הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירה ומניפולציה גנטית של אורגנידים צוואריים אנושיים

731 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69617

⸱

10 במרץ 2026

 ,  ,  , 
1Department of New Biology, DGIST, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University Chilgok Hospital, 3Clinical Omics Institute, Kyungpook National University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University School of Medicine, 5New Biology Research Center, DGIST, 6Graduate Program in Biomedical Science & Engineering, DGIST

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לקביעת ומניפולציה גנטית של אורגנידים צוואריים בצוואר הרחם האנושי.

תקציר

סרטן צוואר הרחם הוא הסרטן הרביעי בשכיחותו בקרב נשים ופוגע בעיקר באקטוצרוויקס הרחם. האקטוסרוויקס הרחם מצופה באפיתל קשקשי שכבתי, הכולל תאי בסיס ותאים פראבאסליים וסופרבאזליים מתמיינים. ההתחדשות שנצפתה לאחר הקוניזציה של צוואר הרחם מרמזת על נוכחות של פעילות תאי גזע חזקה. עם זאת, הבנתנו את זהות ומנגנוני הרגולציה של תאי גזע צוואר הרחם ותהליך הטרנספורמציה הממאיר שלהם מוגבלת בשל הגישה המוגבלת לרקמות צוואר הרחם והיעדר מערכות אופטימליות להערכת פעילות תאי הגזע באקטוצרוויקס הרחם. אורגנואידים צוואריים אנושיים שהוקמו לאחרונה יכולים לסייע בהתגברות על מגבלות אלו ולהציע הזדמנויות חדשות לחקר פיזיולוגיה ופתולוגיה של צוואר הרחם. עם זאת, אין שיטה סטנדרטית לבידוד והקמת אורגנואידים צוואריים אנושיים. כאן אנו מתארים שיטה לקביעת אורגנידים אקטוסרוויים אנושיים. באופן ספציפי, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד תאים בודדים מהאפיתל האקטוצרוקי האנושי. על ידי דגירה של רקמת צוואר הרחם בתמיסת אנזימים אופטימלית, אנו מקלפים את האפיתל הצווארי כדי למקסם את תפוקת התאים תוך מזעור זיהום פיברובלסטים. אנו מפרטים עוד את התנאים לגידול אורגנידים צוואריים אנושיים באמצעות פורמולציה מיטבית. בנוסף, אנו מפרטים את ההליכים להעברת ומניפולציה גנטית של אורגנואידים בצוואר הרחם. פרוטוקול זה מספק גישה יעילה מאוד להקמת אורגנידים צוואריים אנושיים ולשימושם לחקר תאי גזע ומחלות צוואר הרחם.

מבוא

אקטוסרוויקס הרחם הוא האתר הנפוץ ביותר לסרטן צוואר הרחם 1,2. למרות שסרטן צוואר הרחם פוחת לאחר כניסת חיסון נגיף הפפילומה האנושי (HPV) במדינות מפותחות, בעולם הוא עדיין נשאר הסרטן הרביעי בשכיחותו בקרב נשים 3,4. כמו כן, שכיחות נגעים טרום-סרטניים בצוואר הרחם ממשיכה לעלות בכמה מדינות. בעוד שנגע תוך-אפיתל קשקשי בדרגה נמוכה (LSIL) לעיתים נסוג מעצמו, נגע תוך-אפיתל קשקשי בדרגה גבוהה (HSIL) נושא סיכון להתפתחות לסרטן פולשני ודורש בדרך כלל התערבות כירורגית, כגון כריתה או קוניזציה. הליכים אלו יכולים לקצר את האקטוצרוויקס ולהעלות את הסיכון להפלה או ללידה מוקדמת 7,8. הבנה מעמיקה יותר של ביולוגיית צוואר הרחם, יחד עם פיתוח טיפול רגנרטיבי, יכולה לסייע בהתמודדות עם אתגרים אלו, אך דורשת מערכות מודל חזקות ורלוונטיות פיזיולוגית.

מודלים בעלי חיים קידמו משמעותית את ההבנה שלנו לגבי הומאוסטזיס צוואר הרחם, מנגנוני מחלה ואסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, ההבדלים המובנים שלהם מהביולוגיה והפתולוגיה האנושית מגבילים את ערכם התרגומי. כחלופה, אורגנואידים הפכו לפלטפורמות עוצמתיות למידול ביולוגיה ומחלות אנושיות. אורגנואידים הם מיקרו-מבנים תלת-ממדיים שמקורם בתאי גזע, המשחזרים את ההיסטולוגיה והחתימות המולקולריות של רקמת המקורשלהם 9,10,11. הם שימשו לזיהוי תאי גזע מגוונים של רקמות אנושיות ברקמות רבות, כולל קנה הנשימה, הוושט וצוואר הרחם 12,13,14. יתרה מזאת, אורגנואידים מאפשרים מניפולציה גנטית, ומאפשרים מידול של פתוגנזה של מחלות מגוונות, כולל סרטן ופיברוזיס 15,16,17. בנוסף, אורגנואידים משמשים כפלטפורמה יעילה לסינון היעילות והרעילות של תרופות או טיפולים תאיים 18,19,20,21.

לאחרונה, שתי קבוצות עצמאיות הקימו מערכות אורגנואידים צוואריות אנושיות22,23. בהתבסס על ההתקדמות הזו, שיפרנו משמעותית את יעילות תרבית האורגנים הצווארמיים וזיהינו תאי גזע צוואריים אנושיים. יתרה מזאת, על ידי קילוף האפיתל הצווארי, צמצמנו את הכללת הפיברובלסטים שמתחת לאפיתל צוואר הרחם. באמצעות שימוש באורגנידים צוואריים עם מניפולציה גנטית, גילינו את תפקידם של מטבוליטים מיקרוביאליים ומסלוליהם במורד הזרם בשמירה על הומאוסטזיס צוואר הרחם ובמניעת התקדמות טרום-סרטנית. לכן, פרוטוקול סטנדרטי ומותאם ליצירה, תחזוקה ושינוי גנטי של אורגנואידים צוואריים ישמש ככלי חיוני לחקר ביולוגיה ופתולוגיה של צוואר הרחם.

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט ומותאם ליצירת והעברת אורגנידים צוואריים אנושיים. אנו גם מתארים פרוטוקול למניפולציה הגנטית שלהם באמצעות אלקטרופורציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בידוד תאים ותרבות אורגנואידים באמצעות רקמות צוואר הרחם האנושיות אושרו ובוצעו בהתאם לכל התקנות האתיות הרלוונטיות על ידי ועדות הביקורת הפנימיות של DGIST, דאגו, קוריאה ובית החולים הלאומי צ'ילגוק קיונגפוק, גיאונגסאנגבוק-דו, קוריאה (DGIST-20210401-BR-112-01 ו-KNUCH-2020-12-020-001). רקמות אקטוסרוויקליות אנושיות סופקו על ידי המחלקה למיילדות וגינקולוגיה בבית החולים הלאומי צ'ילגוק קיוןפוק. רקמות צוואר הרחם הבריאות הושגו ממטופלים שעברו כריתת רחם לפרוסקופית מלאה בשל מחלות רחם שפירות. התקבלה הסכמה מדעת מכל המטופלים.

1. בידוד תא יחיד מרקמות אקטוסרוויקליות

הערה: פרוטוקול זה מתחיל בדגימת ביופסיה של אקטוסרוויקס אנושי בגודל של כ-5 מ"מ × 5 מ"מ × 5 מ"מ (איור 1).

  1. הניחו את הרקמה שנבדקה בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ ושטפו אותה פעם אחת עם DPBS קר (ללא סידן ומגנזיום) כדי להסיר דם ופסולת.
    הערה: רקמות צוואר הרחם האנושיות הועברו למעבדה תוך 3 שעות לאחר הניתוח ב-Advanced DMEM/F12 קר מאוד ועובדו מיד עם ההגעה.
  2. העבר את הרקמה לצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל תמיסת דיספאז (2.4 U/mL) ודוגר למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין על סיבוב צינור (20 סל"ד).
    הערה: תמיסת הדיספאז (2.4 U/mL) הוכנה טרייה מיד לפני השימוש על ידי המסה של אבקת דיספאז לריכוז העבודה ב-DPBS קרים מאוד.
  3. העבר את הדגימה לצלחת פטרי חדשה בגודל 10 ס"מ. הפרדו בזהירות את שכבת האפיתל הלבנה משאר הרקמה באמצעות מלקחיים.
  4. השתמשו במלקחיים חדים כדי לקלף בעדינות את פני השטח האפיתליאליים כרעיף שלם. העבר מיד את שכבת האפיתל המבודדת לצינור קוני של 50 מ"ל שמוחזק על הקרח.
    הערה: אם האפיתל של פני השטח לא ניתן לקלף בקלות, גרדו את פני השטח עם מלקחיים קהים.
  5. הוסף 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה מבוססת טריפסין רקומביננטית לדגימה הקלופה או המגורדת והעבר את כל התערובת לצינור קוני של 50 מ"ל.
  6. שמור את הרקמה שנותרה מהשלב הקודם בצינור הקוני השני של 50 מ"ל.
  7. דגרו את צינור הקונוס בקוטר 50 מ"ל המכיל אפיתל צווארי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם ערבוב עדין על סיבוב צינור (20 סל"ד).
  8. הוסף 10 מ"ל של בופר חסימה קר טרי (PBS עם 2% סרום עגל בקר (BCS)) לתסיית התא כדי לעצור את התגובה האנזימטית.
  9. צנטריפוגה את הצינור ב-450 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט.
    הערה: אם דם נראה לעין ברקמה המנותקת או שהרקמה נראית דביקה, יש להמשיך בצעד הבא. אחרת, קפוץ לשלב 1.13.
  10. הוסף 1 מ"ל של בופר ליסיס 1X RBC ו-20 מיקרוליטר DNase (מלאי 10 U/μL) לכדור. דגרו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי לפרק תאי דם אדומים ולפרק DNA דביק.
  11. הוסיפו 10 מ"ל של בופר חסימה קר (PBS עם 2% סרום עגל בקר (BCS)) לתליית התא כדי לעצור את התגובה האנזימטית.
  12. צנטריפוגה את הצינור ב-450 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט.
  13. שטפו את כדור התאים עם בופר חסימה קר (PBS עם סרום עגל בקר 2% (BCS)).
  14. צנטריפוגה את הצינור ב-450 × גרם למשך 5 דקות. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט.
  15. החזירו את כדור התא למרחק של 200-500 מיקרוליטר של תרבית אורגנואידים.
  16. סופרים את מספר התאים באמצעות המוציטומטר עם תמיסת טרייפן בלו. התפוקה הצפויה של התאים היא בין 50,000 ל-500,000 תאים לכל דגימת ביופסיה.

2. זריעה וגידול אורגנואידים אקטוסרוויקליים

  1. החזירו 500-2,000 תאים ברי קיימא בנפח סופי של 50 מיקרו-ליטר של תווך תרבית אורגנואיד (הרכב המתואר ברשימת החומרים) בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. השריות של התאים הוערכה על ידי הדרת טרייפן בלו לפני הזרעה.
  2. הוסף 50 מיקרוליטר של מטריצת ממברנה בסיסית (למשל, מטריג'ל) לתליית התא. ערבבו בעדינות על קרח כדי למנוע היווצרות בועות, ושפכו את התערובת של 100 מיקרולטר לתוך פנים של תרבית תאים המונחת בלוח עם 24 בארות. כל ההליכים הכוללים טיפול במטריצת ממברנה בבסיס בוצעו על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע ג'לציה מוקדמת אלא אם צוין אחרת.
  3. דגרו את הפלטה למשך 20-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שתערובת המטריצה-תא של ממברנת הבסיס מתקשה.
  4. לאחר שהתערובת התקשה, הוסיפו 400 מיקרוליטר של תווך תרבית אורגנואיד לבאר שמתחת להכנעה.
  5. תרב את האורגנידים למשך שבוע-שבועיים עד שהם מגיעים לקוטר ממוצע של 150-250 מיקרון (הקוטר המקסימלי הוא כ-500 מיקרון).
    הערה: כאשר האורגנואידים מגיעים לגודל מתאים ומציגים את דפוס הלמלר הקונצנטרי של מיקרו-מבנים דמויי קליפת בצל, שקול לעבור אם צריך.

3. דיסוציאציה אורגנואידית וזריעה מחדש

  1. הוסיפו 1 מ״ל תמיסת דיספאז (2.4 U/mL) מעל הכניסה לתרבות התא והפרדו בעדינות את מטריצת ממברנת הבסיס באמצעות פיפטה.
  2. העבר תערובת מטריצת בסיס דיספאזה לצינור בנפח 15 מ"ל ודגירה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 10 מ"ל של בופר חסימה קר טרי (PBS עם 2% סרום עגל בקר (BCS)) לתסיית התא כדי לעצור את התגובה האנזימטית.
  4. צנטריפוגה את הצינור ב-450 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדור לתלות ב-200 מיקרוליטר של TrypLE Express.
  6. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. הוסיפו 1 מ״ל של בופר חסימה קר (PBS עם 2% סרום עגל בקר (BCS)) ופיפטה בעדינות כדי לנטרל את האנזים.
  8. מסנן את המתלה דרך מסננת תאים בגודל 40 מיקרון כדי לקבל תאים בודדים.
  9. צנטריפוגה את הצינור ב-450 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט.
  10. החזירו את כדור התא למרחק של 200-500 מיקרוליטר של תרבית אורגנואידים.
  11. סופרים את מספר התאים באמצעות המוציטומטר עם תמיסת טרייפן בלו. תפוקת התאים הצפויה היא בין 50,000 ל-500,000 תאים לכל באר של תרבית תאים עם 24 בארות.
  12. לאחר מכן תלויות מחדש 500-2,000 תאים ב-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנואיד (ההרכב המתואר ברשימת החומרים). הוסף 50 מיקרוליטר של מטריצת ממברנה בסיסית לתליית התא. ערבבו בעדינות, הימנעו מהיווצרות בועות, ושפכו את תערובת 100 מיקרול לתוך פנים של תרבות תאים המונחת בלוח עם 24 בארות.
  13. דגרו את הפלטה למשך 20-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שתערובת המטריצה-תא של ממברנת הבסיס מתקשה.
  14. לאחר שהתערובת התקשתה במלואה (בדרך כלל לאחר 20-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס), הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנואיד לבאר שמתחת להכנעה.
  15. מגדלים את האורגנידים למשך 1-2 שבועות במדיום תרבית אורגנואידים (ההרכב המתואר ברשימת החומרים) באמצעות שיטה תלת-ממדית חוץ-תאית משובצת במטריצה. לשמור על תרביות בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ באינקובטור לח. החלף את המדיום כל 2-3 ימים ועקוב אחרי הגדילה עד שהאורגנואידים מגיעים לקוטר ממוצע של 150-250 מיקרון.
  16. העבירו את האורגנידים לסיבוב הבא כאשר הם מגיעים לגודל מתאים והציגו את דפוס הלמלר הקונצנטרי של מיקרו-מבנים דמויי קליפת בצל, במידת הצורך.

4. מניפולציה גנטית של אורגנואידים צוואריים אנושיים באמצעות אלקטרופורציה

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על שימוש ב-Lonza Amaxa 4D-Nucleofector ובערכת P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X (#V4XP-4032).

  1. לאחר הבידוד מתליית תאי צוואר הרחם האנושיים, העבר 100,000-200,000 תאים לכל צינור בנפח 1.5 מ"ל.
  2. צנטריפוגה את הצינורות ב-450 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט.
  3. החזירו את כדור התא ל-20 מיקרוליטר של תערובת תמיסת/תוסף Nucleofector מערכת P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit. התערובת מוכנה על ידי שילוב של 16.4 מיקרוליטר של תמיסת נוקלאופקטור ו-3.6 מיקרוליטר של תוסף לכל צינור.
  4. הוסף 300 ננומטר של siRNA אוליגו בקר או מטרה לכל צינור המכיל את התאים התלויים. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג.
    הערה: נפח האוליגו של siRNA לא צריך לעלות על 2 מיקרו-ליטר לכל צינור.
  5. העבר בזהירות את תערובת הנוקלאופקציה (20 מיקרולטר של תאים שהוחזרו בתערובת תמיסת נוקלאופקטור/תוסף + עד 2 מיקרוליטר siRNA; סה"כ 20-22 מיקרוליטר) לכלי הקובטה האלקטרופורציוניים מתוך ערכת P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X.
  6. טפחו בעדינות על כלי הנוקלאוקובט כדי לוודא שהדגימה מכסה את תחתית הקובט.
  7. סגור את המכסה של כלי הנוקלאוקובט ומניח אותו במחזיק של יחידת נוקלאוופקטור 4D מופעלת על ידי הדלק.
    הערה: ודאו את הכיוון הנכון של כלי הדם הנוקלאוקובט ברטיינר.
  8. התחל את תהליך הגרעין. הגדר את קוד הפולס EA-125 לכל קובטה עם תהליך התא הראשי P4.
  9. לאחר הסיום, הסר בזהירות את כלי הנוקלאוקט מהריטיינר.
  10. דגרו את כלי הנוקלאוקובט בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתייצב.
  11. פתח את מכסה כלי הנוקלאוקובט, הוסף 180 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנואיד מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לכל קובטה, והעבר בעדינות את מתלה התא לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל לתלייה מחדש.
  12. קח נפח של תליית תא המכיל 500-2,000 תאים והחזיר אותו בתווך תרבית אורגנואיד לנפח סופי של 50 מיקרוליטר.
    הערה: אל תזרקו את התאים הנותרים משלב 4.12. הם ישמשו בשלב 4.14.
  13. גידול האורגנידים לפי הפרוטוקול בשיטה 2: זריעה ותרבית אורגנית של אקטוסרוויקס. השווה את השפעות ה-siRNA על ידי הערכת גורמים מגוונים, כולל מספר, גודל ומבנה של האורגנואידים המתקבלים.
  14. יש לחלק את התאים שנותרו משלב 4.12 ללוח חיבור אולטרה-נמוך עם 96 בארות ולדגור במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  15. לאחר 48 שעות, העבר את התאים לצינור של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-450 × גרם למשך 3 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
  16. השתמשו בכדור התא לניסויי PCR בזמן אמת כדי לאשר את הפלת הגנים המטרה ולהעריך שינויים בביטוי הגנים.
    הערה: כל רקמות צוואר הרחם וכל תליית התאים של האדם יש לטפל בהם כחומר שעלול להיות מדבק. לבצע את כל ההליכים הכוללים דגימות אנושיות ראשוניות בארון בטיחות ביולוגית מוסמך לפי נהלי BSL-2 ובהתאם לתקנות אתיות ובטיחות ביולוגית מוסדיות. לבשו ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על עיניים) וחטאו משטחי עבודה וציוד לאחר השימוש בחומר חיטוי מאושר על ידי המוסד. תגובות אנזימטיות (למשל, אנזימי דיספאז ודיסוציאציה כמו TrypLE Express) עלולים לגרום לגירוי בעור ובעיניים וליצור אירוסולים במהלך פיפטינג; הימנעו מיצירת אירוסולים, שמרו על הצינורות סגורים ככל האפשר, ושוטפים מיד במים במקרה של מגע תוך שמירה על נהלי חשיפה מוסדיים והנחיות SDS של היצרן. להשליך את כל הפסולת הביולוגית (כולל חומרים המכילים מטריצה ופלסטיקים מזוהמים) בהתאם להנחיות המוסדיות. לצורך אלקטרופורציה של siRNA, פעלו לפי הוראות הבטיחות החשמלית של היצרן: ודאו שהקובטות יושבות כראוי והמכסה סגור לחלוטין לפני תחילת הפולסים, הימנעו מהפעלת המכשיר עם כפפות רטובות או קרוב לשפיכות, בדקו את המכשיר והאביזרים לאיתור נזקים, והימנעו ממגע ישיר עם אלקטרודות הקובט מיד לאחר הפעם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרבית אורגנית צווארית תלת-ממדית של צוואר הרחם

רקמות אקטוסרוויקליות אנושיות מבודדות טריות פורקו לתאים בודדים בסדר שהוזכר לעיל, אשר צויפו מעל תרבית תאים עם 24 בארות וגודלו ליצירת אורגנידים צוואריים כפי שמפורט בפרוטוקול זה (איור 1). אורגנואידים צוואריים אנושיים גדלים עד קוטר של עד 500 מיקרון מתאים בודדים במשך שבועיים (איור 2A). שיעור ההצלחה ביצירת אורגנואידים הוא מעל 90% (פי 10 מ-11 רקמו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה אנו מתארים את הפרוטוקול להקמת והעברת אורגנואידים צוואריים אנושיים. אנו גם מספקים פרוטוקול למניפולציה גנטית שלהם, שמקדם משמעותית את חקר הביולוגיה והפתולוגיה של צוואר הרחם. למרות שאופטימיזציה של הפרוטוקול במיוחד עבור אורגנואידים צוואריים ברחם האדם, ניתן ליישם את הפרוטוקול על מערכות אורגנואידיות אחרות עם שינויים קלים.

המידע החיוני להקמת ואופטימיזציה של תרבית אורגנואידים כולל הרכב מדיה מפורט ליעילות מקסימלית עם רכיבים מינימליים, וכן פרוטוקול פירוק תא יחיד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

עבודה זו נתמכה במענק ממשרד הבריאות והרווחה (RS-2024-00439434 עבור י. ג'ונג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת P4 Primary Cell 4D-Nucleofector XלונזהV4XP-4032
לוח חיבור אולטרה-נמוך עם 96 בארותSPL39796
מסננת תאים 40 ומיקרו; mSPL93040
צינור קוני 50 מ"ל 500/קופסהקלינאי דיבורSPL50050
צינור קוני 15 מ"לסארסטדט62.554.502
צינור CryoPure 1.8 מ"ל - לבןסארסטדט72.379P
37 & deg; C, 5% CO2  חממהאפנדורף9734IQ905476
הכנסת תרבית תאיםSPL37024
Amaxa 4D-NucleofectorלונזהAAF-1003X
בופר חסימה (2% BCS ב-DPBS)גיבקו / וולג'יןBCS: 26010074; DPBS: LB001-02
אבקת Dispase IIגיבקו17105041
DNAse IאנזינומיקהM059L
מטריג'לקורנינג356231
בופר ליזיס RBCביוססאנגR2015
TrypLE Expressגיבקו12605
בופר שטיפה (HBSS)JBIBL003-1
DMEM/F12 מתקדםגיבקו12634028
תוסף GlutaMAXגיבקו35050-061
פניצילין– סטרפטומיציןביוווסטL0022-100
HEPESגיבקו15630-080
תוספת B27גיבקו17504044
נוגיןPeproTech118214
N-אצטיל-אל-ציסטאיןסיגמאA9165
Y-27632טכנולוגיות STEMCELL72307
FGF2PeproTech100-18B-50UG
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG
A83-01סלקכםS7692 
פורסקוליןסיגמאF6886
ניורגולין 1PeproTech100-03-50UG
NGFPeproTechAF-450-01-100UG
ר-ספונדיןסינוביולוגיה11083-HNAS
HGFפפרוטק100-39H-250ug
FGF10פפרוטק100-26
פטרידיש 35 מ"מ;SPL10035
<מתכון למדיה חזקה>אורגנואיד
<חזק>שם<חזק>חברהמספר קטלוג<חזק>ריכוז
DMEM/F12 מתקדםגיבקו12634028
תוסף GlutaMAXגיבקו35050-0611x
פניצילין– סטרפטומיציןביוווסטL0022-1001x
HEPESגיבקו15630-08010 מ"מ
תוספת B27גיבקו175040441x
בלי ויטמין A
נוגיןPeproTech118214100 ng/ml
N-אצטיל-אל-ציסטאיןסיגמאA91651 mM
Y-27632טכנולוגיות STEMCELL7230710 uM
FGF2PeproTech100-18B-50UG50 ng/ml
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG25 ng/ml
FGF10פפרוטק100-26100 ng/ml
A83-01סלקכםS7692 500 ננומטר
פורסקוליןסיגמאF688610 & mu; M
ניורגולין 1PeproTech100-03-50UG50 ng/ml
NGFPeproTechAF-450-01-100UG20 ng/ml
ר-ספונדיןסינוביולוגיה11083-HNAS100 ng/ml
HGFפפרוטק100-39H-250ug25 ng/ml

מקורות

  1. Singh, D., et al. Global estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2020:a baseline analysis of the WHO Global Cervical Cancer Elimination Initiative. Lancet Glob Health. 11 (2), e197-e206 (2023).
  2. Worldwide cancer data. , World Cancer Research Fund International. https://www.wcrf.org/cancer-trends/worldwide-cancer-data/ (2022).
  3. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
  4. Kwak, K., Hwang, S. S. Predicted cervical cancer prevention: impact of National HPV Vaccination Program on young women in South Korea. Cancer Res Treat. 56 (3), 898-908 (2024).
  5. Kim, J., Lee, D., Son, K. B., Bae, S. The burden of cervical cancer in Korea:a population-based study. Int J Environ Res Public Health. 17 (17), 6308(2020).
  6. Chang, H. K., Seo, S. S., Myong, J. P., Yu, Y. L., Byun, S. W. Incidence and costs of cervical intraepithelial neoplasia in the Korean population. J Gynecol Oncol. 30 (3), e37(2019).
  7. Anwar, A., et al. Pregnancy outcome after electrosurgical cervical cone biopsy using Fischer cone biopsy excisor. J Matern Fetal Neonatal Med. 29 (3), 477-481 (2016).
  8. Pils, S., Eppel, W., Seemann, R., Natter, C., Ott, J. Sequential cervical length screening in pregnancies after loop excision of the transformation zone conisation: a retrospective analysis. BJOG. 121 (4), 457-462 (2014).
  9. Lee, C. J., Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Advanced animal replacement testing strategies using stem cell and organoids. Int J Stem Cells. 18 (2), 107-125 (2025).
  10. Jeong, Y. Methods to identify epithelial stem cells. Organoid. 2, e24(2022).
  11. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  12. Jeong, Y., et al. Identification and genetic manipulation of human and mouse oesophageal stem cells. Gut. 65 (7), 1077-1086 (2016).
  13. Myeong, J., et al. Microbial metabolites control self-renewal and precancerous progression of human cervical stem cells. Nat Commun. 16 (1), 2327(2025).
  14. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  15. Rajkumar, S., et al. Loss of ubiquitin-specific protease 11 mitigates pulmonary fibrosis in human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Int J Stem Cells. 18 (2), 205-213 (2025).
  16. Ko, K. P., et al. Key genetic determinants driving esophageal squamous cell carcinoma initiation and immune evasion. Gastroenterol. 165 (3), 613-628 (2023).
  17. Choi, Y. J., et al. YAP1 regulates esophageal stem cells' self-renewal and differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 726, 150280(2024).
  18. Oh, B., Kim, J., Kim, N., Jeong, Y. Lung cancer organoid system to evaluate the cytotoxicity of natural killer cells. Int J Stem Cells. 18 (1), 99-106 (2025).
  19. Han, K., et al. Synergistic drug combinations for cancer identified in a CRISPR screen for pairwise genetic interactions. Nat Biotechnol. 35 (5), 463-474 (2017).
  20. Jeong, Y., et al. Role of KEAP1/NFE2L2 mutations in the chemotherapeutic response of patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 26 (1), 274-281 (2020).
  21. Zhang, S., et al. Genetically defined, syngeneic organoid platform for developing combination therapies for ovarian cancer. Cancer Discov. 11 (2), 362-383 (2021).
  22. Lohmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
  23. Chumduri, C., et al. Opposing Wnt signals regulate cervical squamocolumnar homeostasis and emergence of metaplasia. Nat Cell Biol. 23 (2), 184-197 (2021).
  24. He, X. C., et al. PTEN-deficient intestinal stem cells initiate intestinal polyposis. Nat Genet. 39 (2), 189-198 (2007).
  25. Wang, S., et al. Pten deletion leads to the expansion of a prostatic stem/progenitor cell subpopulation and tumor initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1480-1485 (2006).
  26. Yanagi, S., et al. Pten controls lung morphogenesis, bronchioalveolar stem cells, and onset of lung adenocarcinomas in mice. J Clin Invest. 117 (10), 2929-2940 (2007).
  27. Jeong, Y., et al. Role of KEAP1/NRF2 and TP53 mutations in lung squamous cell carcinoma development and radiation resistance. Cancer Discov. 7 (1), 86-101 (2017).
  28. Liu, C., et al. Single-cell dissection of cellular and molecular features underlying human cervical squamous cell carcinoma initiation and progression. Sci Adv. 9 (4), eadd8977(2023).
  29. Koster, S., et al. Modelling Chlamydia and HPV co-infection in patient-derived ectocervix organoids reveals distinct cellular reprogramming. Nat Commun. 13 (1), 1030(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אקטו-צוואר רחם אנושיתרבית אורגנואידיםבידוד תאים בודדיםאפיתל קשקשי מרובדאלקטרופורציהפעילות תאי גזעצביעה אימונופלואורסצנטיתסריקת תרופות
יצירה ומניפולציה גנטית של אורגנידים צוואריים אנושיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.