מאמר שיטה

אפיון תכונות פטיחות ואפידרמליות באמצעות פילינג, ניקוי וניתוח תמונות מבוסס בינה מלאכותית

DOI:

10.3791/69615

⸱

27 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre of Estonian Rural Research and Knowledge, 2Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 3Estonian Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה השוואתית להערכת תכונות סטומטליות ואפידרמליות בשני מינים מובחנים, באמצעות פילינג אפידרמלי, טכניקות ניקוי וניתוח תמונות בעזרת בינה מלאכותית. המטרה היא לאפשר כימות בתפוקה גבוהה וניתנת לשחזור של מבנים תאיים הבסיס לתפקוד הפיוניתי ליישומים חקלאיים ולמחקר צמחי רחב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון מדויק של מורפולוגיית הפיוניה ותכונות האפידרמל הסובבות הוא חיוני להבנת תפקוד הפיוניה. פרוטוקול השוואתי מוצג באמצעות שתי טכניקות משלימות – פילינג אפידרמלי ופינוי עלים – להערכת גודל, צורת וצפיפות תאי הפסה והאפידרם בשני מיני דיקוטים אקולוגיים שונים, Fraxinus excelsior ו-Taraxacum officinale. הפרוטוקול כולל שלבים מפורטים להכנת דגימה, הדמיה וכימות תכונות באמצעות מדידות ידניות חסכוניות מבחינת עלות ועבודה (ניקוי וקילוף רקמות), וניתוח תמונה בעזרת בינה מלאכותית עם פוטנציאל להקל על יישומים בעלי תפוקה גבוהה. שלושה כלי סגמנטציה – מודל זיהוי פטליות מבוסס YOLOv8, כלי למידה עמוקה כללי לסגמנטציה של תאים, ומסווג מבוסס פיקסלים – הוערכו לפי דיוקם והתאמתם בין שיטות. הבדלים משמעותיים בתכונות הפומטה והאפידרמלית נצפים בעקביות בין טכניקות קילוף וניקוי הן בניתוחים ידניים והן בניתוחים בינה מלאכותית. כלי בינה מלאכותית אפשרו כימות שחזורי, כאשר מודל זיהוי סטומטלי מבוסס YOLOv8 (StoManager1) מתפקד בצורה הטובה ביותר עבור תכונות סטומטליות וכלי למידה עמוקה כללי לסגמנטציה של תאים (Cellpose) לסגמנטציה אפידרמלית. זיהוי תכונות מבוסס בינה מלאכותית היה עקבי מאוד ב-T. officinale אך מוגבל ב-F. excelsior, והתוצאות עדיין היו שונות ממדידות ידניות, מה שממחיש כיצד אנטומיה ספציפית למין ואיכות תמונה משפיעות על התאמת השיטה. ממצאים אלו מצביעים על כך שבעוד שניתוח בסיוע בינה מלאכותית מספק מסגרת שימושית לכימות תכונות פטליות ואפידרמלס, אימות מקצועי ובדיקות פיילוט נשארים חיוניים לפני יישום רחב או בקצב גבוה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות באפידרמיס שממלאות תפקיד חיוני בוויסות חילופי גזי הצמח והזחלות. לכן, הבנת הבסיס המורפולוגי של תפקוד הסטומטה היא המפתח לשיפור ביצועי הגידול1. בעוד שרוב המחקרים על מבנה ותפקוד הסטומטה מתמקדים אך ורק במורפולוגיה של הסטומטה, הבנה מלאה של תגובתיות הפומטה דורשת גם אפיון של גודל וצורת תאי האפידרמה הסובבים. כימות מדויק של תכונות אלו הוא יסודי להבנת הקשרים בין המבנה-פונקציה שמאחורי חילופי גזים ושיפור הגידולים.

ככל ששיפור הגידולים נשען יותר ויותר על גישות מתקדמות לעריכת גנים, חשוב להבין את התכונות המורפולוגיות המרכזיות – כגון סטומטה – המשפיעות על פוטוסינתזה, יעילות השימוש הפנימית במים ורווח פחמן. הצורך הזה דחוף במיוחד תחת שינויים סביבתיים מתמשכים, כאשר הביקוש לגידולים עמידים ששומרים על יכולת פוטוסינתטית ותפוקה גדל לנוכח בצורות וגלי חום תכופים יותר. כתוצאה מכך, יש צורך חזק בפרוטוקולי הדמיה וניתוח סטנדרטיים. קילוף סטומטלי עם לכה/לק לציפורניים הוא השיטה הפשוטה ביותר לקבלת טביעות על פני העלים למדידת גודל, צורה וצפיפות של הסטומטל והאפידרם 4,5,6. ההליך שלו מהיר, לא הרסני, ומאפשר עיבוד מהיר של דגימות במהירות. שיטת ניקוי רקמות היא גישה חלופית המאפשרת אפיון סימולטני של רשת הוורידים ואפיון מקיף יותר של הידראוליקה של העלים.

ניקוי כימי מרכך והופך את הרקמות לשקופות אופטית, ומאפשר הדמיה במקום של הפיוניות ותאי האפידרמה ללא הפרעה מכנית. ניקוי ישים באופן רחב במגוון סוגי רקמות, כולל דגימות מיובשות או עדינות, וניתן להשתמש בו לא רק להדמיית פטליות אלא גם להמחשת רשתות ורידים, הדמיית פלואורסצנציה ומבנים אנטומיים פנימיים 7,8,9,10,11,12 , וכך ניתן לנתח תכונות סטומטה לצד תכונות פונקציונליות אחרות. קיימות שיטות ניקוי שונות, הכוללות ממסים אורגניים, תמיסות מימיות, היפרהידרציה או הטמעת הידרג'ל 13,14,15. אלה משתנים במשך הזמן, תאימות ההדמיה וזמינות התגובה. הפרוטוקול כאן פשוט, חסכוני, ואינו דורש מיומנויות מיוחדות. שתי הטכניקות זולות ומהירות, בהשוואה לשיטות עתירות עבודה כמו מיקרוסקופ אור או מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, שדורשות קיבוע כימי, הטמעה וחתך של דגימות.

שיטות מסורתיות לניתוח מאפייני פטליות ואפידרמליות לעיתים קרובות מסתמכות על סגמנטציה ידנית של תמונות מיקרוסקופיה, דבר שדורש עבודה רבה, גוזל זמן וחשוף להטיית צופה, שמגבילה את קצב התפוקה ומפחיתה את יעילות צינור הניתוח16. יתרה מזאת, תכונות אנטומיות כמו טריכומות ודפנות תא לא סדירות מציבות אתגרים נוספים בכימות עקבי של תכונות. בעוד שכלי ניתוח תמונות אוטומטיים מציעים הבטחה רבה לחילוץ נתונים בתפוקה גבוהה, הם מותאמים לרקמות צמחים ספציפיות ואינם ניתנים להעברה בקלות בין סוגי עלים ושיטות הכנה. לדוגמה, StoManager1 (איור משלים 1) מספק דיוק גבוה בזיהוי סטומטלי באמצעות מודל זיהוי אובייקטים מבוסס YOLOv8, אך מאומן במיוחד לתכונות סטומטה. Cellpose (איור משלים 2), הוא מודל סגמנטציה גדול, מאומן מראש, כללי, שמתפקד היטב כאשר נתוני הקלט דומים למודלים המאומנים מראש שלו (למשל, cyto, cyto2), המבוסס במקור על תאי בעלי חיים ואברונים. Ilastik (איור משלים 3) הוא כלי סיווג מבוסס פיקסלים המסתמך על הערות שהוגדרו על ידי המשתמש. גם Cellpose וגם Ilastik ידידותיים למשתמש, אך כל אחד מהם עשוי לדרוש אימון מחדש או כיוונון עדין כדי להתאים לשינויים באיכות התמונה, ארטיפקטים ברקע ובתכונות ספציפיות לרקמה.

יתרה מזאת, המורפולוגיה של הפטילה והאפידרמלית מראה שונות גבוהה בין מינים17. תכונות כמו צפיפות וגודל הפיוניות משתנות במיוחד, אך הן בדרך כלל קשורות הפוך ויחד קובעות את ההבדלים בין המינים בקינטיקה של הפיונית. סטומטות גדולות יותר יכולות לפצות חלקית על צפיפות נמוכה יותר, אך בדרך כלל הן מציגות קינטיקה איטיתיותר, מה שעלול להיות חסר ערך בגלי חום תכופים יותר ויותר, שבהם תגובות הסטומטות המהירות קריטיות לשמירה על ספיגת פחמן ומניעת אובדן מים מופרז. בסך הכול, שונות זו מסבכת את מדידת תכונות הסטומטה ועלולה לפגוע בתוקף הפרוטוקול הנבחר ובעמידות התוצאות מבוססות הבינה המלאכותית.

פרוטוקול זה משלב שתי טכניקות הכנה קלאסיות – פילינג אפידרמלי ופילויים כימיים – עם כלים מודרניים לבינה מלאכותית (AI) ולמידת מכונה (ML) לצורך חלוקת תכונה ומדידה. באמצעות שני מיני דיקוט נפוצים הדורשים אור עם אסטרטגיות אקולוגיות מנוגדות (F. excelsior ו-T. officinale), בדקנו שונות בתכונות הפיוניות והאפידרמלית כדי להעריך כיצד שלוש שיטות משתוות והיכן עלולות להיווצר אי-דיוקים. הביצועים של שלושה כלים מבוססי בינה מלאכותית: StoManager1 (מודל למידה עמוקה מבוסס YOLOv8 לזיהוי סטומטה), Cellpose (כלי כללי לפילוח למידה עמוקה), ו-ilastik (מסווג פיקסלי לרקמות אפידרמליות). גישה אינטגרטיבית זו מאפשרת כימות שכפול ובקצב גבוה של תכונות הפיוניות והאפידרמליות, ומציעה מסגרת איתנה וניתנת להרחבה לניתוח פנוטיפי הן במחקר אקולוגי והן במחקר חקלאי. עם זאת, תכונות אנטומיות כמו טריכומות צפופות, ציפוריות עבות או ניגודיות גבול תא נמוכה עלולות להפחית את דיוק הסגמנטציה ויש לקחת בחשבון אותן בבחירה בין גישות קילוף לניקוי וכאשר מיישמים כימות מבוסס בינה מלאכותית.

למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון שלב אחר שלב שמשווה ישירות בין גישות לפילינג אפידרמלי וניקוי כימי בשילוב עם כלי סגמנטציה מבוססי בינה מלאכותית למדידת תכונות של הפומטה והאפידרמל. על ידי איחוד טכניקות מיקרוסקופיה קלאסיות עם תהליכי עבודה נגישים של למידת מכונה, הפרוטוקול מפחית את הטיית המשתמש, מגביר את קצב התפוקה ומקל על פנוטיפינג שחזורי בין מינים. דבר זה הופך את הגישה לרלוונטית באופן רחב לאקולוגיה, שיפור גידולים ומחקר שינויי אקלים, ומספק בסיס להרחבת כלים מתמשכת באמצעות אימון מחדש של מודלים או למידת העברה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לא נדרשו היתרים או אישורים ספציפיים לאיסוף עלי T. officinale ו-F. excelsior , שכן מינים לא מוגנים אלו נלקחו מאזורי גינה נגישים לציבור. כל איסוף הדגימות עמד בהנחיות מוסדיות ומקומיות.

1. איסוף חומרי צמחים

  1. בחר עלים בריאים לניתוח השוואתי. לניסוי הנוכחי נבחרו עלים בוגרים בריאים, חשופים לשמש, משני מיני דיקוטים עם תפוצה סטומטלית מנוגדת: עץ ההיפו-סטומטוס F. excelsior, שנושא סטומטה רק על פני העלה התחתון, והעשב רב-שנתי האמפיסטומטי T. officinale.
  2. לכל סוג דגימה/מיקום קח 3-5 עלים משוכפלים.
  3. נתק את העלה בעזרת מספריים נקיים או להב גילוח. הניחו את העלה החתוך מיד במים כדי למנוע התייבשות.
  4. לאחר האיסוף, טבלו את הפטיול במלואו במים ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4°C.
  5. המשיכו עם סעיפי הפרוטוקול 2 או 3 בתוך 48 שעות.

2. הכנה וצפייה בפילינג של טביעות סטומטה

הערה: כל הפסולת הכימית שנוצרה במהלך פרוטוקול הניקוי טופלה בהתאם לתקנות בטיחות מוסדיות ומקומיות. תמיסות המכילות גלוטראלדהיד נאספו בנפרד והושלכו כפסולת כימית מסוכנת. תמיסות נתרן הידרוקסיד (NaOH) נוטרלו ל-pH 6-8 לפני ההשלכה, כאשר התאפשר. תמיסות אקונומיקה ואתנול מדוללות הושלכו לביוב עם כמויות גדולות של מים קרים במקומות שבהם מותר על פי תקנות מוסדיות ומוניציפליות. תמיסות TBO נאספו והושלכו כפסולת כימית לפי ההנחיות המקומיות. המשתמשים צריכים להתייעץ עם משרד הבטיחות המוסדי שלהם לקבלת הליכי סילוק מאושרים.

  1. אם צריך, שטוף בעדינות את פני העלה שנבחרו במים כדי להסיר אבק או לכלוך. מייד ייבשו את פני העלה עם נייר סינון או מגבת נייר רכה כדי להסיר לחות עודפת. אין לייבש באוויר, שכן הדבר עלול לגרום להתכווצות הרקמה, מה שיוביל למדידות לא מדויקות של הסטומטות ותאי האפידרמה.
  2. סמן את שקופית המיקרוסקופ בפרטי הדגימה (למשל, מין, צד עלה ותאריך הכנה) באמצעות סמן קבוע כדי להבטיח מעקב אחר כל דגימה במהלך ההדמיה, הניתוח ופרשנות הנתונים, ומאפשר אחסון נכון של הדגימה לשימוש עתידי.
  3. למינים עם טריכומים שלא-בלוטיים (שעירים), יש להסיר את הטריכומות מפני העלה עם להב גילוח לפני הכנת הפילינג, שכן נוכחותן עלולה להסתיר גבולות תאים ולהפחית את איכות התמונה (איור 1).
  4. בעזרת מברשת קטנה, מרחי שכבה דקה ואחידה של לק ציפורניים שקוף ובלתי ניתן להארכה (הימנעי מנוסחאות "מתיחה" או "קילוף") על האזור היעד. תמיד בחרו את החלק המרכזי של העלה להכנת הקליפה, תוך הימנעות מהקצה והבסיס.
  5. תנו ללק להתייבש לגמרי (בדרך כלל 2-5 דקות בטמפרטורת החדר). חשיפה ממושכת עלולה לגרום לשינוי צבע ברקמות (למשל, גוון אדום על עלים רכים), שעשוי להיות נראה בפילינג הסופי, ולהפריע לניתוחים במורד הזרם הדורשים צבע אחיד.
  6. לאחר התייבשות, יש להניח רצועת דבק שקוף על האזור המצופף. התחילו בקצה אחד של הלק, והניחו בהדרגה את הסרט על פני המשטח, תוך לחיצה עדינה כדי להבטיח הידבקות טובה ולמנוע בועות אוויר או קמטים. לבש כפפות ניטריל כדי למנוע טביעות אצבע.
  7. קילפו בזהירות את הסרט יחד עם שכבת הלק (טביעת אפידרמל).
  8. הנח את הסרט (הצד הדביק כלפי מטה) על סלייד מיקרוסקופ נקי, תוך הימנעות מקפלים או חפיפות.
  9. שמרו את המגלשות המוכנות בטמפרטורת החדר, מוגנות מאבק ואור שמש ישיר.
  10. בדוק את המחסנית תחת מיקרוסקופ אור מורכב בהגדלה של פי 400. שמור תמונות לפי מדריך התוכנה, יחד עם הקנה מידה הרלוונטי.

3. הכנה וצפייה בקטעים שנקנו

  1. חתיכות עלים בגודל של כ-1 ס"מ רבוע. בצע את כל השלבים עם כפפות ניטריל ועבודה מתחת לכובע אדים.
  2. העבר את הדגימות לבקבוקון מסומן, כסה אותן בתמיסת קיבוע (אלדהיד גלוטרי 4% בבופר פוספט 0.1 מטר, pH = 6.9) (זהירות), ואחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות (טבלה 1, להכנת תמיסת קיבוע).
  3. הסר את תמיסת הקיבוע עם פיפטה וכסה את הדגימות במים מזוקקים. להשאיר ל-30 דקות. חזור על זה שלוש פעמים (איור 2A-C).
  4. הסר את המים וכסה את הדגימות בתמיסת 1 מיליון NaOH (המיס 20 גרם NaOH ב-0.5 ליטר מים מזוקקים).
  5. במהלך ניקוי העלים, תמיסת NaOH תהפוך לירוקה. החלף את תמיסת ה-NaOH פעם ביום בתמיסה טרייה. המשיכו למשך 3 עד 4 ימים, או עד שהדגימות הופכות לצהובות חיוורות ותמיסת ה-NaOH נשארת שקופה (איור 2D-F).
  6. הסר את תמיסת NaOH וכסה את הדגימות באקונומיקה (5% NaClO). אקונומיקה ביתית מסחרית עם ריכוז זה מתאימה.
  7. דגרו את הדגימות באקונומיקה למשך 1-2 דקות. הדגימות יהפכו ללבנים ושקופים (איור 2G-I).
  8. הסר את התמיסה הקודמת וכסה את הדגימות במים מזוקקים למשך 2 דקות. ייבשו את הדגימות באמצעות סדרת מים-אתנול מזוקקת מדורגת כך: 75:25, 50:50, 25:75 ו-100% אתנול.
  9. הסר את האתנול וכסה את הדגימות בתמיסה אלכוהולית 3% של טולואידין כחול O (TBO, המיס 3 גרם TBO ב-100 מ"ל של 100% אתנול). עזוב ללילה.
  10. הסר את תמיסת הצביעה וכסה את הדגימות ב-100% אתנול למשך 2 דקות. חזור על שלב זה באמצעות סדרת מים-אתנול מזוקקת מדורגת כך: 25:75, 50:50, 75:25, ולבסוף מים מזוקקים (איור 2J-L). עיין באיור 3 לטעויות נפוצות ולשלבי פתרון תקלות הקשורים לתהליך הניקוי.
  11. שמור את הדגימות במים מזוקקים בטמפרטורה של 4°C עד הצפייה.
  12. העבר את הדגימות למחסנית זכוכית, הוסף טיפה של מים מזוקקים, וכסה עם כיסוי זכוכית לצפייה והדמיה מיקרוסקופית.
  13. בדוק את המחסנית תחת מיקרוסקופ אור מורכב בהגדלה של פי 400. שמור תמונות לפי מדריך התוכנה, יחד עם הקנה מידה הרלוונטי. למידע נוסף ראו את טבלת החומרים .

4. ניתוח תמונה ומדידות

  1. השתמשבפיג'י 23 (הפצת ImageJ, גרסה 1.54p) לעיבוד וניתוח תמונות.
  2. באמצעות כלי הקו, שרטט קו מעל פס הסקאלה, ואז בחר בניתוח > הגדר קנה מידה, שנו את המרחק הידוע לאורך פס הסולם, ושנה את יחידת האורך למיקרון.
  3. לך לנתח את המידות > הסט. ודא שאפשרויות הקוטר של האזור והפרט נבדקות.
  4. השתמש בכלי בחירת הפוליגונים כדי לתאר את האובייקט המעניין אותו. הקלט את המדידה על ידי לחיצה על מקש M .
  5. מדוד את התכונות הבאות בפיג'י וחשב עבור דגימות שננקו והן עבור קילופים של הפקליות (איור 3).
  6. חשב את מספר הפיוניות (Ns).
    1. קבעו את שטח הפיוניה הממוצע (As).
    2. קבעו את רוחב הפסה הממוצע (Ws): באמצעות הקוטר המינימלי של פרט.
    3. חשב את צפיפות הסטומטה (SD), לפי הנוסחה הבאה:
      משוואה 1
      ; ליחידה Ia (שטח העלה שנבחר למדידות, מ"מ 2).
    4. קבעו את שטח תא האפידרמה הממוצע (Ae).
    5. קבעו את צפיפות התאים האפידרמליים (ECD) באמצעות הנוסחה הבאה:
      משוואה 2

5. סטטיסטיקות

  1. השתמש ב-ANOVA ובמבחן הפוסט-הוק של טוקי HSD כדי לבדוק הבדלים בין קבוצות דגימה.
  2. בצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים ב-R21.
  3. נתח בסך הכל 3 עלים משוכפלים לכל מין, וצפה ב-3 קליפות מכל עלה.

6. ניתוח בסיוע בינה מלאכותית

  1. בחר כלי למידת מכונה לסגמנטציה.
    1. בחר כלי סגמנטציה מתאימים מבוססי למידת מכונה בהתבסס על מבנה היעד (פומטה או תאי אפידרמה), איכות התמונה ומטרות הניתוח.
    2. השתמשו במודל למידה עמוקה ייעודי לסטומטה לזיהוי ומדידה אוטומטיים של תכונות הפיונית, והשתמשו בלמידה עמוקה כללית או בכלי סגמנטציה מבוססי פיקסלים לסגמנטציה של תאי האפידרמל.
    3. ראו את סעיף כלי למידת מכונה ותוכנה ליישומים ספציפיים של תוכנה (קובץ משלים).
    4. לבצע בדיקות פיילוט על תת-קבוצה של תמונות לפני ניתוח רחב היקף כדי להעריך את ביצועי הסגמנטציה ולזהות מקורות פוטנציאליים לתוצאות חיוביות שגויות.
  2. הכינו את סביבת המחשוב.
    1. השתמש בתחנת עבודה המצוידת במעבד 8-12 ליבות, לפחות 32GB זיכרון RAM וכרטיס גרפי עם NVIDIA CUDA עם מינימום 24GB VRAM.
    2. השתמש בתצוגה ברזולוציה גבוהה (רצוי 4K) כדי להקל על הערות ובדיקה ויזואלית.
    3. התקן את כל כלי התוכנה הנבחרים לפי הוראות המפתחים והקלט את גרסאות התוכנה כדי להבטיח שחזוריות.
  3. הכינו תמונות לניתוח למידת מכונה.
    1. ייבא תמונות מיקרוסקופיות בפורמט TIFF או PNG, תוך שימוש בתמונות גווני אפור של 8 או 16 ביט כשאפשר.
    2. ודא שכל תמונה מכילה פס קנה מידה גלוי או שעברה כיול מרחבי לפני הניתוח.
    3. בחרו אזורים מעניינים עם פסולת, קפלים או בועות אוויר מינימליות, אפילו תאורה, וגבולות תאים מוגדרים בבירור.
    4. יש להוציא תמונות עם קצוות מטושטשים, צללים חזקים או ניגודיות נמוכה, שכן אלה מפחיתים את דיוק הסגמנטציה.
  4. בצע סגמנטציה של הסטומטה.
    1. טעין תמונות למודל הלמידה העמוקה הספציפי לסטומטה (קובץ משלים סעיף 1).
    2. הגדר פרמטרי זיהוי, כולל מגבלות גודל האובייקט וספי ביטחון, בהתאם למין ולרזולוציית התמונה.
    3. הרץ זיהוי אוטומטי לקטע קומפלקסים של סטומטלים ולהוציא מדדי פלט כמו מספר הפסיסה, שטח וקוטר פרט.
    4. ייצוא מסכות סגמנטציה וטבלאות מדידה לניתוח במורד הזרם. בדוק ויזואלית שכבות סגמנטציה והחריג ידנית אובייקטים שזוהו בטעות במידת הצורך.
  5. לבצע סגמנטציה של תאי האפידרמה.
    1. טען תמונות לכלי סגמנטציה כללי ללמידה עמוקה או למסווג מבוסס פיקסלים (סעיף 2 - 4 של קובץ משלים).
    2. לאמן או לכוון את המודל באמצעות תמונות מייצגות עם דוגמאות ידניות עם הערות של תאי אפידרם, גבולות תאים ורקע.
    3. הרץ סגמנטציה ליצירת מסכות אובייקטים וייצא את המסכות לעיבוד לאחר מכן בתוכנות ImageJ/Fiji או בתוכנות ניתוח תמונות מקבילות.
    4. יש להחיל סינון מבוסס גודל או כמותי להסרת עצמים חיוביים שגויים קטנים ולאמת את דיוק הסגמנטציה באמצעות בדיקה ויזואלית לפני הפקת מדדי תא אפידרמל כגון שטח תא וצפיפות תאים.
  6. תיעוד פרמטרים וביצוע בקרת איכות.
    1. רשם את כל גרסאות התוכנה, הגדרות הפרמטרים, ספי הסינון ומפרטי החומרה שבהם נעשה שימוש במהלך הניתוח.
    2. שמור על שכבות סגמנטציה מייצגות לאיכות הסגמנטציה של המסמכים.
    3. אימות ויזואלי של פלטי סגמנטציה אוטומטית לפני ניתוח סטטיסטי או דיווח נתונים.
  7. הכנת תמונה לכל עיבוד למידת הלמידת
    1. הדמיית דגימה
      הערה: מכיוון שסגמנטציה מבוססת למידת מכונה מתבססת על גרדיאנטים של עוצמה, רציפות קצוות וגאומטריית אובייקטים עקבית ולא על הקשר ביולוגי, עיבוד מוקדם של תמונה ובחירת אזורים קובעים באופן קריטי ביצועי המודל ומבנה השגיאות.
      1. צלם תמונות ברזולוציה גבוהה של משטחי עלים נקיים או מקולפים עם פס קשקשים גלוי. לתהליכי עבודה טובים בלמידת מכונה, ודאו שהאובייקטים המדידים חדים, רציפים ובעלי ניגודיות גבוהה בכל התמונה.
    2. בחירת אזור ואיכות תמונה
      הערה: לאחר רכישת התמונה בסעיף 6.7.1, התמונות נבדקות ויזואלית, וכאשר קנה המידה של התמונה מאפשר, אזורים בעלי עניין ללא ארטיפקטים נבחרים ידנית לצורך חלוקה במורד הזרם. בחרו אזורים מעניינים עם חפצים מינימליים (למשל, פסולת, קפלים, בועות אוויר, תאורה לא אחידה). למודלים של פטליות (למשל, StoManager1), יש להעדיף נראות נקבוביות ברורה וצללית מוגדרת היטב של תאי שמירה. במודלים אפידרמליים (למשל, Cellpose, ilastik), יש להבטיח גרדיאנטים יציבים של עוצמה לאורך קווי המתאר של התאים; קצוות לא רציפים או בעלי ניגודיות נמוכה מפחיתים משמעותית את ביצועי הסגמנטציה. תמונות עם גבולות לא מוגדרים היטב צריכות להיפסל או לעיבוד מחדש לפני הסגמנט.
    3. פורמט קובץ
      קבצי שמירה בפורמט TIFF או PNG (גווני אפור בגודל 8 או 16 ביט מומלץ לסגמנטציה).
    4. שיפור תמונה אופציונלי
      1. שפר את הניגודיות או החסר רקע ב-ImageJ/Fiji אם הגבולות חלשים.
      2. התמקדו בגאומטריית הקצוות, שכן אלה עלולים ליצור גרדיאנטים שגויים שמפורשים כגבולות תאים.
      3. יישם התאמות כאלה באופן עקבי על כל התמונות בתוך מאגר נתונים.
        הערה: יש לשים דגש מיוחד על גאומטריית הקצוות, שכן צללים, הילות או גרדיאנטים לא אחידים ברקע עלולים ליצור מעברי עוצמה מלאכותיים שמודלים של למידת מכונה עלולים לפרש בטעות כגבולות תאים.
  8. StoManager1 (v1.0.0 גרסת GUI)
    הערה: StoManager1 מאפשר זיהוי, מדידה וניתוח אוטומטיים ובעלי תפוקה גבוהה של סטומטות עלי צמחים באמצעות רשתות עצביות קונבולוציונליות (YOLOv8-seg-x). הכלי מכמת מדדים מרכזיים של הפסה (שטח, צפיפות, יחס נקבובית/תאי מגן, מדדי הצטברות וכו') מסוגי תמונות שונים, ומפחית מאמץ ידני והטיה, ומקל על מחקרים אקולוגיים ופיזיולוגיים רחבי היקף. קיימת אפליקציית Windows ידידותית למשתמש, שאינה דורשת מיומנויות קידוד למעט עיבוד פוסט-פרוסטינג אופציונלי (קובץ משלים סעיף 1)23.
    1. הרצת StoManager1: התקנה והגדרה
      1. גישה דרך GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) או אפליקציית Windows העצמאית (קובץ משלים סעיף 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)23.
      2. להבטיח גרסאות ספריות תואמות (תלותיות לפייתון); עלולות להתרחש קונפליקטים אם מותקנת תוכנות ML/תמונה אחרות.
    2. הפעל את StoManager1 דרך ממשק גרפי או ממשק שורת פקודה.
    3. בחר את תיקיית הקלט שלך שמכילה תמונות עלים.
    4. בחירת דגם; בדוק את מודל YOLOv8-seg-x למדדים מבוססי סגמנטציה ומפורטים יותר. להשאיר את זה ללא סימון עבור מודל תיבת הגבולות (YOLOv3), עם פחות מדדים.
    5. כיוון פרמטרים; התאם את ספי הזיהוי, רזולוציית התמונה, הרחבת המסכה ומגבלות גודל האובייקט לפי הצורך עבור שיטת ההדמיה/מין שלך. אנא השתמשו בפרמטרים ברירת מחדל, כאשר חלק מהאובייקטים בסטומטה נשארים בלתי מזוהים, בעיקר (1) להוריד את סף האמון בזיהוי כדי לשחזר יותר סטומטות אמיתיות תוך בדיקת זיהוי חיובי שגוי; ו-(2) להגדיל את רזולוציית התמונה, שכן ערך גבוה יותר יכול לשפר את זיהוי הסטומטות הקטנות במחיר של ביקוש חישובי גבוה יותר.
    6. ריצת סגמנטציה:
      1. לחץ על " התחל תהליך" כדי לזהות, לקטע ולמדוד את הסטומטות והסטומטה השלמות.
      2. לחץ על " ניתוח סטטיסטי" כדי לעבד סטטיסטיקה ברמת הקבוצה.
    7. אסוף תוצאות. הפלט נשמר ל-YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (מצב סגמנטציה) או ישירות ל-YOUR_OUTPUT_PATH (מצב קופסה מוגבלת). קבצי CSV מכילים מדדים לכל אובייקט וסיכום; גם מסכות ותמונות תוצאה נוצרות.
    8. השיק עיבוד אצווה.
    9. לאחר סיום העבודה, אספו את הפלט: מסכות סגמנטציה וקבצי תוצאות CSV לכל תמונה. התוצאות בתמונה כוללות: מספר הפטימות ושטח הפיוניה, קוטר פרט (מקסימום/מינימום), מדדי תאי שומר, אינדקסי הצטברות/אחידות/סטייה ויחסי נקבוביות/תאי שומר.
    10. בדוק את התוצרים באמצעות Excel, R או Python לעוד סטטיסטיקות והדמיה.
    11. בקרת איכות; בדוק ויזואלית מסכות ושכבות עליונות. הסר אובייקטים חריגים לפי גודל, צורה או אוצרות ידנית במידת הצורך (ראו להלן).
      הערה: פרוטוקולים מפורטים ושלבים לאחר עיבוד עבור Cellpose ו-ilastik מסופקים בקובץ המשלים. לביצועים מיטביים עם מערכי נתונים גדולים ותמונות מורכבות, אנו ממליצים על מערכת עם מעבד של 8-12 ליבות, לפחות 32GB RAM, וכרטיס גרפי עם NVIDIA CUDA עם זיכרון VRAM של מינימום 24GB. גם תצוגה גדולה ברזולוציה גבוהה (רצוי 4K) מומלצת בחום לצורך הערות והמחשה יעילה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השוואת תוצאות בין פילינג לניקוי

גם T. officinale וגם F. excelsior הראו שונות בתכונות הסטומטלית והאפידרמלית בהתאם לשאלה האם הדגימות נלקחו או נקלפו (איור 4). דגימות שננקו סיפקו בדרך כלל גבולות תאים חדים יותר והמחשה ברורה יותר של צורת תאי השומר ופתח הנקבוביות, אם כי שכבות רקמה חופפות לעיתים הסתירו את הסטומטות הקטנות יותר והערכות גודל מוטות כלפי מעלה. ב-F. excelsior, שטח הפיוניה הממוצע ורוחב הפטילה היו גבוהים משמעותית בדגימות שננקו מאשר בקליפה, בעוד שב-T. officinale לא נצפו הבדלים משמעותיים. צפיפות הסטומטלים הייתה גבוהה משמעותית בדגימות מקולפות של F. excelsior, בעוד שלא זוהה אפקט שיטה ב-T. officinale. שטח תאי האפידרמל לא השתנה בין שיטות בשתי המינים, אך צפיפות תאי האפידרמל הייתה מעט גבוהה יותר בדגימות מקולפות של F. excelsior.

בסך הכול, ההבדלים התלויים בשיטה היו ספציפיים לתכונות ולמין, מה שמרמז כי קילוף מספק אפשרות אמינה למדידות סטומטה, במיוחד כאשר הפיוניות משתנות בגודלן (למשל, בעלים המתפתחים), בעוד שתכונות האפידרמלית כמעט ולא הושפעו (איור 5).

תוצאות בינה מלאכותית ואיך הן מתאימות לשיטות קילוף וניקוי

המודל הספציפי לסטומטה StoManager1 זיהה את הסטומטות באופן אמין יותר בתמונות מקולפות (איור 6), בעוד שהביצועים ירדו משמעותית בדגימות שננקו (איור 7). כדי להעריך עוד את ביצועי StoManager1 בשיטות הכנה, השווינו זיהוי תכונות סטומטלית ב-T. officinale ו-F. excelsior באמצעות פילינג ותמונות מנוקות (איור 8). ב-T. officinale, המודל זיהה באופן אמין נוכחות וצפיפות הסטומטים לאורך שיטות ההכנה. עם זאת, הערכים שהתקבלו היו שונים משמעותית ממדידות ידניות (טבלה 2 ואיורים 5 ו-8). רוב תכונות הסטומטה היו שונות משמעותית (p < 0.05) בין דגימות מקולפות למנוקות (איור 8), מה שמעיד שצינורות זיהוי בינה מלאכותית רגישים מאוד לשיטות הכנה ודורשים אימות זהיר לפני יישום בקנה מידה רחב. לעומת זאת, ב-F. excelsior, הגילוי היה מוגבל למשטח האבקסיאלי עקב היעדר סטומטה אדקסיאלית, ובדגימות שננקו הגילוי היה לא עקבי, עם תוצאות חיוביות שגויות תכופות (איור 8). תוצאות אלו מדגישות את ההשפעה החזקה של תכונות אנטומיות ייחודיות למין ואיכות התמונה על יעילות ניתוחים מבוססי בינה מלאכותית. כלים כלליים ללמידת מכונה כמו Cellpose (איור 9A) ו-Ilastik (איור 9B) חילקו תאים אפידרמליים בצורה יעילה יותר בתמונות מקולפות מאשר בתמונות שננקו. עם זאת, שני הכלים הפיקו תוצאות חיוביות שגויות רבות בשתי שיטות ההכנה (קילוף וניקוי), במיוחד בתנאי ניגודיות נמוכה או כאשר קווי המתאר של התאים היו מטושטשים. במקרים כאלה, קווי המתאר הלא ברורים של הסטומטל או האפידרמל חולקו לעיתים קרובות למספר עצמים זעירים שסווגו בטעות כתאים אפידרמליים בודדים (ראו איור 10). כתוצאה מכך, עיבוד לאחר הבדיקה הוא חיוני, לא רק הסרת חריגים אלא גם סינון על ידי קוונטילים עליונים, כדי לשמור על תאים מזוהים באופן אמין.

איור 1
איור 1: קילופים של עלי F. carica לפני ואחרי הסרת טריכומות באמצעות להב גילוח. טריכומים גדולים יכולים להשאיר סימנים על הקליפה, וליצור כיסי אוויר שיוצרים משטחים לא אחידים ומקשים על מיקוד עקבי (נראים כנקודות אפורות גדולות). F. carica נכללה כחריג כדי להרחיב את הפרוטוקול לעלים שעירים. (א) בהגדלה של 200x, התמונה לפני הסרת הטריכום מוסתרת חלקית על ידי הטביעות של הטריכומים. (ב) איכות התמונה משתפרת לאחר הסרת הטריכומים. (ג) בתמונה בהגדלה של פי 400 לפני הסרת הטריכום נחסמת ברובה על ידי טביעות טריכומים. (ד) החסימה בתמונה מינימלית לאחר הסרת טריכום עם להב גילוח. פסי קנה מידה 100 מיקרון (A, B) ו-50 מיקרון (C, D). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2
איור 2: שלבים עוקבים בפרוטוקול הניקוי. תמונות מייצגות של T. officinale, F. excelsior ו-F. carica ממחישות שלבים עוקבים של פרוטוקול הניקוי. (A-C) עלים טריים. (D-F) עוזב אחרי שסיים עם NaOH. (G-I) עוזב אחרי הלבנה עם NaClO. (J-L) עלים לאחר צביעה בטולואידין כחול O. עזר ויזואלי זה מציג את מראה המדגם הצפוי לפני המעבר לשלב הבא ומדגיש את השונות בפרוטוקול בין המינים. F. carica נכללה כמין יוצא דופן כדי להוכיח יישום פרוטוקולי במגוון רחב יותר של מורפולוגיות עלים ועורקים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: דוגמאות למדידות של תכונות פטליות ואפידרמליות. תכונות שנמדדו מוצגות בתמונה כך: As = שטח סטומטה; Ls = אורך הסטומטה; Ws = רוחב הסטומטה; Ae = אזור תא אפידרמלי. צפיפות הסטומטל וצפיפות התאים האפידרמליים חושבו בתוך האזור המסומן, כפי שמתואר בפרוטוקול. תמונה בהגדלה של 400x. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4
איור 4: השוואת תמונות שהתקבלו עם פרוטוקול ניקוי ופרוטוקול קילוף. תמונות מייצגות של T. officinale ו-F. excelsior המשוות בין תמונות ניקוי ופילינג סטומטה המראות את הראות והשונות של גודל וצפיפות תאי הפומטה והאפידרמיס. קנה מידה 50 מיקרון, והתמונות מצולמות בהגדלה של פי 400. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5
איור 5: הבדלים בתוצאות מדידת תכונה ידנית בין פרוטוקול ניקוי לפרוטוקול קילוף. תרשימי קופסה המראים הבדלים בתכונות הפיוניות והאפידרמליות בין שיטות ניקוי לפילינג אפידרמלי ב-T. officinale ו-F. excelsior. (A) שטח הפסה הממוצע (B) רוחב הפסה הממוצע (C) צפיפות הפסה (D) שטח תא אפידרמלי ממוצע, ו-(E) צפיפות תאים אפידרמליים. כוכבי מציינים רמות של מובהקות סטטיסטית (P < 0.05; *P < 0.01; **P < 0.001). המשמעות הסטטיסטית הוערכה באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן הפוסט-הוק HSD של טוקי. גודל מדגם לקבוצה: n = 3-5. קיצורים: As = שטח הפיוניה; Ws = רוחב הסטומטה; SD = צפיפות פטלית; Ae = אזור תא האפידרמלי; ECD = צפיפות תאים אפידרמליים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6
איור 6: דוגמה לתוצאות סגמנטציה באמצעות מודל זיהוי סטומטה על דגימת פילינג. תוצאת סגמנטציה של StoManager1 עבור דגימה מקולפת של T. officinale (הצד התחתון של עלה בוגר חשוף בצל), המראה דיוק זיהוי טוב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7
איור 7: דוגמה לתוצאת סגמנטציה באמצעות מודל זיהוי סטומטה על דגימה שננקה. תוצאת סגמנטציה של StoManager1 עבור דגימה מנוקה של T. officinale (הצד התחתון של עלה בוגר חשוף בצל), שמראה דיוק זיהוי מופחת בהשוואה לדגימות מקולפות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 8
איור 8: הבדלים בתוצאות מדידת תכונות בסיוע בינה מלאכותית בין פרוטוקול ניקוי לפרוטוקול קילוף. תרשימי קופסה המציגים מדידות שמקורן בבינה מלאכותית של תכונות אנטומיות סטומטלית מתמונות שעובדו על ידי StoManager1 ב-T. officinale ו-F. excelsior. התכונות כוללות שטח הפיוניה (As), רוחב הסטומטה (Ws), אורך הסטומטה (Ls) וצפיפות הסטומטה (Ds). היחידות הן כפי שמופיע באיור 5. המשמעות הסטטיסטית הוערכה באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן הפוסט-הוק HSD של טוקי. כוכבי מציינים רמות של מובהקות סטטיסטית (P < 0.05; *P < 0.01; **P < 0.001). גודל מדגם לקבוצה: n = 3-5. קיצורים: As = שטח הפיוניה; Ws = רוחב הסטומטה; Ls = אורך הסטומטה; Ds = צפיפות פטלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 9
איור 9: צילומי מסך המציגים סגמנטציה עם כלי למידה עמוקה כללי ומסווג מבוסס פיקסלים. סגמנטציות דגימת F. excelsior (משטח עלים אבקסיאלי) עם (A) כלי למידה עמוקה כללי (Cellpose (cyto2)), ו-(B) מסווג מבוסס פיקסלים (ilastik). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 10
איור 10: מסכת סגמנטציה אילסטית לדגימה מקולפת של F. excelsior (הצד האבסאלי של עלה), המראה תוצאות חיוביות שגואות רבות. נקודות זעירות מסווגות בטעות כתאים אפידרמליים נפרדים. במהלך העיבוד לאחר הטיפול, נדרש בדיקה ידנית (ויזואלית) כדי לקבוע סף גודל כדי לסנן חיוביים שגויים בצורה יעילה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פתרוןהכנההכרך האחרון
בסיס לבופר 17.12 גרם (Na2HPO4 *2H2O) ב-200 מ"ל מרחק. H2O200 מ"ל
בסיס למאגר 27.12 גרם Na2HPO4 *2H2O) ב-200 מ"ל של מרחק. H2O200 מ"ל
בופר פוספטמערבבים 36 מ"ל של בסיס 1, 14 מ"ל של בסיס 2 + 50 מ"ל של דיסט. H2O100 מ"ל
פתרון קיבועמערבבים 9.25 מ"ל של 5% גלוטראלדהיד עם 12.5 מ"ל בופר פוספט ו-28.25 מ"ל דיסט. H2O50 מ"ל

טבלה 1: מתכון לפתרון קיבוע24. הרכב הפתרונות ששימשו במחקר זה.

מיניםצדשיטהאיש (אס)בינה מלאכותית (AS)גבר (Ws)בינה מלאכותית (Ws)גבר (L)בינה מלאכותית (Ls)
פרקסינוסאבקסיאליפילינג177.439.3212.712.8517.583.58
טראקסאקוםאבקסיאלינקי408.0918.8420.14.1926.145.39
טראקסאקוםאבקסיאליפילינג262.5413.9315.183.4722.24.68
טראקסאקוםאדקסיאלינקי414.4814.9120.113.4426.095.71
טראקסאקוםאדקסיאליפילינג258.7211.3715.723.321.154.08

טבלה 2: השוואות אינדיקטיביות על מדידות ידניות ובינה מלאכותית. ML (StoManager1) עם תוצאות בקנה מידה. האדם והבינה המלאכותית מציגים, בהתאם, תוצאות ידניות ובינה מלאכותית (StoManager1). היחידות הן כפי שמופיע באיור 5. מדידות ידניות ומדידות בינה מלאכותית שונות באופן משמעותי. חלק מההשוואות אינן זמינות מסיבות שונות, כולל סטומטות חסרות (למשל, F. excelsior אדקסיאל) או גילוי כושל (למשל, סטומטות היו קשות יותר לזיהוי בדגימות שננקו עקב קווי מתאר תאים מטושטשים יותר).

איור משלים 1: דוגמאות לטעויות נפוצות שמתרחשות במהלך ניקוי העלים שמשפיעות על התוצאות. התמונות מוצגות לצורכי פתרון תקלות: (א) צביעה לא אחידה עקב הידרציה לא מלאה של הדגימה במהלך סעיף 3.10; (ב) נזק מכני הנגרם מטיפול לקוי בדגימה שעובדה כימית ושברירית מאוד; (ג) גוון ירוק במרכז הדגימה עקב הסרה לא מלאה של כלורופיל במהלך סעיף 3.5. אנא לחצו כאן להורדת הדמות הזו.

איור משלים 2: דוגמה לממשק משתמש StoManager1. צילום מסך של ממשק המשתמש StoManager1 המציג את הגדרת הקלט וטבלת התוצאות (משמאל), ותצוגות מיקרוגרף עם תמונות מקוריות (מימין למעלה) ושכבת זיהוי סטומטלית (מימין תחתון, משטח אדקסאלי של דגימת T. officinale מקולפת). אנא לחצו כאן להורדת הדמות הזו.

איור משלים 3: דוגמה לממשק משתמש של Cellpose. צילום מסך של סגמנטציה של Cellpose בתהליך באמצעות הממשק הגרפי עם פרמטרים מתכווננים (למשל, בחירת מודל - מודל cyto2 מאומן מראש מומלץ או מודל מותאם אישית, ספים וכיול קוטר התא). אנוטציה ידנית מפוקחת של תאי האפידרמל מדגישה כל תא בצבע ייחודי כדי להנחות את כיול המודלים. שכבת הכיסוי מראה סגמנטציה של פילינג אפידרמלי בצורת F. excelsior abaxial. אנא לחצו כאן להורדת הדמות הזו.

איור משלים 4: תהליך סגמנטציה אילסטית. שכבה ממחישה סיווג מבוסס פיקסלים על תמונת פילינג אפידרמלית אבקסיאלית של F. excelsior . (א) צילום מסך של סגמנטציה אילסטית בתהליך המראה אימון מפוקח עם מחלקות מסומנות ידנית: תאי אפידרמל (צהוב), קווי מתאר תאים (כחול), ורקע לא אפידרמלי כמו טריכומות (אדום). (B) צילום מסך המציג רק את מחלקת האפידרמיס (צהוב), הממחיש כיצד המסווג מבודד תאים אפידרמליים בודדים. שימו לב לנוכחות של מספר זיהויים "זעירים" חיוביים שגויים, במיוחד באזורים עם ניגודיות נמוכה או תאורה לא אחידה. (ג) צילום מסך המראה רק את מחלקת הקונטור (כחול), הממחיש כיצד המסווג מבודד גבולות תאים מרקמת האפידרמלית הסובבת. יש לשים לב שחלק מהקווים הם לא רציפים וכי מתרחשות מספר זיהויים חיוביים שגויים "זעירים", במיוחד באזורים עם קונטרסט נמוך או תאורה לא אחידה. (ד) צילום מסך שמראה את כיתת הרקע. המסכה מדגישה קומפלקסים סטומטליים, טריכומות בלוטות ופסולת מגוונת (אדום), תוך הדרת גופי תאי האפידרמל. זיהויים קטנים וחיוביים "זעירים" רבים נראים באזורים אפידרמליים, הנובעים מארכיפקטים בגווני אפור וסיווג שגוי מבוסס מרקם. אנא לחצו כאן להורדת הדמות הזו.

איור משלים 5: הגדרות אימון ל-Cellpos. דוגמה להגדרות אימון Cellpose (GUI) לדגימת T. officinale שננקתה (שני משטחי העלה), המציגה פרמטרים ברירת מחדל של המודל לפני ההתאמה. נבחר מודל cyto2 מאומן מראש, עם קצב למידה של 0.1 ו-100 תקופות אימון (ערכי ברירת מחדל), שקובעים את מהירות העדכון של משקלי המודל ואת מספר מעברי האימון, בהתאמה. ברירת המחדל הזו משתנה לעיתים קרובות (למשל, קצב למידה = 0.15; אפוקים = 12) כדי לקצר את זמן האימון ולהתאים את המודל למורפולוגיית האפידרמלית של הצמח; עם זאת, מספרים נמוכים יותר בתקופה עשויים להפחית את ביצועי הגילוי ולהגדיל את תוצאות החיוביות השגויות. אנא לחצו כאן להורדת הדמות הזו.

איור משלים 6: מסכת "תוויות" בתא. החלת מסכת "תוויות" של Cellpose עבור דגימת F. excelsior מקולפת (משטח עלה אבקסיאלי), המציגה את תוצאת האימון המפוקח שבו לכל אובייקט מחולק מוקצה מזהה ייחודי. תאי האפידרמל (מסומנים e) שולטים, בעוד זוגות תאי שמירה על הפומטה (מסומנים g) גם הם מתגלים. תוצאות חיוביות שגויות ניכרות כאשר טריכומות מסווגות בטעות כתאי אפידרמל (משמאל עליון) או סטומטה (מרכז תחתון), וכן שליליות שגויות שבהן תאי האפידרם נשארים ללא תוויות בחלקים מהתמונה. סוג מסכה זה משמש לכימות ושיפור מודלים מפוקחים במורד הזרם. אנא לחצו כאן להורדת הדמות הזו.

איור משלים 7: כימות של תאי אפידרמה מקוטעים ב-ImageJ/Fiji. צילומי מסך המציגים כימות תאי אפידרמלי מקוטעים לאחר סיווג פיקסלים אילסטיים עבור דגימת F. excelsior מקולפת (משטח עלה אבאקסילי). (A) במסכה המיוצאת, כל אשכול פיקסלים מזוהה מתאים לחלקיק בודד, מה שמאפשר חילוץ אוטומטי של מדדים ברמת האובייקט (למשל, שטח, היקף, קוטר פרט). חלון התוצאות (למטה) מציג מדידות גולמיות לאלפי אובייקטים; שימו לב למספר יוצא הדופן של חלקיקים קטנים הנובעים מרעש נקודות "זעיר" וקווי מתאר מקוטעים, המצביעים על נוכחות של חיובים שגויים רבים. ארטיפקטים אלו דורשים סינון ביולוגי נוסף כדי לבודד תאי אפידרמל אמיתיים לפני ניתוח סטטיסטי במורד הזרם. (B) סינון מבוסס אזור של אובייקטים אפידרמליים מקוטעים אילסטיים ב-ImageJ/Fiji. מקטעים קטנים ורעש מודרים על ידי יישום סף שטח מינימלי של 150-350 מיקרומ², מה שמפחית את מספר החלקיקים שזוהו בערך בסדר גודל (פי עשרה) ביחס למסכה הלא מסוננת בלוח A. למרות ששלב הסינון הזה מסיר באופן משמעותי חיוביים שגויים זעירים, סיווג לא מושלם נשאר: קווי המתאר המקוטעים ואלמנטים שאינם אפידרמליים נשארים ודורשים שיפור נוסף, כגון ספי מעגליות או סינון ביולוגי לאחר סינון. אנא לחצו כאן להורדת הדמות הזו.

איור משלים 8: עיבוד לאחר מסכת "תוויות" של Cellpose ב-ImageJ/Fiji. באמצעות תוסף Labels to ROIs עבור דגימת F . excelsior מקולפת (משטח עלה אבקסיאלי), כל אובייקט מחולק במסכה מומר לאזור עניין (ROI), מה שמאפשר בדיקה ומדידה אישית של תאי אפידרמל וקומפלקסים של תאי שומר סטומטה. ROI מונחים על המיקרוגרף המקורי (משמאל), בעוד שחלון התוצאות (למטה מימין) מציג מדדים ברמת תא (למשל, שטח, קוטר פרט, היקף). שלב זה מאפשר אוצרות ביולוגית מושכלת, ומאפשר למשתמשים לוודא האם כל ROI מתאים לתא אפידרמלי אמיתי ולהשליך ארטיפקטים כמו טריכומות או סטומטות שאינן מחולקות שנוצרו לאחר סינון סף, ובכך ליידע את שלבי הניתוח הבאים. אנא לחצו כאן להורדת הדמות הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לצורך מדידות עקביות בסטומטה, יש לקחת קליפות מהלמינה המרכזית לקבלת תוצאות סטנדרטיות, תוך הימנעות מהורידים עיקריים, שכן צפיפות הסטומטה מראה שונות חזקה בתוך העלה, היורדת לקראת בסיס העלה, הקצה והשוליים25,26. עלים טריים מניבים את הקליפות האמינות ביותר, בתנאי שמשתמשים בלק ציפורניים שקוף ובלתי מתכווץ וסרט דבק שקוף איכותי כדי למנוע עיוותים או ארטיפקטים. עיכובים מעבר ל~12 שעות מפחיתים את בהירות הקונטור בעקבות התייבשות. מכיוון שהפילינגים מותקנים זמנית ועלולים ללכוד אוויר, מומלץ להדמיה מוקדמת, אך האיכות נשארת מקובלת גם לאחר חודש.

קיימות שיטות ניקוי שונות לסוגי רקמות ספציפיים, מטרות הדמיה ושיקולי בטיחות 13,14,15. ניקוי כימי בוצע באמצעות פרוטוקול מימי מבוסס NaOH בשל נגישותו, רעילות נמוכה ויישום רחב על סוגי עלים. מכיוון שתגובות הרקמות משתנות בין מינים, נדרשים בדיקות ואופטימיזציה. עלים סקלרופיליים עשויים לדרוש ≥2 שבועות, ורקמה ירוקה שנותרה עלולה להפריע לצביעה ולהסתיר תכונות אנטומיות (איור משלים 1C). לניקוי מהיר יותר, ניתן להעלות את ריכוז NaOH ל-2.5 מ' או 5 מ'. עלים רכים הופכים לשבריריים לאחר ההלבנה (סעיף 3.7; איור משלים 1B), וחשיפה מופרזת להיפוכלוריט נתרן (NaClO) עלולה לפרק רקמות או לגרום להיפרדות שכבת האפידרמה. בעוד ש-30 עד 2 דקות של הלבנה מספיקות לרוב העלים הרכים, מינים קשיחים עשויים לדרוש עד שעהו-27 דקות. למרות שהניקוי איטי יותר מההכנת הקליפה, דורש ~5 ימים וללא אימון מיוחד, ניתן להתאים אותו למינים מגוונים. דגימות מנוקות ומוכתמות יכולות להיאחסן במים מזוקקים בטמפרטורה של 4°C, עם המלצה להתקנה קבועה לשימור ארוךטווח 15,27.

StoManager1 הספציפי לסטומטה זיהה באופן אמין קומפלקסים סטומטליים ברוב סוגי התמונות (איור משלים 2), כאשר תוצאות הגילוי בדרך כלל תואמות להערות ידניות בשיטות מבוססות פילינג. עם זאת, מדידות שטח הפיוניות היו שונות באופן שיטתי ממדידות ידניות (טבלה 2), מה שדרש כיול על בסיס תת-קבוצה קטנה שנמדדה ידנית (למשל, 10-20 פומטות לכל מין) לפני ניתוח בקנה מידה גדול. StoManager1 מגביר משמעותית את קצב התפוקה, כאשר נדרש אימות ידני במקרים לא סטנדרטיים.

סגמנטציה סימולטנית בין פטיחות לאפידרמיס היא אתגר משום שחדות אופטימלית שונה, והטרוגניות במורפולוגיה ובבהירות הממברנה מביאה לשגיאות סגמנטציה. אותו האופן אימון על סט תמונות גדול (למשל, משטחים אדקסיליים/אבאקסיליים, קלופים/נקיים) מאבדים ספציפיות. אין מודל Cellpose מאומן מראש לאפידרמיס הצמח; המודלים הסטנדרטיים "cyto" ו-"cyto2", שמאומנים בעיקר על תאי בעלי חיים, מתפקדים פחות טוב בתמונות אפידרמליות. לכן נדרש הכשרה מותאמת אישית לאמינות (סעיף משלים 2). גם לאחר האימון, סגמנטציה יתר ותוצאות חיוביות שגויות עדיין נפוצות, במיוחד בתמונות עם קונטרסט נמוך או לא נקיות (איור משלים 3).

ב-ilastik (סעיף משלים 3, איור משלים 4), יש ליצור מסכות אובייקט עבור מחלקות התאים היעד (למשל, מחלקה 1 עבור אפידרמיס), תוך שמירה על מסכות מחלקה לביקורת ותיקון ידני. עיבוד אצווה ותהליכי עבודה של ImageJ/Fiji יכולים לחסוך זמן ולהפחית שגיאות ידניות. סינון עקבי לפי שטח, סטיית תקן או קוונטילים הוא חיוני לדיכוי רעש וזיהוי שגוי. לאחר הסינון, שטח התא החציוני וספירת התאים מתקרבים לערכים ידניים. הבנצ'מרקינג מול מדידות ידניות וכלים חלופיים ללמידת מכונה (Weka, RootPainter) נשאר חיוני לכיוון פרמטרים ולהערכת איכות הסגמנטציה. עיבוד אצווה ב-ML דורש משאבים. אימון יציב וחלוקת אצווה בקנה מידה גדול דורשים כרטיס מסך תואם NVIDIA CUDA ו-≥32GB RAM. במערכות בינוניות (למשל, 16GB RAM עם גרפיקה משולבת), אימון מפוקח בדרך כלל דורש ~5-10 דקות עבור <10 תמונות ולעיתים קרובות קרס כאשר נעשה שימוש במספר מחלקות הערות או סוגי תמונות הטרוגניים. CUDA הגדילה את מהירות העיבוד פי ~10-20 ביחס לביצוע CPU או GPU משולב.

הבדלים בביצועים בין Cellpose, ilastik ו-StoManager1 נובעים מייצוגי התכונות הייחודיים שלהם. Cellpose חוזה שדות זרימה וקטוריים לכיוון מרכזי האובייקטים ורגיש להילות אופטיות ולגבולות שבירה פתאומיים, שמפריעים לזרימה ויוצרים אשכולות חיוביים שגויים ב-F. excelsior שנוקה מחדש. אילסטיק, כמסווג פיקסלים מונחה על ידי אדם, מחלק מעל דפנות תאים או הילות עם ריסוף גבוה אלא אם כן מסומנים במפורש כרקע. StoManager1 מזהה קומפלקסים של סטומטים באמצעות דפוסי צורה ברמת האובייקט (תאי שמירה מזווגים עם נקבוב מרכזי) ומצליח בהכנות לפילינג, כולל F. excelsior28; עם זאת, טשטוש שנגרם על ידי הילה משפיע על נראות הנקבוביות בניקוי ויוצר תוצאות שליליות שגויות במקום סיווג שגוי (סעיף 1 ו-3 בקובץ המשלים). בהתאם לכך, Cellpose ו-StoManager1 פועלים כסגמנטרים אוטומטיים, בעוד ש-ilastik פועל כמסווג מונחה על ידי אדם (קובץ משליםסעיף 1-3)28,.

ארכיטקטורת תאים ספציפיים למין מסדרת את ביצועי הבינה המלאכותית. ב-T. officinale, שולי תאי שמירה חלקים ואליפטיים תואמים את התפלגות האימון StoManager1, מה שמאפשר זיהוי בדגימות מקולפות (איור משלים 2), בעוד שכלים כלליים לעיתים קרובות בלבלו בין תאי שמירה לתאי אספלט. ב-F. excelsior, סטומטה שקועה ותאי ריצוף בעלי הקלה גבוהה גורמים לשליליים שגויים בתמונות מנוקות. הבדלים אלו משקפים גאומטריית דימות תלויה במין ובהכנה. הבדלים שיטתיים בין מדידות ידניות למדידות שמקורן בבינה מלאכותית נובעים משני מקורות: היעדר קידוד קנה מידה מהתמונה על ידי בינה מלאכותית ופריטיקים אופטיים שנגרמו מהכנה. אסטרטגיות ההפחתה כוללות מיון חזותי של טשטוש והילות כתוצאה מהכנת רקמות, שימוש מועדף בפילינג בתנאים שתוארו לעיל, כיול ידני עם תיקון ליניארי על תת-קבוצה קטנה של סטומטה (ידני = a + b × AI). אסטרטגיות נוספות כוללות הרחבה ספציפית לטקסונים ועיצוב מחלקות עזר לאימון (עם זאת, מודלים מאומנים מראש צפויים להישאר נמוכים יותר מאשר מודלים מאומנים מראש על מערכי נתונים גדולים ומגוונים), וסינון קוונטילים עליונים לאחר סגמנטציה.

מכיוון ששגיאות סגמנטציה של בינה מלאכותית הן שיטתיות ולא אקראיות, עיבוד לאחר התהליך הוא חיוני. אבחון איכות תמונה יכול לעקוב אחרי עץ החלטות פשוט. התחילו בבדיקת ניגודיות וחדות האפידרמל: אם חדות, עברו לתוצאות חיוביות שגויות; אם התמונה מטושטשת, צפה לארטיפקטים קטנים בתדר גבוה ולהתאים פילטרים. אם חיובי שגוי (למשל, נקודות, פסולת) מינימליים, סינון חריג ב-SD ±2-3 בדרך כלל מספיק. אם ארטיפקטים קטנים שולטים, השתמשו בסינון מבוסס קוונטילים. לאחר מכן השווה התפלגויות תכונות (למשל, חציון Ae) לציפיות ביולוגיות או נתונים ידניים. לחדד את הספים לפי הצורך - שמירה על קוונטילים עליונים של 10-50% במאגרי נתונים עשירים בארטיפקטים מבטיחה תוצאות משמעותיות (איורים משלימים 7 ו-8). עקב שיעורי החיוביים השגויים הגבוהים שנוצרים על ידי כלי למידת מכונה אפידרמלית, לא ניתן היה לגזור אוטומטית הערכות צפיפות פטריות אמינות, בעוד ש-StoManager1 סיפק מדידות מדויקות של סטומטה28 כאשר הגבולות היו ברורים (ראו איורים 6 ו-7). עבור החציון האפידרמלי, Ae הוכח כעמיד, והיה פחות רגיש לחיובים שגויים קטנים מהממוצע.

בחירת שיטה השפיעה על זיהוי תכונות. הפילינג התעלה על ניקוי הצפיפות של הפיוניות על ידי חשיפת מלאה של הסטומטות (איור 3), בעוד שניקוי לעיתים קרובות הסתיר פיסות קטנות יותר ברקמות שכבתיות או פיגמנטליות, למרות שלעיתים שמרו טוב יותר על צורת הפיוניה27. מבין כלי הבינה המלאכותית, StoManager1 סיפק בעקביות מדידות פטריות חזקות עם אוצרות מינימליות, במיוחד על תכשירים לפילינג23, והפילינג גם שיפר את מדידות האפידרמל על ידי הגדלת כיסוי התאים והתמונה שזוהו נכון2. הרווחים העתידיים צפויים לנבוע בעיקר ממודלים גדולים, מגוונים טקסונומית, מאומנים מראש לשילוב בצינורות דימות אוטומטיים לאקופיזיולוגיה ושיפור גידולים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בתוכנית H2020 של האיחוד האירופי (פרויקט GAIN4CROPS, GA מס' 862087). מרכז המצוינות AgrocroCrop Agroecology עתידי וגידולים חדשים באקלים עתידי (משרד החינוך והמחקר האסטוני), המועצה למחקר אסטוניה (PRG 3201 ו-PRG 2207 ו-TARISTU24-TK28).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומר ניקוי נוזלי חיטוי NaClO & lt 5%דומסטוס, בריטניהH000023244  כוויות עור  
די-נתרן מימן פוספט דיהידרט (Na2HPO4. 2H2O) פנטה, CZ10028-24-7NA
אתנול, abs. 100% a.r.כימיה-לאב NV, BECL00.0505.1000  דליק מאוד 
בקבוקון זכוכית 2 מ"למדעי החיים של VWR, ארה"ב548-0045
תמיסת גלוטראלדהיד 50%מדעי החיים של VWR, ארה"ב23H2856331קטלני אם נשאף אותו. רעיל אם נבלע.  תלבש כפפות מגן,   בגדים,  משקפיים.
שקופיות מיקרוסקופנורמקס, פיזיותרפיה5470308ANA
שכבת עליונה לטיפוח ציפורניים מתייבשה מהירהBfigure-materials-1K (אינזה), LTLT-02244NA
ניקון אקליפס E600 ו-Nikon DS0Fi1 5 MPחברת ניקון, JPhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600NA
קצות פיפטה ופיפטהתרמו-סיינטיפיק, FIKJ16047NA
להבי פלדה חד-צדדייםכלי אוקספורד51-1625-0182NA
נתרן די-הידרוגן פוספט דיהידרט (NaH2PO4 . 2H2O) טהורפנטה, CZ13472-35-0NA
כדורי נתרן הידרוקסיד (NaOH) טהוריםמרק KGaA, DE1310-73-2כוויות קשות.
סרט נייר מכתבי שקופפורופיס, LV91231NA
טולואידין כחול, דרגה כלליתתרמופישר סיינטיפיק, בריטניה2045836NA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lawson, T., Blatt, M. R. Stomatal size, speed, and responsiveness impact on photosynthesis and water use efficiency. Plant Physiol. 164 (4), 1556-1570 (2014).
  2. Smith, E. N., et al. Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives. Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).
  3. Flexas, J., et al. What can we learn from the ecophysiology of plants inhabiting extreme environments? from "sherplants" to "shercrops.". J Exp Botany. 76 (17), 4831-4848 (2025).
  4. Wu, S., Zhao, B. Using clear nail polish to make Arabidopsis epidermal impressions for measuring the change of stomatal aperture size in immune response. Plant Pattern Recognit Recept.: Methods Protoc. 1578, 243-248 (2017).
  5. Kübarsepp, L., Laanisto, L., Niinemets, Ü, Talts, E., Tosens, T. Are stomata in ferns and allies sluggish? Stomatal responses to CO, humidity and light and their scaling with size and density. New Phytol. 225 (1), 183-195 (2020).
  6. Pathoumthong, P., Zhang, Z., Roy, S. J., El Habti, A. Rapid non-destructive method to phenotype stomatal traits. Plant Methods. 19 (1), 36(2023).
  7. Warner, C. A., Biedrzycki, M. L., Jacobs, S. S., Wisser, R. J., Caplan, J. L., Sherrier, D. J. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiol. 166 (4), 1684-1687 (2014).
  8. Petruzzellis, F., et al. Plasticity of functional traits of tree of heaven is higher in exotic than in native habitats. Trees. 33 (2), 411-420 (2019).
  9. Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Sato, Y., Higashiyama, T. Optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging. J Vis Exp. (179), e63428(2022).
  10. Hériché, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: advances and promising clearing practices. Trends Plant Sci. 27 (6), 601-615 (2022).
  11. Ensikat, H. J., Malekhosseini, M., Rust, J., Weigend, M. Visualisation of calcium oxalate crystal macropatterns in plant leaves using an improved fast preparation method. J Microsc. 290 (3), 168-177 (2023).
  12. Li, Y. M., Fei, T., Zhang, H. X., Xie, Z. S., Li, B. Observation of the development of leaf vein and stomata and identification of candidate transcription factors related to vein/stoma development in grapevine leaf (Vitis vinifera L.). Sci Hortic. 307, 111-518 (2023).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  15. García-Gutiérrez, E., Ortega-Escalona, F., Angeles, G. A novel, rapid technique for clearing leaf tissues. Appl Plant Sci. 8 (9), e11391(2020).
  16. Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytol. 238 (2), 904-915 (2023).
  17. Liu, C., Sack, L., Li, Y., Zhang, J., Yu, K., Zhang, Q., He, N., Yu, G. Relationships of stomatal morphology to the environment across plant communities. Nat Commun. 14, 42136(2023).
  18. Lawson, T., Vialet-Chabrand, S. Speedy stomata, photosynthesis and plant water use efficiency. New Phytolt. 221 (1), 93-98 (2019).
  19. Stein, R. A., Sheldon, N. D., Smith, S. Y. comparing methodologies for stomatal analyses in the context of elevated modern CO2. Life. 14 (1), 78(2024).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2025).
  22. Gibbs, J. A., Burgess, A. J. Application of deep learning for the analysis of stomata: a review of current methods and future directions. J Exp Bot. 75 (21), 6704-6718 (2024).
  23. Wang, J., Renninger, H. J., Ma, Q., Jin, S. Measuring stomatal and guard cell metrics for plant physiology and growth using StoManager1. Plant Physiol. 195 (1), 378-394 (2024).
  24. Rikisahedew, J. J., Niinemets, Ü, Scodeller, R., Tosens, T. Assessing structural traits in Triticum aestivum and Zea mays for C and C photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections. J Vis Exp. (209), e66843(2024).
  25. Poole, I., Weyers, J. D. B., Lawson, T., Raven, J. A. Variations in stomatal density and index: implications for palaeo climatic reconstructions. Plant Cell Environ. 19 (6), 705-712 (1996).
  26. Smith, S., Weyers, J. D. B., Berry, W. G. Variation in stomatal characteristics over the lower surface of Commelina communis leaves. Plant Cell Environ. 12 (6), 653-659 (1989).
  27. Niewiadomski, I., et al. A comprehensive illustrated protocol for clearing, mounting, and imaging leaf venation networks. Appl Plant Sci. 13 (2), (2025).
  28. Wang, J., Renninger, H. J., Ma, Q. Labeled temperate hardwood tree stomatal image datasets from seven taxa of Populus and 17 hardwood species. Sci Data. 11 (1), (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Stomatal TraitsEpidermal PeelsLeaf ClearingAI Image AnalysisStomatal MorphologyCell SegmentationTrait QuantificationDeep Learning ToolsStomatal Detection
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים