הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

אוסטהול משפר את דלקת מפרקים בעכברים דרך ציר miR-34a/Bcl-2

97 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69624

⸱

15 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, and Public Experimental Research Center, Xuzhou Medical University, 2Department of Joint Surgery, Shuyang Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אוסתולה (OST) הוא תרכובת טבעית עם פעילות פרמקולוגית נרחבת. מחקר זה מציע כי OST מקל על השפעות אוסטיאוארתריטיס בברך (KOA) דרך ציר miR-34a/Bcl-2, כפי שמודגם במחקרים in vivo ו-in vitro בחולדות, ומספק רעיונות וכיוונים חדשים לרפואה פטנטית וליישומים קליניים.

תקציר

אוסטיאוארתריטיס בברך (KOA), המכונה גם דלקת מפרקים היפרטרופית או ניוונית, היא הפרעה נפוצה במפרקים. אסטרטגיות הניהול הקליני הנוכחיות כוללות טיפול פרמקולוגי, התערבות פיזית, פרוצדורות כירורגיות וטיפולים משלמים. למרות שגישות אלו יכולות להקל במידה מסוימת על תסמיני KOA, לעיתים קרובות יש להן מגבלות, כגון תופעות לוואי, יעילות מוגבלת או פולשניות. אוסטהול (OST), נגזרת טבעית מקומרין, נחקרה רבות בזכות תכונותיה הרפואיות, במיוחד בהקלה על כאבי מפרקים ובשיפור תפקוד המפרקים. במחקר זה נעשה שימוש במבחן CCK8, מיקרוסקופ אלקטרוני העברה (TEM), צביעת H&E וניתוח ביוכימי בסרום כדי להוכיח כי OST מפעיל אפקטים מגנים על כונדרוציטים הן במבחנה והן בחיים, ללא רעילות משמעותית. מחקרים מאוחרים יותר שהשתמשו ב-TEM, צביעת כתום אקרידין, ציטומטריית זרימה ווסטרן בלוטינג הראו כי OST מקדם אוטופגיה ומדכא אפופטוזיס בכונדרוציטים. מחקרים מכניים נוספים באמצעות qRT-PCR ומבחני דוח לוסיפראז הראו כי OST מוריד את miR-34a, ובכך מעלה את ביטוי Bcl-2 ומעכב אפופטוזיס דרך מסלול miR-34a/Bcl-2. לסיכום, ממצאים אלו מצביעים על כך ש-OST מגן על כונדרוציטים במודלים תאיים ובעלי חיים, מפחית לחץ שנגרם מ-LPS ומפחית דלקת ואפופטוזיס בעכברי KOA. הירידה בוויסות של miR-34a והעלייה בביטוי Bcl-2 תורמות להשפעה האנטי-אפופטוטית שלו. תוצאות אלו מספקות בסיס תיאורטי לפיתוח תרופות פטנטיות מבוססות OST ולפוטנציאל לתרגום קליני שלהן בטיפול KOA.

מבוא

אוסטיאוארתריטיס בברך (KOA) היא מחלת מפרקים נפוצה הידועה גם כדלקת מפרקים היפרטרופית, היפרטרופית או סנילית של הברך. היא נגרמת מהתנוונות של הסחוס המפרקי ושינויים במבנה סביב המפרק. לפי מחקרים אפידמיולוגיים, אוסטיאוארתריטיס בברך היא מחלה נפוצה, במיוחד בקרב קשישים1. השכיחות שלו קשורה קשר הדוק לגיל, משקל, גנטיקה, פגיעות במפרקים וכדומה. גם פונקציות פיזיולוגיות יכולות להיות מושפעות, כולל תנועת מפרקים מוגבלת, ירידה בכוח השרירים והליכה לא תקינה. נכון להיום, בטיפול בדלקת מפרקי הברך, השיטות הנפוצות כוללות טיפול תרופתי, פיזיותרפיה, ניתוח וטיפול אדג'ובנטי2. התרופות כוללות לעיתים קרובות משככי כאבים, תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות, ותרופות לדלקת מפרקים כרונית להפחתת כאב ולשליטה בדלקת. הפיזיותרפיה כוללת קומפרסים חמים, קומפרסים קרים, עיסוי ותרגילי שיקום ייעודיים לשיפור תפקוד המוטורי של המפרקים ולהפחתת כאב. טיפול כירורגי יכול לכלול ניתוח ארתרוסקופי, החלפת מפרק מלאכותי או תיקון מורפולוגי של עצם המפרק לשיקום מבנה ותפקוד המפרק. יתרה מזאת, טיפולים משלימים כמו דיקור, פיזיותרפיה ורפואה סינית מסורתית משמשים גם הם באופן נרחב.

עם זאת, למרות שטיפולים אלו מספקים הקלה מסוימת בתסמינים ובמצב של אוסטאוארתריטיס בברך, עדיין קיימות מגבלות. טיפול תרופתי עלול לגרום לתגובות שליליות ובעיות תלות; פיזיותרפיה דורשת תהליך שיקום מתמשך, והתוצאות משתנות בהתאם להבדלים אישיים; הטיפול הכירורגי מסוכן, תהליך ההחלמה ארוך ודורש שיקול דעת מדוקדק; ולמרות שטיפול אדג'ובנט זכה לתשומת לב ויישום נרחבים, עדיין קיימות תמיכה מדעית מוגבלת ליעילותו, יש לחקור לעומק את מנגנון הרגולציה של טיפול אדג'ובנט. בטיפול אדג'ובנט, תרופות סיניות מסורתיות לטיפול באוסטיאוארתריטיס בברך היו בשימוש נרחב בתחומים רבים והוכחו כשימושיות. חייבים להיות מרכיבים מסוימים ברפואה הסינית המסורתית שעדיין אינם ידועים היטב, אך הוכחו באמצעות תרגול ארוך טווח ומחקרים מעקבים. כיום, רבות מהרפואה הסינית צברו ניסיון רב בטיפול באוסטיאוארתריטיס בברך, כגון Cibotium barometz3, Ligusticum wallichii Franchat4, Angelica pubescens5 ואחרים. לעשבים אלו יש השפעות משככות כאבים ונוגדות דלקת שיכולות להקל על כאב ולהפחית דלקת ביעילות.

OST הוא תרכובת דמוית קומרין הנפוצה ברפואה כתמצית צמחית טבעית6. יש לה פעילויות פרמקולוגיות רבות והיא נתמכת על ידי מחקרים רבים. מחקרים הראו שלקנידיום יש פעילויות פרמקולוגיות רבות, כולל אנטי-גידול, אנטי-דלקת, היפרגליקמיה, אנטי-הצטברות טסיות והגנה עצבית, ויש לו השפעות טיפוליות פוטנציאליותעל מחלות רבות נוספות. דווח כי OST יכול לקדם אפופטוזיס של תאי סרטן על ידי ויסות אוטופגיה, שבה OST מעכב אפופטוזיס של תאי קרצינומה שחלתית באמצעות אוטופגיה מתווכת LC3 ופירופטוזה תלויה ב-GSDME8; OST גורם לאפופטוזיס של תאי HT-29 באמצעות לחץ על הרשתית האנדופלזמית ואוטופגיה תאית; OST מקדם אפופטוזיס של סרטן המעי הגס על ידי דיכוי איתות AMPK/Akt, השראת אוטופגיה תאית, ROS ופרופטוזיס10; OST עשוי לעכב את התפתחות סרטן המעי הגס על ידי ויסות אוטופגיה והעברת אותות בתיווך מיטוכונדריה11. במקביל, OST משמעותי במיוחד בהקלה על כאבי מפרקים ובשיפור תפקוד המפרקים, בעיקר על ידי הפחתת תגובה דלקתית והקלה על כאבי מפרקים. והרכיבים הפעילים שלו יכולים להפחית את שחרור החומרים הדלקתיים ולעכב את התדרדרות סחוס המפרקים הנגרמת מדלקת מפרקים. בהשוואה לסמים מערביים נפוצים, פסקול פסקול בטוח יותר ובעל רעילות נמוכה, ושימוש ממושך לא יגרום לעמידות לתרופות. דווח כי אוסטהול משפר את האוסטאוגנזה באוסטאובלסטים על ידי העלאת פקטור השעתוק אוסטריקס באמצעות איתות cAMP/CREB במבחנה וב-vivo12; OST מדכא התפתחות אוסטיאוארתריטיס בברך על ידי הגברת האוטופגיה המופעלת דרך מסלול AMPK/ULK113; לקטון קנידיום מעכב התמיינות אוסטאוקלסטית דרך מסלול איתות14 של p38 MAPK ו-PI3K-Akt ו-c-Fos/NFATc1; לקטון קנידיום מונע אובדן עצם במודל חולדה שעבר שחלות דרך מסלול איתות אסטרוגן-α/BMP-2/Smad15; OST משפר את האוסטאופורוזיס על ידי הגברת האוטופגיה של תאי גזע מזנכימליים16. עם זאת, התצפית והניתוח הראו שרוב המחקרים נשארו בפנוטיפ, או לא חשפו את מנגנון ויסות מסלולי האיתות של השתתפות תרופות ברמה המולקולרית, וזה גם אחד הסיבות לכך שתרכובות שמופקות מהרפואה הסינית המסורתית קשות להתקבל באופן נרחב. לכן, חשוב מאוד להמשיך לחקור את מנגנון הוויסות הביולוגי של אוסטולה ברמה המולקולרית עבור רפואת הפטנטים והיישום הקליני שלו.

miRNA הוא RNA קטן שמווסת את התפקוד הביולוגי על ידי עיכוב ביטוי גנים יעדיים. רבות מהרפואה הסינית המסורתית ידועות בכך שמשפיעות ביולוגיות על ידי ויסות מירנ"א. באופן דומה, דווח גם כי OST משפיע על ביטוי miRNA. ראשית, OST ממלא תפקיד ביולוגי אנטי-גידולי דרך miRNA. דווח כי OST עיכב התרבות תאים וגרם לאפופטוזיס תאי על ידי הפחתת ביטוי CPEB2 באמצעות הגברת miR-424 בקרצינומה ריריתהרחם 17; OST מדכא את ההתרבות ומאיץ את האפופטוזיס של תאי גליומה אנושיים באמצעות הגברת ויסות miR-16 והורדת ויסות של MMP-918; OST מציג אפקט אנטי-גידולי ברטינובלסטומה על ידי עיכוב מסלול PI3K/AKT/mTOR וויסות הציר19 של hsa_circ_0007534/miR-214-3p. שנית, OST יכול גם להשפיע על התהליכים הפיזיולוגיים של איברי הגוף באמצעות ויסות miRNA, אשר OST מקל על עיצוב כלי דם ריאתיים על ידי ויסות תכנות מחדש מטבולי של שומנים במתווך miR-22–3p20; OST מגן על חולדות מפני איסכמיה/פגיעות רפרפוזיה בשריר הלב באמצעות הפחתת ויסות miR-30a וקידום אוטופגיה21; OST מגן על קרדיומיוציטים H9c2 מפני נזק שנגרם על ידי טרסטוזומאב על ידי חיזוק האוטופגיה דרך מסלול איתות p38MAPK/mTOR22. שלישית, OST יכול למלא תפקיד נוירוהגני באמצעות miRNA, ש-OST עורר התמיינות תאי גזע עצביים לנוירונים במודל תאי מחלת אלצהיימר באמצעות הגברת תאי miR-9 והציל את הפגיעה התפקודית של נוירוני ההיפוקמפוס בעכברים טרנסגניים APP/PS123; OST מפחית את רמות הבטא אמילואידים באמצעות הגברת ה-miR-107 במחלת אלצהיימר 24. עם זאת, לא דווח כי miRNA יכול להיות מווסת על ידי OST לטיפול באוסטיאוארתריטיס בברך. הספרות הראתה כי miR-34a מגביר אפופטוזיס כונדרוציטים ומקל על התפתחות אוסטיאוארתריטיס על ידי מיקוד ב-DLL1 וויסות מסלול PI3K/AKT25. RNA ארוך שאינו מקודד MEG3 מווסת את התקדמות אוסטיאוארתריטיס על ידי ויסות ציר miR-34a/Klotho26; ירידה בוויסות של miR-34a מעודדת התרבות ומעכבת אפופטוזיס של תאי סחוס אוסטיוארטריטיים בעכברוש על ידי הפעלת מסלול PI3K/Akt27. לכן, האם ניתן לטפל ב-KOA עם OST באמצעות רגולציה של miR-34a? לכן, משערים כי OST יכול לטפל באוסטיאוארתריטיס בברך על ידי ויסות miRNA.

לסיכום, OST הוא תרכובת טבעית עם פעילויות פרמקולוגיות נרחבות28. מוקדם יותר, קבוצת המחקר אישרה כי OST יכול לשפר אוסטיאוארתריטיס בברך אצל חולדות, אך העברת האותות התאית והמנגנונים המולקולריים שמאחורי ההשפעה הביולוגית הזו לא הובארו במלואם. במאמר זה, על ידי חקר נוסף של מסלולי האיתות של miRNA, אוטופגיה ואפופטוזיס של OST, מטרתו להבהיר את מנגנון OST בטיפול באוסטיאוארתריטיס בברך ולספק רעיונות וכיוונים חדשים לרפואה הפטנטנטית וליישום הקליני שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים אושרו על ידי ועדת הטיפול והטיפול המוסדי של אוניברסיטת שוז'ואו לרפואה. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. מודל חיה

זכרים ונקבות בוגרים מסוג Sprague-Dawley (SD) במשקל 250–300 גרם נרכשו ממרכז בעלי החיים הניסיוניים של אוניברסיטת הרפואה שוז'ואו. חולדות גודלו בחדר מיוחד ללא פתוגנים. ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים, כולל טיפול, טיפול ובחירת סיום, פעלו לפי ההנחיות "מחקר בעלי חיים: דיווח ניסויים בחיים החיים". ניסויים בבעלי חיים בוצעו באמצעות אקראיות. חולדות SD חולקו לארבע קבוצות (n = 8 לכל קבוצה): קבוצה תקינה (ללא ניתוח, האכלה תקינה) (קבוצה תקינה), קבוצת שאם (ניתוח מזויף: חתך עור ושריר ללא חיתוך רצועות צלב קדמיות [ACLT], ואחריה גז מלח), קבוצת KOA/NC (ניתוח ACLT + גז מלח), קבוצת KOA/OST (ניתוח ACLT + גז OST). מודל KOA של ברך העכברוש נבנה בשיטת חיתוך הרצועה הצולבת הקדמית (ACLT) כפי שתוארה קודם29. קבוצת הסליין קיבלה תמיסת מלח באמצעות גאווג', וקבוצת ה-OST קיבלה OST באמצעות גאבג' במשך 4 שבועות. מינון ה-OST הוא 50 מ"ג/ק"ג משקל גוף (מומס ב-PEG 400 ומדולל עם מלח פיזיולוגי), ותדירות המתן היא פעם ביום במשך 4 שבועות בתת-הסעיף של Rats. לאחר מכן, חולדות הושמתו לניתוח (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). רקמות הוקפאו מיד בחנקן נוזלי או מקובעים ב-4% פאראפורמלדהיד.

2. תרבית תאים

קו תאי כונדרוציטים אנושיים (C28/I2) התקבל מאוסף תרביות הסוגים האמריקאי (ATCC, מנאסס, וירג'יניה). התאים תורבדו לפי הנחיות ATCC ושימשו תוך 6 חודשים.

תנאי תרבית: מדיום DMEM/F-12 עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין, מודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בדגירה לח של 5%CO2 .

טיפולים: תאים זרעו ב-1 ×10 6 תאים/באר בלוחות עם 6 בארות; לאחר 24 שעות של היצמדות, טופלו ב-LPS (1 מיקרוגרם/מ"ל) בלבד או ב-OST (100 מיקרומון) למשך 24 שעות.

3. בדיקות לקיימות תאים

תאי כונדרוציט הוגדרו יחד עם OST או LPS בריכוזים שונים בלוחות של 96 בארות. מבחן CCK8 משקף את חיוניות התאים על ידי זיהוי ספיגה (OD450 ננומטר) באמצעות קורא מיקרופלט, כאשר ערכי OD גבוהים יותר מצביעים על תאים ברי קיימא יותר.

גרדיאנט ריכוזי OST: 0, 25, 50, 100, 200, 400 מיקרומולר (מודגר ל-24 שעות). בדיקת CCK8 הראתה >90% מהחיוניות של התאים בכל הריכוזים, מה שמאשר את אי-הרעילה של התרכובת.

גרדיאנט ריכוז LPS: 0, 0.1, 0.5, 1, 2 מיקרוגרם/מ"ל (מודגר ל-24 שעות). קבוצת LPS של 1 מיקרוגרם/מ"ל הייתה בעלת ~50% חיוניות תאית (לעומת קבוצת Ctrl), ולכן ריכוז זה נבחר לניסויים הבאים.

4. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעת ספאנין O

הרקמות הוטבעו בפרפין, הוסרו מהשעווה, הודרו מחדש וצבועו במגני H&E ו-Safranin O/Fast Green בהתאם להוראות היצרן. תנאי צביעה: ריכוז העבודה של AO היה 1 מיקרוגרם/מ"ל; התאים היו מודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בחושך.

שיטה כמותית: שיעור החיוביות של AVO חושב על ידי ספירת תאים המכילים נקטה כתומה ב-5 שדות אקראיים (×הגדלה של 400) לכל דגימה באמצעות תוכנת ImageJ. לאחר מכן, קטעים צולמו תחת מיקרוסקופ BX43 (הגדלה ×400).

5. ציטומטריית זרימה

התאים נקטפו והושעו מחדש בתמיסת Annexin-V FITC/PI לניתוח אפופטוזיס. תנאי הדגירה: התאים הוצפו מחדש ב-1 × 106 תאים/מ"ל בתמיסת Annexin-V FITC/PI (KeyGEN) ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך.

אסטרטגיית שערים: פיזור קדמי (FSC) לעומת שערי פיזור צד (SSC) שימשו למניעת פסולת תאים; תאי FITC⁺/PI⁻ באנקסין-V הוגדרו כאפופטוטיים מוקדמים, ותאי FITC⁺/PI⁺ באנקסין-V כאפופטוטיים מאוחרים. גרף השער כלול בקובץ המשלים 1 (נתוני ציטומטריית זרימה גולמיים). תאים נאספו באמצעות ציטומטר זרימה. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת Flow Jo.

6. טרנספקציה של פלסמידים וחיקוי

חיקוי MiR-34a (34a-mimic), חיקוי ביקורת-לא ספציפי (NC) הושגו ממקור מסחרי. התאים עברו טרנספקט עם פלסמידים באמצעות LipofectamineTM 3000 לפי הוראות היצרן.

7. צביעת כתום אקרידין

אוטופגיה הוערכה בדרך כלל באמצעות צביעת כתום אקרידין בתאים. לאחר שהתאים טופלו ב-LPS או OST בריכוזים ספציפיים במשך 24 שעות, הם דוגרו ב-AO (1 מיקרוגרם/מ"ל) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בחושך. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. שיעור החיוביות של AVO חושב על ידי ספירת תאים המכילים פונקטה כתומה ב-5 שדות אקראיים (×הגדלה של 400) לכל דגימה באמצעות תוכנת ImageJ. הנתונים מדווחים כממוצע ± SD משלושה ניסויים עצמאיים.

8. תצפית במיקרוסקופ אלקטרוני בהעברה

הדגימות קיבעו ב-2.5% גלוטראלדהיד ו-1% אוסמיום טטרוקסיד, לאחר מכן יובשו, שטפו והושררו. לאחר הפולימריזציה, הדגימות נחתכו לחתכים בעובי 70 ננומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום. האולטרה-מבנה של התאים נצפה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית.

9. אימונובלוטינג

נוגדן מונוקלונלי לעכבר (Abs) נגד Bcl-2 (#68103), נוגדן פוליקלונלי של ארנב נגד LC3 (#14600-1-AP), IL-6 (21865-1-AP), ונוגדן מונוקלונלי לעכבר נגד β-אקטין (#66009-1-lg) נרכשו מ-Proteintech. בטן משנית הוצגה מסחרית ל-IRDye 800CW עז (פוליקלונלית), אנטי-ארנבת IgG (H+L) או IRDye 800CW עז (פוליקלונלית) אנטי-עכבר IgG (H+L). התאים עברו ליזזה במבחן פירוק תאי שלם, שהופרדו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל SDS-פוליאקרילאמיד. חלבונים זוהו באמצעות Abs ראשוניים ו-Abs משניים מתאימים. עומס החלבונים היה 30 מיקרוגרם לכל נתיב; דילול נוגדנים ראשוניים: Bcl-2 (1:1000), LC3 (1:1500), β-טובולין (1:5000); נוגדנים משניים (IRDye 800CW) שימשו ב-1:10,000, IL-6 (1:800). לאחר מכן, רצועות החלבון נלכדו על ידי מערכת ה-Chemiluminescence Laser Imaging Imaging Models. רצועות החלבון נמדדו על ידי תוכנת ImageJ.

10. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR)

רנ"א כולל בודד מתאים באמצעות תגובת טריזול. cDNAים שמקורם ב-RNA כולל סונתזו באמצעות ערכת הרגנט של cDNA ונותחו בשיטות SYBR Green. cDNAים שמקורם ב-miRNA סונתז באמצעות קיט cDNA של miRcute plus miRNA ונותחו על ידי ערכת qPCR של miRcute plus miRNA. כל ההליכים בוצעו בהתאם לפרוטוקול היצרן. הביטוי של תמלול היעד חושב באמצעות שיטת 2-△△CT . GADPH ו-U6 שימשו כבקרת טעינה ל-mRNA ו-miRNA, בהתאמה. רצף הפריימרים מופיע בטבלה 1.

11. בדיקות כתב ללוציפראז

פלסמיד דיווח מסוג פראי מסוג פראי (WT) ו-psiCHECK2- פלסמיד דיווח Bcl-2-3′UTR עם מוטנט באתר הקשר miR-34a (Mut). הכתבים והמחקה miR-34a הועברו יחד לתאי כונדרוציטים באמצעות LipofectamineTM 3000. התאים נקטפו ופורקו לאחר 24 שעות של טרנספקציה. לאחר מכן נמדדה עוצמת הלוציפראז באמצעות ערכת בדיקת הגנים Dual-LumiTM Luciferase Reporter לפי הוראות היצרן.

12. מבחני ניתוח הליכה

מערכת MGT-PR שימשה לצפייה בתנועות הגפיים הרצות של חולדות בכל קבוצה. לפני הניסויים, העכברים הורשו להסתגל לסביבת המסלול. נרשמו נתוני הליכה במהלך הליכה חופשית, עם שלושה ניסויי הליכה תקפים רצופים עבור כל עכברוש. הפרמטרים שנותחו כללו אורך צעד, משך הנפה ותיאום בין הגפיים האחוריות הימניות והשמאליות.

13. ניתוח סטטיסטי

הניסויים בוצעו בשלושה עותקים וחזרו על עצמם לפחות שלוש פעמים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת GraphPad Prism 9. הנתונים הוצגו כממוצע ± SD. ההבדלים הסטטיסטיים הוערכו באמצעות ANOVA חד-כיווני (מבחן הפוסט-הוק של טוקי) עבור השוואות מרובות, או באמצעות מבחן Student t דו-זנבי להשוואות שתי קבוצות ניסוי. ההבדלים התקבלו כמובהקים ב-p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאי כונדרוציט מוגנים על ידי OST, הן במבחנה והן ב-vivo
כמוצר טבעי, פרופיל הבטיחות של הפסקול דורש בדיקה יסודית. מחקר זה העריך תחילה את הציטוטוקסיות שלו על כונדרוציטים במבחנה באמצעות מבחן CCK8. התוצאות הראו כי OST לא הראה רעילות כלפי כונדרוציטים אפילו בריכוז של 400 מיקרומול (איור 1A). כדי לבחון את ההשפעות האנטי-דלקתיות והאנטי-אפופטוטיות של OST על כונדרוציטים, הוערך מוות תאי באמצעות מבחן CCK8 לאחר טיפול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מעל לכל, OST הגן על כונדרוציטים מלחץ שנגרם על ידי LPS במבחנה והקל על דלקת ואפופטוזיס בעכברי KOA במצב חי. השפעות הגנה אלו היו קשורות לירידה בוויסות של miR-34a ולעלייה בביטוי Bcl-2, בהתאם לתפקיד המוצע של ציר miR-34a/Bcl-2 בתיווך פעולת OST.

במחקר זה, נמצא כי OST מקדם את האוטופגיה של תאי כונדרוציטים ומפחית אפופטוזיס הן במבחנה והן בחיים. המנגנונים המולקולריים הקשורים למחקר נותחו בפירוט באיור 8. ראשית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים פיננסיים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי המעבדה המרכזית של אוניברסיטת ג'יאנגסו לתרופות חדשות ורפואה קלינית (XZSYSKF2021037). הניסויים במאמר זה נערכו חלקית במרכז המחקר הניסויי הציבורי ובמרכז בעלי החיים המעבדתיים של אוניברסיטת הרפואה שוז'ואו. הוקרות מועברות לפוקשינג דונג, קייג'יה ג'אנג, ג'ינקסיה קואי ומין ג'אנג על עזרתם הנלהבת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1% אוסמיום טטרוקסידטכנולוגיית רויקסין
2.5% גלוטראלדהידטכנולוגיית ג'ונגג'ינגקיי
תפוז אקרידיןסיגמאאמרסקו 0360
פתרון Annexin-V FITC/PIKeyGENKGA107
Bcl-2פרויטנטק#68103
ערכת ספירת תאים-8VICMED39.VC5001L
כימילומינסנציהאודיסאה  CLX
מיקרוסקופ קונפוקלילייקהSTELLARIS 5
DMEM/F-12הייקלון12.SH30023-01
ערכת בדיקת גנים Double-LumiTM Luciferase ReporterביוטייםRG088
ערכת הרג'נט של FastKing cDNAטיאנגןKR116-03
ציטומטר זרימהBDקנטו II של FACS
קו תאי כונדרוציטים אנושייםאוסף תרבות הטיפוס האמריקאיתYTLK280144
LC3פרויטנטק#14600-1-AP
ליפופקטמיןTM 3000InvitrogenL3000015
ליפופוליסכרידיםסיגמא29.L2880
בדיקת ליסיסKeyGENKGP704-100
קורא מיקרופלטביו-טקסינרגיה 2
miRcute plus miRNA עם ערכת cDNA חוט ראשוןטיאנגןKR211-02‌
miRcute plus miRNA qPCR kitטיאנגןFP411-02
אוסטהולהמדכימקספרסO815127-25 גרם
אלקטרופורזה בג'ל SDS-פוליאקרילאמידNCM ביוטכנולוגיהP2012
סרוםקלארק ביוסיינסFB15015
SYBR גריןטיאנגןFP217-01‌
מיקרוסקופיית אלקטרונים מעבריתFEITecnai G2
אולטרה-מיקרוטוםלסיהUC7
מיקרוסקופ פלואורסצנציה זקוףאולימפוסBX43
β-Actinפרויטנטק#66009-1-LG

מקורות

  1. Kan, H. S., et al. Non-surgical treatment of knee osteoarthritis. Hong Kong Med J. 25 (2), 127-133 (2019).
  2. Dantas, L. O., Salvini, T. F., McAlindon, T. E. Knee osteoarthritis: Key treatments and implications for physical therapy. Braz J Phys Ther. 25 (2), 135-146 (2021).
  3. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1-15 (2022).
  4. Li, H., et al. Intra-articular injection of a nanosuspension of tetramethylpyrazine dihydroxynaphthalenate for stronger and longer-lasting effects against osteoarthritis. J Biomed Nanotechnol. 17 (6), 1199-1207 (2021).
  5. Qiang, R., et al. Carbon quantum dots derived from herbal medicine as therapeutic nanoagents for rheumatoid arthritis with ultrahigh lubrication and anti-inflammation. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (32), 38653-38664 (2023).
  6. Sun, M., Sun, M., Zhang, J. Osthole: An overview of its sources, biological activities, and modification development. Med Chem Res. 30 (10), 1767-1794 (2021).
  7. Yang, S., et al. Osthole: An up-to-date review of its anticancer potential and mechanisms of action. Front Pharmacol. 13, 945627(2022).
  8. Liang, J., et al. Osthole inhibits ovarian carcinoma cells through LC3-mediated autophagy and GSDME-dependent pyroptosis except for apoptosis. Eur J Pharmacol. 874, 172990(2020).
  9. Zhou, X. H., Kang, J., Zhong, Z. D., Cheng, Y. Osthole induces apoptosis of HT-29 cells via endoplasmic reticulum stress and autophagy. Oncol Lett. 22 (4), 726(2021).
  10. Zhou, X., Kang, J., Zhang, L., Cheng, Y. Osthole inhibits malignant phenotypes and induces ferroptosis in KRAS-mutant colorectal cancer cells via suppressing AMPK/Akt signaling. Cancer Chemother Pharmacol. 92 (2), 119-134 (2023).
  11. Song, J., et al. Osthole impairs mitochondrial metabolism and the autophagic flux in colorectal cancer. Phytomedicine. 125, 155383(2024).
  12. Zhang, Z. R., et al. Osthole enhances osteogenesis in osteoblasts by elevating transcription factor Osterix via cAMP/CREB signaling in vitro and in vivo. Nutrients. 9 (6), 588(2017).
  13. Ma, T., et al. Osthole suppresses knee osteoarthritis development by enhancing autophagy activated via the AMPK/ULK1 pathway. Molecules. 27 (23), 8624(2022).
  14. Liang, J. Y., Wu, W. L., Chen, Y. X., Liu, H. The efficacy and potential mechanism of cnidium lactone to inhibit osteoclast differentiation. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 3087-3093 (2019).
  15. Wang, Z., Bao, H. W., Xu, Y. J. Cnidium lactone prevents bone loss in an ovariectomized rat model through the estrogen-α/BMP-2/Smad signaling pathway. J Cell Biochem. 121 (10), 4567-4576 (2020).
  16. Zheng, X., et al. Osthole improves therapy for osteoporosis through increasing autophagy of mesenchymal stem cells. Exp Anim. 68 (4), 347-355 (2019).
  17. Lu, K., Lin, J., Jiang, J. Osthole inhibits cell proliferation and induces apoptosis through decreasing CPEB2 expression via upregulating miR-424 in endometrial carcinoma. J Recept Signal Transduct. 40 (1), 89-96 (2020).
  18. Lin, K. A. I., et al. Osthole suppresses proliferation and accelerates apoptosis of human glioma cells via upregulation of microRNA-16 and downregulation of MMP-9. Mol Med Rep. 12 (3), 4592-4597 (2015).
  19. Lv, X., et al. Osthole exhibits an anti-tumor effect in retinoblastoma through inhibiting the PI3K/AKT/mTOR pathway via regulating the hsa_circ_0007534/miR-214-3p axis. Pharm Biol. 60 (1), 417-426 (2022).
  20. Niu, Z., et al. Osthole alleviates pulmonary vascular remodeling by modulating microRNA-22-3p mediated lipid metabolic reprogramming. Phytomedicine. 96, 153840(2022).
  21. Lu, W. Osthole down-regulates miR-30a and promotes autophagy to protect rats against myocardial ischemia/reperfusion injury. Turk J Thorac Cardiovasc Surg. 27 (2), 178-184 (2019).
  22. Hou, H., Yang, Y., Chen, R., Guo, Z. Osthole protects H9c2 cardiomyocytes against trastuzumab-induced damage by enhancing autophagy through the p38MAPK/mTOR signaling pathway. Toxicol In Vitro. 93, 105704(2023).
  23. Li, S. H., et al. Osthole stimulated neural stem cells differentiation into neurons in an Alzheimer’s disease cell model via upregulation of microRNA-9 and rescued functional impairment of hippocampal neurons in APP/PS1 transgenic mice. Front Neurosci. 11, 340(2017).
  24. Jiao, Y., et al. Osthole decreases beta amyloid levels through upregulation of miR-107 in Alzheimer’s disease. Neuropharmacology. 108, 332-344 (2016).
  25. Zhang, W., et al. miR-34a enhances chondrocyte apoptosis, senescence and facilitates development of osteoarthritis by targeting DLL1 and regulating PI3K/AKT pathway. Cell Physiol Biochem. 48 (3), 1304-1316 (2018).
  26. Xiong, G., et al. Long non-coding RNA MEG3 regulates the progress of osteoarthritis by regulating the miR-34a/Klotho axis. Ann Transl Med. 10 (8), 454(2022).
  27. Tao, H., Cheng, L., Yang, R. Downregulation of miR-34a promotes proliferation and inhibits apoptosis of rat osteoarthritic cartilage cells by activating PI3K/Akt pathway. Clin Interv Aging. 15, 373-385 (2020).
  28. Zafar, S., et al. Osthole: A multifunctional natural compound with potential anticancer, antioxidant and anti-inflammatory activities. Mini Rev Med Chem. 21 (18), 2747-2763 (2021).
  29. Zhang, H., Zheng, W., Li, D., Zheng, J. miR-146a-5p promotes chondrocyte apoptosis and inhibits autophagy of osteoarthritis by targeting NUMB. Cartilage. 12 (10), 1467S-1477S (2021).
  30. Lu, R., et al. Oroxin B alleviates osteoarthritis through anti-inflammation and inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and enhancement of autophagy. Front Endocrinol. 13, 1060721(2022).
  31. Lv, X., et al. miR-34a-5p was involved in chronic intermittent hypoxia-induced autophagy of human coronary artery endothelial cells via Bcl-2/beclin 1 signal transduction pathway. J Cell Biochem. 120 (11), 18871-18882 (2019).
  32. Ma, L., et al. Knee osteoarthritis therapy: Recent advances in intra-articular drug delivery systems. Drug Des Devel Ther. 16, 1311-1347 (2022).
  33. Zhang, W., et al. GelMA hydrogel as a promising delivery system for osthole in the treatment of rheumatoid arthritis: targeting the miR-1224-3p/AGO1 axis. Int J Mol Sci. 24 (17), 13210(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

OstholeWestern BlotqRT PCR
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.