Method Article

בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

DOI:

10.3791/69601

⸱

February 6th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג שיטה איתנה לבידוד mRNA אקסונים באמצעות הכנסות ממברנה נקבוביות, המאפשרת הפרדה מלאה בין נוירונים לנויריטים וטיהור RNA. בשילוב עם RTddPCR, הגישה מאפשרת כימות מוחלט של תמלילים בעותק נמוך, ומקלה על מחקרים של העברת mRNA ותרגום מקומי עם רגישות גבוהה, שחזוריות ויישום ניסויי רחב.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדינמיקה המרחבית של מיקום תרגום mRNA בתוך נוירונים חיונית למנגנונים שונים של תפקוד נוירוני, כולל קישוריות נוירונים, פלסטיות סינפטית ותגובה לפציעה. עקב הקוטביות הקיצונית של נוירונים, רבות מהפונקציות הללו תלויות ביכולת של אקסונים לתרגם מקומית תמלילים מסוימים. עם זאת, כימות אוכלוסיות ה-RNA התת-תאיות הללו נותר אתגר טכני. כאן, אנו מתארים גישה ניתנת לשחזור להשגת תאים סומטיים ומועשרים אקסונים נפרדים מנוירוני מכרסמים מתורבתים, וכן לכימות ביטוי mRNA ספציפי לאזור. נוירונים עובריים או בוגרים ראשוניים של מכרסמים גודלו על כניסות עם ממברנה נקבובית בגודל 1-3 מיקרון. ממברנות אלו מותרות רק לאקסונים, ומאפשרות הפרדה פיזית בין המדורים הסומטיים לאקסונליים. RNA בודד לאחר מכן מהנוירון כולו ומחלקים מועשרים באקסונים בנפרד, אשר שימשו גם ל-RTddPCR דיגיטלי לטיפות טרנסקריפטאז הפוך עם פריימרים ייחודיים לגנים. מערכת זו מציעה השוואה כמותית מוחלטת בין תאים תת-תאיים, ומאפשרת זיהוי רגישות גבוהה של תמלילים מקומיים. גישה זו מודדת שפע RNA במצב יציב ומקלה על בחינת שינויים ב-RNA אקסונלי לאורך זמן בתגובה לגורמים נוירוטרופיים, לחץ או מודלים של פציעות. השילוב של חלוקה פיזית וניתוח RTddPCR מפחית זיהום צולב ונותן מספרי עותקים מדויקים של תמלולים נדירים, ומציע רגישות גבוהה, שחזוריות וזיהוי mRNA במספר עותק נמוך השולטים בצמיחה והתחדשות אקסון. שיטה זו פועלת גם עם בדיקות בהמשך, כגון מדידת סינתזת חלבונים, חקר יציבות RNA, וביצוע ניסויים בהפרעה באמצעות siRNA או תרופות החוסמות חלבונים מסוימים. חשוב לציין שטכניקה זו יכולה להיות מותאמת לתתי-סוגים נוירונליים שונים, שלבי התפתחות או מודלים של פציעה. באופן כללי, גישה זו היא דרך גמישה, רגישה וניתנת לשחזור לחקור את הבסיס המולקולרי של מיקום mRNA אקסונלי וכיצד הוא משפיע על תפקוד הנוירונים ומנגנוני המחלה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים הם אחד התאים המורכבים והמקוטבים ביותר מבחינה מבנית בביולוגיה. יש להם תהליכים ארוכים שיכולים לפעמים להגיע למרחקים העולים על מטר. קוטביות זו מסבכת את התקשורת התאית וההומאוסטזיס של החלבונים בדרכים שונות. גישה מעודנת למענה לדרישות אלו היא להעביר mRNA לתאים מרוחקים כגון אקסונים ודנדריטים, תוך הקלה על תרגומם באופן מוסדר בתגובה לאותות מקומיים 1,2,3. תרגום מקומי מאפשר לאקסונים לסנתז חלבונים באופן מרחבי-זמן. תהליך זה חיוני להתפתחות האקסונים, פלסטיות סינפטית, התחדשות לאחר פציעה ותגובות לגירויים התפתחותיים וחוץ-תאיים 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

היכולת לנתח את תפקידי mRNA מקומיים באקסונים היא קריטית להבנת תפקידם הן בתפקוד נוירוני תקין והן בהקשר של פתופיזיולוגיה. דיסרגולציה של תרגום mRNA אקסונלי נקשרה למחלות ניווניות נוירודגנרטיביות שונות16, כגון טרשת לטרלית אמיוטרופית (ALS)17,18,19, אטרופיה שרירית של עמוד השדרה (SMA)20,21, ומחלת אלצהיימר (AD)22. התחדשות אקסונים לאחר נזק תלויה מאוד בתרגום מהיר ומדויק של חלבוני ציטוסקלטל, מולקולות איתות וקולטנים 3,23,24,25,26,27,28. למרות רעיונות חדשניים אלו, התחום ממשיך להתמודד עם אתגרים בכימות ולכידת אוכלוסיות mRNA ספציפיות לאקסונים.

אחד האתגרים של טרנסקריפטומיקה אקסונלית הוא לגרום להפרדה נקייה של הסומה והאקסונים. מכיוון שרוב ה-mRNA מועשר בסומה, אפילו כמויות קטנות של זיהום מגוף התא יכולות להשפיע על התוצאות בהערכת תכולת האקסונים של mRNA מסוים. טכניקות קונבנציונליות, כולל תאי מיקרופלואיד 29,30,31,32 או תאי קמפנו 33, מספקות גדילה אקסונלית כיוונית והפרדה ברורה בין שני התאים, אך תפוקת האקסונים עלולה להיות נמוכה מדי למחקרים ביוכימיים כגון ריצוף RNA בכמויות גדולות (RNA-seq), קו-אימונופרציפיטציה של RNA ואחריה ריצוף RNA, או תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR). RNA-seq בכמויות גדולות ו-qPCR, אף שהם מועילים, לעיתים קרובות חסרים את הרגישות הנדרשת לזיהוי מדויק של תמלילים בעלי עותק נמוך באקסונים, מה שמוביל להערכה שגויה של מינים בעלי חשיבות פיזיולוגית.

כדי להתמודד עם אתגרים אלו, אנחנו ואחרים השתמשנו בהכנסות ממברנה חדירות להפרדה פיזית של אקסונים וסומטות 34,35,36,37,38,39,40,41. הכנסות אלו מאפשרות לנוירונים להתפתח על משטח מיקרו-נקבובי, ואקסונים יכולים להימשך לתא התחתון דרכם, אך לא לסומה. ארכיטקטורה בסיסית אך יעילה זו מאפשרת לגדל מספר עצום של נוירונים עם הפרדה פיזית ברורה בין סומה לאקסונים. השיטה מבוססת ממברנה חשובה כי היא נמנעת מהבעיות הטכניות הנלוות למכשירים מיקרופלואידיים ומספקת כמויות גבוהות של חומר אקסוני שניתן להשתמש בו למחקרים מולקולריים וביוכימיים. מערכת ההכנסות גם קלה לשימוש בדברים כמו פציעות מכניות, מה שהופך אותה לשימושית במגוון רחב של ניסויי שקשורים לתיקון עצבים. השיטה המתוארת כאן ממקסמת עוד יותר את התפוקה והטוהר של הנוירונים על ידי שיפור תנאי התרבית, התאמת מאפייני נקבוביות הממברנה, ושילוב אימות מבוסס PCR דיגיטלי של טיפות טרנסקריפטאז הפוך (RTddPCR) לדגימות RNA אקסונליות בעלות תפוקה נמוכה.

חשוב גם לוודא שהשברים האקסונליים טהורים. אנו מוציאים אקסונים מהתא התחתון רק לאחר הסרת חומר סומטי שנותר מהמשטח העליון. אימות פריימר מראה העשרה חזקה של סמנים אקסונליים וללא או זניח של סמנים סומטיים. אישור מולקולרי מחזק הבחנה זו: שברים אקסונליים מועשרים ב-mRNA אקסונים מוכרים כמו Gap43, ובביטוי נמוך יותר של Actγ42. זה מראה שמערכת ההחדרה מייצרת דגימות אקסונליות עם תכולת סומה זניחה בתוכן, מה שמתאים לבדיקה נוספת.

לאחר בידוד שברים אקסונליים מועשרים, המכשול הבא הוא למדוד mRNA הקיימים במספרי עותקים נמוכים במיוחד. החומר ההתחלתי הקטן מחלקי אקסונים ונוכחות mRNAs עם מספר עותק נמוך באקסונים דוחפים את גבולות הרגישות של PCR כמותי הקונבנציונלי (RT-qPCR), המשתמש בעקומות סטנדרטיות לכמות. יתרה מזאת, RT-qPCR גם אינו מספק את מספרי העותקים המוחלטים של תמלול מסוים. לעומת זאת, RTddPCR מפריד דגימות cDNA לאלפי טיפות, מה שעוזר לקבל ספירת תמלול מדויקת באמצעות סטטיסטיקות פואסון. דבר זה מאפשר למצוא תמלולים באופן אמין גם אם רק כמה עותקים של התמלולים עשויים להימצא בננוגרם אחד של RNA כולל 5,6,7,43.

במאמר זה אנו מספקים גישה יעילה, הכוללת שיטות לתרבית נוירונים בוגרים או עובריים שונים על אינסרטים, בידוד RNA מאזורים מועשרים בין נוירונים שלמים לבין תאים מועשרים אקסוניים, בדיקת טוהר אקסונלי, וכימות מוחלט מבוסס RTddPCR של העתקי mRNA. שיטות אלו יכולות לשמש לקביעת רמות ה-mRNA הספציפיים, המתמקמים באקסונים בתנאים בסיסיים, וכיצד הם משתנים באקסוטומיה או בתגובה לגירוי גורמי גדילה או לאותות נוירוטוקסיים. על ידי שילוב שיטה זו עם קו-אימונופרציפיטציות חלבונים, ניתן גם להעריך את הדינמיקה של קומפלקסים של חלבוני ריבונקולר (RNP) באקסונים. לדוגמה, השתמשנו רבות בשיטה זו כדי לחקור את ה-mRNA, הנמצאים בגרגירי החלבון הקושר לחלבון 1 (G3BP1) האקסונלי שמפעיל את Ras GTPase. G3BP1 הוא רכיב מרכזי בגרנולות מאמץ44, ומחקרינו הקודמים הראו שהוא מעכב את סינתזת חלבוני האקסונים ובתורו חוסם הן את ה-PNS והן את התחדשות האקסונים של מערכת העצביםהמרכזית (CNS). יתרה מזאת, שיטה זו יכולה לשמש לחקר תפקיד דיסרגולציה של תרגום אקסונלי במצבים פתופיזיולוגיים שונים, כולל ALS, SMA ו-AD.

מטרת המחקר היא ליצור ולבדוק שיטה למדידת mRNA אקסונליים שהיא רגישה, ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה. על ידי שילוב תרביות מבוססות הכנסה מחולקות לבין כימות מבוסס RTddPCR, אנו מספקים לתחום פתרון לבעיות המתמשכות של טרנסקריפטומיקה אקסונית. שיטה זו לא רק תאפשר גילויים חיוניים בנוגע לתרגום מקומי, אלא גם תבסס בסיס לחקירות תרגומיות המתמקדות בהתערבויות טיפוליות בתיקון עצבי ובנאורודגנרציה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת האינסרטים לזרעת תאים

  1. הניחו את האינסרטים עם גודל נקבוביות מתאים בפלטה עם 6 בארות.
    הערה: השתמש בגודל נקבובית של 1 מיקרון להפרדת אקסונים מהסומה ובגודל נקבובית של 3 מיקרון להפרדת כל הנוירייטים (אקסונים ודנדריטים) מהסומה.
  2. הוסיפו 100 מיקרוגרם/מ"ל פולי-אל-ליזין (PLL) לפלטת 6 בארות כך שהיא נוגעת בתחתית האינסרטים, ולחלק העליון של ההכנסות (2 מ"ל/באר ו-1 מ"ל/אינסרט).
  3. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. שטוף את הבארות (תחתית ההכנסות) ואת החלק העליון של ההכנסות במים סטריליים וטהורים במיוחד - 4 שטיפות × 5 דקות.
  5. לנוירונים של גנגליון שורש גב (DRG) בלבד, הוסף 5 מיקרוגרם/מ"ל למינין (2 מ"ל/באר ו-1 מ"ל/הכנסה) ודגר לפחות שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ודא שגם החלק העליון וגם התחתון של האינסרט מצופים באופן שווה.
  6. שטיפה עם סליין סטרילי עם בופר פוספט (PBS) (pH 7.4) המכיל 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין - 2 שטיפות × 5 דקות.
  7. המשיכו בדיסקציה וזרעו סביב 1 × 106 תאים/הכנסה עבור נוירונים קורטיקלייםעובריים 5, היפוקמפוס45, ובסיסי לנוירונים כולינרגיים קדמייםבמוח 31,32. ל-DRGs בוגרים של חולדות, לוחות 6-8 DRGs/הכנסה 5,7 (איור 1).

2. איסוף שברים תת-תאיים נוירונליים מתוך הכנסות 6 בארות

  1. Aliquot 250 מיקרוליטר טריזול כל אחד בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לכל אינסרט ובאר/החדרה אחת של לוח 6 בארות. תשאיר את זה בצד.
  2. בפלטה נוספת עם 6 בארות, הוסף 2 מ"ל לבאר של PBS סטרילי. מספר הבארות/הלוחות צריך להיות פרופורציונלי למספר ההכנסות.
  3. שאיפת מדיה לתרבות מהחלק העליון ומהתחתון של ההכנסה והעבירה לפלטת 6 בארות המכילה PBS.
  4. באמצעות מלקחיים, הנח בעדינות את האינסרט והוסיף 2 מ"ל PBS מעל האינסרט. שאיפת מדיה מהחלק העליון ומהתחתון של האינסרט וחזרו על הפעולה. בסך הכל, שטוף פעמיים עם PBS והשאר ב-PBS טרי (1 מ"ל ו-2 מ"ל בחלק העליון והתחתון, בהתאמה).
  5. בידוד כל חלק הנוירון
    1. באמצעות מגרד תאים סטרילי, גרדו את כל חלק הנוירון (החלק העליון של ההכנסה). הפעילו לחץ מספיק כדי שהתאים יתחילו להתנתק, אך הממברנה לא תישבר (איור 1).
    2. אסוף את כל הנוירון מההכנסה והעבר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    3. צנטריפוגה את הצינור ב-10000-15000 גרם למשך 2 דקות.
    4. זרוק את הסופרנטנט והחזיר את הליזאט ל-250 מיקרוליטר טריזול.
    5. תתייג את הצינור הזה כחלק מלא של הנוירונים.
    6. המשך באיסוף חלקי הנויריטים.
  6. בידוד שבר הנויריטים
    1. קח מטוש כותנה סטרילי, והשתמש בקצה אחד, זז בדפוס זיגזג מלמעלה למטה לאט מאוד בצד הנוירון. סובב את ההכנסה ב-90 מעלות וחזור על התהליך עם הקצה השני של המטוש (אם משתמשים במגביה דו-צדדית, או להשתמש במגביה חדשה למטלית חד-צדדית). השליכו את המטוש הזה (איור 1).
    2. השתמשו במקלון חדש והזיזו במעגלים קונצנטריים, מתחילים מאמצע התוספת ויוצאים החוצה. תוודא לנקות גם את הקירות (היקף).
    3. הפוך את הכנסת הממברנה (צד הנוירייט פונה כלפי מעלה) וחתוך את הממברנה באמצעות להב סקלפל סטרילי חדש תוך כדי אחיזתו עם מלקחיים. תוודא להשאיר ~2-3 מ"מ בשוליים.
    4. הניחו את הממברנה החתוכה בצלחת 6 בארות המכילה טריזול כאשר צד הנוירייט פונה כלפי מטה. תוודא שהוא שקוע במים.
    5. אספו את הטריזול המכיל את נויריט ליזאט מהצלחת בעלת 6 הבארות והעבירו לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  7. עבור ליזאטים של כל הנוירון והנויריטים, יש לבצע בידוד RNA או לשמור את הליזטים ב-80 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר.

3. בידוד וכימות RNA

  1. בידוד RNA
    הערה: לחלק הזה, תמיד תעבוד בסביבה ללא RNase עם כלי פלסטיק וכפפות ייעודיים וסטריליים.
    1. הוסיפו 0.2 מ"ל כלורופורם לכל 1 מ"ל טריזול, נערו בעוצמה במשך 15 שניות, ודגרו 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להתפצל לשכבות: אורגנית, אינטרפאזית ומימית (המכילות RNA).
    2. העבר את הפאזה המימית העליונה לצינור חדש, תוך הימנעות מהאינטרפאזה. כדי להשקיע את ה-RNA, מוסיפים נפח אחד של איזופרופנול ומערבבים בעדינות. דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (או יותר ב-20- מעלות צלזיוס לתפוקה גבוהה יותר) כדי להוציא RNA. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לפלט RNA.
    3. זרוק את הסופרנטנט ושוטף את הכדור עם 1 מ"ל של 75% אתנול. לרגע מערבולת וצנטריפוגה בטמפרטורה של 7,500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. המיס RNA: הסר בזהירות את שטיפת האתנול וייבש את הכדור באוויר למשך 5-10 דקות, תוך הימנעות מיובש מוחלט. החזירו את הגלגל בנפח קטן של מים ללא RNase או 1x בופר Tris-EDTA (TE), תוך דגירה בטמפרטורה של 55-60 מעלות צלזיוס להפסה מלאה. אחסן RNA מטוהר בטמפרטורה של -80°C.
  2. כימות RNA באמצעות מבחן RiboGreen
    הערה: מבחן RiboGreen (להלן) משתמש בצבע פלואורסצנטי ייעודי לחומצות גרעין, ומציע רגישות, ספציפיות גבוהה יותר ויכולת לזהות RNA שלם מאשר שיטות ספיגת UV. שקלו טיפול ב-DNase אם זיהום DNA הוא בעיה.
    1. הכינו 1x בופר TE, דיללו פי 20 את בופר ה-TE שסופק פי 20 במים ללא RNase. הכינו פתרונות עבודה של RiboGreen והגנו על הצבע הרגיש לאור עם נייר כסף. דיללו את הצבע המרוכז ב-1:200 ב-1x TE לבדיקה בטווח גבוה (10 ng/mL-1 μg/mL), או 1:2000 ב-1x TE לבדיקה בטווח נמוך (2.5 ng/mL-50 ng/mL). הכינו תקני RNA באמצעות דילול סדרתי של תקן ה-RNA של הערכה ב-1x TE כדי לכסות את טווח הדגימה הצפוי. הרץ תקנים בשלושה עותקים.
    2. הכינו דגימות על ידי דילול דגימות RNA ב-1x TE כדי להתאים לטווח הדינמי של הבדיקה. הרץ דגימות בשלושה עותקים.
    3. הוסף נפחים שווים של תמיסת עבודה של RiboGreen ותקן RNA או דגימה (למשל, 100 מיקרוליטר כל אחד). דגרו 2-5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מאור. מדדו פלואורסצנציה בהגדרות המתאימות (עירור ~500 ננומטר, פליטה ~525 ננומטר). מדוד וחסר קריאה ריגנטית ריקה (1x TE + צבע RiboGreen).
    4. ניתוח וכמות: צייר עקומה סטנדרטית באמצעות ערכי הפלואורסצנציה של התקנים מול ריכוזיהם. השתמש בעקומה זו כדי לקבוע את ריכוז ה-RNA בדגימות (איור 2).

4. סינתזת cDNA

  1. הפשיר את כל הרכיבים על הקרח. ערבבו בעדינות כל צינור על ידי סיבוב קצר לפני השימוש. בצינור PCR על קרח, יש לשלב את הרכיבים הבאים לכל תגובה:
    RT מאסטר מיקס (5x): 4 מיקרוליטר
    דגימת RNA: משתנה (עד 1 מיקרוגרם RNA בסך הכל)
    מים נטולי נוקלאז: עד 20 מיקרו ליטר בנפח כולל
    הערה: עבור בקרה ללא תבנית (NTC), החלף את דגימת ה-RNA במים ללא נוקלאז.
  2. ערבב בעדינות וסובב את הצינורות כדי לאסוף את התכולה בתחתית ולהפעיל את תוכנית התרמחזור.
    חישול פריימר: 25 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות
    סינתזת cDNA: 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
    כיבוי חום: 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת

5. עיצוב ואימות פריימרים

הערה: עיצוב פריימר RTddPCR בדרך כלל עוקב אחרי אותם עקרונות כמו qPCR כמותי, אך דורש תשומת לב נוספת כדי להבטיח הפרדה ברורה בין טיפות חיוביות ושליליות. השתמש בכלי עיצוב פריימר של NEB, IDT או ThermoFisher כדי להקל על התהליך הזה. בדיקת RTddPCR מוצלחת מוגדרת על ידי ספציפיות גבוהה והגברה עמידה, היוצרת הפרדה ברורה בין טיפות מוגברות (חיוביות) ולא מוגברות (שליליות). מזהי הגישה הבאים של NCBI RefSeq שימשו לעיצוב פריימרים PCR:

Actg: NM_001127449.1
קדימה 1: CAGTCTAACAGGGTGGGAAAG
הפוך 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
אורך מגבר: 98
חלוץ 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
רוורס 2: GACTTTCCCCCCCTGTTAGAC
אורך מגבר: 118

Gap43: NM_017195.3
חלוץ 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
הפוך 1: GACTCCTCAGAACGGAAC
אורך מגבר: 122
חלוץ 2: CAGTCATCTTGGGGGAATTTTCTTGC
ריוורס 2: CATTGCACACACACTTGG
אורך אמפליקון: 116

  1. עצב פריימר עם אורך פריימר מומלץ של 18-30 זוגות בסיסים ותכולת GC של 40-60%. ודא שטמפרטורת ההתכה (Tm) יורדת בין 55-65 מעלות צלזיוס, והפריימרים הקדמיים והאחוריים נמצאים בטווח של 2-5 מעלות צלזיוס זה מזה. שלבו מהדק GC, אחד או שניים של בסיסי G או C בתוך חמשת הבסיסים האחרונים בקצה 3 רגל, כדי לשפר את הספציפיות של הקשר, אך להימנע מרצפים ארוכים של G או C.
  2. אימות ספציפיות הפריימר באמצעות כלי יישור כגון כלי החיפוש המקומי הבסיסי (BLAST) של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) כדי להבטיח שהפריימרים נקשרים רק לרצף היעד המיועד. מגברים עיצוביים בגודל של 50-200 זוגות בסיסים, כאשר ~100 זוגות בסיסים הם האופטימליים, כאשר מוצרים קצרים יותר מתגברים ביעילות רבה יותר תוך שמירה על הבחנה מהפריימר-דימרים.
    הערה: במחקר זה, מוצרי ה-PCR הקצרים בדרך כלל מוגברים ביעילות גבוהה יותר מאשר מוצרים ארוכים יותר ב-RT-ddPCR.
  3. מזעור דימרים של פריימר על ידי עיצוב פריימרים עם 50-60% תוכן GC, הימנעות ממבנים משניים והתאמה של 3 רגל. במהלך אימות פריימר, יש להשתמש באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, ותמיד להשתמש בבקרה ללא תבנית להערכת דימרים של פריימר.
  4. הימנע מתכנון פריימרים באזורים בתבנית עם סבירות גבוהה ליצירת מבנים משניים, שכן זה עלול להפריע ליעילות ההגברה.

6. RTddPCR

הערה: השתמשו במערכת QX200 ddPCR (Bio-Rad) לביצוע RTddPCR לפי הוראות היצרן וכפי שתוארו קודם על ידי Das ואחרים (2022)43, עם כמה התאמות קלות לשיפור שחזור הבדיקה.

  1. הכינו תגובות RTddPCR עם תערובת אוניברסלית מוכנה לשימוש ddPCR ופריימרים ספציפיים למטרה תוך שימוש ב-cDNA מתאים.
  2. יצר את הטיפות באמצעות מחולל הטיפות.
  3. קרא את הפלואורסצנציה של נקודת הקצה עם קורא הטיפות, ונתח את הנתונים עם התוכנה המובנית.
  4. השתמש באמצעי בקרת האיכות הבאים כדי להבטיח כימות מדויק והיווצרות טיפות שניתנות לשחזור:
    1. הרץ סטים של פריימר בעקביות באותה שורה או עמודה כדי למזער את אפקטי הלוחות.
    2. הכינו תערובות מאסטר להפחתת פיפטינג בנפחים קטנים.
    3. פיפט בקצב זרימה נמוך למניעת בועות ושימוש בפיפטות רב-ערוציות לחלוקת דגימות אחידה.
    4. טפלו בלוחות בעדינות לאחר יצירת הטיפות ואטמו מיד כדי למנוע אידוי.
    5. הכינו את כל התגובות על קרח והימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים עבור תגובות.
    6. כלול בקרות ללא תבנית לכל פריימר שמנטר זיהום.
    7. יש להוציא בארות המכילות פחות מ-10,000 טיפות מאושרות מהניתוח.
    8. בצע שכפולים טכניים לכל הדגימות כדי להבטיח שחזוריות.
  5. בדוק ידנית את גרפי משרעת פלואורסצנציה של הטיפות כדי לוודא את דיוק הסף האוטומטי.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים קורטיקליים עובריים ראשוניים, נוירונים מההיפוקמפוס ו-BFCNs המוצבים על אינסרטים מצופים PLL בגודל 1 מיקרומטר נדבקים בחוזקה ומארחים את הנוירייטים על פני הממברנה ב-5-7 ימים במבחנה (DIV). עד 11 DIV, התרבויות מציגות רשתות צפופות. עבור DRGs של עכברים בוגרים, הוספת שכבת למינין לתוספות 3 מיקרון מצופות PLL מסייעת להשיג הארכה אקסונלית דומה ב-5 DIV. תצפיות אלו מאשרות את יכולת ההכנסות לתמוך בצמיחה ארוכת טווח של נוירונים ולספק חומר אקסוני מספק להפקת RNA במורד הזרם. במקרה הצורך בהרחבה, אנו משלבים מספר תוספות כדי לספק לנו חומר מספק.

הפקת טריזול מהכנסות בודדות מניבה מספיק RNA לשעתוק הפוך ול-ddPCR לאחר מכן. כימות RiboGreen מאשר תפוקות RNA עקביות משברים שלמים של נוירונים (212.85 ng/insert) ותפוקות נמוכות יותר משברים של נויריטים (42.75 ng/insert) (איור 2). בדרך כלל אנחנו מקבלים RNA פי ~5-7 מכל חלק הנוירון לעומת החלק העשיר בנויריט.

כל הפריימרים מאומתים לפני ניסויי RTddPCR. לכל תמלול יעד, לפחות שני סטים של פריימרים מסודרים ונבדקים באמצעות PCR קונבנציונלי על cDNA שנוצר מאותם דגימות נוירונים. זוג הפריימר שמייצר את הרצועה החזקה והספציפית ביותר נבחר עבור RTddPCR (איור 3A). לדוגמה, בחרנו בערכת פריימר 1 עבור Gap43. במקרים של תוצאות דו-משמעיות, כמו אלו שהתקבלו עבור Actγ, אנו מבצעים PCR גרדיאנט לאופטימיזציה של טמפרטורות החישוש (איור 3B). דבר זה מבטיח שרק פריימרים מאומתים היטב משמשים לכימות מוחלט, מה שמפחית את הסבירות ליצירת ארטיפקטים בהפרדת טיפות.

הליך הגירוד והדגימה מפריד באופן אמין בין התאים הסומטיים לנויריטיים. RNA שמבודד מכל חלקי הנוירון מראה העשרת תמלולים, כגון Actγ 46,47,48,49 (איור 4). לעומת זאת, שברי אקסון/נויריט מניבים RNA כולל נמוך משמעותית, בהתאם לנפח המוגבל שלהם, אך מראים העשרה של תמלילים הידועים כממוקמים בתהליכים רחוקים, כמו Gap43 (איור 4). גילוי צולב מינימלי של תמלילים מוגבלים על ידי סומה מצביע על טוהר תא גבוה כאשר ההכנסות מטופלות בזהירות ומצופות בצפיפות אופטימלית.

התוצאות החיוביות מאופיינות ב: (1) מורפולוגיה נוירונית שלמה עם הארכה אקסונלית ברורה, (2) הפרדה נקייה של מחלקות ללא קרע של הממברנה, (3) פריימרים מאומתים שמייצרים הפרדה ברורה בין טיפות חיוביות לשליליות, ו-(4) אותות RTddPCR חזקים לתמלילי אקסון. ניסויים לא אופטימליים גורמים לתפוקת RNA נמוכה, זיהום צולב כפי שניתן לראות על ידי סמני סומה בחלקי נויריטים, או ארטיפקטים של RTddPCR כגון "גשם" טיפות מוגבר עקב דימריזציה של פריימר. בעיות אלו קשורות לרוב לנזק לממברנה הפנימית, לחץ גירוד מופרז או אופטימיזציה לא מספקת לטמפרטורת חימוש הפריימר.

איור 1
איור 1: סקירה של בידוד RNA ספציפי לתחום באמצעות תוספות ממברנה. נוירוני מכרסמים גודלו על אינסרטים חדירים למחצה עם גודל נקבובית של 1-3 מיקרון, מה שמאפשר התרחבות נויריטים תוך הגבלת הסומה. להכנת נוירונים שלמים, תאים מהתא העליון נגרדו באמצעות מגרד תאים סטרילי, טופלו ואז פורסמו ב-TRIzol לבידוד RNA, סינתזת cDNA ו-RTddPCR. שאריות תאיות הוסרו מהממברנה המוכנעת באמצעות מטוש כותנה סטרילי. להכנת נויריטים, ממברנת ההכנסה שמכילה כעת רק נוירייטים הופכה ונחתכה עם להב סכין, וטבלה ישירות ב-TRIzol, ולאחר מכן בוצעה בידוד RNA, סינתזת cDNA ו-RTddPCR. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2
איור 2: עקומת ריכוז RNA סטנדרטית באמצעות בדיקת RiboGreen. (A) עוצמת הפלואורסצנציה נמדדה באמצעות בדיקת כימות RNA של RiboGreen לאורך סדרת דילול של תקני RNA. ניתוח רגרסיה ליניארית חשף מתאם חזק בין ריכוז ה-RNA לאות הפלואורסצנציה (R² = 0.9956). ערך R² הקרוב לאחד מדגים ליניאריות ואמינות מצוינות של מבחן RiboGreen לכימות RNA מדויק. (B) באמצעות המשוואה (y=19.738x + 14.905) עבור השיפוע שהתקבל ב-A, חושב סך ה-RNA עבור כל שבר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: אימות פריימר באמצעות PCR ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. (א) מוצרי הגברת PCR באמצעות cDNA עבור Actγ ו-Gap43 נפתרו על ג'ל אגרוז 2% להערכת ספציפיות הפריימר. לכל גן נבדקו שתי קבוצות פריימרים עצמאיות (קבוצה 1 וקבוצה 2). סמני גודל DNA (סולמות) מוצגים בנתיבים סמוכים עם משקלים מולקולריים מסומנים (10 קילובאט, 0.5 קילובאט, 0.1 קילובאט). רצועות בודדות מובחנות בגודל הצפוי מאשרות הגברה מוצלחת וספציפיות של קבוצות הפריימר הנבחרות. (B) הגברת PCR בוצעה באמצעות סט פריימר Actγ 2 לאורך גרדיאנט טמפרטורה (55-65 מעלות צלזיוס) לקביעת טמפרטורת החישוש האופטימלית. מוצרים מוגברים נפתרו על ג'ל אגרוז 2% לצד סולם DNA (נתיב 2, גודל מצוין). רצועות בודדות עקביות בגודל הצפוי נצפתו לאורך הטווח הנבדק, כאשר ההגברה החזקה ביותר זוהתה ב-55 מעלות צלזיוס, מה שמרמז שמדובר בטמפרטורה האופטימלית לסט פריימר זה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4
איור 4: ניתוח RTddPCR של תמלילים נבחרים וכימות עותקי mRNA. (A,B) גרפים חד-ממדיים מייצגים של משרעת חד-ממדית המראים הפרדת טיפות עבור (A) Actγ, ו-(B) Gap43. כל נקודה מייצגת טיפה אחת, כאשר טיפות כחולות מצביעות על הגברה חיובית וטיפות אפורות מצביעות על הגברה שלילית. ציר ה-Y מייצג את המשרעת, וציר ה-X מציין את מיקום הבאר בלוח ddPCR. הפרדה ברורה בין טיפות חיוביות (כחולות) ושליליות (אפורות) מאשרת זיהוי איתן של תמלילי היעד עם קבוצות הפריימר המצוינות. (ג) טבלה המסכמת את מספר העותקים ל-μL והעותקים ל-ng של RNA כולל עבור תמלולים של Actγ ו-Gap43 בחלקי נוירונים ונויריטים שלמים. הערכות מספר עותקים התקבלו מכימות מוחלט באמצעות ספירות טיפות ddPCR (המוצגות בפאנלים A,B). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר שלבים הם קריטיים לשחזוריות. ציפוי ההכנסה חייב להיות אחיד כדי לקדם הידבקות נוירונלית; ציפוי לא שלם מוביל לצמיחה לקויה של נויריטים/אקסונלים. צפיפות ציפוי התאים חשובה לא פחות, שכן צפיפות מופרזת מגבירה את החצייה הדנדריטית, בעוד שציפוי דליל מניב RNA אקסוני לא מספק. רצף הגירוד והשטיפה חייב להתבצע בדיוק: לחץ נמוך מדי גורם לזיהום סומטי, בעוד שלחץ גבוה מדי עלול לפגוע בתוצר.

אימות פריימר מייצג שלב קריטי נוסף. הרצת שתי מערכות פריימר עצמאיות לכל תמלול מאפשרת בחירת הזוג האמין ביותר, בעוד ש-PCR גרדיאנט יכול לחדד עוד יותר את טמפרטורות האנילינג. פרקטיקה זו מפחיתה את היווצרות פריימר-דימר, מגבירה את בהירות הטיפות ומבטיחה כימות שכפול בין שכפולים ביולוגיים. למרות שגישה זו משיגה טוהר תא גבוה, לא ניתן לשלול לחלוטין זיהום עקבות מחומר סומטי. תפוקות RNA אקסונליות נמוכות מטבען, מה שמגביל את היקף הניתוחים הדורשים קלט גבוה, כגון ריצוף מלא של טרנסקריפטום. מגבלה קריטית של שיטה זו היא חוסר היכולת שלה לטפל בלוקליזציה של תמלול בתוך אקסונים דיסטליים לעומת אקסימליים. למרות שדווח על הארכות גליאלית או אנדותליאליות דרך נקבוביות ממברנה בתנאים מסוימים, מערכת התרביות שלנו מצמצמת את האפשרות הזו. בתרביות DRG בוגרות, הוספת ציטוזין β-D-ערבינופורנוסיד (Ara-C)5,7 ושימוש במדיה נטולת סרום לתרביות נוירונים אחרות (קורטיקלית, היפוקמפלית ו-BFCNs) מגבילות ביעילות את התרבות תאי הגליאלי והאנדותליאלי. בנוסף, ממברנות הפוליקרבונט הקשות או פוליאתילן טרפתלטל (PC/PET) המשמשות כאן אינן אלסטיות ואינן מתירות להגירה פעילה של תאים. יתרה מזאת, אנו משתמשים בתוספות בגודל נקבוביות של 3 מיקרון לתרביות DRG כדי לאפשר מעבר של אקסונים בקוטר גדול. לעומת זאת, בתרביות קורטיקליות או BFCN, אנו משתמשים בהכנסות בגודל נקבוביות של 1 מיקרון, מה שמגביל עוד יותר את נדידת הגליה. תכונות אלו מבדילות את ההגדרה שלנו ממיקרו-מכשירים מבוססי PDMS התומכים בנדידת אנדותל דרך נקבוביות גמישות. בהתאם לדיווחים קודמים 34,35,36,40, האימות המולקולרי במחקר זה מאשר העשרה חזקה של תעתיקים אקסונליים (למשל, Gap43) וזיהוי זניח של סמנים סומטיים (למשל, Actγ), התומך בספייקוליות הנוירונית של החומר החוצה את הממברנה. מכיוון שהמגבלה הפיזיקלית אינה מבטלת לחלוטין את נדידת הגליות, החוקרים צריכים גם להשתמש ב-Gfap כסמן שלילי.

בהשוואה למכשירים מיקרופלואידיים, מערכת ההכנסות פשוטה יותר, ניתנת להרחבה יותר ותואמת לתהליכי עבודה שגרתיים של תרביות. הוא נמנע מציוד מיוחד ועדיין מאפשר הפרדה אקסון-סומה שניתן לשחזור. על ידי חיבור אינסרטים עם RTddPCR, שיטה זו מספקת גם נגישות וגם רגישות גבוהה, ומאפשרת כימות מוחלט של תמלולים שלעיתים קרובות מתחת לספי זיהוי qPCR. פרוטוקול זה מתאים במיוחד לחקירת שינויים במיקום התמלול האקסונלי, להערכת תרגום מקומי בתגובה לגירויים התפתחותיים, נוירוטוקסיים או פציעה, וכן לחקר פגמים בהעברת RNA הקשורים למחלות ניווניות או להפרעות נוירו-התפתחותיות. שיפורים עתידיים עשויים לכלול RTddPCR מולטי-פלקס לכימות סימולטני של מספר mRNA, או אינטגרציה עם גישות ריצוף RNA בקלט נמוך להרחבת כיסוי הטרנסקריפטום. בנוסף, התאמת מערכת זו לנוירונים שמקורם ב-iPSC אנושיים עשויה להרחיב את יישומה למידול מחלות ומחקרים רגנרטיביים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ל-PKS יש פטנטים אמריקאיים על השימוש בפפטיד החדיר לתא G3BP1 להתחדשות אקסונים ולניוורדגנרציה. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקים ממרכז מרקין לנוירופתיה פריפרית והתחדשות עצבים (ל-P.K.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תוספות תרבית תאים ללוח 6 בארות, 1.0  μ גודל נקבוביות, סטריליקורנינג353102מוצרי צריכה
תוספות תרבית תאים ללוח 6 בארות, 3.0  μ גודל נקבוביות, סטריליסלטריט230603מוצרי צריכה
מרים תאים עם להב צרVWR76036-006מוצרי צריכה
לוחות תרבית רקמה של CELLSTAR 6-wellVWR82050-842מוצרי צריכה
ddPCR 96-לוחות באר ביו-רד12001925מוצרי צריכה
שמן קורא טיפות ddPCR  ביו-רד1863004ריאגנטים
מחסניות DG8 לגנרטור טיפות QX200/QX100ביו-רד1864008מוצרי צריכה
למיניןגיבקו/פישר סיינטיפיק23017-015ריאגנטים
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010Lריאגנטים
פלטות מיקרו לפלטות שחורות מבוססות פלואורסצנציה, 96 בארותתרמו פישרM33089מוצרי צריכה
אטם חום לפלטת PCR, נייר כסף, חדירביו-רד1814040מוצרי צריכה
פולי-ליזיןסיגמאP1274ריאגנטים
PTC Tempo 96 Thermal Cyclerביו-רד12015382ציוד
תוכנת QuantaSoftביו-ראדתוכנת ניתוח נתוני PCR
ערכת בדיקת ריבוגרין ו-RNA כמותיתתרמו פישרR11490ריאגנטים
QX200 ddPCR EvaGreen Supermixביו-רד1864034ריאגנטים
שמן ייצור טיפות QX200 עבור EvaGreenביו-רד1864005ריאגנטים
מחולל טיפות QX200ביו-רד17005227ציוד
קורא טיפות QX200ביו-רד17005228ציוד
ריאגנט טריזולInvitrogen15-596-026ריאגנטים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrawal, M., Welshhans, K. Local translation across neural development: A focus on radial glial cells, axons, and synaptogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 717170(2021).
  2. Dalla Costa, I., et al. The functional organization of axonal mRNA transport and translation. Nat. Rev. Neurosci. 22 (2), 77-91 (2021).
  3. Sahoo, P. K., Smith, D. S., Perrone-Bizzozero, N., Twiss, J. L. Axonal mRNA transport and translation at a glance. J. Cell Sci. 131 (8), (2018).
  4. Alber, S., et al. PTBP1 regulates injury responses and sensory pathways in adult peripheral neurons. Sci Adv. 9 (30), eadi0286(2023).
  5. Sahoo, P. K., et al. Disruption of G3BP1 granules promotes mammalian CNS and PNS axon regeneration. Proc Natl Acad Sci. 122 (9), e2411811122(2025).
  6. Sahoo, P. K., et al. A Ca2+-dependent switch activates axonal casein kinase 2α; translation and drives G3BP1 granule disassembly for axon regeneration. Curr Biol. 30 (24), 4882-4895.e6 (2020).
  7. Sahoo, P. K., et al. Axonal G3BP1 stress granule protein limits axonal mRNA translation and nerve regeneration. Nat Commun. 9 (1), 3358(2018).
  8. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359 (6382), 1416-1421 (2018).
  9. Van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  10. Zahavi, E. E., et al. Repeat-element RNAs integrate a neuronal growth circuit. Cell. 188 (16), 4350-4365.e22 (2025).
  11. Rajgor, D., Welle, T. M., Smith, K. R. The coordination of local translation, membranous organelle trafficking, and synaptic plasticity in neurons. Front Cell Dev Biol. 9, 711446(2021).
  12. Oliveira, M. M., Klann, E. A deep dive into local mRNA translation in neurons. Proc Natl Acad Sci. 118 (45), e2117116118(2021).
  13. Sun, C., et al. The prevalence and specificity of local protein synthesis during neuronal synaptic plasticity. Sci Adv. 7 (38), eabj0790(2021).
  14. Castillo, P. E., Jung, H., Klann, E., Riccio, A. Presynaptic protein synthesis in brain function and disease. J Neurosci. 43 (45), 7483-7488 (2023).
  15. Younts, T. J., et al. Presynaptic protein synthesis is required for long-term plasticity of GABA release. Neuron. 92 (2), 479-492 (2016).
  16. Nagano, S., Araki, T. Axonal transport and local translation of mRNA in neurodegenerative diseases. Front Mol Neurosci. 14, 697973(2021).
  17. Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nat Commun. 12 (1), 6914(2021).
  18. Bar Avi, O., Perlson, E. Navigating the pathways: Tar-DNA-binding-protein-43 aggregation, axonal transport, and local synthesis in amyotrophic lateral sclerosis pathology. Neural Regen. Res. 20 (10), 2921-2922 (2025).
  19. Ionescu, A., Altman, T., Perlson, E. Looking for answers far away from the soma-the (un)known axonal functions of TDP-43, and their contribution to early NMJ disruption in ALS. Mol. Neurodegener. 18 (1), 35(2023).
  20. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: The role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  21. Rehorst, W. A., et al. Muscle regulates mTOR dependent axonal local translation in motor neurons via CTRP3 secretion: Implications for a neuromuscular disorder, spinal muscular atrophy. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 154(2019).
  22. Twiss, J. L., Buchanan, C. N. Regulation of subcellular protein synthesis for restoring neural connectivity. Int J Mol Sci. 26 (15), 7283(2025).
  23. Gomes, C., et al. Axonal localization of neuritin/cpg15 mRNA is limited by competition for HuD binding. J Cell Sci. 130 (21), 3650-3662 (2017).
  24. Lee, S. J., et al. hnRNPs interacting with mRNA localization motifs define axonal RNA regulons. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2091-2106 (2018).
  25. Lee, S. J., et al. Selective axonal translation of the mRNA isoform encoding prenylated cdc42 supports axon growth. J Cell Sci. 134 (7), jcs251967(2021).
  26. Merianda, T. T., et al. Axonal amphoterin mRNA is regulated by translational control and enhances axon outgrowth. J Neurosci. 35 (14), 5693-5706 (2015).
  27. Patel, P., et al. Intra-axonal translation of Khsrp mRNA slows axon regeneration by destabilizing localized mRNAs. Nucleic Acids Res. 50 (10), 5772-5792 (2022).
  28. Smith, T. P., Sahoo, P. K., Kar, A. N., Twiss, J. L. Intra-axonal mechanisms driving axon regeneration. Brain Res. 1740, 146864(2020).
  29. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).
  30. Ionescu, A., Perlson, E. Microfluidic neuromuscular co-culture system for tracking cell-to-cell transfer and axonal transport of labeled proteins. Methods Mol Biol. 2431, 145-161 (2022).
  31. Dasgupta, S., et al. Cortical brain injury causes retrograde degeneration of afferent basal forebrain cholinergic neurons via the p75NTR. eNeuro. 10 (8), (2023).
  32. Dasgupta, S., Pandya, M. A., Friedman, W. J. Microfluidic cultures of basal forebrain cholinergic neurons for assessing retrograde cell death by live imaging. Bio-protoc. 15 (1), e5149(2025).
  33. Bi, J., Tsai, N. -P., Lin, Y. -P., Loh, H. H., Wei, L. -N. Axonal mRNA transport and localized translational regulation of κ-opioid receptor in primary neurons of dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci. 103 (52), 19919-19924 (2006).
  34. Hirai, T., et al. Aberrant plasticity of peripheral sensory axons in a painful neuropathy. Sci Rep. 7 (1), 3407(2017).
  35. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  36. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat Cell Biol. 10 (2), 149-159 (2008).
  37. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  38. Brown, K. C., et al. An experimental protocol for the Boyden chamber invasion assay with absorbance readout. Bio Protoc. 14 (15), e5040(2024).
  39. Willis, D. E., Twiss, J. L. Profiling axonal mRNA transport. Methods Mol Biol. 714, 335-352 (2011).
  40. Zheng, J. -Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21 (23), 9291-9303 (2001).
  41. Shigeoka, T., et al. On-site ribosome remodeling by locally synthesized ribosomal proteins in axons. Cell Rep. 29 (11), 3605-3619.e10 (2019).
  42. Sun, Y., Joyce, P. A. Application of droplet digital PCR to determine copy number of endogenous genes and transgenes in sugarcane. Plant Cell Rep. 36 (11), 1775-1783 (2017).
  43. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of circular RNAs using digital droplet PCR. J Vis Exp. (187), e64464(2022).
  44. Desai, M., Gulati, K., Agrawal, M., Ghumra, S., Sahoo, P. K. Stress granules: Guardians of cellular health and triggers of disease. Neural Regener Res. 21 (2), 588-597 (2026).
  45. Agrawal, M., et al. Restoring DSCAM expression rescues neuronal morphology and axon guidance deficits in Down syndrome. bioRxiv. , (2025).
  46. Bassell, G. J., et al. Sorting of β-actin mRNA and protein to neurites and growth cones in culture. J Neurosci. 18 (1), 251-265 (1998).
  47. Moradi, M., et al. Differential roles of α-, β-, and γ-actin in axon growth and collateral branch formation in motoneurons. J Cell Biol. 216 (3), 793-814 (2017).
  48. Willis, D. E., et al. Extracellular stimuli specifically regulate localized levels of individual neuronal mRNAs. J Cell Biol. 178 (6), 965-980 (2007).
  49. Zhang, H. L., et al. Neurotrophin-induced transport of a β-actin mRNP complex increases β-actin levels and stimulates growth cone motility. Neuron. 31 (2), 261-275 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axonal mRNA IsolationPorous Membrane InsertsDroplet Digital PCRNeuronal CompartmentalizationRNA QuantificationLocal Protein SynthesisNeurite FractionGrowth Cone AnalysisRNA LocalizationSynaptic Plasticity

Related Articles