פרוטוקול זה מדגים שיטה ליצירת פצעי עור עגולים בעובי מלא בעכברים ולהגברת ההחלמה שלהם באמצעות סליל נחושת גמיש שמספק שדה אלקטרומגנטי אפולס.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה מדגים שיטה ליצירת פצעי עור עגולים בעובי מלא בעכברים ולהגברת ההחלמה שלהם באמצעות סליל נחושת גמיש שמספק שדה אלקטרומגנטי אפולס.
פצעים כרוניים וגדולים מהווים אתגרים קליניים משמעותיים בשל עיכוב בהחלמה וסיכון גבוה לזיהום. טיפול בשדה אלקטרומגנטי פועם (PEMF) הוא גישה לא פולשנית שיכולה לקדם תיקון רקמות. מחקר זה מתאר פרוטוקול מודל עכברוש שניתן לשחזור באמצעות טלאי סליל נחושת מודפס גמיש המחובר לבקר PCB מותאם אישית כדי לספק גירוי PEMF מקומי לפצעים גביים בעובי מלא. הפצע הנגדי שימש כבקרה שלא טופלה. התקדמות ההחלמה הוערכה באמצעות צילום קבוע ומדידות אזור הפצע. הפרוטוקול מספק מערכת מעשית וגמישה להערכת ואופטימיזציה של טיפולים מבוססי PEMF ב-vivo במגוון מצבים, עם דגש על יישום מקומי והתאמת פרמטרים ברפואה רגנרטיבית. בחירת הפרמטרים התבססה על מסך CCK-8 אורתוגונלי של התרבות פיברובלסטים שבדקה 0.25-1.3 mT, 10-40 Hz ו-30-90 דקות ליום; ניתוח האפקט העיקרי זיהה רמות אופטימליות של 1.3 mT, 30 Hz ו-60 דקות ליום, שאומצו לבדיקות in vivo .
פצעים עוריים כרוניים (כגון כיבים סוכרתיים) הם בעיה בריאותית הולכת וגדלה, ולעיתים מובילים לפגיעה בריפוי, זיהום או קטיעה1. טיפולים מסורתיים יכולים להיות ממושכים ויקרים, מה שמעורר עניין בטיפולים משלימים שיכולים להאיץ את תיקון הרקמות2. טיפול בשדה אלקטרומגנטי הוא אחת מהשיטות הללו, שהיא לא פולשנית והוכיחה השפעות פרו-ריפוי הן בסביבות פרה-קליניותוהן בסביבות קליניות 2,3,4,5. שדות אלקטרומגנטיים פולסים (PEMFs) בטווח תדרים נמוך מאוד (~1-100 הרץ) יכולים לעורר תהליכים תאיים חשובים לתיקון, כולל אנגיוגנזה ושחרור גורמי גדילה 2,6,7.
לדוגמה, חשיפה ל-PEMF האיצה משמעותית את סגירת הפצעים בקרב מכרסמים סוכרתיים ובריאים על ידי הגברת גורם גדילה פיברובלסטים-2 (FGF-2) והגברת האנגיוגנזה8. באופן דומה, במודל הריפוי המופגע (למשל, חולדות סוכרתיות), טיפול ב-PEMF הוכח כמשפר את קצב ההחלמה ומעלה את חוזק המתיחה של רקמה חדשה9. קלינית, טיפול ב-PEMF נחקר אצל מטופלים עם פצעים כרוניים. ניסוי פיילוט אקראי בחולי כיב כף רגל סוכרתי דיווח על שיפור זרימת הדם המיקרו-מחזורית ומגמה לסגירת פצעים מהירה יותר תחת חשיפה ל-PEMF10. באופן כללי, PEMF הראה גם השפעות חיוביות בסוגי פצעים אחרים, לדוגמה, שיפור בהחלמה נצפה בפציעות כוויות שטופלו בשדות מגנטיים פולסים11. מחקרים אלו מדגישים יחד את הפוטנציאל של גירוי אלקטרומגנטי כטיפול משלים לטיפול בפצעים, 8,9,10,11.
בהשוואה לגירויים קוויים קונבנציונליים, הפעלה מגנטית מבטלת את הצורך במחברים טרנס-קונטניים ומפחיתה את הסיכון לסיבוכים הקשורים לחומרה. מערכות מגנטיות אלחוטיות השיגו גירוי ספציפי לרקמה בהקשרים אחרים, לדוגמה, תעלת הנחיה עצבית מולכת יכולה לייצר מיקרוזרמים מושרים תחת שדה מגנטי מתחלף, כאשר עוצמת הזרם נקבעת בעקיפין על ידי פרמטרי השדה12. אסטרטגיות מגנטיות יכולות גם לתמוך בוסקולריזציה – צוואר בקבוק קריטי בריפוי העור – משום ששדות מגנטיים סטטיים או דינמיים, לבדם או בשילוב עם חומרים ביולוגיים מגיבים מגנטית, הוכחו כמווסתים התנהגות אנדותליאלית ואותות אנגיוגניים13. תקדימים אלו הניעו אותנו לפתח גישה לבישה: טלאי סליל קונפורמלי וניתן להסרה שמרכז PEMF במיטת הפצע תוך שמירה על חוסר פולשנות ותכנות חיצוני12,13. בפרוטוקול הבא אנו מפרטים את השלבים ליישום טיפול PEMF זה במודל פצע בעובי מלא של חולדה, כולל יישום המכשיר, משטר גירוי והערכת תוצאות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדית בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת ג'יאנגנאן (JN. No2025-0630S0360-915[408]). יישמנו את הפרוטוקול עם זכרים של חולדות SD (בני 6-8 שבועות, בערך 200-250 גרם). לפני הניסויים, חולדות היו מאוחסנות בנפרד עם גישה חופשית למזון ומים, תוך שמירה על מחזור אור/חושך של 12 שעות, בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה.
1. יצירת פצעים כריתתיים בעובי מלא
2. יישום מכשיר ה-PEMF
3. ניטור פצעים ואיסוף נתונים
4. ניתוח ופרשנות נתונים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
במודל פצעי עכברוש בעובי מלא, טיפול יומי ב-PEMF באמצעות טלאי סליל גמיש הביא לסגירת פצע מהירה משמעותית בהשוואה לביקורת. כדי להעריך את ההשפעה בקפדנות, חולקו העכברים לשלוש קבוצות בהתבסס על עיצוב הניסוי המפורט בסעיף הפרוטוקול: קבוצת ביקורת בתוך הנבדק (שבה לכל עכברוש היה פצע אחד מטופל ב-PEMF ופצע נגדי לא מטופל, שנאספו נתונים לניתוח), קבוצת ביקורת מזויפת (PATCH: פצע מכוסה בסליל לא מופעל), וקבוצת ביקורת לא מטופלת (CTRL: טיפול פצעים סטנדרטי בלבד). איור 1,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
צעדים קריטיים כוללים יצירת פצעים סימטריים בעובי מלא, הבטחת שכבת הסליל שטוחה מעל מחסום סטרילי ללא רווחים, ושמירה על חשיפה יומית עקבית; סטיות יכולות להפחית את העברת השטח ולהגדיל את השונות בתוצאות ההחלמה.
לעבודה זו יש מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת פרשנות הממצאים והערכת פוטנציאל התרגום. ראשית, הפרוטוקול הוכח אצל זכרים בריאים עם חולדות SD (6-8 שבועות, 200-250 גרם) עם פצעים חריפים בכריעה, ולכן אינו תופס באופן מלא סביבות ריפוי קליניות פגועות כמו סוכרת, איסכמיה, זיה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים או אינטרסים פיננסיים במוצרים או במכשירים בהם השתמשו במחקר זה. התקן ה-PEMF המותאם אישית המתואר מיועד למטרות מחקר ואינו קשור מסחרית.
אנו מודים לד"ר ג'אנג על הדיונים המעמיקים ולד"ר פו על הסיוע בטיפול בבעלי חיים ובהיסטולוגיה. עבודה זו נתמכה על ידי (2022YFC3006200) תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית הלאומית של סין. המחברים גם מודים לצוות בית הספר לרפואה ווקסי, מתקן בעלי החיים של אוניברסיטת ג'יאנגנאן, על תמיכתם במהלך ניסויי ה-in vivo .
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| לוחות תרבית תאים עם 96 בארות | BaiDi | H908002 | לבדיקת CCK-8 |
| שקופיות מיקרוסקופ ADHESION | סיטוטסטו | P/N.80312-3161 | ציוד ל H& צביעת E/Masson |
| משכך כאבים (הזרקת לידוקאין הידרוכלוריד) | HUAMU | 70011657 | משכך כאבים אופיאטיים, 4 מ"ג/ק"ג (לשליטה בכאב) |
| מכונת הרדמה | RWD Life Science (שנזן, CN) | R520-Iso | מאייד איזופלוראן עם אספקת חמצן |
| מכונת צביעה אימונוהיסטוכימית אוטומטית | לייקה | 21.2201 | צביעת אימונוהיסטוכימיה אוטומטית |
| אגרוף ביופסיה (20 מ"מ) | אינטגרה מילטקס | #33-37 | אגרוף עור עגול, קוטר 2 ס"מ |
| מצלמה, דיגיטלית | Huawei Mate 70 pro | לא זמין | ≥ 12 MP להדמיית פצעים |
| נוגדן CD31 | אבקאם | ab182981 | סמן אנדותל ל-IHC (איור 4B) |
| נוגדן CD34 | אבקאם | ab81289 | סמן אנדותל ל-IHC (איור 4B) |
| ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) | ביושארפ | BS350B | משמש לסינון פרמטרים של PEMF במבחנה (OD450) |
| צלחת תרבית תאים (10 ס"מ) | BaiDi | H802004 | צלחת תרבית רקמה בגודל 10 ס"מ (100 מ"מ) לתרבית פיברובלסטים |
| מדיום תרבית תאים (למשל, DMEM + FBS) | BaiDi | L100-500 | לתרבות פיברובלסטים במסך CCK-8 |
| חממת CO2 | תרמו | BB150-2TCS-L | לתרבות פיברובלסטים |
| סליל, נחושת גמישה | ייצור בהתאמה אישית (בתוך החברה) | לא זמין | סליל מודפס ספירלי (קוטר 5 ס"מ, פוליאימיד) |
| לוח בקרה (גנרטור PEMF) | עיצוב מותאם אישית (עיצוב פנימי) | לא זמין | לוח מעגלים מותאם אישית, מניע סליל ב-30 הרץ, ~1.3 mT |
| מכונת תספורת חשמלית | ווהל או אוסטר (טיפוח חיות מחמד) | דגם 9160 | קוצץ טיפוח בעלי חיים לגילוח פרווה |
| קולר אליזבתני (מכרסם) | MukeBio | MK-EC-01 | מניעת הפרעות פצע |
| תחנת הטמעה | אפרדיה היסטוסטאר | A81000002 | עיבוד להיסטולוגיה (אם מבוצע) |
| מסיכת פנים | ודנג | V531596 | שמירה על הרדמה |
| פיברובלסטים (קו תאים L929) | פרוסל | CL-0137 | תאים המשמשים לסקר התרבות CCK-8 |
| תוכנות סימולציית אלמנטים סופיים (למשל, COMSOL Multiphysics) | COMSOL | CM010004 | סימולציית שדה מגנטי (איור 5B-C) |
| סד אלומיניום גמיש | דיארגו | 1592 | תמיכה למניעת הזזת סליל |
| מלקחיים | מג'סטיק | 01625 | לטיפול בעור ובתחבושות במהלך ניתוח |
| המטוקסילין & אאוסין (H& ה) אוניברסיטה אוטומטית לצביעה ואיטום | DRS-Prisma-P+FILM | 61770249 | מתכלה לצביעה היסטולוגית שגרתית |
| תוכנת ניתוח תמונות | המכונים הלאומיים לבריאות | גרסה 1.54 | למדידת שטח הפצע (למשל, ImageJ) |
| תוכנת ניתוח תמונות | המכונים הלאומיים לבריאות | גרסה 1.54 | למדידת שטח הפצע (למשל, ImageJ) |
| תא אינדוקציה | RWD Life Science (שנזן, CN) | 802-00132-00 | השראת הרדמה איזופלורנית |
| מצלמת דימות תרמי אינפרא-אדום | HIKMICRO | H11 | טמפרטורת פני השטח של סליל המוניטור (איור 5A) |
| חומר חיטוי יוד פובידון 10% | היינאוט | לא זמין | חומר חיטוי לעור (יודופור) |
| איזופלוראן | RWD Life Science (שנזן, CN) | 20037015 | הרדמה בשאיפה (דרגת USP) |
| הזרקת לידוקאין 10% | סאנמה | לא זמין | להקלה על כאבים לאחר ניתוח |
| ערכת הצביעה בטריכרום של מסון | בסו | C250202 | מוצר מתכלה לוויזואליזציה של קולגן/ECM |
| טוש עור וסרגל רפואי | טונדאוס | לא זמין | כלול קנה מידה בתמונות פצעים |
| קורא מיקרופלט | תרמו | A51119500C | למדידת OD450 במבחן CCK-8 |
| מיקרוטום | אפרדיה HM 340E | 23900670 | חתכים להיסטולוגיה/IHC (אם מבוצעים) |
| קיבוע רקמת פוליפורמלדהיד | שיתוף ביוגרפיה | SB-C009 | קיבוע דגימות רקמות בעלי חיים |
| כלוב מגורים לעכברים | פנג צ'יאו | CP-JM | כלוב דיור סטנדרטי לעכברים למגורים אישיים. |
| ראטס, ספרג דולי (זכר, 6– 8 שבועות) | וויג'ינגיו סוז'ואו | SCXK2024-0004 | 200– 250 גרם; מגורים אישיים; שימוש מאושר על ידי IACUC |
| סכין מנתח | ג'ינחואן | 35W0602 | ליצירת פצע כריתה |
| סיפוי סרט חדיר-חדיר | ZD | Q20189 | מחסום פציעה חלופי |
| תוכנות ניתוח סטטיסטי (למשל, GraphPad Prism או R) | מקייב תוכנה | 10.6.9(890) | ANOVA דו-כיווני והשוואות מרובות לאחר מכן |
| גזה סטרילית | ZD | 3141626 | חבישת פצעים/מחסום מגן |
| וילונות ניתוחים סטריליים | ZD | V271617 | לכסות את שדה הניתוח לאחר הכנת העור |
| מספריים כירורגיים | מג'סטיק | 01627 | ליצירת פצע כריתה |
| מזרקים ומחטים | מיננק | 20193141643 | למתן משכך כאבים תת-עורי |
| סורק שקופיות שלמות | 3DHISTECH | לא זמין | סריקת שקופיות דיגיטלית |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.