Aδ-LTMRs ו-C-LTMRs יוצרים קומפלקסים לנסולטים אורכיים סביב זקיקי השיער2. Aδ-LTMRs יוצרים קצוות חניתיים מקוטבים סביב זקיקי השיער בצד הזנב, תכונה חיונית לתגובותיהם הסלקטיביות לכיוון סטייה7. סופים אקסונליים בקומפלקסים הלנסוליים מיושרים בצמוד לשערות ומכוסים בתהליכים דמויי אצבע מתאי שוואן הסופיים, המספקים תמיכה טרופית ומשפיעים על מורפוגנזה אקסונית 8,9,10. בעור חלק, אקסוני Aβ RA-LTMRs מסתיימים בקורפוסקולות מייסנר, שהם מבנים בצורת ביצות הממוקמים בתוך הפפילות הדרמליות ומכוונים לתנועה על פני העור 2,11.

הארגון של טרמינלים אקסונליים LTMR מוסדר הן על ידי תוכניות פנימיות והן על ידי רמזים תלויים בעור במהלך ההתפתחות12,13. כאשר נפגע, תפקוד לקוי של LTMR קשור למצבים פתולוגיים כמו אלודיניה מכנית12,14. עם זאת, המנגנונים לפיתוח ותחזוקת LTMR בעור השלם נותרו לא ברורים. רוב מה שידוע על התפתחותם נובע מרקמות קבועות, שאינן יכולות ללכוד את התהליכים הדינמיים שעשויים להתרחש ב-vivo 6,15,16,17,18. לדוגמה, Aβ RA-LTMRs ו-Aδ-LTMRs מציגים עצבוב פעיל סביב זקיקי השיער וגיזום אקסונים במהלך התפתחות פוסט-לידתית מוקדמת19. כיצד מושגים עצבוב ותחזוקה של זקיקי השיער ב-vivo עדיין לא ידוע.

מיקרוסקופ לייזר עם שני פוטונים, טכניקת דימות מתקדמת המאפשרת הדמיה של מבנים מסומנים פלואורסצנטית ברקמות חיות, אפשרה הדמיה ברזולוציה גבוהה ב-vivo של תהליכים פיזיולוגיים דינמיים20,21. במהלך הדמיה בשני פוטונים, פולסים קצרים של אור אינפרא-אדום קרוב מעוררים פלואורופורים רק במישור המוקד, ובכך מגבילים את האות לנפח קטן וממזערים פלואורסצנציה מחוץ למוקד21,22. כליאה זו מפחיתה משמעותית את הפוטוטוקסיות ומאפשרת הדמיה תלת-ממדית ומפוזקת מרחבית של מבנים 20,23,24. יתרה מזאת, אורכי הגל הארוכים של העירור המשמשים במיקרוסקופיה של שני פוטונים מתפזרים פחות בתוך הרקמה, מה שמאפשר חדירה עמוקה יותר ורעש נמוך יותר בסביבות מורכבות 20,25,26. לדוגמה, הדמיה בשני פוטונים חשפה פלסטיות סינפטית מבנית ופעילות נוירונית בנוירונים של קרן גבית של חוט השדרה 27,28,29. בנוסף, הדמיה כרונית ב-2-פוטון של זקיקי שיער ב-2 פוטונים חשפה תובנות לגבי ההומאוסטזיס שלהם בעור אוזן העכבר23. לכן, מיקרוסקופ דו-פוטוני מתאים מאוד לחקר מבני LTMR בעור בחיים החיים, במיוחד כאשר נדרשת הדמיה חוזרת וארוכת טווח כדי לעקוב אחר שינויים התפתחותיים וכרוניים.

כאשר הוא משולב עם קווי עכברים מהונדסים גנטית המבטאים דיווחים פלואורסצנטיים, מיקרוסקופיה דו-פוטונית יכולה לחשוף מורפולוגיה נוירונית בעור3. במערכת הסומטוסנסורי, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) המובע תחת שליטת פרומוטר thy1 (Thy1-YFP)30 מתייג באופן סלקטיבי קומפלקסים לנסולאטיים Aβ-LTMR בעור שעיר וקורפוסקולות מייסנר בעור גלגל30,31. בעכברי Thy1-YFP, אקסונים מסומנים חיוביים לחלבון בסיס מיאלין ולנוירופילמנט, שהם סמנים לאקסונים מיאלינייםAβ 30,31. בנוסף, TrkB CreER, שבו CreERהמונעת על ידי ביטוי גן TrkB (קינאז קולטני טרופומיוזין), מתייג באופן סלקטיבי Aδ-LTMRs במהלך ההתפתחות7. בעור, מיקרוסקופיה דו-פוטונית יעילה ביותר להדמיית LTMR בעכברים מורדמים, שכן תנועת העכבר משפיעה על רכישת ההדמיה ברזולוציה גבוהה. לוקח זמן להמחיש חלבונים פלואורסצנטיים בקצה האקסונליים לאחר ביטוי מושרה על ידי CreER, ויש לקבוע את תקופת ההמתנה המינימלית לכל קו טרנסגני. באופן כללי, מתודולוגיה זו ניתנת ליישום להמחשת LTMR בעכברים בכל שלבי ההתפתחות ובמבוגרים.

פרוטוקול זה מסביר את ההליכים לשימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית לחקירת מורפולוגיית אקסון LTMR בעור השעיר והחלקלק של עכברים מתפתחים ובוגרים ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול כולל מספר טיפים להדמיה כרונית ברזולוציה גבוהה ואופטימלית. גישה אינטגרטיבית זו מאפשרת חקירה של המנגנונים התאיים המניעים את ההרכבה והפלסטיות של אקסוני החישה במגע ב-vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם לתקנות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) באוניברסיטת ואנדרבילט. למען בטיחות הניסיינים, כל ההליכים בוצעו עם חלוקי מעבדה, כפפות סטריליות ומסכות. כל הכלים עברו חיטוי יסודי לפני השימוש, וכל משטחי הניסוי נוקו עם 70% אתנול לפני ואחרי כל ניסוי. העכברים ששימשו במחקר זה היו מתבגרים ובעלי חיים בוגרים משני המינים, והם נגזרו מזנים של Thy1-YFP, TrkB CreER ו-Ai140. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת כלים

  1. תדליק את הלייזר. תן זמן מספיק ללייזר להתחמם. בעבודה זו נעשה שימוש בלייזר זיקייטון דיסקברי NX, שמשך הפולס שלו 100 פמטו-שניות (fs) וקצב חזרה של 80 ± 0.5 מגה-הרץ (MHz).
  2. הפעל את המיקרוסקופ הדו-פוטוני ופתח את תוכנת הבקרה והרכישה במחשב.
  3. הפעל את כרית החימום והגדר אותה ל-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע היפותרמיה במהלך ההרדמה.

2. הכנת ההרדמה והכף הקדמית להדמיה

  1. כדי לגרום להרדמה, הניחו את העכבר בתא האינדוקציה והגדרו את המערכת ל-3.5% איזופלורן עד שהעכבר מאבד את רפלקס ההתיישרות שלו ומראה נשימות חלקות וסדירות (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). אוויר בחדר משמש כנושא וצריך להיות מוגדר ל-1.0 ליטר לדקה (L/min).
  2. הנח את העכבר על כרית החימום בפלטפורמת ההדמיה והפחית את האיזופלוראן ל-1.5% ואת החמצן ל-0.5 ליטר לדקה. איזופלורן צריך להיות מועבר דרך חרוט האף. בעכברים צעירים יותר מיום 20 לאחר הלידה, איזופלוראן מוגדר ל-2-4% לשמירה על ההרדמה. יש לעקוב אחרי עומק ההרדמה כל 10 דקות על ידי הערכת אובדן הרפלקסים של הדוושה והפלפברל, קצב הנשימה והעומק, וטונוס השרירים הכללי.
  3. כדי למזער ארטיפקטים של תנועה במהלך ההדמיה, כולל תנועות הקשורות לנשימה, יש למקם את העכבר על שלב נפרד מהכף. בפרוטוקול זה, גוף העכבר נשען על פלטפורמה הסמוכה אך לא נוגעת בפלטפורמת ההדמיה שבה מונחת הכף רגל.
  4. מרחו משחה עינית על העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההדמיה.
  5. מרחי בעדינות קרם הסרת שיער על כף הרגל באמצעות מטוש כותנה להסרת השיער. אחרי שהשארתי אותו על העור לדקה, מסירים את הקרם, ואז מנקים את כף העכבר עם 70% אתנול ומים.
  6. מתוח בעדינות את העור כדי לייצב את פני העור. באמצעות מחט סטרילית של 30 גרם ודיו שחור, חורצים בעדינות את העור והקעקוע עם שתי נקודות סמוכות משני צידי אזור התמונה המיועד. ודא שהנקודות ממוקמות במרחק של כ-2 מילימטרים (מ"מ). לאחר סיום הקעקוע, השליכו את המחט כראוי במיכל חדים.
  7. על סלייד זכוכית מיקרוסקופית, מניחים ארבע נקודות של גריז ואקום בפינות והניחו חתיכת חימר קטנה (למשל, חימר DAS Air-hardening Modeling) בעובי של כ-1 מ"מ במרכז הסלייד. הנח את הסלייד מתחת לעדשת המטרה ומרכז את כף הרגל של העכבר ישירות על חתיכת החימר (איור 1A,B). גלגלו בעדינות את כף העכבר על המחסנית כדי לשטח אותה וללחוץ אותה לתוך החימר. הנח בזהירות כיסוי בגודל 22 מ"מ על 60 מ"מ מעל הכף כדי לאבטח את המחסנית. כוון את זווית עור העכבר על ידי לחיצה קלה על כל פינה של הכיסוי עד שפני השטח של הכיסוי והעור מקבילים למישור ההדמיה. שימוש בכוח עדין במהלך ההדמיה עוזר למנוע פגיעות עור פוטנציאליות.
  8. להדמיית העור החלק, הנח את הסלייד מתחת לעדשת המטרה ומרכז את כף הרגל של העכבר על הסלייד כפי שמפורט בשלב 2.7. השתמש בפינצטה כדי לסובב את הכף כך שהעור החלקלק יפנה כלפי מעלה. השתמשו בקצה השטוח של המלקחיים כדי ללחוץ בעדינות את הכף לתוך החימר. כאשר הכף שטוחה, מניחים את ה-coverslip למעלה ולחצו כלפי מטה כפי שמתואר בשלב 2.7.

3. הדמיית מיקרוסקופ דו-פוטוני של מורפולוגיית LTMR

הערה: הפרמטרים הבאים ניתנים להתאמה בהתאם לניסוי הספציפי. לניסוי זה נעשה שימוש בעדשת אובייקטיב טבילה במים בעומק 20x עם צמצם מספרי של 1 ומרחק עבודה של 2.00 מ"מ. שלבים 3.1-3.6 מתארים את הפרמטרים הספציפיים המשמשים לכף הקדמית הימנית של עכברי Thy1-YFP , שיכולים לשמש כמדריך ייחוס.

  1. הנח טיפה של מים מזוקקים על הכיסוי, ישירות מעל כף הרגל של העכבר.
  2. הורד את עדשת האובייקטיב עד שנוצר עמוד מים.
  3. לאחר שהעדשה האובייקטיבית ממוקמת מעל כף העכבר, סגרו את תיבת המיקרוסקופ והשתמשו במסך ה-LED כדי להתמקד בדגימה דרך בקרי X, Y ו-Z. מסך ה-LED מציג תמונה חיה המוארת על ידי נורית LED המובנית של המיקרוסקופ.
    הערה: מצב LED משמש לאישור שהעדשה האובייקטיבית ממוקדת בשדה העניין לפני המעבר למצב שני פוטונים. תמונת ה-LED מציגה תכונות שטחיות כמו כלי דם וזקיקי שיער, ומשמשת כמדריך חזותי ליישור ומיקוד. הקעקועים על כף הרגל של העכבר מופיעים ככתמים שחורים על מסך ה-LED. באמצעות נקודות ציון אלו, מצא והתמקד באזור שבין הכתמים השחורים. זה מבטיח שאותו אזור בכף העכבר יוצג שוב ושוב.
  4. ברגע שנמצא הדגימה, כבה את מסך ה-LED. כדי לבצע הדמיה בשני פוטונים מהרקמה, העבר את המיקרוסקופ ממצב המראה למצב דיכרואי על ידי הפיכת מנוף בצד העליון-ימין של המיקרוסקופ.
  5. סגור את וילונות האפלה והפעיל את הגלאי כדי להמחיש את YFP.
  6. באמצעות Prairie View, פתחו את התריס והעבירו את התוכנה למצב הדמיה. לצילום Thy1-YFP, הפעל את הלייזר המכוון על 960 ננומטר (ננומטר) לרווח של 700-800. בעת צילום GFP, הגדר את הלייזר המכוון ל-920 ננומטר.
    1. לעכברים ביום העשירי לאחר הלידה או צעירים יותר, הגדרו את עוצמת הלייזר ההתחלתית ל-50, תוך העלאת עוצמת האות הרצויה. עוצמת הלייזר ההתחלתית הנמוכה הזו ממזערת את חדירת האור ואת הסיכון לנזק אור. לאחר שאורך הגל, הרווח וההספק של הלייזר מוגדרים, התחל לסרוק.
      הערה: לצילום תמונה בשדה ראייה ברזולוציה גבוהה של 1.00x או תמונה של גופיות מייסנר בקצות אצבעות חלקות, מומלץ להשתמש בגודל תמונה של 1024 על 1024 עם שדה ראייה של 601.9 מיקרון x 601.9 מיקרון, וגודל פיקסל של 0.588 מיקרומטר x 0.588 מיקרון. להדמיית קצוות חניתים סביב זקיקי השיער, מומלץ לגדל תמונה בגודל 1024 על 1024 בזום של 8.00x, שדה ראייה של 75.2 מיקרון על 75.2 מיקרון, וגודל פיקסל של 0.147 מיקרון x 0.147 מיקרון. חשוב לציין ששדה הראייה של התמונה וגודל הפיקסלים משתנים בהתאם להגדרת הזום.
  7. השתמש בבקרי X, Y ו-Z כדי למצוא את שדה ההדמיה, להתאים את הזום לפי הצורך, ולהתחיל באיסוף תמונה. תמונה אופטימלית מתקבלת בדרך כלל במיקום התחלתי, כ-10-20 מיקרון מתחת לפני העור.
    הערה: תמונה ברזולוציה גבוהה של העור השעיר בדרך כלל כוללת גודל שלב של 1 מיקרון או 2 מיקרון עם כ-40-120 פרוסות. בינתיים, תמונה ברזולוציה גבוהה של העור החלקלק בדרך כלל כוללת גודל שלב של 2 מיקרון עד 4 מיקרון עם כ-80-100 פרוסות. כתוצאה מכך טווח z טיפוסי של 100-250 מיקרון, ועומק ההדמיה המרבי הכולל הוא כ-300 מיקרון.
  8. סשן ההדמיה יוגבל ל-25 דקות כדי למזער את משך החשיפה לאיזופלוראן ולהפחית את הסיכון לתופעות לוואי הקשורות להרדמה על בעל החיים. האיזופלורן הנוסף נספג על ידי מיכל מסנן פחם להרדמה, שניתן להשליך לפח רגיל.

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. הסר את כף הרגל של העכבר מהזכוכית והחזיר את העכבר לכלוב התאוששות.
  2. שמור על כלוב העכבר חם על כרית חימום עד שהעכבר מתאושש לחלוטין מההרדמה.
  3. החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו, תוך התבוננות בו למשך 30 דקות נוספות כדי לוודא שהעכבר משתלב עם חבריו לכלוב.

5. הדמיה כרונית ב-in vivo של מורפולוגיית LTMR

  1. הנח את העכבר תחת מיקרוסקופ שני פוטונים על ידי צעדים 2.4-3.3.
  2. באמצעות מסך ה-LED, אתר את נקודות הדיו מההדמיה הקודם. כוון את המסך בין הנקודות כדי לוודא שהאזור הרצוי נתפס. במהלך מצב סריקה במיקרוסקופ, יש לבדוק אם יש סימנים כמו עצבים גדולים או דפוסי זקיקי שיער, כדי להבטיח את מיקום אותו אזור.
  3. לאחר שנמצא אזור ההדמיה, יש לפעול לפי שלבים 3.4-3.6 להמשך ההדמיה.
  4. בדקו את איכות ועוצמת התמונות, וכן את המורפולוגיה של האקסונים המרכזיים, המתקבלים באמצעות עירור דו-פוטוני של אזור העור. ודא ששדות התמונה דומים לאלו שצולמו במהלך מפגש ההדמיה הקודם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעבודה זו, מיקרוסקופ דו-פוטוני שימש להמחשת מבנים אקסונליים של Aβ RA-LTMR ו-Aδ-LTMR בעור במהלך ההתפתחות ובמבוגרים. קצוות חנית בוגרים, המתרחשים בעכברים סביב יום 20 לאחר הלידה ומעלה, מפותחים במלואם19,32. הארגון הכולל של טרמינלי האקסון בעור השעיר של עכברים בוגרים דומה, כפי שמוצג בהקרנת העוצמה המרבית (איור 2A). העומק והצורה של מסופי האקסון הללו ניתנים לצפייה באמצעות שחזור תלת-ממדי, הכולל Aβ שדה-LTMR, Aβ RA-LTMR, וכמה אקסוני תת-סוג Aβ לא מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מדגים שימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית לבחינת מורפולוגיית LTMR בעור שלם של עכברים יילודים ובוגרים. גישה זו של דימות אורך מתגברת על מגבלות קיבוע הרקמות ומאפשרת תצפית בזמן אמת על מבנים אקסונליים ברקמות שלמות. המורפולוגיות האקסונליות Aβ RA-LTMR ו-Aδ-LTMR המוצגות באמצעות הדמיה בשני פוטונים תואמות לתצפיות מרקמות קודמות עם PFA קבוע 2,6,7,19,33,34.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על גילויים רלוונטיים.

תודות

אנו רוצים להודות לד"ר חנה אלם, ד"ר סניגדה מוקרג'י, רשל לריבי וד"ר טגי ג'יי. ודאקן על כל תמיכתם ועזרתן לאורך כל המחקר הזה. אנו מודים לריאן מייקל נוארה על העזרה בהקמת מערכת האיזופלורן. עבודה זו נתמכת על ידי מלגת האנה גריי של מכון הווארד יוז לרפואה (מענק#GT17518).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עדשת אובייקטיבי 20x – סופר NA 1.0אולימפוס1-U2B965מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
כיסוי 22x60VWR16004-330מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
חימר מודלינג עם הקשחת אווירDASמערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
משאבת אוויר הרדמה (HF), 110VRWD Life Science Inc.R510-30מערכת איזופלוראן
מסכת הרדמה קונצנטריתRWD Life Science Inc.R510-Mמערכת איזופלוראן
תא הרדמה ו-ndash; עכבר ועכברושRWD Life Science Inc.V105מערכת איזופלוראן
חוקר ברוקר אולטימה פלוס מיקרוסקופ סורק לייזרברוקר נאנו, בע"מ;מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
מחטי פרפרפישר סיינטיפיק1484041מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
זיקית דיסקברי NX עם TPC: Dualקוהרנטי1385777מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
מסכת חרוט עם צינורות לעכברים יילודיםRWD Life Science Inc.68680מערכת איזופלוראן
מסנני פליטה כפולים (et525/70m ו-et595/50m) ו-t565lpxr  מפצל קרן דיכרואיניקוןINVP-01מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
סט פילטר אפי-פלואורסצנציה ET-GFP ET470/40x ו-ET252/50m; Dichroic T495LPXR ניקון518065מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
אתנולמעבדות דקון בע"ממערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
רפידת חימום אינפרא-אדום רחוקה עם בקר (חשמל AC)קנט סיינטיפיקRT-0515מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
גלאי GaAsp (2) המאמאצו פוטוניקה  HED-UP-2 מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
מיכלי סינון גזRWD Life Science Inc.R510-31-6מערכת איזופלוראן
גריז ואקום גבוהסיגמא אולדריץ'Z273554מערכת הדמיה
איזופלורן, USP (250 מ"ל)טיפול נמרץ פירמל6679-017-25מערכת איזופלוראן
תיבת כיסוי לייזר טכנולוגיית טקומערכת הדמיה
עכברים: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
עכברים: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
עכברים: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/Jנהר צ'ארלס3709
קרם מסיר שיער נאיראמזון28001מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
קבצי נתונים גולמייםזנודו10.5281/zenodo.17370834
מעמד קשיח עם מחזיק הכניסה מלבני גדולThorlabsMP15Mמערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
פלטפורמת ניתוח הרדמה לבעלי חיים קטניםRWD Life Science Inc.R510-PGLמערכת איזופלוראן
משחת סיכה לעיניים מרגיעותבאוש + לומבמערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני
שקופיות סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-550-15מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני

מקורות

  1. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  2. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  3. Meltzer, S., Santiago, C., Sharma, N., Ginty, D. D. The cellular and molecular basis of somatosensory neuron development. Neuron. 109 (23), 3736-3757 (2021).
  4. Burgess, P. R., Petit, D., Warren, R. M. Receptor types in cat hairy skin supplied by myelinated fibers. J Neurophysiol. 31 (6), 833-848 (1968).
  5. Iggo, A., Muir, A. R. The structure and function of a slowly adapting touch corpuscle in hairy skin. J Physiol. 200 (3), 763-796 (1969).
  6. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
  7. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  8. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  9. Handler, A., et al. Three-dimensional reconstructions of mechanosensory end organs suggest a unifying mechanism underlying dynamic, light touch. Neuron. 111 (20), 3211-3229 (2023).
  10. Yamamoto, T. The fine structure of the palisade-type sensory endings in relation to hair follicles. J Electron Microsc (Tokyo). 15 (3), 158-166 (1966).
  11. Cauna, N., Ross, L. L. The fine structure of Meissner's touch corpuscles of human fingers. J Biophys Biochem Cytol. 8 (2), 467-482 (1960).
  12. Olson, W., Dong, P., Fleming, M., Luo, W. The specification and wiring of mammalian cutaneous low-threshold mechanoreceptors. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (3), 389-404 (2016).
  13. Koutsioumpa, C., et al. Skin-type-dependent development of murine mechanosensory neurons. Dev Cell. 58 (20), 2032-2047 (2023).
  14. Duan, B., Cheng, L., Ma, Q. Spinal circuits transmitting mechanical pain and itch. Neurosci Bull. 34 (1), 186-193 (2018).
  15. Botchkarev, V. A., Eichmüller, S., Johansson, O., Paus, R. Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin. J Comp Neurol. 386 (3), 379-395 (1997).
  16. Peters, E. M. J., et al. Developmental timing of hair follicle and dorsal skin innervation in mice. J Comp Neurol. 448 (1), 28-52 (2002).
  17. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3 (4), 389-395 (2003).
  18. Liu, Q., et al. Molecular genetic visualization of a rare subset of unmyelinated sensory neurons that may detect gentle touch. Nat Neurosci. 10 (8), 946-948 (2007).
  19. Meltzer, S., et al. A role for axon-glial interactions and Netrin-G1 signaling in the formation of low-threshold mechanoreceptor end organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (43), e2210421119(2022).
  20. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  21. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  22. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  23. Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nat Protoc. 10 (7), 1116-1130 (2015).
  24. Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus. J Vis Exp. (185), e64104(2022).
  25. Rompolas, P., Mesa, K. R., Greco, V. Spatial organization within a niche as a determinant of stem-cell fate. Nature. 502 (7472), 513-518 (2013).
  26. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 23 (12), 3139-3149 (2006).
  27. Ahanonu, B., Crowther, A., Kania, A., Rosa-Casillas, M., Basbaum, A. I. Long-term optical imaging of the spinal cord in awake behaving mice. Nat Methods. 21 (12), 2363-2375 (2024).
  28. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760(2012).
  29. Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T., Ito, S. In vivo two-photon imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model. Eur J Neurosci. 41 (7), 989-997 (2015).
  30. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  31. Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 88 (10), 582-595 (2012).
  32. Luo, W., Enomoto, H., Rice, F. L., Milbrandt, J., Ginty, D. D. Molecular identification of rapidly adapting mechanoreceptors and their developmental dependence on Ret signaling. Neuron. 64 (6), 841-856 (2009).
  33. Neubarth, N. L., et al. Meissner corpuscles and their spatially intermingled afferents underlie gentle touch perception. Science. 368 (6497), eabb2751(2020).
  34. Bai, L., et al. Genetic Identification of an Expansive Mechanoreceptor Sensitive to Skin Stroking. Cell. 163 (7), 1783-1795 (2015).
  35. Griffin, J. W., Thompson, W. J. Biology and pathology of nonmyelinating Schwann cells. Glia. 56 (14), 1518-1531 (2008).
  36. Tsai, P. F., Chou, F. P., Yu, T. S., Lee, H. J., Chiu, C. T. Depilatory creams increase the number of hair follicles, and dermal fibroblasts expressing interleukin-6, tumor necrosis factor-α, and tumor necrosis factor-β in mouse skin. Korean J Physiol Pharmacol. 25 (6), 497-506 (2021).
  37. Bourane, S., et al. Low-threshold mechanoreceptor subtypes selectively express MafA and are specified by Ret signaling. Neuron. 64 (6), 857-870 (2009).
  38. Jung, Y., Ng, J. H., Keating, C. P., Senthil-Kumar, P., Zhao, J. Comprehensive evaluation of peripheral nerve regeneration in the acute healing phase using tissue clearing and optical microscopy in a rodent model. PLoS One. 9 (4), e94054(2014).
  39. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606 (7912), 137-145 (2022).
  40. Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Exp Dermatol. 26 (5), 379-383 (2017).
  41. Meleshina, A. V., et al. Multimodal label-free imaging of living dermal equivalents including dermal papilla cells. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 84(2018).
  42. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

LTMRIn Vivo
הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים של מורפולוגיית אקסון חושי במגע בעור עכבר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.