הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקר גליקוליזה במיקרוגליה ראשונית באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

258 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69638

⸱

10 באפריל 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר דרך חסכונית לביצוע בדיקת מאמץ גליקוליזית לכימות תכנות מחדש מטבולי במיקרוגליה ראשונית של העכברים. לאחר בידוד וגירוי דלקתי, נמדד קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) באמצעות מגיבים טריים ומותאמים ל-pH, ולאחר מכן נרמול חלבונים כדי לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של היסטים גליקוליטיים.

תקציר

המיקרוגליה, תאי המקרופאגים התושבים במערכת העצבים המרכזית, משנים באופן דינמי את תוכניות המטבוליזם שלהם בתגובה לרמזים פיזיולוגיים ופתולוגיים. הבנת השינויים המטבוליים הללו חיונית להבהרת תפקידם בדלקת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להערכת פרופיל הגליקוליטי של מיקרוגליה ראשונית שבודדה מקורטקסי מוח של עכבר יילודה, באמצעות בדיקת מאמץ גליקוליזה על אנלייזר שטף חוץ-תאי. בדיקה זו מאפשרת מדידה בזמן אמת של ECAR, אינדיקטור לפעילות גליקוליטית הקשורה ל-pH נמוך, כגון לקטט. הגישה שלנו כוללת טיפול במיקרוגליה מתורבתת בתנאים שונים כדי לבחון כיצד מסלולים מטבוליים משתנים בתגובה לגירויים שונים, כולל גירויים פרו-דלקתיים. באופן ייחודי, המעבדה שלנו מכינה תמיסות מלאי טרי של מגיבים שונים, כולל גלוקוז, אוליגומיצין ו-2-דאוקסיגלוקוז (2DG), כדי למקד את ההיבטים השונים של המסלול, תוך התאמת pH מדויקת לכל מגיב כדי להבטיח דיוק ניסיוני ויכולת שחזור. שיטה זו מספקת פלטפורמה איתנה לחקר גליקוליזיס במיקרוגליה ראשונית ומספקת תובנות לגבי מצבם התפקודי בתנאים דלקתיים או רלוונטיים למחלות.

מבוא

תאים במערכת העצבים המרכזית משנים את אופן ייצור האנרגיה בתגובהלתנאים תקינים ומחלות. מבין מסלולי המטבוליזיה המרכזיים, גליקוליזה וזרחון חמצוני (OXPHOS) הם מסלולים מרכזיים שמווסתים את תפקוד תאי מערכת החיסון – הם עוברים תגובה מיידית וחזקה למצבים פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתיים, בהתאמה 3,4. לכן, תאי החיסון יכולים לעבור בין מסלולים מטבוליים בתגובה לאותות דלקתיים למצבים תפקודיים5. מיקרוגליה, כמו מקביליהם המיאלואידיים, קשורים מטבולית לתפקודיהם ומסתגלים במהירות למסלולים שונים כדלק מטבולי חלופי, ומפגינים גמישות מטבולית 6,7. מיקרוגליות עוברות תכנות מטבולי מהיר במהלך דלקת, כאשר גליקוליזה מוגברת משמשת כסימן מטבולי מרכזי למצבים פרו-דלקתיים8. לכן, בדיקות שמזהות תלות תאית בפנוטיפ מטבולי מאפשרות לנו לחקור את מצבם התפקודי בתנאים שונים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו שואפים לקבוע האם מיקרוגליה ראשונית מסתמכת על גליקוליזה מוגברת במהלך מצבים פרו-דלקתיים. לשם כך, אנו מבצעים בדיקות מאמץ של גליקוליזה באופן שגרתי. בעוד שהאנלייזר Seahorse XFe24 (אנלייזר שטף חוץ-תאי) שימש רבות למדידת ECAR בקווי תאים מונצחים ותאים שעברו טרנספורמציה, מיקרוגליה ראשונית מציבה אתגרים טכניים ייחודיים, כולל תפוקות תאים מוגבלות, תכונות היצמדות משתנות ורגישות גבוהה לתנאי תרבית, העלולות לבלבל מדידות מטבוליות. יתרה מזאת, היא מספקת מדידה בזמן אמת של ECAR, ומאפשרת הערכה מדויקת של גליקוליזה מונעת על ידי לקטט בנקודות זמן מרובות, שלא ניתן לתפוס באמצעות בדיקות לקטט בנקודות קצה בלבד. פרופיל מטבולי מבוסס זרם חוץ-תאי אומץ באופן נרחב במחקרי מטבוליזם לאפיון ביואנרגטיקה של תאים, מה שהופך פרוטוקול זה למתאים במיוחד למחקרים החוקרים שינויים מטבוליים בתאים במהלך ההפעלה, מידול מחלות או בדיקות תרופות. הקוראים יכולים לקבוע התאמה בהתבסס על הצורך במדידות גליקוליטיות דינמיות ברזולוציה גבוהה בתוך התאים הראשוניים.

הגלוקוז מתפרץ לפירובט באמצעות גליקוליזה ואז מומר ללקטט בציטופלזמה או ל-CO₂ ולמים במיטוכונדריה. המרת הגלוקוז ללקטט מובילה לשחרור פרוטונים למרחב החוץ-תאי, מה שמוביל לחמצון בתווך. מנתח השטף החוץ-תאי מכמת את החמצה הזו כ-ECAR9. במבחן המאמץ של גליקוליזה, התאים מודגרים תחילה במדיום נטול גלוקוז ופירובטים, ו-ECAR הבסיסי שלהם נרשם. ההזרקה הראשונה מספקת כמות רוויה של גלוקוז, שתאים מפרקים באמצעות גליקוליזה לפירובטים, ומייצרת ATP, NADH, מים ופרוטונים. שחרור הפרוטונים המוגבר מעלה את ECAR, ומשקף 'גליקוליזה'. לאחר מכן מוסיפים אוליגומיצין כדי לעכב את סינתזת ATP המיטוכונדריאלית, מה שמאלץ את התאים להסתמך אך ורק על גליקוליזה. שינוי זה בגרדיאנט הפרוטונים מעלה עוד יותר את ECAR ונמדד כקיבולת הגליקוליטית המקסימלית של התא. לבסוף, 2DG, אנלוג גלוקוז, מוצג בפועל. הוא מעכב הקסוקינאז באופן תחרותי, חוסם גליקוליזה ומפחית את ECAR. ירידה זו מאשרת ש-ECAR קודם היה תלוי בגליקוליזה. ההבדל בין הקיבולת הגליקוליטית המרבית לרמת הגליקוליזה מגדיר את המאגר הגליקוליטי. ה-ECAR הראשוני לפני הוספת הגלוקוז מייצג חמצות לא-גליקוליטית מתהליכים תאיים אחרים (איור 1).

ביצענו בדיקת מאמץ לגליקוליזה באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי. ערכי ECAR גולמיים יוצאו לאקסל לניתוח. לכל מצב זיהינו את נקודות הזמן המתאימות ל-ECAR בסיסי (לפני הוספת הגלוקוז), גליקוליזה (לאחר הזרקת גלוקוז), וקיבולת גליקוליזית (לאחר טיפול באוליגומיצין). ערכי ECAR מנקודות הזמן הרלוונטיות בכל פאזה ובין ארבעת השכפולים הטכניים נמדדו בממוצע, וגליקוליזה חושבה כעלייה ב-ECAR לאחר הוספת גלוקוז. קיבולת הגליקוליז חושבה כעלייה ב-ECAR לאחר הוספת אוליגומיצין. המלאי הגליקוליטי חושב כירידה ב-ECAR לאחר הזרקת 2DG. ערכים ממוצעים אלו שימשו לאחר מכן להשוואת תגובות מטבוליות בין קבוצות.

מצד שני, להערכת קצב צריכת החמצן (OCR) ולהערכת תפקודי המיטוכונדריה, בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלית (Agilent) היא הגישה הסטנדרטית, שמודדת פרמטרים כגון נשימה בסיסית, נשימה מקושרת ל-ATP, דליפת פרוטון, נשימה מרבית, קיבולת נשימתית נוספת ונשימה לא-מיטוכונדרית. מדידות אלו מתקבלות על ידי הזרקה רציפה של מעכבי מיטוכונדריה ספציפיים, אוליגומיצין (מעכב ATP סינתאז), FCCP (קרבוניל ציאניד-4 (טריפלואורומתוקסי) פנילהידראזון), מפריד שמניע את הנשימה המקסימלית, ורוטנון/אנטימיצין A (מעכבי I/III מורכבים), המאפשרים הערכה כמותית של בריאות המיטוכונדריה וביואנרגטיקה 10,11,12,13 . בדיקות ECAR ו-OCR מבוצעות בתנאים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים וקיבלו אישור מוועדת הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ממוריאל בניופאונדלנד לפי פרוטוקול מספר 22-01-DK.

1. הכנות לפני תחילת הניסויים

  1. הכינו תמיסת חיתוך על ידי הוספת 10 mM HEPES ל-1x HBSS ללא Ca2+ ו-Mg 2+.
  2. הכינו תמיסת עיכול (לכל 2–3 מוחות) על ידי שילוב של 1 מ"ל של 2.5% טריפסין (10 פעמים מלאי, לא מדולל), 2 מ"ל תמיסת כריכה, ו-200 מיקרוליטר DNase I (1 מ"ג/מ"ל).
  3. הכינו מדיום גליה מעורב על ידי תוספת DMEM עם 10% FBS, פעם גלוטמקס, ואנטיביוטיקה/אנטימיקוטיקה אחת.
  4. הכינו מדיום מיקרוגליה על ידי תוספת DMEM עם 10% FBS, פעם גלוטמקס, MEM NEAA, פירובט נתרן ופעם פנצילין/סטרפטומיצין.

2. ציפוי לתרבויות גליה מעורבות (איור 2A)

  1. ביום הראשון:
    1. אספו גורי יום לאחר הלידה (P0)-P2 מעכברי C57BL/6C וחילצו את הקורטקס באמצעות מיקרוסקופ סטריאופו, והסירו את קרום המוח. לאחר מכן, נתח את הקורטקס לחתיכות קטנות בתמיסת חיתוך והעבר אותם לצינור קוני של 15 מ"ל. אפשר לרקמות לשקוע בתחתית הצינור.
    2. פנו את תמיסת הניתוח והחליפו ב-3 מ"ל תמיסת עיכול לכל 2–3 מוחות. יש לפרק בעדינות פיפטה סרולוגית בנפח 2 מ"ל כדי להפריד את הרקמה.
    3. הניחו את הצינורות על רוטור בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, וערבבו באמצעות פיפטה סרולוגית בנפח 2 מ"ל כל 8 דקות, בסך הכל כ-24 דקות.
    4. לאחר עיכול הרקמות, בצנטריפוגה של התאים בעוצמה של 300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, להשליך את הסופרנטנט ולתלות את הכדור ב-5 מ"ל של מדיה גליה מעורבת.
    5. באמצעות מחט 18G במזרק של 5 מ"ל, יש לפרק את התאים, ואז להעביר אותם דרך מסננת תאי ניילון של 70 מיקרון. צנטריפוגה שוב את התאים שנאספו ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    6. החזירו את הכדור בתחילה ל-1 מ"ל של מדיום גליה מעורב ומשכו מספר פעמים כדי להסיר גושים תאיים, ואז שוב בהשארה בנפח גבוה יותר, כך שמגיעים עד 12 מ"ל בכל בקבוק T75 (מומלץ 2–3 קליפות מוח לכל בקבוק)
      הערה: אין צורך לצפות את הבקבוק בפולי-די-ליזין או בתגובת אחרת.
  2. ביום השני, תשנה את כל המדיה ותוסיף מדיה גליה מעורבת טרייה.
  3. ביום השלישי, החליפו בערך שנישליש מהמדיה בגליה מעורב טרי. אפשר לתאים לגדול עוד שבעה ימים, בסך הכל 10 ימים.
    הערה: בשלב זה ניתן להבחין בשכבת אסטרוציטים.
  4. ביום השישי, החליפו שני שלישים מהמדיה במדיה גליה מעורבבת טרייה. אשר את נוכחות שכבת אסטרוציטים מתאחדת.

3. השגת מיקרוגליה ראשונית טהורה (איור 2A)

הערה: בסביבות היום העשירי, נראים תאים קטנים ועגולים הצפים מעל שכבת האסטרוציטים; אלו בעיקר מיקרוגליות (איור 2B).

  1. נער את הבקבוק ב-250 סל"ד למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. אסוף את כל המדיה המכילה את התאים הצפים לצינור קוני של 15 מ"ל וצנטריפוגה בעוצמה של 300 x g למשך 10 דקות.
  2. החזירו את הכדור למדיום מיקרוגליה וצלחת כ-250,000 תאים בכל באר בלוחות מיקרו של מנתח השטף החוץ-תאי.
    הערה: כ-3–4 מיליון תאים למיליטר מתקבלים משלושה בקבוקי T75; ציפוי לוחות תרבית התאים בפולי-די-ליזין או תגובות אחרות אינו דרישה.
  3. דגרו את המיקרופלטה ב-5%CO2 למשך 30–45 דקות. לאחר מכן, החלף שוב את המדיה כדי לקבל תרבית מיקרוגליה טהורה ולהסיר אוליגונדרוסיטים שעדיין צפים. התאים מוכנים לטיפול כבר למחרת (איור 2C).
  4. החריגו את ארבע הבארות המוגדרות כבקרות 'רקע' מזריעה של תאים: אחת בכל שורה (איור 3C). בארות אלו מקבלים מדיות בדיקה.
    הערה: מלאו את הבארות שלא נוצלו במים סטריליים או PBS כדי למנוע אידוי מדיה, ולוחמים את התאים בדפוס אקראי במקום בשורות או עמודות קבועות כדי למזער שונות מבוססת פלטות.

4. טיפול במיקרוגליה ראשונית באמצעות גירויים פרו-דלקתיים

  1. ביום ה-11, טפלו בתאים ב-100 ng/mL ליפופוליסכריד (LPS) למשך 24 שעות. אקראי בארות בקרה ובארות שטופלו ב-LPS כדי לשלול השפעות מיקומיות.
    הערה: משך הטיפול עשוי להשתנות בהתאם לתנאי הניסוי ודורש אופטימיזציה מוקדמת.

5. הכנה למבחן השטף החוץ-תאי יום לפני ביצוע הניסוי

  1. ביום ה-11, הוסיפו בופר כיול של 1 מ"ל ללוח הכיול (פורמט 24 בארות; ערכת בדיקת שטף חוץ-תאי) בכל הבארות. שמור על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בלי CO2.
    הערה: לוח הכיול מורכב מ-4 בארות הזרקה. במבחן המאמץ של גליקוליזה, הגלוקוז מתווסף לפורט A, אוליגומיצין לפורט B, ו-2DG מוזרק לפורט C (ראו איור 4A).
  2. הכינו תמיסות גלוקוז ומלאי 2DG
    1. גלוקוז – המיס 90 מ״ג גלוקוז ב-2 מ״ל של מדיית בדיקת שטף חוץ-תאית (טבלת חומרים). בתחילה, ממסים בכ-1.9 מ"ל כך שכאשר ה-pH מותאם ביום הבא עם 1N NaOH, הנפח הסופי לא יעלה על 2 מ"ל, דבר קריטי לשמירת המולריות.
    2. 2DG – המיס 328 מ"ג ב-2 מ"ל של מדיום בדיקת שטף חוץ-תאי.
      הערה: יש לאחסן גם את הגלוקוז וגם את ה-2DG בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה
  3. עליקו 30-40 מ"ל מדיום בדיקה בצינור קוני של 50 מ"ל ואחסנו ב-4 מעלות צלזיוס לביצוע הבדיקות ביום הבא.

6. מבחן שטף חוץ-תאי (יום 12)

  1. ביום ה-12, חממו את הגלוקוז המורכב מראש, 2DG, ואת מדיום הבדיקה המשודר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כווננו את ה-pH של הגלוקוז ו-2DG, ואת זה של מדיום הבדיקה המצוטט, ל-7.4 על ידי הוספת 1N NaOH בהדרגה (למשל, 5 מיקרוליטר, ואז 10 מיקרוליטר).
  2. מערבולת לזמן קצר לערבוב אחיד עד שה-pH מגיע מעל 7.
    הערה: רצועות מד pH מומלצות לניטור pH עקבי.
  3. הוסף 2 מיקרוליטר תמיסה מלאית של 10mM אוליגומיצין ב-2 מ"ל של מדיום בדיקה מותאם ל-pH.
    1. הכנת תמיסת מלאי של 10mM אוליגומיצין: לשחזר בקבוקון של 10 מ"ג אוליגומיצין ב-1 מ"ל DMSO סטרילי, לריכוז של 10 מ"ג/מ"ל, ולשמור בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
  4. הוצא את התאים מהאינקובטור (מהשלב הרביעי) ואסוף את המדיה בצינורות צנטריפוגה מיקרו של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה בצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
  5. אסוף את הסופרנטנט (זרוק את הכדור כדי להיפטר מתאים/פסולת) ואחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למדידות לקטט, כפי שצוין בשלב 8.
  6. שטפו את התאים ב-1 מ"ל של מדיום בדיקה מותאמת pH בעדינות רבה כדי למנוע התרוממות מהתאים.
  7. השליכו את מדיום הבדיקה והוספו 500 מיקרו-ליטר של מדיום בדיקה מותאם ל-pH ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ללאCO2) למשך 45 דקות עד שעה.
  8. בינתיים, הוסף את כל המעכבים הנדרשים ללוח הכיול של מנתח השטף החוץ-תאי בפתחים המתאימים – 55 מיקרוליטר גלוקוז לפורט A בפינה השמאלית העליונה בכל הבארות, 60 מיקרוליטר אוליגומיצין בפורט B לבארות הימניות העליונות ו-65 מיקרוליטר 2DG בפורט C לבארות השמאליות התחתונות (כולל בארות רקע) (ראו איור 4A).
    הערה: העלאת הנפח בכל שלב נדרשת כדי לשמור על המולריות, שכן הנפחים עולים עם הוספת גלוקוז ואוליגומיצין קודמים.
  9. לאחר הוספת המעכבים, יש להגדיר בדיקת מאמץ לגליקוליזה באמצעות תוכנת Agilent Seahorse Wave (ראו איור 3). לאחר מכן, הרץ את לוח הכיול ברגע שהתבקש.
    הערה: הסר את הכיסוי העליון מהפלטה ואת הכיסוי הוורוד בין הלוחות לפני הכנסת לוח הכיול למכונה. במהלך שלב זה, חיישני ה-pH ו-O2 ייבדקו ויבדוק בקרת איכות.
  10. לאחר סיום הכיול, המכונה תבקש לפרוק את לוח הכיול ולטעון את לוח התרבות.
    1. שלב א': בחירת תבנית בדיקה (איור 3A)
      1. פתח את תוכנת Wave , ומחלק התבניות , בחר את תבנית הבדיקה המתאימה לניסוי.
      2. במקרה זה, בחר "XF Glycolysis Stress Test" במנתח השטיפה החוץ-תאי.
    2. שלב II: הגדרת קבוצות ואסטרטגיות הזרקה (איור 3B)
      1. גש ללשונית הגדרות קבוצות וצור קבוצות ניסיוניות (למשל, רקע, שליטה ו-LPS).
      2. הגדר את אסטרטגיית ההזרקה על ידי בחירת התרכובות להזרקה בכל פורט (למשל, גלוקוז, אוליגומיצין, 2DG למבחן לחץ גליקוליזה; הגדרות אלו מוגדרות מראש על ידי התוכנה כברירת מחדל, בדוק בהתאם).
    3. שלב III: הקצאת קבוצות למפת הלוחות (איור 3C)
      1. פתח את תצוגת מפת הלוחות והקצה בארות לכל קבוצה על ידי גרירת שמות הקבוצות (למשל, רקע = שחור, בקרה = ירוק, LPS = אדום) על פריסת הלוחות.
      2. ודא שבארות ריקות/רקע מוגדרות לנרמול מדויק.
    4. שלב IV: הגדרת הפרוטוקול (איור 3D)
      1. בלשונית הפרוטוקול , תכנתו את מחזורי המדידה וההזרקות. רצף טיפוסי לבדיקת מאמץ הגליקוליז כולל חמצון לא-גליקוליטי, הזרקת גלוקוז (פורט A) → מודדת גליקוליזה, הזרקת אוליגומיצין (פורט B) → מודדת קיבולת גליקולית, הזרקת 2-DG (פורט C) → מודדת מאגר גליקוליטי
      2. הגדירו את מספר מחזורי המדידה לאחר כל הזרקה והתאימו את התזמון (למשל, 3 מחזורים של תערובת של 3 דקות, המתנה של 2 דקות, מדידה של 3 דקות).
        הערה: בניסויים שלנו, אנו משתמשים בהגדרות ברירת המחדל של התוכנה.
      3. בדוק את זמן הבדיקה הכולל לפני ביצוע הבדיקה.
    5. שלב V: נרמול (איור 3E)
      1. נרמול נתונים עם ערכי ריכוז חלבון שהתקבלו מבדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA) בתוך תוכנת Wave באמצעות אפשרות הנרמול המובנית (למשל, לפי תכולת חלבון, מספר תא או שיטות זמינות אחרות). מדידות ריכוז החלבון מוצגות בטבלה 1.
        הערה: הפרוטוקול לבידוד החלבון לבדיקת BCA לאחר מדידת ECAR מתואר בשלב 7 הבא.

7. איסוף תאים לכימות ונירמול נתונים

  1. לאחר השלמת בדיקת השטף החוץ-תאי, הסר את צלחת התרבית והמשך מיד למימוש חלבון או לאחסן את הצלחת בטמפרטורה של מינוס 80°C עד שתהיה מוכנה להפקת חלבון.
    הערה: בדיקות חלבון מאפשרות לנו לנרמל ערכים בתנאי טיפול שונים (הן אחת השיטות לנרמול הנתונים, לא היחידה).
  2. לבידוד מיידי של חלבון, יש להסיר את מדיום הבדיקה מהבארות ולשטוף פעם אחת עם 500 מיקרולטר של RT PBS (פעם אחת) (מומלץ לשטוף בעדינות אחת כדי למזער את ההפרעה לשכבת התא).
  3. כדי לאסוף תאים שעשויים להתנתק במהלך תהליך זה, צנטריפוגה את הפלטה פעם אחת ב-300 × גרם למשך 5 דקות, השליכו את ה-PBS, והחזירו את הכדור המתקבל בבופר RIPA כדי להבטיח מדידות חלבון כוללות מדויקות.
  4. הוסיפו כ-75–100 מיקרוליטר של בופר RIPA לכל אחת מהבארות והניחו את הלוח על שייקר (סיבוב נמוך-בינוני) למשך 30 דקות (RT). לאחר מכן, העבר את התכולה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: יש לשלב ולערבב היטב בתוך הבארות לפני העברת בופר ה-RIPA לצינור המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  5. דגרו את צינור המיקרוצנטריפוגה על סיבוב למשך כ-30 דקות ב-RT לפירוק תקין של התאים. במהלך תקופה זו, יש לקרר את הצנטריפוגה מראש ל-4 מעלות צלזיוס.
  6. צנטריפוגה את התא ליזאט ב-16,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הכדור כי הוא יכיל פסולת תאית.
  7. אסוף את הסופרנטנט לכימות חלבון באמצעות בדיקת BCA (או כל שיטה מועדפת אחרת). יש להמשיך מיד או לאחסן את הליזטים לאחר הסרת כל חומר הבדיקה בטמפרטורה של -20°C (לאחסון קצר) או -80°C (לאחסון ארוך טווח).
  8. בעת הפעלה מחדש לאחר אחסון הדגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס, יש להפשיר אותן על הקרח למשך כ-20–30 דקות, לזמן קצר מערבולת/סיבוב, ולהמשיך בפרוטוקול BCA הסטנדרטי.
  9. חלופה נוספת היא לספור את התאים בכל באר באמצעות המוסיטומטר או דרך ציטומטר זרימה ולשלב באסטרטגיות הנרמליזציה. במקרה כזה, יש להוסיף כ-100–200 מיקרוליטר של טריפסין (מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס) מיד לאחר סיום הבדיקה והסרת מדיום הבדיקה, ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. איסוף התאים על ידי הוספת 100–200 מיקרוליטר של 10% FBS כדי לנטרל את השפעות הטריפסין.
    1. צנטריפוגות את התאים ב-300 x g למשך 5 דקות, הסר את הסופרנטנט, והחזיר את הכדור בכ-1 מ"ל של 10% FBS לפני הספירה באמצעות המוציטומטר. חלופה נוספת היא שניתן לקבוע את התאים עם PFA של 4% למשך 15 דקות לפני שמבצעים ספירת תאים מבוססת ציטומטריית זרימה.
      הערה: אם ממשיכים בספירת תאים מיד, אין צורך בקיבוע מבוסס PFA.
  10. נרמל ערכי ECAR עם ריכוז חלבון משלב 7.8 או ספירות תאים משלב 7.9.1 בכל באר באמצעות תוכנת Wave כפי שבשלב 6.10.5.1. הערכים המתקבלים הם הערכים המנורמליים של מבחן המאמץ לגליקוליזה.
  11. יצר את התוצאות והגרף באמצעות האפשרות "ייצוא" ואחריה אפשרות "Graph Pad Prism" ו-"גיליון אקסל" לכל ערך נקודת נתונים לצורך כמות.
    הערה: בלוח תרבית התאים, הבחירה בין ארבעה בארות ריקות ייעודיות גמישה וניתן לקבוע על ידי הניסוי. הסידור הריק ברירת המחדל מוצג באיור 3C.

8. מדידות לקטט מסופרנטנטים תרבותיים

  1. הפשרה הדרגתית של האליקוטים העל-טבעיים על הקרח שנאספו ביום ה-12 ואוחסו בטמפרטורה של −80°C משלב 6.5.
  2. קבעו את ריכוזי ה-L-לקטט באמצעות ערכת הבדיקה של L-Lactate במצב פלואורומטרי, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    הערה: המצב הפלואורומטרי רגיש הרבה יותר מהבדיקה הקולורימטרית.
  3. הכינו תקנים באמצעות דילול סדרתי של תקן הלקטט המסופק ליצירת עקומת כיול הנעה בין 0 ל-0.1 ננומול/באר.
  4. הוסף דגימות ותקנים למיקרופלטה שקופה בת 96 בארות בשכפול, ואז הוסף את תערובת התגובה המכילה תערובת אנזימי לקטט וגלאי פלואורסצנטי לכל באר.
  5. לדוגר ב-RT למשך 30 דקות מוגן מאור. מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרופלט פלואורסצנציוני עם אורכי גל עירור/פליטה ב-535/587 ננומטר.
  6. חשב ריכוזי לקטט בדגימות מהעקומה הסטנדרטית וביטא אותם כ-pM. רמות לקטט מסופרנטנטים של מיקרוגליה ראשונית לא מטופלת (בביקורת) ושל LPS מוצגות בטבלה 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מבחן המאמץ של גליקוליזה המבוססת על זרם חוץ-תאי מודד בהצלחה את הפרופיל הגליקוליטי של מיקרוגליה ראשונית. המבחן מודד גליקוליזה בסיסית, כלומר גליקוליזה לאחר הזרקת גלוקוז, קיבולת גליקוליזית לאחר הזרקת אוליגומיצין, ועיכוב הגליקוליזה בעת הזרקת 2DG. בניסוי שלנו, השווינו בין מיקרוגליה ראשונית (לא מטופלת) למיקרוגליה ראשונית שטופלה ב-LPS. ראינו שינויים מורפולוגיים קלים בין מיקרוגליה מבוקרת למיקרוגליה שטופלה ב-LPS לאחר 24 שעות (איור 2D-E). מצאנו כי מיקר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התגובה המיקרוגליאלית במהלך דלקת עצבית מלווה בחיווט מטבולי עמוק שמאפשר לתאים אלו לעמוד בדרישות האנרגטיות והביוסינתטיות של מצבם התפקודי. מבחן המאמץ הגליקוליזה המבוססת על זרם חוץ-תאי מציע שיטה רגישה ובזמן אמת למדידת שטף גליקוליז, המאפשרת לנו לנתח כיצד מיקרוגליות ראשוניות מסתגלות את חילוף החומרים שלהן בתנאים פרו-דלקתיים. במחקר זה השתמשנו במיקרוגליה ראשונית בעכברים והערכנו את פעילותה הגליקוליטית לאחר חשיפה לגירויים דלקתיים קלאסיים, LPS, וסיפקנו תובנות לגבי שינויים מטבוליים הקשורים למטבוליזם ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים להצהיר עליו.

תודות

העבודה ממומנת באמצעות מענק פרויקט CIHR ל-DKK. ה-RTI לד"ר קרייג מור עבור ניתוח ה-Seahorse XFe24 מוערך מאוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פתרון HEPES של 1Mסיגמא אולדריץ'H0887
1X HBSSGibco   14175-079
2.5% טריפסיןGibco   15090-046
2DGמיליפור סיגמא D6134
אנטיביוטיקה/אנטימיקוטית גיבקו15240-062
D & ndash; (+)גלוקוז, חסר מים תרמוסנטיפיק   A16828.36
DMEMגיבקו  11965-092
DNase Iמיליפור סיגמא 11284932001- רוש
FBSפישרברנדFB12999102
גלוטמקסGibco   35050-061
ערכת L-לקטטאבקאםab65330
LPS סיגמא אולדריץ'  L4391
מם NEAA Gibco   11140-050
אוליגומיצין Aמיליפור סיגמא 495455
פניצילין/סטרפטומיציןGibco   15240-062
רצועות מדד pHפישרברנד13-640-516
Seahorse XFe24אג'ילנט טכנולוגיותלא זמיןשם כללי: מנתח שטף חוץ-תאי
לוחות מיקרו לתרבות תאים של Seahorse 24 V7 PSאגילנט סיהורס100777-004שם כללי: מיקרופלטות תרבית תאי שטף חוץ-תאית
בופר קליברנט XF לבדיקת סוסון ים (pH 7.4)אג'ילנט סיהורס   100840-000שם כללי: בופר כיוון זרם חוץ-תאי
בדיקת סוסון ים XF DMEM מדיה (pH 7.4)אג'ילנט סיהורס     103575-100שם כללי: מדיית בדיקת שטף חוץ-תאית
ערכת בדיקת זרם חוץ-תאית של Seahorseאג'ילנט סיהורס 102342-100שם כללי: לוח כיול זרם חוץ-תאי&nb;
פירובט נתרן  Gibco   11360-070

מקורות

  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179, 292-311 (2019).
  2. Tay, T. L., et al. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathol. Commun. 6, 87(2018).
  3. Wang, Z., et al. Glycolysis and oxidative phosphorylation play critical roles in natural killer cell receptor-mediated natural killer cell functions. Front. Immunol. 11, 202(2020).
  4. Soto-Heredero, G., Gómezde Las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis-a key player in the inflammatory response. FEBS J. 287, 3350-3369 (2020).
  5. O'Neill, L. A., Kishton, R. J., Rathmell, J. A guide to immunometabolism for immunologists. Nat. Rev. Immunol. 16, 553-565 (2016).
  6. Bernier, L. P., et al. Microglial metabolic flexibility supports immune surveillance of the brain parenchyma. Nat. Commun. 11, 1559(2020).
  7. Bernier, L. P., York, E. M., MacVicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43, 854-869 (2020).
  8. Geric, I., et al. Metabolic reprogramming during microglia activation. Immunometabolism. 1, e190002(2019).
  9. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol. Cells. 47, 100095(2024).
  10. Zhang, Z., et al. Glutamine metabolism modulates microglial NLRP3 inflammasome activity through mitophagy in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation. 21, 261(2024).
  11. Wang, L., et al. Glucose transporter 1 critically controls microglial activation through facilitating glycolysis. Mol. Neurodegener. 14, 2(2019).
  12. Lu, J., Zhou, W., Dou, F., Wang, C., Yu, Z. TRPV1 sustains microglial metabolic reprogramming in Alzheimer's disease. EMBO Rep. 22, e52013(2021).
  13. Orihuela, R., McPherson, C. A., Harry, G. J. Microglial M1/M2 polarization and metabolic states. Br. J. Pharmacol. 173, 649-665 (2016).
  14. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J. Neuroinflammation. 18, 129(2021).
  15. Kaushik, D. K., et al. Enhanced glycolytic metabolism supports transmigration of brain-infiltrating macrophages in multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 129, 3277-3292 (2019).
  16. Hu, Y., et al. mTOR-mediated metabolic reprogramming shapes distinct microglia functions in response to lipopolysaccharide and. Glia. 68, 1031-1045 (2020).
  17. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Front. Cell. Neurosci. 14, 22(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ECAR
חקר גליקוליזה במיקרוגליה ראשונית באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.