מאמר שיטה

בדיקת הרג סדרתי באמצעות מדידת עמידות תאי גידול מבוססת התנגדות לאורך זמן - שיטה שימושית להערכת ביצועי תאי T

DOI:

10.3791/69623

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, LMU University Hospital, 2Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, LMU University Hospital, 3German Cancer Consortium (DKTK), Partner Site Munich, a partnership between the DKFZ and the University Hospital of the LMU, 4German Center for Lung Research (DZL), 5Einheit für Klinische Pharmakologie (EKLiP), Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health Neuherberg

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג מבחן בזמן אמת מבוסס התנגדות לכימות את יכולת ההרג הסדרתי וההתמדה של תאי CAR T תחת גירוי אנטיגן כרוני, תוך שילוב שיטת שטיפת לוחות לשימוש חוזר חסכוני בלוחות הבדיקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בתאי קולטני אנטיגן כימרי (CAR) חולל מהפכה בטיפול במלמאירויות המטולוגיות ספציפיות. עם זאת, חלק משמעותי מהמטופלים חווים הישנות עקב אובדן אנטיגן, ירידה באנטיגן או תשישות תאי T. אתגרים אלו מדגישים את הצורך בבדיקות פונקציונליות שיכולות להעריך את יכולת ההרג וההתמדה של תאי CAR T תחת גירוי אנטיגן כרוני. בדיקות הרג סדרתי, שמודדות את יכולת תאי CAR T לחסל שוב ושוב מטרות גידול, מספקות תובנות חשובות לגבי העמידות והעוצמה של תגובות תאי CAR T.

כאן, אנו מציגים בדיקה מבוססת התנגדות באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA) לכימות רצח סדרתי בתאי CAR T במבחנה. תאי הגידול עוברים זריעה חוזרת ומורשים להיצמד ללוחות E ספציפיים לבדיקה לפני הוספת תאי CAR T ביחס אפקטור למטרה (E:T) מוגדרים. הפלטפורמה עוקבת באופן רציף אחר חיוניות תאי הגידול ללא תוויות, ולוכדת ציטוטוקסיות דינמית ברזולוציה זמנית גבוהה. הקריאות המרכזיות כוללות קינטיקה של מדד התאים (CI), קצב השמדת תאי הגידול, וזמן הפינוי למטרה. הירידה ההדרגתית ביכולת ההרג שנצפתה לאחר פגיעות חוזרות במטרה של גידול משמשת כסימן לתפקוד לקוי של תאי CAR T נרכשים, המכונה לעיתים תשישות תאי T. יחד, מדדים אלו מאפשרים הערכה מדויקת של תפקוד תאי CAR T ביחסי E:T שונים ומאפשרים השוואה ישירה בין מבנים או טיפולים משותפים שונים של תאי CAR T לאורך זמן.

כדי לשפר את היעילות בעלויות, פיתחנו הליך שטיפת לוחות שמאפשר שימוש חוזר בלוחות E של הבדיקה מבלי לפגוע בביצועי הבדיקה או בשלמות הנתונים. זרימת העבודה האופטימלית מפחיתה את עלות הבדיקה תוך שמירה על עמידות אנליטית. גישה זו מאפשרת הערכה פרה-קלינית משתלמת וניתנת להרחבה של תפקוד תאי CAR T, ומקלה על שיפורים בעיצוב טיפול בתאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בתאי T מסוג קולטני אנטיגן כימרי (CAR) חולל מהפכה באימונותרפיה בסרטן עם הצלחה קלינית מרשימה במגוון ממאירות המטולוגית כגון לוקמיה לימפואידית כרונית, לוקמיה לימפובלסטית חריפה, לימפומה גדולה מסוג B ומיאלומה נפוצה 1,2,3,4,5. מאז האישורים הרגולטוריים הראשונים, מספר מוצרי תאי CAR T והמטופלים שטופלו גדל בהתמדהב-6. בהתאם למוצר הספציפי ולאינדיקציה הקלינית, מינוני עירוי טיפוסיים נעים בין כ-2 × 106ל-5 × 108תאי CAR+ T לכל מטופל7. מינוני עירוי גבוהים נדרשים להשגת ניקוי יעיל של גידול ושליטה ארוכת טווח במחלה, אך הם קשורים לאתגרים קליניים ומעשיים. מספר תאים גדול עלול להעלות את הסיכון לתופעות לוואי חמורות כמו תסמונת שחרור הציטוקינים (CRS) ותסמונת הנוירוטוקסיות הקשורה לתאי אפקטור חיסון (ICANS), שתיהן יכולות להיות תלויות במינון8. בנוסף, ייצור מספיק של תאי CAR T פונקציונליים הוא אתגר עבור מטופלים מטופלים מטופלים מוקדמים או עם לימפודדות כבדה, והתהליך עלול להיות תובעני לוגיסטית ויקר למרכזי טיפול9.

למרות אתגרים אלו, טיפולי תאי CAR T המיועדים ל-CD19 משיגים שיעורי הפוגה מלאה של 70%-90% בחולים עם ממאירות תאי B שנפלו או עמידים, ומדגימים השפעה קלינית טרנספורמטיבית 10,11,12. עם זאת, טיפול בתאי CAR T מתמודד עם אתגרים רלוונטיים שמגבילים את יעילותו לטווח הארוך. מכשולים מרכזיים כוללים אובדן או ירידה בוויסות האנטיגן, עמידות לא מספקת של תאי CAR T ועייפות תפקודית9. תשישות תאי T ב-CAR - המאופיינת ביכולת רבייה מופחתת, פגיעה בפעילות אנטי-גידולית והתמדה לקויה - מהווה סיבה חיונית לאי-תגובה ולהישנות13. תאי CAR T מותשים מגיעים עם תפקוד אפקטור מופחת, ביטוי מתמשך של קולטנים מעכבים, וייצור ציטוקינים פגום עקב חשיפה כרונית לאנטיגנים ומיקרוסביבות גידול מדכאות חיסון14. מחקרים קליניים הראו כי אובדן ההתמדה התפקודית של תאי CAR T קשור לסיכון מוגבר להישנות 11,15,16,17. מכיוון שפעילות ממושכת ב-vivo נראית כמנבא מרכזי להצלחה טיפולית, הבנת העמידות והיכולת ההרג המתמשכת של מוצרי תאי CAR T היא מטרה חשובה הן במחקר פרה-קליני והן במחקר תרגומי. מעניין במיוחד הוא היכולת של תאי CAR T לזהות וללזה תאי גידול לאורך תקופות ממושכות – מה שמכונה 'הרג סדרתי' – שכן תכונה זו מספקת מדד פונקציונלי להתמדה ועמידות לעייפות18.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקות הרג סדרתי באמצעות פלטפורמת ההתנגדות xCELLigence Real-Time Cell Cell Analysis (RTCA), כולל הליך שטיפה אופציונלי שמאפשר שימוש חוזר בלוחות הבדיקה, המכונים גם E-plates, ובכך משפר את יעילות העלות מבלי לפגוע בביצועי הבדיקה. ההיגיון בפיתוח פרוטוקול כזה נובע ממגבלות בבדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות, שבדרך כלל מציעות רק קריאות סטטיות בנקודת קצה. גישות נפוצות, כגון שחרור כרום-51, בדיקות לקטט דה-הידרוגנאז (LDH), או בדיקות היתכנות מבוססות ציטומטריית זרימה, דורשות תוויות, כוללות תהליכי עבודה עתירי עבודה, ומוגבלות לנקודות זמן מוגדרות18,19. חשוב מכך, הם אינם יכולים ללכוד בקלות קינטיקה דינמית של הרג במהלך גירוי ממושך או חשיפה מרובת לאנטיגן, מצב הקשור ישירות להתמדה של תאי CAR T ולעייפות תפקודית18.

פלטפורמת xCELLigence RTCA מתמודדת עם פערים אלו על ידי מתן ניטור קינטי בזמן אמת, ללא תוויות ובזמן אמת של עמידות תא המטרה באמצעות התנגדות חשמלית20. תאי המטרה הדביקים של הגידול מוזרעים על לוחות E מצופים זהב במיקרואלקטרודות, כאשר ההצמדה והתרבות שלהם מגבירה את ההתנגדות הנמדדת, המדווחת כמדד התאים (CI)21. בעת הריגה בתיווך CAR T, תאי המטרה נהרגים ומתנתקים, מה שמוביל לירידה מהירה בהתנגדות20. קריאה בזמן אמת זו מאפשרת הערכה רציפה של ציטוטוקסיות במשך שעות או ימים ללא צורך בתוויות או חומרים נוספים22. תאי CAR T, שהיו לא דבקים, אינם תורמים לאות ההתנגדות, מה שמאפשר הפרדה נקייה בין קריאות האפקטור למטרה23. מכיוון שהנתונים נרשמים ברציפות, חוקרים יכולים לבצע פרוטוקולי גירוי רב-סבבים שבהם תאי T של CAR מועברים ונחשפים שוב ושוב לתאי מטרה טריים של גידול, מה שמאפשר מדידה ישירה של התפתחות יכולת ההרגלאורך זמן. זה מחקה את המפגשים החוזרים של אנטיגן שתאי CAR T חווים ב-vivo ומספק קריאה פונקציונלית של היכולות הציטוטוקסיות שלהם.

מבחן הרג סדרתי מבוסס אימפדנס זה מתאים במיוחד לחוקרים שמעריכים את תפקוד תאי CAR T בהקשרים פרה-קליניים, כולל אופטימיזציה של מבנה, השוואות פונקציונליות ובדיקות עוצמה. פרוטוקול זה דורש את מערכת xCELLigence RTCA ושימוש ב-E-Plate 96. למרות שהוא חל באופן רחב על מודלים דבקים של גידול, הוא אינו מתאים ישירות לתרביות השעיה ללא אסטרטגיות קיבוע או קשירה. מכיוון שמדידות התנגדות לבדן משקפות רק את ההיצמדות והחיוניות לתאי היעד, מומלץ לבצע ניתוחים משלימים כגון ציטומטריית זרימה או בדיקות ציטוקינים כדי לאפיין באופן מלא את הפעלה, התרבות ודינמיקת התשה של תאי CAR. הפרוטוקול כולל שלבים ייעודיים המאפשרים איסוף תאים וסופרנטנטים לקריאות נוספות אלו, ומאפשרים הערכה מקיפה יותר של תפקוד תאי CAR T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה מותאם ל-E-Plate 96 ודורש מערכת xCELLigence RTCA. תאי הגידול הדבקים נזרעים בלילה מראש כדי להגיע לשלב הגידול הלוגריתמי בזמן הוספת תאי CAR T. בהתאם לקו תאי הגידול ולצפיפות הזריעה, ניתן לקצר את התקופה ל-6 - 9 שעות, מה שמאפשר הוספת אפקטור באותו יום. אם תהליך העבודה השני מתבצע, ציר הזמן היומי הנומינלי המתואר בפרוטוקול משתנה, והמשתמשים צריכים להתאים את לוח הזמנים בהתאם. קו-קולטורות נשמרות במשך 48 שעות לפני שתאי CAR T מועברים לתאי גידול שצופים זה עתה, מה שדורש שתי עמדות לוחות במכשיר xCELLigence והחלפת ציפוי תאי הגידול והוספת אפקטור כל יומיים. תאי CAR T צריכים להיווצר בהתאם לנהלים מוסדיים או פרוטוקולים מבוססים. בקצרה, תאי T הדם ההיקפיים מבודדים תחת תקנים אתיים מאושרים, מועברים בתנאי בטיחות ביולוגית מתאימים, ומוערכים ליעילות ויכולת המעבר באמצעות ציטומטריית זרימה או בדיקות QC מקבילות. בדיקות xCELLigence אינן צריכות להתבצע כאשר יעילות הטרנסדוקציה של CAR נמוכה מ-20%, שכן יעילות נמוכה יותר עלולה להוביל להגברת הרקע והרג לא ספציפי על ידי תאים לא מועברים, מה שעלול לעוות את עקומות הצמיחה של הגידול. כל טיפול בתא צריך להתבצע בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינרי. מדיה יכולה לשמש לפי תקן המעבדה או לפי המלצת הספק. אלא אם צוין אחרת, תאים מודגרים בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂. למרות ששיטה זו מותאמת לתאי CAR T, ניתן ליישם אותה גם על תאי אפקטור מבוססי מתלה ומטרות דבקות.

1. הכנה והתעלמות (יום 1)

  1. הכנת צלחות
    1. הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום גידול לתחתית כל באר של לוח ה-E 96.
      הערה: היזהר לא לשרוט את תחתית הבאר כי זה עלול לגרום נזק לפלטה.
    2. הנח את פלטת ה-E באינקובטור, וממקם אותה באותו חריץ במכונה לשימוש למדידות.
    3. דגרו את פלטת ה-E למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להביא אותה לטמפרטורת הבדיקה ול-pH המתאימים.
  2. הגדרת כלי נגינה
    1. בינתיים, הפעילו את RTCA Software Pro (גרסה 2.6.1) ובחרו נתיב קובץ לשמירת הניסוי.
    2. הזן את שם הניסוי בשדה "RTCA Operator" ושמור.
    3. בחר את הבארות שיש למדוד.
    4. הקצה שמות תאים תחת לשונית התאים וסוגי טיפול תחת לשונית הטיפול .
  3. לוח מדידות
    1. הגדר את לוח הזמנים עם השלבים הבאים:
      שם צעד = ריק ; סוויפים = 1 ; אינטרוול = 1 ; משך = 0:00
      שם צעד = תאי גידול ; סווייפים = 250-300 ; הפסקה = 15 דקות; משך = מינימום 24 שעות
      שם צעד = טיפול ; סווייפים = עד 2500 ; הפסקה = 5 דקות; משך = מינימום 72 שעות
    2. לחץ על Apply וודא שאוטומטי לא נבחר בשום שלב.
  4. שלב ריק
    1. לאחר הדגירה של 30 דקות של לוח ה-E בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לחץ על PLAY/RUN כדי להתחיל את השלב הריק.
    2. חכה עד שהתוכנה תסמן את השלב DONE (בערך 1-2 דקות).
    3. שחרר את העריסה והסר את פלטת ה-E רק כשמוכן להמשיך בזריעה של תאים.

2. סבב 1: זריעת תאי גידול (יום 1)

  1. זריעת תאי גידול
    1. הכינו תלייה של תאי הגידול ב-50 מיקרוליטר של מדיום מתאים לכל באר.
    2. הסר את צלחת ה-E מהאינקובטור וזרע את התאים בשלושה עותקים.
  2. מדידת התחלה
    1. מיד החזיר את פלטת ה-E למכונה ונעל את העריסה.
    2. המתינו 5-10 דקות לפני המדידה הראשונה כדי לאזן את טמפרטורת ה-E-plate וה-pH, ואז לחצו על כפתור PLAY/RUN כדי להתחיל את המדידה (שלב 2 בלוח הזמנים = תאי גידול).
    3. דגרו את צלחת ה-E ללילה כדי לאפשר היצמדות התאים. עקוב אחרי מדד התאים (CI) הלא מנורמל. כאשר ה-CI נכנס לשלב הגדילה הלוגרית-פאזה, המשיכו לשלב הבא. שלב זה תלוי בקו התאים בו משתמשים ויכול להיות מושפע ממספר התאים הזורעים. תאי BxPC3 (ATCC CRL-1687) זרעו ב-20,000 תאים לבאר, כאשר גידול בשלב לוגריתמי בדרך כלל מושג לאחר 6-18 שעות.

3. סבב 1: טיפול בתאי T ב-CAR (יום 2)

  1. הכנה וזריעה של תאי T
    1. הכינו את המספר הנדרש של תאי CAR T ב-100 מיקרוליטר/באר בתווך תאי T אנושי ללא ציטוקינים התפשטותיים (למשל IL-2, IL-7, IL-15 וכו').
      הערה: יעילות ההעברה של CAR נמדדת פעם אחת בתחילת הניסוי. היחס הרצוי בין אפקטור למטרה (E:T) נקבע לפי מספר תאי CAR⁺ T ביחס לתאי הגידול שצופים בתחילה. לדוגמה, עבור יחס E:T של 1:1 עם תאי T של 50% CAR⁺ ו-20,000 תאי גידול BxPC3, יש לצופה 40,000 תאי T בסך הכול. לכן, יחס E:T מתייחס למצב ההתחלתי בתחילת מבחן הרצח הסדרתי; אלא אם יבוצעו מדידות נוספות, שינויים ב-E:T בסבבים מאוחרים יותר נשארים לא ידועים. שינויים בהתרבות או הישרדות תאי T לאורך זמן, ולכן ביחס E:T, נחשבים לחלק מקריאת ההריגות הסדרתיות. אם תאי T מחולקים בין סבבים, ה-E:T מחושב מחדש באופן יחסי (למשל, חלוקה של 1:1 לאחר סבב 3 מפחיתה את ה-E:T ההתחלתי של 2:1 ל-1:1 בסיבוב 4). אם דינמיקת E:T בין סבבים מעניינת, ניתן לצלוח בארות נוספות אופציונליות למדידות ביניים של אחוז CAR או פונקציית אפקטור. הסרת חרוזי גירוי תאי T של אנטי-CD3/CD28 באמצעות הפרדה מגנטית יכולה לסייע בהפחתת הרג לא ספציפי. מומלץ גם להשתמש בתאי T בשלב הצמיחה הלוגריתמי (בדרך כלל בין 5 ל-20 ימים לאחר הגירוי) ולהרחיב תאים עם ציטוקינים לפחות יומיים לפני הבדיקה, ולא יום שלפני.
    2. כוונן את יעילות ההעברה של CAR בין קבוצות ניסוי לאחוז הנפוץ הנמוך ביותר על ידי ערבוב עם תאי T לא מומרת, בהתבסס על ניתוח יעילות ההמרה.
      הערה: אם לכל הקבוצות יש יעילות טרנסדוקציה שווה, אין צורך בהתאמה. אם אחוזי CAR⁺ שונים, מספר תאי ה-T לצליחה מחושב כך שכל קבוצה מתחילה עם אותו מספר אפקטיבי של תאי CAR⁺ ותאי CAR. זה נעשה על ידי הכפלת מספר התאים הרצוי CAR⁺ (בהתבסס על יחס E:T וזריעת גידול) ב-100 וחלוקה באחוז CAR⁺ הנמדד לכל קבוצה, ולאחר מכן הוספת תאי T לא מועברים אם יש צורך כדי להתאים את מספר תאי ה-T הכוללים. לדוגמה, אם לקבוצה אחת יש 50% תאי T של CAR⁺, 40,000 תאי T מצופים (20,000 CAR⁺ + 20,000 CAR-), בעוד שקבוצה עם תאי T של 60% CAR⁺ תציפוי 33,333 תאי T כדי לספק 20,000 תאי CAR⁺, ותוסיף 6,667 תאי T לא מועברים כדי להתאים למספר תאי T הכולל של הקבוצה הראשונה (סה"כ 40,000).
    3. באופן אופציונלי, אם יש לחקור את הציטוקין או הטיפול המורכב, יש להוסיף 20 מיקרוליטר לתמיסה המורכבת ממדיום תאי T אנושי והציטוקין או התרכובת הרצויה בריכוז הסופי המיועד. נפח זה מתווסף ל-200 מיקרוליטר הסטנדרטיים שכבר נמצאים בכל באר (50 מיקרוליטר לבלינק, 50 מיקרוליטר לזרעת תאי גידול, ועד 100 מיקרוליטר להוספת תאי T). לפי היצרן, ה-E-Plate 96 תומך בנפח מרבי של 243 מיקרוליטר ± 5 מיקרוליטר לבאר, מה שהופך את הנפח הכולל של 220 מיקרוליטר לטיפולים אופציונליים כאלה.
  2. זריעה ומדידה של תאי T
    1. הסר את פלטת ה-E על ידי פתיחת העריסה רק כשמוכן להוסיף תאי T.
    2. הזרע הכין תאי T ישירות לתאי הגידול.
    3. נעל את העריסה בתוך מכשיר המדידה ובטל את שלב 2 בתוכנת RTCA.
      הערה: אם שלב 2 לא מבוטל, המערכת תמשיך למדוד את השלב הקודם ותעצור רק כאשר השלב הושלם, מה שמוביל לאובדן נקודות נתונים.
    4. חכה ששלב 2 יסומן כ-DONE.
    5. לחץ על כפתור PLAY/RUN כדי להתחיל שלב 3 (טיפול) ואשר את ההודעה על ידי לחיצה על אישור.
      הערה: מתן תקופת שיווי משקל של 15-30 דקות לאחר הטיפול (למשל, לאחר זריעה או העברת תאים) לפני תחילת שלב המדידה הבא (לפני שלב 3.2.5) מסייע למזער סטייה ראשונית הנגרמת מתנודות טמפרטורה או pH בעקומות הצמיחה.

4. סבב 2: זריעת תאי גידול (יום 3)

  1. הכינו לוח E-Plate חדש עם 96 בארות xCELLigence כפי שמתואר בשלבים 1.1 ו-1.4.
  2. זרע תאי גידול טריים כפי שמתואר בשלב 2.
  3. דגרו את צלחת ה-E ללילה כדי לאפשר היצמדות התאים.

5. סיבוב 2: העברת תא T של CAR ללוחית E השנייה (יום 4)

  1. העבר את תכולת כל באר לבאר מתאימה של לוח U-תחתית 96 בארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. היזהר לא לגעת באלקטרודות בתחתית פלטת ה-E.
  2. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 400 × גרם למשך 5 דקות.
  3. שאפו בזהירות את הסופרנטנט ושמרו אותו לבדיקת אימונוסורבנט עם אנזימים (ELISA) במידת הצורך.
  4. החזירו את כדור התא ל-100 מיקרוליטר של מדיום טרי ללא ציטוקינים של התפשטות.
    הערה (אופציונלית): ניתן כעת לפצל תאי T (למשל, 50 מיקרוליטר = 1:2) ולהשתמש בהם לניתוחים נוספים, כגון ציטומטריית זרימה. פיצול תאי T מתאים את התרבות שלהם במהלך בדיקת ההרג xCELLigence. זה עוזר להפחית את מספר המחזורים הנדרש עד שהעייפות מתגלה. מומלץ לבדוק יחס פיצול בין 2 ל-4.
  5. הוסיפו 100 מיקרוליטר/באר תאי T לפלטת E של הגידול בסיבוב השני (50 מיקרוליטר אם מפוצלים 1:2), ומבטיחים שהמדיום ואם רלוונטי, ציטוקין/תרכובת יתחדשו במלואם.

   

6. המשך מבחן הרצח הסדרתי (ימים 5 - 10 ואילך)

  1. חזור על שלבים 4 ו-5 לסיבובי הריגה נוספים לפי הצורך במרווחים של 48 שעות.
  2. יש לעקוב אחרי פעילות ההרג והתמדה של תאי T בכל שלב באמצעות קריאות xCELLigence ובדיקות משלימות כגון ELISA או ציטומטריית זרימה.

7. איסוף נתונים וטיפול בלוחות אלקטרוניים

  1. לאחר משך המדידה הרצוי, לחץ על STOP בתוכנה.
  2. ייצוא נתונים מנורמל לנקודת הזמן של הוספת תאי אפקטור וללא ממוצע כדי לאפשר תרשים מדויק של ממוצע ± SEM בתוכנת הניתוח (R, GraphPad Prism וכו'). ייצא את מערך הנתונים הממוצע אם רוצה.
  3. פתח והסיר את לוחית ה-E. שחרר את הניסוי בתוכנה.
  4. נקה או אחסן את פלטת ה-E באינקובטור לניתוחים נוספים (למשל, סופרנטנט ל-ELISA או קציר תאים לציטומטריית זרימה).

8. אופציונלי: שטיפת לוחות אלקטרוניים לשימוש חוזר

הערה: שלב אופציונלי זה מאפשר שימוש חוזר בלוחות ה-E של xCELLigence כדי להפחית עלויות ניסוי. שימוש חוזר מומלץ רק אם התכונות החשמליות של לוח ה-E נשארות יציבות לאורך הניסויים ועד שבארות בודדות נכנסות לטווח הבסיס המקובל. יש לעקוב אחרי כל נהלי הבטיחות, במיוחד בעת טיפול בנתרן הידרוקסיד (NaOH). בדקו ויזואלית את פלטות ה-E לאחר הכביסה כדי לזהות תקלות פוטנציאליות באלקטרודות.

  1. להשליך את כל תכולת לוח ה-E מבלי לגעת בתחתית ה-E.
  2. שטפו כל באר שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מים דה-יוננים.
  3. הוסף 200 מיקרוליטר של 0.1 M NaOH לכל באר.
    אזהרה: NaOH הוא קורוזיבי. ודאו שהנחיות הבטיחות המקומיות נשמרות. לבש כפפות, מעיל ומשקפי מגן. לטפל ב-1 מטר NaOH בארון בטיחות. השליכו פסולת NaOH בכיור עם מים זורמים כדי להבטיח דילול תקין. לעולם אל תערבב חומצות מרוכזות ובסיסים. אין להוסיף מים לחומצה; רק חומצה למים.
  4. דגרו את פלטת ה-E בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  5. שטפו כל באר לפחות שלוש פעמים במים דה-יוניים, כדי לוודא שכל שאריית ה-NaOH מוסרת.
  6. ייבשו את צלחת ה-E על ידי טפיחה עדינה על טישו, ואז ייבוש באוויר.
  7. חטא את פלטת ה-E תחת אור UV בתוך ארון בטיחות ביולוגית למשך לפחות שעה או מכשיר הקרנה UV.
    הערה: מקם את פלטת ה-E כך שהבארות פונות ישירות כלפי מעלה. אור UV לא חודר לתחתית הפלסטיק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצוע מוצלח של הפרוטוקול מניב קריאות מבוססות התנגדות שחוזרות המשקפות את חיוניות תאי הגידול ואת הציטוטוקסיות של תאי CAR T לאורך זמן. צמיחת התאים וציטוטוקסיות הוערכו באמצעות מערכת RTCA מסחרית. הנתונים הוצגו כמדד תאים מנורמל (NCI), שחושב על ידי חלוקת ה-CI בכל נקודת זמן ב-CI בזמן נרמול נבחר. זמן הנרמול נקבע מיד לפני הוספת תאי האפקטור. זמן הפינוי מוגדר כמרווח עד שה-NCI מגיע לאפס לאחר הוספת אפקטור. NCI מחושב על ידי תוכנת RTCA וניתן לייצא אותו לניתוח נוסף, כולל קצב הרג וזמן לאישור, באמצעות תוכנות סטטיסטיות כמו GraphPad Prism. נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה להערכת ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי CAR T במהלך מספר סבבים של חשיפה לאנטיגן באמצעות פלטפורמת xCELLigence RTCA. על ידי מתן מדידה לאורך זמן של חיוניות תאי הגידול באמצעות אימפדנס, גישה זו לוכדת תגובות ציטוטוקסיות חזרתיות - המכונות הרג סדרתי - בפורמט רציף וללא תוויות. הפרוטוקול נועד לנטר כיצד תפקוד אפקטור תאי T משתנה לאורך זמן בתגובה לאתגרים חוזרים של תאי הגידול, ומספק תובנות לגבי פרמטרים כמו התמדה תפקודית, תשישות מוקדמת ודינמיקת הריגה כוללת (איור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SK קיבלה שכר כבוד מ-Plectonic, TCR2 Inc., Miltenyi, Galapagos, Cymab, Novartis, Regeneron, BMS ו-GSK. SK הוא ממציא של מספר פטנטים בתחום האימונו-אונקולוגיה. SK קיבלה דמי רישיון מ-TCR2 Inc ומ-Carina Biotech. SK קיבלה תמיכה מחקרית מ-TCR2 Inc., Tabby Therapeutics, Catalym GmbH, Plectonic GmbH ו-Arcus Bioscience עבור עבודות שאינן קשורות לכתב היד. כל שאר המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TT, SM ו-NTTN קיבלו מענקים מ-Else-Kröner Fresenius Stiftung (IOLIN). NTTN קיבלה מענקים נוספים מ-Friedrich-Baur-Stiftung ומ-German Cancer Aid (AvantCAR.de). MPT נתמכת על ידי קרן מוניקה קוצנר והמועצה האירופית למחקר (MSCA Fellowship 101106951). SK נתמכת על ידי תוכנית הדוקטורט הבינלאומית 'i-Target: immunotargeting of Cancer' (במימון רשת האליטה של בוואריה), מרכז מחקר הסרטן הבווארי (BZKF) (TANGO to S.K.), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, מספר מענק: KO5055-2-1 ו-KO5055/3-1), ברית מחקר המלנומה (מספר מענק 409510), רשת ההכשרה מארי סקלודובסקה-קירי לאופטימיזציה של טיפול תאי T אימוץ בסרטן (ממומנת על ידי תוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי; מענק 955575), רשת ההכשרה מארי סקלודובסקה-קירי למעקב ושליטה בתאי חיסון טיפוליים בסרטן (ממומנת על ידי תוכנית Horizon של האיחוד האירופי, מענק 101168810), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (IOLIN), German Cancer Aid (AvantCAR.de), Wilhelm-Sander-Stiftung, Ernst Jung Stiftung, Institutional Strategy LMUמצוין של LMU מינכן (במסגרת יוזמת המצוינות הגרמנית), Go-Bio-Initiative, פרס m4 של משרד הכלכלה של בוואריה, Bundesministerium für Bildung und Forschung, EUROSTAR-Programm, המועצה האירופית למחקר (Starting Grant 756017, PoC Grant 101100460 ו-CoG 101124203), על ידי SFB-TRR 338/1 2021-452881907, קרן Fritz-Bender, קרן Deutsche José Carreras Leukämie Fund, קרן הקטור, קרן המחקר הבווארית (BAYCELLATOR), קרן מוניקה-קוצנר, קרן ברונו והלנה יוסטר (360° CAR), קרן ד"ר רוריינסקי וקרן בריג'יט וד"ר קונסטנצה וגנר

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BxPC3ATCCCRL-1687
E-Plate 96Agilent 300600910
תוכנת RTCA Pro (Basic) Agilent לא זמיןגרסה 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (מספר לוחות)Agilent לא זמין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Brudno, J. N., et al. T cells genetically modified to express an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of poor-prognosis relapsed multiple myeloma. J Clin Oncol. 36 (22), 2267-2280 (2018).
  5. Gauthier, J., et al. Phase 1 study of CD19 CAR T-cell therapy harboring a fully human scFv in CAR-naïve adult patients with B-ALL. Blood Adv. 9 (8), 1861-1872 (2025).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of CAR T-cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10 (12), e005678(2022).
  8. Foster, M., et al. Cross-study safety analysis of risk factors in CAR T-cell clinical trials: An FDA database pilot project. Mol Ther Oncolytics. 27, 182-194 (2022).
  9. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  10. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B-cell ALL patients. J Clin Invest. 126 (6), 2123-2138 (2016).
  11. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  12. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  13. Zugasti, I., et al. cell therapy for cancer: Current challenges and future directions. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 210(2025).
  14. Tao, Z., et al. Impact of T-cell characteristics on CAR-T cell therapy in hematological malignancies. Blood Cancer J. 14 (1), 213(2024).
  15. Wittibschlager, V., et al. T-cell persistence correlates with improved outcome in patients with B-cell lymphoma. Int J Mol Sci. 24 (6), 5688(2023).
  16. Myers, R. M., et al. Humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR) T cells in CAR-naive and CAR-exposed children and young adults with relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 39 (27), 3044-3055 (2021).
  17. Gardner, R. A., et al. Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults. Blood. 129 (25), 3322-3331 (2017).
  18. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  19. Peper, J. K., et al. An impedance-based cytotoxicity assay for real-time and label-free assessment of T-cell-mediated killing of adherent cells. J Immunol Methods. 405, 192-198 (2014).
  20. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLoS One. 13 (3), e0193498(2018).
  21. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol In Vitro. 20 (6), 995-1004 (2006).
  22. Lee, E. H. J., et al. Antigen-dependent IL-12 signaling in CAR T cells promotes regional to systemic disease targeting. Nat Commun. 14 (1), 4737(2023).
  23. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Evaluation of CAR-T cell cytotoxicity: Real-time impedance-based analysis. Methods Cell Biol. 167, 81-98 (2022).
  24. Sahoo, P., et al. Mathematical deconvolution of CAR T-cell proliferation and exhaustion from real-time killing assay data. J R Soc Interface. 17 (162), 20190734(2020).
  25. Li, N., Zhang, W. Calculation principles of Agilent xCELLigence RTCA software. , Agilent Technologies. (2022).
  26. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. J Vis Exp. (157), e60400(2020).
  27. Brezinger-Dayan, K., et al. Impact of cryopreservation on CAR T production and clinical response. Front Oncol. 12, 1024362(2022).
  28. Foulke, J. G., et al. Optimizing ex vivo CAR-T-cell-mediated cytotoxicity assay through multimodality imaging. Cancers (Basel). 16 (14), (2024).
  29. Cadinanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33 (5), 2291-2309 (2025).
  30. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-Plate cell sensor arrays in the xCELLigence real-time cell analyzer. Biotechniques. 61 (3), 117-122 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CAR TTE Plate

מאמרים קשורים