מאמר שיטה

מודלים סטנדרטיים של בעלי חיים הנגרמות מחוסר יציבות למחקרים פרה-קליניים של אוסטיאוארתריטיס

467 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69612

⸱

23 בדצמבר 2025

 ,  , 
1Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Chinese Medicine), 2The First School of Clinical Medicine, Zhejiang Chinese Medical University, 3Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Hematology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Chinese Medicine), 4Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Orthopedics Research Institute of Zhejiang University, 6Key Laboratory of Motor System Disease Research and Precision Therapy of Zhejiang Province, 7Clinical Research Center of Motor System Disease of Zhejiang Province

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה נועד לקבוע מודלים מתאימים לבעלי חיים למחקר אוסטיאוארתריטיס.

תקציר

כהפרעת מפרקים הנפוצה ביותר בעולם, דלקת מפרקי הברך (OA) מהווה נטל בריאותי עולמי משמעותי, מה שמוביל למחקר מעמיק על הפתוגנזה ואסטרטגיות הטיפול שלה. למרות מחקרים רבים, מתודולוגיות סטנדרטיות להקמת מודלים נותרות חסרות. לכן, כדי להתמודד עם הפער הזה, אנו מציגים פרוטוקולים מקיפים וניתנים לשחזור לפיתוח מודלים של אוסטיאוארתריטיס בבעלי חיים הנגרמות מחוסר יציבות, במיוחד את חוסר היציבות של מודל המניסקוס המדיאלי (DMM) בעכברים ואת מודל קרע המניסקוס המדיאלי (MMT) בעכברים. בנוסף, אנו מתארים הליך פשוט וקל להערכת ספי הכאב לאחר הניתוח ויציבות ההליכה המרחבית, שמטרתו לקדם עקביות מתודולוגית במחקר הפרה-קליני של OA. אימות היסטולוגי והתנהגותי אישר את הצלחת שני המודלים, שכן ציוני החברה הבינלאומית למחקר אוסטיאוארתריטיס (OARSI) היו גבוהים משמעותית, אורך הצעד שונה באופן משמעותי, וספי הכאב המכניים ירדו משמעותית בקבוצות DMM ו-MMT בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמעיד על התדרדרות בולטת במפרקים ורגישות יתר. תוצאות האימות הללו מדגישות את השחזוריות והרלוונטיות התרגומית של שני המודלים. לכן, באמצעות מתן תיעוד וידאו מפורט, עבודה זו מקדמת תקינה פרוצדורלית ומקלה על עקביות בין מעבדות, ובכך משפרת את האמינות וההשוואה של תוצאות מחקר OA.

מבוא

אוסטיאוארתריטיס (OA) היא הפרעה ניוונית נפוצה מאוד במפרקים ואחת הסיבות המובילות לנכות ברחבי העולם 1,2. למרות מחקר נרחב, פיתוח תרופות יעילות לשינוי מחלה (DMOADs)היה איטי יחסית. כיום מוכר באופן נרחב כי OA היא מחלה רב-גורמית הכוללת שינויים פתולוגיים מורכבים ברקמות פרי-מפרקיות רבות, כולל סחוס מפרקי, עצם תת-כונדרלית, גידים וסינוביום 4,5. מחקר פרה-קליני יעיל על תהליכים פתולוגיים מגוונים של OA דורש שימוש במודלים בעלי חיים מוגדרים ומתאימים. למרות שמגוון מודלים של בעלי חיים OA הוקמו ודווחו 6,7,8,9,10,11, מחקרים רבים ממשיכים להשתמש במודלים לא מתאימים של בעלי חיים, מה שמגביל את הרלוונטיות התרגומית של ממצאיהם. כדי להתמודד עם בעיה זו, אנו מציגים מודלים סטנדרטיים של OA הנגרמות מחוסר יציבות, כולל ניתוח שכפול של ניתוח התייצבות של המניסקוס המדיאלי (DMM) וקרע המניסקוס המדיאלי (MMT), בפורמט וידאו כדי לשמש כמקור מעשי למחקר פרה-קליני OA ולסטנדרטיזציה של מודלים.

כפי שדווח במחקרים קודמים, חוסר יציבות במניסקל הוא גורם מרכזי התורם לניוון מפרק הברך במקרים קליניים. לכן, חוסר יציבות מניסקלי שנגרם בניתוח בעכברים וחולדות משמש כגישה יעילה לאינדוקציה ניסיונית של OA. בהקשר זה, אנו מציגים שני מודלים מייצגים של OA הנגרמת מחוסר יציבות, כולל מודל DMM בעכברים ומודל MMT בעכברים. מודל ה-DMM בעכברים חשוב במיוחד לחקר מנגנונים מולקולריים של OA, שכן עכברים ניתנים למניפולציה טרנסגנית, ומודל זה מציג התקדמות מחלה הדרגתית וממושכת, המדמה במידה רבה את OA האנושי. עם זאת, חשוב לציין שמודל ה-DMM פחות מתאים למחקרים המתמקדים בשינויים פתולוגיים בעצם התת-כונדרית, שבהם מודלים חלופיים עשויים לספק רלוונטיות תרגומית טובה יותר.

יתרה מזאת, קבענו את מודל MMT בעכברים כדי להשלים את מודל ה-DMM של העכבר. הליך ה-MMT גורם לנזק מבני נרחב יותר הכולל הן את הסחוס המפרקי והן את העצם התת-כונדרלית, ובכך משקף טוב יותר את התכונות הפתולוגיות המתקדמות של OA שנצפו בהקשרים קליניים. זה הופך את מודל MMT של חולדה למתאים במיוחד לביו-הנדסה ומחקר תרגומי, כולל הערכת ביומטרים, טיפולים רגנרטיביים ומערכות אספקת תרופות המיועדות לתיקון מפרקים. למרות שטכניקות הניתוח MMT וה-DMM תוארו במחקרים קודמים, עדיין חסר פרוטוקול חזותי מקיף שלב אחר שלב שמבטיח סטנדרטיזציה, שחזוריות ודיוק טכני בין מעבדות מחקר. לכן, כדי להתמודד עם הפער הזה, פיתחנו הדגמה מפורטת מבוססת וידאו הממחישה כל שלב קריטי בהקמת המודל, מהכנת בעלי חיים ועד טיפול לאחר הניתוח. בנוסף, אנו מציגים שתי שיטות הערכה התנהגותיות נפוצות, אחת להערכת סף הכאב ואחת לניתוח יציבות ההליכה המרחבית כדי לספק מסגרת עקבית להערכה פונקציונלית לאחר השראה ל-OA. לכן, באמצעות שילוב פרוטוקולים כירורגיים והתנהגותיים, מאמר זה שואף לקדם סטנדרטיזציה מתודולוגית במחקר OA פרה-קליני, ובכך לשפר את השוואת הנתונים ואת הרלוונטיות התרגומית בין המחקרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה והרווחה של בעלי החיים של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה הסינית ואושרו תחת מספר הפרוטוקול IACUC-20251020-11. לניתוח ה-DMM נבחרו עכברים זכרים מסוג C57BL/6 בגילאי 10-12 שבועות, בעוד שזכרים של עכברי ספרג-דולי במשקל 200-225 גרם נבחרו להליך MMT. כל בעלי החיים שוחזקו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים (SPF) ואושרו תקופת הסתגלות של שבוע לפני הניסוי. תנאי הטיפול הסטנדרטיים נשמרו, עם החלפת אוכל, מים ומיטות לפחות פעמיים בשבוע כדי להבטיח את רווחת בעלי החיים ועקביות ניסיונית.

1. הכנת בעלי חיים

  1. יש לתת משכך כאבים מתאים (למשל, בופרנורפין) לפני הניתוח בהתאם להנחיות המוסדיות. הרדמו את בעל החיים באמצעות הרדמה בשאיפה (למשל, איזופלורן 2% ב-0.4 ליטר/דקה עם זרימת גזים טרייה של 4 ליטר לדקה בתא השראה) ושומרים על הרדמה לאורך כל ההליך באמצעות קונוס אף. אשר את עומק ההרדמה על ידי הבטחת היעדר רפלקס גמילה מהפדל.
  2. מרחו רצועת משחה עינית משכה בעובי 2-3 מ"מ בשק הלחמית של העפעף התחתון ומעסים בעדינות את העפעף כדי להבטיח פיזור אחיד של המשחה על פני העין.
  3. גלח את הפרווה סביב מפרק הברך הימנית וחטא את אתר הניתוח באמצעות הליך ניקוי בן שלושה שלבים עם פובידון-יוד ואחריו 70% אתנול. מקם את החיה על שולחן ניתוחים סטרילי.

2. ניתוח DMM בעכברים

הערה: הליך זה גורם לחוסר יציבות מפרקים על ידי חתך הרצועה המניסקוטיביאלית המדיאלית (MMTL), המודגשת באדום באיור 1, אשר בדרך כלל מעגן את המניסקוס המדיאלי לפלטו השוקה.

  1. ממקם את העכבר המורדם במצב שכיבה ובצע חתך קטן בעור פרא-פטלרי מדיאלי (כ-3-5 מ"מ) מעל הברך הימנית.
  2. נתח בזהירות את הרקמות הרכות שמעליה כדי לחשוף את קפסולת המפרק. בצע חתך מדיאלי לגיד הפיקה והזיז בעדינות את הפיקה לרוחב כדי לראות את מפרק הברך. אשר שה-MMTL מופיע כרצועה דקה ורצועה המחברת את הקרן הקדמית של המניסקוס המדיאלי לפלטו השוקה. השתמש במיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ כדי לשפר את הוויזואליזציה ולהפחית את הסיכון לנזק לסחוס המפרקי.
  3. חתך בזהירות את חיבור השוקה של ה-MMTL באמצעות מיקרו-מספריים, להב סכין #11 או מחט מזרק מעוקלת. כאשר משתמשים במחט מזרק מעוקמת, הקצה הקהה מסייע להגן על הסחוס המפרקי שמתחת. לאשר את החיתוך המוצלח על ידי תצפית על חוסר יציבות המניסקוס המדיאלי.
  4. סגור את קפסולת המפרק החתוכה באמצעות 8-0 תפרים נספגים, ואחריהם סגירת חתך העור באמצעות קליפסים לפצע או תפרים 6-0.
    הערה: יש להימנע מפירסינג או נזק לסחוס המפרקי במהלך התפירה ולוודא שההידוק במפרקים נשמר כראוי בעת סגירת החתך.
  5. אפשר לבעל החיים להתאושש על כרית חימום ולעקוב אחריו מקרוב עד שתחזור לתנועה מלאה.

3. ניתוח MMT בעכברוש

הערה: הליך זה גורם לדלקת מפרקים על ידי יצירת קרע מלא במניסקוס המדיאלי לאחר חיתוך הרצועה הצדדית המדיאלית (MCL), ובכך יוצר חוסר יציבות במפרקים וניוון סחוס מתקדם.

  1. מקמו את העכברוש המורדם כראוי ובצעו חתך פרא-פטלרי מדיאלי, באורך של כ-6-8 מ"מ, מעל הברך הימנית.
  2. בצע ניתוח קהה כדי להפריד את שכבות השרירים ולחשוף בבירור את ה-MCL (איור 2).
  3. באמצעות מספריים כירורגיים, חתכו את ה-MCL במלואו בנקודת האמצע שלו.
  4. משכו בעדינות את ה-MCL המועבר כדי לחשוף את המניסקוס המדיאלי שמתחת. באמצעות מלקחיים דקים, אחזו במניסקוס ובצעו חיתוך בעובי מלא באזור הצר ביותר שלו ליצירת קרע מלא.
  5. ממקמים מחדש את הרקמות הרכות וסגרו את החתך בשכבות, תוך שימוש בתפרי 5-0 נספגים לשריר ולפשיה, ואחריהם קליפסים לפציעה או תפרים 5-0 לא נספגים לסגירת העור.
  6. אפשר לבעל החיים להחלים על ידי ביצוע אותו הליך שתואר בשלב 2.5.

4. הערכות התנהגותיות

  1. לבצע הערכות בסיס לפני הניתוח והערכות חוזרות בנקודות זמן לאחר הניתוח (למשל, שבוע 2, 4 ו-8).
    הערה: כדי למזער שונות בין מפעילים, בוצעו בדיקות התנהגות על ידי אותו מפעיל מיומן שהיה עיוור לקבוצה הניסויית. כל מדידה חזרה על עצמה שלוש פעמים לכל בעל חיים, והערך הממוצע שימש לניתוח.
    1. בדיקת סף משיכה מכנית פשוטה
      1. הניחו את העכברים בתאים נפרדים על פלטפורמת רשת תיל מוגבהת ואפשרו להם להסתגל לפחות 30 דקות לפני הבדיקה. לאחר מכן מוערכת רגישות מכנית לכאב באמצעות מד הרדמה אלקטרוני של פון פריי.
      2. באמצעות חוט פון פריי, החלו את הגשוש על פני השטח של כף הרגל האחורית הימנית של העכבר והגבירו בהדרגה את הכוח12.
      3. הקלט את התגובה, ושים לב שתגובה חיובית מסומנת על ידי משיכת כפות פתאומית, התכווצות או ליקוק. הערך את נוכחות או היעדר תגובה עקבית כדי להעריך שינויים ברגישות לאורך זמן.
    2. ניתוח הליכה
      1. השתמש במערכת ניתוח הליכה אוטומטית להערכה.
      2. אפשרו לבעל החיים ללכת מרצונה על מעבר הזכוכית של המכשיר. הגדר משפט תקף כזה שבו החיה נעה בקצב יציב מבלי לעצור. חכו שתוכנת המערכת תזהה אוטומטית טביעות כפות ותחשב מספר פרמטרים של הליכה. נתחו מדדים מרכזיים לגפה האחורית הימנית (המופעלת), כולל משך שלב העמידה, מהירות הנפה ולחץ כפות הרגליים, והשווה אותם לאלו של הגפה הנגדית ובקרת הגפה המופעלת על ידי שמה.
        הערה: כל בעלי החיים הותאמו למערכת הבדיקה עם אימונים יומיים לפני ההערכה הבסיסית. לכל בעל חיים נרשמו שלוש ריצות לכל נקודת זמן, ורק ניסויים שבהם החיה שמרה על מהירות עקבית ללא עצירה נחשבו תקפים. כל המדידות בוצעו על ידי מפעילים מיומנים בתכנון כפול-סמיות כדי למזער שונות בין מפעילים, וממוצע ריצות חוזרות נערך כדי להבטיח שחזור נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אפיון ואימות של מודל העכבר OA של DMM
לאחר תקופת הסתגלות של שבוע, הוכח מודל אוסטיאוארתריטיס (OA) המושרה על ידי DMM בעכברים בהתאם להליך המוצג באיור 1. בוצעו הערכות פתולוגיות והתנהגותיות שבועיים לאחר הניתוח. כפי שמוצג באיור 2A, השינויים הניווניים הבולטים ביותר התרכזו במפרק הפמורוטיבי המדיאלי. היקף הניוון הסחוס נמדד עוד יותר באמצעות מערכת הניקוד OARSI13,14, שהראתה ציונים גבוהים משמעותית ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק מסגרת סטנדרטית להשראה והערכה של שני מודלים כירורגיים בשימוש נרחב ב-OA. מודלים אלו חשובים במיוחד משום שהם משקפים מקרוב את התכונות הפתופיזיולוגיות של OA פוסט-טראומטי אנושי, ובכך מציעים רלוונטיות תרגומית חזקה. מודל ה-DMM כולל חתך של הרצועה המניסקוטיביאלית המדיאלית, בעוד שמודל MMT כולל קרע ישיר של המניסקוס המדיאלי. במעבדה שלנו, הליך ה-DMM מתבצע באופן שגרתי בעכברים, שכן המניסקוס המדיאלי קשה לזיהוי מדויק במין זה, וקרע מלא במניסקוס עלול לגרום לנזק מופרז לסחוס. בנוסף, שמנו לב שנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך כלכלית על ידי פרויקט המחקר של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה סינית (מענק מס' 2025JKJNTZ09) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 32401092). אנו גם מביעים את הערכתנו הכנה לחברת Hangzhou Xinyao Biotechnology Co., Ltd. על מתן שירותי ניתוח הליכה, שהיו חיוניים להשלמת מחקר זה בהצלחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת ניתוח צעידהשנגחאי שין רואן לטכנולוגיית מידע בע"מXR-FP202
ליפוסיקמשחת עיניים
עכבריםמכון נאנג'ינג לבעלי חיים מודליםc57/bl6
מערכת בדיקות כאבשנגחאי שין רואן לטכנולוגיית מידע בע"מXR-XZDמד הרדמה אלקטרוני פון פריי
עכברושמכון נאנג'ינג לבעלי חיים מודליםS/D

מקורות

  1. Barnett, R. Osteoarthritis. Lancet. 391 (10134), 1985(2018).
  2. Chen, S., et al. Epidemiological trends and characteristics of osteoarthritis in China during 1990-2021. J Orthop Translat. 17 (51), 218-226 (2025).
  3. Xingyan, A., Jiao, W., Ke, X., Robert Chunhua, Z., Jiacan, S. Perspectives on osteoarthritis treatment with mesenchymal stem cells and Radix Achyranthis Bidentatae. Aging Dis. 15 (3), 1029-1045 (2024).
  4. Konstantinos, H., et al. Translational genomics of osteoarthritis in 1,962,069 individuals. Nature. 641 (8065), 1217-1224 (2025).
  5. Samantha, A. Low-dose methotrexate fails to treat inflammatory knee osteoarthritis. JAMA. 334 (4), 295(2025).
  6. Zaki, S., Blaker, C. L., Little, C. B. OA foundations - experimental models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 30 (3), 357-380 (2022).
  7. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  8. Parrish, W. R., et al. Intra-articular therapy with recombinant human GDF5 arrests disease progression and stimulates cartilage repair in the rat medial meniscus transection (MMT) model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 25 (4), 554-560 (2017).
  9. Thever, Y., Shen Xuanrong, M., Rong Chuin, T., BinAbd Razak T, H. R. Comparison of early-stage knee osteoarthritis induced by medial meniscus tear versus tibial osteotomy in the rat model. Cartilage. 15 (1), 19476035241292320(2024).
  10. Minghao, Q., et al. Pip5k1c Loss in Chondrocytes Causes Spontaneous Osteoarthritic Lesions in Aged Mice. Aging Dis. 14 (2), 502-514 (2023).
  11. Wakale, S. How are Aging and Osteoarthritis Related. Indira Prasadam Aging Dis. 14 (3), 592-604 (2023).
  12. Alicia, S., Eleri, L. F. M., Oakley, B. M., Elodie, N., Jeffrey, S. M. Normative preclinical algesiometry data on the von Frey and radiant heat paw-withdrawal tests: an analysis of data from more than 8,000 mice over 20 years. J Pain. 25 (7), 104468(2024).
  13. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  14. McAlindon, T. E., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 22 (3), 363-388 (2014).
  15. Sharifah Zakiah Syed, S., et al. Comparison of bone and articular cartilage changes in osteoarthritis: a micro-computed tomography and histological study of surgically and chemically induced osteoarthritic rabbit models. J Orthop Surg Res. 16 (1), 663(2021).
  16. Zengfa, D., et al. IRF1-mediated upregulation of PARP12 promotes cartilage degradation by inhibiting PINK1/Parkin-dependent mitophagy through ISG15 attenuating ubiquitylation and SUMOylation of MFN1/2. Bone Res. 12 (1), 63(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים