מאמר שיטה

נהלים לזיהוי מעכבי כניסה ל-SARS-CoV-2 כאנטי-ויראליים פוטנציאליים באמצעות פסאודו-וירוסים מבוססי MLV

DOI:

10.3791/69628

⸱

27 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Biología Celular y Molecular de enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT AIP), 2Maestría en Ciencias Biomédicas, Universidad de Panama, 3Sistema Nacional de Investigación (SNI), SENACYT

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה ליצירת חלקיקים מדומים מסוג SARS-CoV-2 באמצעות מערכת מדווח לוסיפראז ואת השימוש בה לזיהוי מעכבי כניסה. פרוטוקולים אלו מודגים באמצעות שני מעכבי כניסה שונים: חלבון מיזוג ACE2-Fc האנושי רקומביננטי והתרכובת המולקולית הקטנה ארבידול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגיף SARS-CoV-2 הוא פתוגן זואונוטי מתהווה שגרם לעומס עצום של מחלות ותמותה ברחבי העולם מאז הופעתו ב-2019. פלטפורמות בטוחות ונגישות להערכת כניסת וירוס ותרכובות אנטי-ויראליות פוטנציאליות נשארות חיוניות לגילוי מתמשך של תרופות נגד וריאנטים מתפתחים. מאמר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי מאוד ליצירת חלקיקים פסאודוטיפיים המבוססים על נגיף לוקמיה עכברית (MLV) המבטאים את חלבון הקוץ SARS-CoV-2 ונושאים גן מדווח לוסיפראז, המאפשר חקר חדירת וירוס בתנאי בטיחות ביולוגית 2. השיטות המתוארות מפרטות שימוש בקווי תאים אופטימליים, יעילות טרנספקציה גבוהה באמצעות מגיבים חסכוניים, ייצור פסאודו-וירוסים יעילים מאוד, וטיטרציה של הזיהום כדי לקבוע את הקלט הוויראלי המינימלי לבדיקות סקר. תוצאות מייצגות מראות פעילות לוסיפראז חזקה בתאים נגועים בהשוואה לביקורת שאינה נגועה, בעוד שביקורת ללא קוץ ו-VSV-G-פסאודו-וירוסים מאשרים את הספציפיות לבדיקה. יתרה מזאת, המערכת תומכת בסקר תרכובות על ידי כימות השפעות מעכבות על כניסת הווירוס והערכת ציטוטוקסיות באמצעות בדיקת הקיימות של MTT. בסך הכול, פרוטוקול שכפול וניתן להרחבה זה מספק פלטפורמה אמינה לסינון בקצב בינוני עד גבוה של מעכבי כניסה חדשים לווירוסים, תורם לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים ולקידום מחקר על מנגנוני כניסה ל-SARS-CoV-2.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הופעת נגיף הקורונה של תסמונת נשימתית חריפה חמורה 2 (SARS-CoV-2) בסוף 2019 הובילה למגפה עולמית שגרמה למיליוני מקרי מוות ברחבי העולם וממשיכה להוות איום באמצעות וריאנטים חדשים עם יכולת הדבקה מוגברת ויכולת בריחה חיסונית1. כנגיף RNA עטוף ממשפחת הקורונאוורידיי, SARS-CoV-2 משתמש בגליקופרוטאין הטרימרי (S) שלו כדי לתווך כניסת תאי המארח על ידי קישור לאנזים הממיר אנגיוטנסין 2 (ACE2) והפעלה פרוטאוליטית על ידי TMPRSS2 ופרוטאזות מארחים אחרות 2,3. בעוד שפותחו מספר אפשרויות טיפול לניהול תסמיני COVID-19, ההתפתחות המתמשכת וההתפתחות המהירה של וריאנטים ויראליים מדגישים את הצורך הדחוף במערכות בטוחות וניתנות להרחבה לחקר כניסת וירוס ולהעריך תרכובות אנטי-ויראליות חדשות המיועדות לשלב מוקדם זה בזיהום4.

נגיף SARS-CoV-2 נשאר מסווג כסוכן בטיחות ביולוגיתרמה 3 5 באזורים מסוימים בשל פוטנציאל ההעברה הגבוה שלו. לכן, כל משימת מעבדה משכפלת דורשת מתקן BSL-3 עם שליטה גבוהה, מה שמקשה על רוב המעבדות בשטח לבצע מחקר מדעי עם הווירוס הזה. מערכות מבוססות וירוסים פסאודוטייפיות, הידועות גם כפסאודו-וירוסים (PVs), מציעות חלופה מעשית המאפשרת מחקרי כניסת וירוס במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), ומרחיבה את הנגישות למאמצי מחקר גלובליים6. החלקיקים הפסאודוטיפיים הנושאים את חלבון הקוץ SARS-CoV-2 אינם משכפלים, מה שהופך אותם לפונדקאים בטוחים להערכת כניסת וירוס ולסינון מעכבי מולקולותקטנות. חלקיקים אלו יכולים להיות מהונדסים לשאת גן לוסיפראז או מדווח פלואורסצנטי, מה שמאפשר זיהוי מהיר וכמותי של זיהום על ידי מדידת אות המדווח בתאים נגועים. מערכות המבוססות על וירוס לוקמיה עכברית (MLV) או עמוד השדרה של לנטיווירוס שימשו רבות לחקר כניסת SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, וירוס האבולה ואחרים 8,9,10,11.

בפרוטוקולים אלו אנו מתארים את יצירת PVs מבוססי MLV באמצעות מערכת תלת-פלסמידית, בהתבסס על העבודה שדווחו על ידי מילט וויטאקר8. הפלסמידים בהם השתמשו כוללים פלסמיד אריזה המקודד את גני הליבה של MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol), וקטור העברה המקודד את גן המדווח לוסיפראז (pTG-Luc), ופלסמיד המבטא את גליקופרוטאין ה-SARS-CoV-2 התואם לווריאנט המקורי של Wuhan-Hu-1. בנוסף, פסאודו-וירוסים נוצרים גם באמצעות G-גליקופרוטאין של וירוס הסטומטיטיס הוזיקולרי (VSV-G) לשימוש מאוחר יותר כסינון נגד פגיעות פוטנציאליות. פסאודו-וירוסים מיוצרים בתאים שמקורם ב-HEK293 ומשמשים להדבקת תאים רגישים מאוד המבטאים באופן יציב hACE2 ו-TMPRSS2. יעילות הטרנספקציה מוערכת תחילה באמצעות פלסמיד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). לאחר מכן, באמצעות תנאי טרנספקציה אופטימליים, PVs נוצרים על ידי קו-טרנספקציה של שלושת הפלסמידים הללו, ולאחר מכן טיטרציה של הווירוסים המתקבלים. באמצעות כמות מתאימה של PVs, מתבצעת בדיקה בלוחות 96 בארות כדי לאתר תרכובות שיכולות לעכב את כניסת הווירוסים. פרוטוקול זה עושה שימוש בפוליאתילנימין מסועף (PEI) כמגיב טרנספקציה חסכוני, המאפשר יישום קל יותר של ההליכים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טרנפקציה יעילה של תאים שמקורם ב-HEK293T באמצעות פוליאתילנאמין מסועף (PEI)

הערה: בצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקת אספטיקה סטנדרטית ונהלי BSL-2. השתמש בתאים שמקורם ב-HEK293T לטרנספקציה ויצירת וירוסים פסאודוטיפיים. בשיטה זו התאים מועברים לשישה לוחות באר שטופלו בתרביות תאים. פתרון המלאי של PEI מוכן כפי שתואר קודם על ידי יאנג ועמיתיו (2017)12. לפני ביצוע הטרנספקציה המשולשת ליצירת הפסאודו-וירוס, מומלץ לאופטם את הפרופורציה הטובה ביותר של PEI-פלסמיד DNA כדי להבטיח יעילות טרנספקציה גבוהה (יותר מ-70-80%). אופטימיזציה זו צריכה להתבצע על ידי טרנספקציה של פלסמיד מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ולאחר מכן בדיקת יחס התאים הפלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאופטימיזציה זו, שמרו על DNA פלסמיד קבוע ב-2.5 מיקרוגרם לבאר ובדקו כמה כמויות של PEI, בטווח של 1-20 מיקרוליטר. להלן התנאים הטובים ביותר לכמות אלו של תאים ו-PEI, הכוללים 5 מיקרוליטר של תמיסת PEI (1 מ"ג/מ"ל) ו-2.5 מיקרוגרם פלסמיד המבטא GFP לכל באר בלוח של 6 בארות.

  1. זרע 7.5 x 10 תאים שמקורם ב-HEK293 בכל באר בפלטת תרבית רקמה עם 6 בארות, בנפח כולל של 2 מ"ל לבאר של מדיום שלם (DMEM-C: Dulbecco's Modified Eagle's Medium בתוספת 10% סרום בקר עוברי מושבת-חום (FBS), 20 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין אתןסולפונית חומצה (HEPES), 100 IU/mL פניצילין, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) 24 שעות לפני ההעברה.
    הערה: בעת זריעת תאים, הימנעו מהזזת לוח תרבית הרקמה בתנועות מעגליות, שכן הדבר עלול לגרום להצטברות תאים במרכז הבארות, מה שמוביל להתפלגות תאים לא סדירה ובהמשך לירידה ביעילות הטרנספקציה. לוח אחד עם 6 בארות מספיק לניסוי אחד, כולל באר אחת כבקרה תאית (לא מועברת), ושאר הלוח לבדיקת מספר פרופורציות של DNA של PEI-פלסמיד.
  2. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ במהלך הלילה. למחרת, ודאו שהתאים מתחברים בכ-50-60%.
  3. ביום הטרנספקציה, יש להכין את קומפלקסי ה-DNA של PEI-פלסמיד בצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים בנפח 1.5 מ"ל.
    1. לכל באר, יש להכין צינור תמיסת PEI המכיל 5 מיקרוליטר של מאגר PEI (1 מ"ג/מ"ל) ב-50 מיקרוליטר של מדיום סרום ממוחזר, וצינור תמיסת DNA אחד המכיל 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד המבטא GFP, ב-50 מיקרו-ליטר מאותו תווך.
    2. אם יש לעבור מספר בארות, ניתן להגדיל את הפתרונות בהתאם. ערבבו כל צינור בקצרה במערבולת וסובבו למטה במשך 5 שניות. דגר צינורות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות.
  4. במהלך תקופת הדגירה, הסר בזהירות את המדיום מכל באר של לוח 6 הבארות, כדי למנוע הפרעה לשכבת התא. החלף בזהירות ב-1 מ"ל לבאר של מדיום טרנספקטיה מלא (DMEM-T, כמו DMEM-C, אבל ללא אנטיביוטיקה).
  5. הכינו את קומפלקס הטרנספקציה. לאחר 10 דקות הדגירה, הוסף את 50 מיקרול צינור תמיסת ה-DNA לצינור התמיסה של PEI. ערבב במהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שש פעמים ודגירה ב-RT בדיוק 3 דקות. מיד המשיכו להוסיף קומפלקס טיפה לתאים בכל באר מתאימה.
  6. אטום את גבולות הלוח עם פרפילם וצנטריפוגה בעוצמה של 1,000 x g למשך 30 דקות ב-RT, ללא בלם, באמצעות רוטור מתנדנד ודלי לוח.
  7. לאחר הצנטריפוגה, הסר בעדינות את הפרפילם ודוגר את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 3 שעות.
  8. לאחר הדגירה, הסר בעדינות את מדיום הטרנספקציה מכל באר והחליפו בהדרגה ב-2 מ"ל DMEM-C מחומם מראש לכל באר.
  9. דגרו תאים שעברו טרנספקט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ במשך 48 שעות.
  10. הערכת יעילות הטרנספקציה באמצעות ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תדירות התאים הפלואורסצנטיים צריכה להיות גבוהה מ-70-80% (איור 1). זה קריטי ליעילות השיטה הבאה בסעיף 2.

2. יצירת חלקיקים פסאודו-ויראליים מדוברים של SARS-CoV-2 ו-VSV-G

הערה: שיטה זו משתמשת באותו הליך כמו סעיף 1, למעט שבמקום להשתמש בפלסמיד GFP, התאים יועברו טרנספטקט משותף עם שלושת הפלסמידים הנדרשים ליצירת וירוסים פסאודוטיפיים, תוך שימוש בתנאי טרנספקציה אופטימליים להבטחת יעילות טרנספקציה גבוהה. הפרוטוקול משתמש גם בתאים שמקורם ב-HEK293T בלוחות של 6 בארות, מספיקים לשלושת התנאים הנדרשים הבאים: א) תאים שלא עברו טרנספקט (באר אחת), ב) תאים שעברו טרנספקט רק עם הפלסמיד מאריזת MLV וקטור העברת דיווח הלוציפראז (באר אחת; פסאודו-וירוסים ללא קוצים) ו-ג) תאים שעברו טרנספקט עם שני פלסמידים אלו ופלסמיד מבטא הקוצים ליצירת וירוסים פסאודוטיפיים של SARS-CoV-2 (ארבעה בארות). הפלסמיד המבטא קוץ שבו משתמשים כאן מקודד את העלייה של זן ווהאן SARS-CoV-2, ומכיל שינויים ברצף כדי לאפשר הצגה יעילה של החלבון ב-PVs. הפסאודו-וירוס ללא קוץ יידרש כבקרה מאוחר יותר במהלך זיהומים, כדי לאמת את הכניסה התלויה בקוץ בתאים מתירים. באופן דומה, VSV-G-PVs נוצרים באותו עיצוב ניסויי לשימוש מאוחר יותר כסינון נגד של תרכובות מעכבות פוטנציאליות. אם נדרש נפח גדול יותר של פסאודו-וירוס, ניתן להגדיל את הפרוטוקול לשני לוחות של 6 בארות, מה שעשוי להיות גם מעשי לשלב הצנטריפוגציה של הלוחות.

  1. ביום שלפני הטרנספקציה, זרעו תאים שמקורם HEK293T לשני לוחות עם 6 בארות, כפי שמתואר בסעיף 1. השתמש בלוח אחד ליצירת PVs קוצניים ובשני ל-VSV-G-PV.
  2. ביום הטרנספקציה, הכינו את תערובות הטרנספקציה כפי שמוצג בטבלה 1, בהתאם לשלב 1.3.
    הערה: פתרון PEI מוכן כפי שדווח קודם12. פלסמידים pCMV-MLVgagpol ו-pTG-Luc הושגו ממילט וויטאקר8. פלסמיד pVSV-G התקבל מ-Gee ואח' 202013. כל הפלסמידים צריכים להיות מוכנים מראש כהכנה איכותית, ללא אנדוטוקסים. מומלץ להשתמש בערכות מקסיפרפ מסחריות, עם שלב סופי של סינון סטרילי באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרון עם קישור נמוך.
  3. מערבבים כל צינור כפי שמתואר בסעיף 1 ודגרו ב-RT למשך 10 דקות.
  4. במהלך הדגירה, הסר בזהירות את המדיום מכל באר של לוחות 6 הבארות, כדי להימנע מהפרעה לשכבת התא המונולרית. החלף בהדרגה ב-1 מ"ל מדיום DMEM-T מחומם מראש לכל באר, כדי להבטיח שהמדיום זורם לאורך קיר הבאר ולא ישירות על התאים.
  5. הכינו קומפלקסים לטרנספקציה כפי שמתואר בסעיף 1 וטרנפקטים תאים באמצעות הפרוטוקול שתואר קודם.
  6. לאחר 48 שעות הדגירה לאחר הטרנספקציה, אספו את הסופרנטנטים, העבירו אותם לצינורות צנטריפוגה חרוטיים סטריליים בנפח 50 מ"ל, ולצנטריפוגה ב-290 x גרם למשך 7 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנאנט החופשי מהתאים, וסינן אותו באמצעות פוליווינילידן פלואוריד (PVDF), יחידת סינון סטרילית של 0.45 מיקרון מעל הבקבוק. הכינו אליקוטים של 1 מ"ל ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: חלקיקים פסאודוטיפיים יציבים בטמפרטורה של -80°C למשך מספר חודשים. הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים כדי לשמור על הזיהום.
ל-SARS-CoV-2 עם קוץ PV (לכל באר)עבור VSV-G-PVs (לכל באר)עבור PVs ללא קוצים (לכל באר)
פתרון PEI:
PEI (1 מ"ג/מ"ל)15 מיקרוליטר5 מיקרוליטר5 מיקרוליטר
מדיום סרום מופחת45 מיקרו ליטר45 מיקרו ליטר45 מיקרו ליטר
תמיסת DNA של פלסמיד:2
pCMV-MLVgagpol0.79 מיקרוגרם0.79 מיקרוגרם0.79 מיקרוגרם
pTG-luc0.92 מיקרוגרם0.92 מיקרוגרם0.92 מיקרוגרם
pUNO1-spike0.79 מיקרוגרם--
pVSV-G-0.79 מיקרוגרם-
מדיום סרום מופחתעד 50 מיקרוליטרעד 50 מיקרוליטרל-50 מיקרוליטר

טבלה 1: הכנת תערובות טרנספקציה ליצירת PVs.

3. טיטרציה של חלקיקים פסאודוטיפיים של SARS-CoV-2 ו-VSV-G

הערה: שלב זה חיוני לאישור שהחלקיקים הפסאודוטיפיים המיוצרים הם מדבקים ולקבוע את הנפח האפקטיבי המינימלי הנדרש ליישומים במורד הזרם כמו סקר מורכב. הטיטרציה צריכה להתבצע עבור כל אצווה חדשה של פסאודו-וירוס. למטרה זו, תאים רגישים מאוד לזיהום ב-SARS-CoV-2 (תאי HSI) נדבקים בכמויות הולכות ופוחתות של וירוסים פסאודוטיפיים. כניסת הפסאודו-וירוסים, המתווכת על ידי אינטראקציה בין ACE2 בין קוץ לאדם, או על ידי VSV-G עם קולטנים תאיים אחרים, מנוטרת 72 שעות לאחר מכן על ידי זיהוי פעילות הלוציפראז במבחן לומינסציה.

  1. יום לפני ההעברה, זרעו 2.5 x 104 תאי HSI בכל באר בלוח תרבית רקמה של 96 בארים, ב-50 מיקרוליטר של מדיום שלם (DMEM-C). הכינו שלושה בארות לכל כמות של פסאודו-וירוס לבדיקה, וכללו בארות לזיהום, גם עם פסאודו-וירוסים ללא קוצים, ולתאים שאינם נגועים. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ במהלך הלילה.
  2. ביום ההעברה, הפשיר אליקו אחד מכל אצווה פסאודו-וירוסית לבדיקה על קרח וערבב בעדינות באמצעות היפוך. כלול גם אליקו אחד של הבקרה ללא קוצים. הוסף לכל באר ישירות כמויות של הכנת הפסאודו-וירוס (100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5 ו-0.8 מיקרוליטר). כוונן את נפחי כל הבארות ל-150 מיקרוליטר עם DMEM-C.
  3. אטום את הפלטה עם פאראפילם וצנטריפוגה ב-2,500 × גרם למשך 45 דקות ב-RT, בלי בלם.
  4. הסר את חותם הפרפילם ודוגר את הפלטה במשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
  5. לאחר הדגירה, יש להתכונן לבדיקת הלוציפראז בהתאם להוראות היצרן. הפשרה של מצע הלוציפראז (מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס) ו5 פעמים בופר לליזיס של בדיקת לוסיפראז (מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס) ומאוזנת ב-RT (10-15 דקות).
  6. מדלל את בופר הליזה של מבחן לוסיפראז ל-1x עם מים סטריליים. תכין לפחות 3 מ"ל.
  7. שאפו לאט ובזהירות והשליכו את הסופרנטנט של כל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
  8. הוסף 30 מיקרוליטר של בופר ליזיס 1x לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. הניחו את הפלטה במנער לוחות למשך 10 דקות במהירות 150 סל"ד, ב-RT. באמת את הליזה המלאה תחת מיקרוסקופ הפוך (כל התאים צריכים להיות מפורקים ולא ניתנים להבחנה בבדיקה ויזואלית).
    הערה: יש להכין מראש את קורא המיקרופלט לביצוע זיהוי זוהר מיד לאחר הוספת המצע, כדי להבטיח עקביות ולמנוע דעיכת אות.
  9. העבר את הליזטים ללוח לבן, אטום עם 96 בארות.
  10. הוסיפו 50 מיקרו-ליטר של מצע לוסיפראז לכל באר וערבבו לזמן קצר על ידי תנועת הלוח בתנועה מעגלית. הנח את הלוחית בלומינומטר ומדד את הלומינסנציה.
  11. נתח את הנתונים שהתקבלו.
    1. וודא שהבקרות נותנות את ערכי הזוהר הצפויים. ודא שהתאים הלא נגועים נותנים ערכי זוהר רקע נמוכים מאוד.
      הערה: תאים שנדבקו בפסאודו-וירוס ללא קוץ צריכים לתת ערכים ברמת תאים לא נגועים, ותאים שנדבקו בכמויות פוחתות של פסאודו-וירוס המציג קוץ צריכים להראות ערכי לומינציה גבוהים ותלויי מינון (איור 2). ערכי הלומינסנציה שנוצרים על ידי VSV-G-PVs בדרך כלל גבוהים בהרבה מאלו של PVs קוצניים, בערך סדרי גודל של אחד או שניים.
    2. לסינונים הבאים, בחרו את כמות הפסאודו-וירוס שמייצרת אות לפחות מאה עד אלף פעמים מזה של התאים הלא נגועים.

4. סקר תרכובות לעיכוב כניסה לפסאודו-וירוס באמצעות ספייק-PVs

  1. זרעו 2.5 x 104 תאי HSI לכל באר ב-50 מיקרוליטר של מדיום שלם (DMEM-C) בלוח עם 96 בארות, כפי שמתואר בסעיף 3. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
    1. שקלו עיצוב לוחית שכולל עמודות 1 עד 11 לתרכובות בתוספת פסאודו-וירוס, ועמודה 12 לבקרות. בעמודה 12, הקצה ארבע בארות לבקרת וירוסים (רק פסאודו-וירוס) וארבע בארות לתאים לא נגועים ולא מטופלים.
  2. למחרת, יש להכין דילול סדרתי (1:3) של תרכובות לבדיקה, החל מ-50 מיקרומולר (ריכוזים סופיים במהלך זיהומים: 50, 16.6, 5.5, 1.8, 0.6, 0.2 ו-0.06 מיקרומון), ב-DMEM-C המכיל 0.5% DMSO.
    1. לנוחות, יש להכין דילול בלוח דילול נפרד עם 96 בארים, שבו מתבצעים תחילה דילול סדרתי ואז מועברים (50 מיקרוליטר) לפלטה המכילה את התאים.
    2. אם מספר התרכובות גדול מאוד, בסדר גודל של מאות או יותר, הפחיתו את סדרת הדילול הראשונה לכ-4 נקודות, תוך שימוש באר אחת לכל נקודת דילול, ושקול סינון מוקדם. לאחר מכן, בדקו מחדש את הפגיעות הפוטנציאליות באמצעות דילול סדרתי בן 7 נקודות, 1:3, עם שלושה שכפולים, החל מריכוז זהה של 50 מיקרומון.
  3. לאחר שהדילול של התרכובות מוכן, יש לשאוב בעדינות את מדיום התאים באמצעות פיפטה רב-ערוצית ולהוסיף 50 מיקרו-ליטר של דילול תרכובות לבארות המתאימות. דגרו במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. לבקרות בעמודה 12, הוסיפו רק DMEM-C.
  4. בלי להסיר את התרכובות, מוסיפים לכל באר את כמות הפסאודוטיפ של פסאודו-וירוס SARS-CoV-2, בנפח של 50 מיקרוליטר של מדיום שלם, המכיל את התרכובות בריכוזים זהים. אטום את הלוחות עם פאראפילם.
  5. צנטריפוגה את הלוח ב-2,500 × גרם למשך 45 דקות ב-RT ללא בלם, ואז הסר את הפרפילם ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 למשך 72 שעות.
  6. המשך עם כימות ההדבקה מבוסס לוסיפראז כפי שמתואר בסעיף 3.
  7. בצע ניתוח נתונים.
    1. ייצוא ערכי לומינסנציה לגיליון אלקטרוני כדי לעצב את הנתונים לייבוא נוסף לתוכנות ניתוח נתונים וגרפים.
    2. הכן גרפים עמודות המציגים את ממוצע כל נקודת ריכוז, כולל השגיאה הסטנדרטית של הפסים הממוצעים. ציין גם את הערכים שהתקבלו מביקורות חיוביות (PVs בלבד) ושליליות (תאים לא נגועים).
      הערה: תוצאות הבדיקה נחשבות תקפות אם 1) תאים לא נגועים מראים ערכים נמוכים מאוד, 2) בקרות PVs מראות ערכים גבוהים, 3) שליטה חיובית בעיכוב (כלומר, ארבידול או hACE2-Fc) מראה עיכוב זיהום, בהתאם למינון (איור 3A, B).
    3. לאחר מכן, התבוננו בערכים שנוצרים על ידי תרכובות לא ידועות כדי להעריך אם יש עיכוב ואם יש השפעה תלויה במינון. אם כן, יש לחשוף את התרכובות הללו לניתוחים מאשרים נוספים.
      הערה: לאישור נוסף של פגיעות פוטנציאליות, עקבו אחר הצעדים הבאים. ראשית, בדוק מחדש את תרכובות הפגיעה הפוטנציאליות כפי שהוצע בשלב 4.2. אם השפעת תגובת המינון מאושרת, יש לבצע סקר נגד באמצעות אותה סדרת דילול אך מדביק ב-VSV-G-PVs. בדיקה זו חשובה כדי לבדוק האם עיכוב הכניסה הוא ספציפי לאינטראקציה בין ספייק-ACE2, ואינו נובע מהפרעה בשלב אחר מאוחר יותר במהלך ייצור הלוציפראז בתאים הנגועים (איור 3A, B). כאן, התרכובת החיובית לא אמורה להראות פעילות מעכבת נגד VSV-G-PVs. אם זה המצב, אז יש לבדוק את אותה סדרת ריכוזים לציטוטוקסיות באמצעות מבחן קיום תאים (בדיקת MTT, המוצגת בסעיף 5). לסיכום, תרכובת פגיעה פוטנציאלית צריכה להראות עיכוב של SARS-CoV-2-spike-PVs, וללא או פחות עיכוב של VSV-G-PVs, ואין, או לפחות עיכוב חלש בהרבה של חיוניות התאים. התאמת עקומת מינון-תגובה באמצעות נתוני הזוהר תאפשר הערכת ריכוז מעכב חצי-מקסימלי (IC50) לעיכוב ה-PVs, וריכוז ציטוטוקסי חצי-מקסימלי (CC50) מבדיקת ההישרדות. היחס CC50 / IC50 משמש לחישוב מדד הסלקטיביות (SI), שהוא אינדיקטור חשוב לפוטנציאל השימושיות של התרכובת החיובית. לניתוח עקומות המינון-תגובה והערכת IC50 ו-CC50 תוארו נהלים מפורטים מאוד:14.

5. בדיקת קיום תאים מבוססת MTT

  1. זרעו 2.5 x 104 תאי HSI לכל באר ב-50 מיקרוליטר DMEM-C בפלטת 96 בארות. דגרו את הצלחת בלילה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂. ודא שהתאים מגיעים לכ-50% מפגש ביום הבא. הכינו מספיק בארות, תוך התחשבות בכל הריכוזים השונים של התרכובת להערכה, תאים לא מטופלים, ובארות ריקות המכילות רק מדיום, בשלושה עותקים. בדקו את התרכובות הפוטנציאליות באותם ריכוזים שנבדקו במבחן עיכוב הכניסה ל-PV.
  2. לאחר הדגירה, מסירים בזהירות את המדיום והחליפו ב-100 מיקרוליטר של מדיום שלם המכיל ריכוזים שונים של התרכובת להערכה, ב-0.5% DMSO.
  3. צנטריפוגה של הפלטה ב-2,500 × גרם למשך 45 דקות ב-RT ללא בלימה, ודגרה במשך 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. שלב זה נכלל כדי לטפל בתאים בדיוק כפי שנעשה בסעיף הקודם, למעט הוספת ה-PVs.
  4. הכינו תמיסת MTT של 0.5 מ"ג/מ"ל באמצעות DMEM. סטריליזציה על ידי סינון של 0.2 מיקרון ושמירה על החושך.
    הערה: 3-(4,5-דימתיל-2-תיאזוליל)-2,5-דיפניל-2H-ברומיד טטרזוליום (MTT) רגיש לאור. הוא צריך להישאר קפוא, בחושך.
  5. הסר בזהירות את המדיום מכל באר והחלף אותו ב-100 מיקרוליטר של תמיסת MTT. דגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2.
  6. במהלך דגירה זו, יש להכין תמיסת מסיסה המכילה 40 mM HCl באלכוהול איזופרופיל.
  7. הסר בזהירות את תמיסת ה-MTT באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מבלי להפריע לגבישי הפורמזן בתחתית כל באר.
  8. הוסף 100 מיקרוליטר מפתרון המסיסות לכל באר. עטוף את הפלטה בנייר אלומיניום והניח אותה על מנער צלחות במהירות 150 סל"ד למשך 15 דקות.
  9. שיא הספיגה ב-570 ננומטר ו-630 ננומטר.
  10. בצע ניתוח נתונים.
    1. באמצעות ערכי הצפיפות האופטית הגולמיים, הפחת את הערכים המתקבלים ב-630 ננומטר מאלו שמתקבלים ב-570 ננומטר עבור כל באר. לאחר מכן ממוצע את הערכים המתוקנים של בארות התאים שלא טופלו. תחשוב על התאים הלא מטופלים האלה כחיוניים ב-100%.
    2. לאחר מכן נרמול ערכי התאים המטופלים מול בארות התאים שלא טופלו, באמצעות הנוסחה:
      כדאיות (%) = figure-protocol-1
  11. אחוזי הכדאיות בגרף כעמודים המייצגים את הממוצע משכפלים ±± שגיאת תקן של הממוצע. לבצע ניתוח סטטיסטי נוסף להשוואת קבוצות באמצעות הליכים המיושמים בתוכנת ניתוח נתונים וגרפים, תוך השוואת כדאיות בריכוזים שונים עם בקרת התאים שלא טופלו.
  12. השוו את ממוצע כל נקודת ריכוז לאלו של התאים שטופלו רק ב-DMSO באמצעות Kruskal-Wallis לא פרמטרי עם מבחן פוסט-מבחן Dunn (ההבדלים נחשבים משמעותיים בערכי p < 0.05). לשרטוט עקומת מינון-תגובה והערכת CC50 מתוך ערכי OD, בדוק את ההליך שדווח על ידי14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דווח על מספר שיטות טרנספקציה שמייצרות PVs, כולל פוספט סידן15, שיטות מבוססות ליפידים16 ו-PEI, הן ליניאריות והן מסועפות. מאמר זה מראה כי טרנספקציה של תאים שמקורם ב-HEK293T עם PEI מסועף מאפשרת טרנספקציה יעילה מאוד (איור 1), בדרך כלל דומה לשיטות טרנספקציה המשתמשות בסוכני טרנספקציה מבוססי ליפידים מסחריים (הנתונים לא מוצגים). תוצאות מייצגות התואמות לכמות האופטימלית של PEI שנמצאה בתנאים שלנו, המקבילות ל-5 מיקרוליטר של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגמישות הזו של מערכת ה-MLV ליצירת פסאודוטיפים לווירוסים אחרים דווחה על ידי וירוסים חשובים נוספים, כגון וירוס האבולה18, MERS-CoV8, SARS-CoV19, וירוס לה קרוס20, הנטאווירוס20, וירוס ויסנה21, ארנירוס22, וירוס שפעת23 ואחרים. פסאודוטיפים אלו היו שימושיים מאוד למגוון יישומים הכוללים חקר הטרופיזם

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למערכת הלאומית לחקירות (SNI) ולמזכירות הלאומית של התעשייה, טכנולוגיה וחדשנות (SENACYT, פנמה) על תמיכה כספית במסגרת חוזה SENACYT מס' 031-2022 וחוזה SNI מס' 050-2023. אנו גם מודים מאוד לד"ר גארי וויטאקר על תרומת הפלסמידים pCMV-MLVgagpol ו-pTG-Luc.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2 ומיקרו; m מסנני מזרקים בעלי קישור חלבון נמוך  תרמו-סיינטיפיק720-1320מסנני מזרק (0.2 & mu; m, 13 מ"מ, PES, סטרילי)
0.25% פתרון Trypsin-EDTA 1Xגיבקו25200-056טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום
0.45 ומיקרו; יחידות סינון עם מכסה בקבוק PVDF  אוונטור514-1045מערכות סינון ואקום על הבקבוק (PVDF, 250 מ"ל, 50 מ"מ, 0.45 ומיקרו; m)
צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים בנפח 1.5 מ"לאפנדורף30123611מנעול בטוח  שפופרות
תמיסת סטרפטומיצין 100X פניציליןקורנינג30-002-CIתמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100x
5 X מבחן לוסיפראז, בופר ליזיס פרומגהE2650חלק ממערכת הבדיקה של פרומגה, Bright-Glo Luciferase
צינורות קוניים סטריליים בנפח 50 מ"לקורנינג 352070צינור צנטריפוגה PP בהיר 50 מ"ל, תחתית חרוטית, סטרילי
לוחות תרבית רקמה עם 6 בארותתרמו-סיינטיפיק140675רב-מנות שטופלו בתרבות תאים
לוחות תרבית רקמה עם 96 בארותתרמו-סיינטיפיק168055Nunc&Trade; MicroWell & trade; 96-באר, פלטת מיקרו-פלט שטוחה שטופלה בדלתא נונקלון
הידרוכלוריד ארבידולסיגמא-אלדריץ'SML0860
פוליאתילנימין מסועף, 25 קילו-דלטוןסיגמא-אלדריץ'408727
מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי  (FV 3000)אולימפוס קו.SKU: FV3000
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אלדריץ'D8418
DMEM (מדיום הנשר המותאם של דולבקו) עם: רמות גבוהות של גלוקוז, L-גלוטמין, פנול אדום, נתרן פירובט)גיבקו11995-065
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקו26140-079מושבתת בחום (56 מעלות; C, 30 דקות)
תאים שמקורם ב-HEK293T (קו תאים Lenti-X 293T)ביוגרפיה של טקרה632180תת-שיבוט שניתן להעברה גבוהה של קו התאים HEK293 ותומך ברמות גבוהות של ביטוי חלבוני וירוס
בופר HEPESגיבקו15630-080
תאים רגישים מאוד לזיהום (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) קו תאים)משאבי BEINR-55293קו התאים HEK293T שונה לביטוי יציב של ACE2 ו-TMPRSS2
חומצה הידרוכלורית  סיגמא-אלדריץ'H1758-500ML
מיקרוסקופ ניגוד מופע הפוך חברת אולימפוס  SKU: 2404040005
איזופרופנולסיגמא-אלדריץ'I9516-500ML
מצע לוציפראזפרומגהE2650חלק ממערכת הבדיקה של לוציפראז בהיר-זוהר
קורא מיקרופלט עם זיהוי זוהרAgilent BioTekBTH1MG
MTT [3-(4,5-דימתילתיאזול-2-יל)-2,5-דיפנילטרזוליום ברומיד]סיגמא-אלדריץ'M2128
לוחות לבנים אטומים עם 96 בארותקורנינג3917מיקרופלטות פוליסטירן שטוחות עם תחתית שטוחה עם 96 בארים עם טיפול TC
פאראפילםבימיסPM999
pcDNA3-EGFP פלסמידאדג'ין13031pcDNA3-EGFP הייתה מתנה מדאג גולנבוק (פלסמיד Addgene # 13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol פלסמיד--נתרם בנדיבות על ידי ד"ר גארי וויטאקר  
סליין עם בופר זרחן ללא Ca2+ ו-Mg2+ (PBS)קורנינג21-040-CVסליין מפוזר בפוספט, פעם אחת ללא סידן ומגנזיום
מערכת Promega PureYield פלסמיד מקסיפרפפרומגהA2393
pTG-Luc פלסמיד--נתרם בנדיבות על ידי ד"ר גארי וויטאקר  
pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (ווהאן) פלסמידאינויווגןp1-spike
פלסמיד pVSV-Gאדג'ין138479pVSV-G הייתה מתנה מאקיצו הוטה (Addgene plasmid # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
חלבון מיזוג ACE2-Fc האנושי רקומביננטיאינויווגןFC-Hace2
מדיום סרום מופחת (Opti-MEM)גיבקו31985-070מדיום סרום מופחת Opti-MEM

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., et al. SARS-CoV-2 and emerging variants: Unmasking structure, function, infection, and immune escape mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 869832(2022).
  2. Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (1), 3-20 (2022).
  3. Le, K., Kannappan, S., Kim, T., Lee, J. H., Lee, H. -R., Kim, K. K. Structural understanding of SARS-CoV-2 virus entry to host cells. Front Mol Biosci. 10, 1288686(2023).
  4. Ayoub, P. G., et al. Improved SARS-CoV-2 spike glycoproteins for pseudotyping lentiviral vectors. Front Virol. 1, 793320(2021).
  5. Lippi, G., et al. Biosafety measures for preventing infection from COVID-19 in clinical laboratories:IFCC Taskforce Recommendations. Clin Chem Lab Med. 58 (7), 1053-1062 (2020).
  6. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  7. Rizatdinova, S. N., Ershova, A. E., Astrakhantseva, I. V. Pseudotyped viruses: A useful platform for pre-clinical studies conducted in a BSL-2 laboratory setting. Biomolecules. 15 (1), 135(2025).
  8. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Murine leukemia virus (MLV)-based coronavirus spike-pseudotyped particle production and infection. Bio Protoc. 6 (23), e2035(2016).
  9. Millet, J. K., et al. Production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting. J Vis Exp. (145), e59010(2019).
  10. Eichler, M., Aksi, E., Pfeilschifter, J., Imre, G. Application of pseudotyped virus particles to monitor Ebola virus and SARS-CoV-2 viral entry in human cell lines. STAR Protoc. 2 (4), 100818(2021).
  11. Thomas, J., et al. Development of a pseudo-typed virus particle based method to determine the efficacy of virucidal agents. Sci Rep. 14 (1), 2174(2024).
  12. Yang, S., Zhou, X., Li, R., Fu, X., Sun, P. Optimized PEI-based transfection method for transient transfection and lentiviral production:PEI-based transfection for lentiviral production. Curr Protoc Chem Biol. 9 (3), 147-157 (2017).
  13. Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nat Commun. 11 (1), 1334(2020).
  14. Ferrara, F., Temperton, N. Pseudotype neutralization assays:From laboratory bench to data analysis. Methods Protoc. 1 (1), 8(2018).
  15. Soneoka, Y., et al. A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 23 (4), 628-633 (1995).
  16. Chen, Y., Miller, W. M., Aiyar, A. Transduction efficiency of pantropic retroviral vectors is controlled by the envelope plasmid to vector plasmid ratio. Biotechnol Prog. 21 (1), 274-282 (2005).
  17. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  18. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses:Identification of receptor-deficient cell lines. J Virol. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  19. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. J Virol. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  20. Ma, M., Kersten, D. B., Kamrud, K. I., Wool-Lewis, R. J., Schmaljohn, C., González-Scarano, F. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan bunyaviruses:A system for analysis of cell tropism. Virus Res. 64 (1), 23-32 (1999).
  21. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. J Virol. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  22. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  23. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. J Virol Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  24. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).
  25. Sholukh, A. M., et al. Evaluation of cell-based and surrogate SARS-CoV-2 neutralization assays. J Clin Microbiol. 59 (10), e0052721(2021).
  26. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiol Res. 258, 126993(2022).
  27. Johnson, M. C., et al. Optimized pseudotyping conditions for the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. J Virol. 94 (21), e01062-e01120 (2020).
  28. Xiaojie, S., Yu, L., Lei, Y., Guang, Y., Min, Q. Neutralizing antibodies targeting SARS-CoV-2 spike protein. Stem Cell Res. 50, 102125(2021).
  29. Cao, L., et al. De novo design of picomolar SARS-CoV-2 miniprotein inhibitors. Science. 370 (6515), 426-431 (2020).
  30. Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913.e7 (2020).
  31. Ahmad, I., Pawara, R., Surana, S., Patel, H. The repurposed ACE2 inhibitors:SARS-CoV-2 entry blockers of COVID-19. Top Curr Chem. 379 (6), 40(2021).
  32. Alqaaf, M., et al. Discovering natural products as potential inhibitors of SARS-CoV-2 spike proteins. Sci Rep. 15 (1), 200(2025).
  33. Chan, C. C. -Y., et al. Identification of novel small-molecule inhibitors of SARS-CoV-2 by chemical genetics. Acta Pharm Sin B. 14 (9), 4028-4044 (2024).
  34. Lei, C., et al. Neutralization of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus by recombinant ACE2-Ig. Nat Commun. 11 (1), 2070(2020).
  35. Wang, X., et al. The anti-influenza virus drug, arbidol is an efficient inhibitor of SARS-CoV-2 in vitro. Cell Discov. 6 (1), 28(2020).
  36. Kang, Y., Shi, Y., Xu, S. Arbidol:The current demand, strategies, and antiviral mechanisms. Immun Inflamm Dis. 11 (8), e984(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MLVSpikethroughput

מאמרים קשורים