מיפוי גנומי רחב של שינויים בהיסטונים ואתרי קישור לפקטורי שעתוק בקווי תאי סרטן ריאות נוירואנדוקריניים קטנים באמצעות CUT&amp;RUN

Meijun Du; Jaime Wendt Andrae; Michael Tschannen; Angela Mathison; Victor Jin; Hui-Zi Chen

doi:10.3791/69656

מאמר שיטה

מיפוי גנומי רחב של שינויים בהיסטונים ואתרי קישור לפקטורי שעתוק בקווי תאי סרטן ריאות נוירואנדוקריניים קטנים באמצעות CUT&RUN

DOI:

10.3791/69656

⸱

3 באפריל 2026

Meijun Du¹^,² , Jaime Wendt Andrae² , Michael Tschannen² , Angela Mathison² , Victor Jin²^,³ , Hui-Zi Chen¹^,²

¹Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, Cancer Center, Medical College of Wisconsin, ²Linda T. and John A. Mellows Center for Genomic Sciences and Precision Medicine Center Medicine, Medical College of Wisconsin, ³Data Science Institute, Medical College of Wisconsin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתואר פרוטוקול חיתוך אופטימלי תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז ואחריו פרוטוקול רצף מהדור הבא (CUT&RUN-seq) עבור קווי תאי סרטן ריאות נוירואנדוקריניים קטנים. הוא מאפשר מיפוי גנומי רחב של שינויים שונים בהיסטונים ואתרי קישור לפקטור שעתוק (למשל E2F7) כדי לחקור די ויסות אפיגנטי ושעתוק בפתוביולוגיה של SCLC.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני שיקום הכרומטין וגורמי שעתוק (TFs) ממלאים תפקידים קריטיים בביולוגיית הגידולים של סרטן ריאות תאים קטנים (SCLC). אפיון כללי של שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) של היסטונים ואתרי קישור TF הוא חיוני לזיהוי אלמנטים רגולטוריים של DNA ונתיבי גנים שיביאו להבנה מכנית עמוקה יותר של SCLC ולקביעת מטרות להתערבות טיפולית. חיתוך תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז ואחריו ריצוף דור הבא (CUT&RUN-seq) הוא שיטה עוצמתית למיפוי שינויים ספציפיים בהיסטונים וקביעת פרופילי קשירת DNA של מגוון רחב של חלבונים במקום בגנום התאי. ב-CUT&RUN, הנוקלאז המיקרוקוקלי (MNase) המאוחד לחלבון A/G מגויס באמצעות נוגדנים למיקומים הגנומיים של חלבונים הקשורים לכרומטין, שם קטעי ה-DNA הבסיסיים משתחררים מכרומטין בתפורה עם הפעלה ופיצול MNase. העיכול המקומי הזה מייצר קטעי DNA קטנים וספציפיים ללוקוס, המתאימים לריצוף.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לפרופיל שינויים בהיסטונים H3K4me3 (קשור לפרומטורים פעילים או פתוחים) ו-H3K4me1 (קשור למגברים פעילים), וכן את פקטור השעתוק E2F7 ב-SCLC. פרוטוקול זה מותאם למודלים של קווי תאים נוירואנדוקריניים (NE) SCLC, אשר מאופיינים בדרך כלל בגרעינים גדולים, ציטופלזמה דלה וצמיחה כאגרגטים לא דביקים בתלוי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים פוסט-תרגומיים של היסטונים (PTMs) וגורמי שעתוק (TFs) הם רגולטורים מרכזיים של ביטוי גנים. PTMs היסטונים, כגון אצטילציה, מתילציה, פוספורילציה ויוביקוויטינציה, בעיקר בזנב הקצה ה-N שלהם, משפיעים על מבנה הכרומטין ^1,2. בסרטן, PTMs של היסטונים לעיתים קרובות לא מוסדרים, מה שמוביל להפעלה חריגת של אונקוגנים או להשתקת גנים מדכאי גידול³. TFs נקשרים רצפי DNA ספציפיים במקדמים או מגברים כדי להפעיל או לדכא גנים יעדיים, לעיתים קרובות מגייסים אנזימים משני היסטונים המתאמים את עיצוב מחדש הכרומטין⁴. אנזימים שכותבים, מוחקים או קוראים סימני היסטון, כמו אצטילטרנספראזות היסטונים (HATs), היסטונים דה-אצטילזים (HDACs) ומתילטרנספראזות (HMTs), לעיתים קרובות מוטנטים או לא מוסדרים בסרטן, מה שהופך אותם לאטרקטיביים למטרות טיפוליות⁵.

ב-SCLC, שינויים אפיגנטיים וגורמי שעתוק מגדירים שושלת (LDTFs) הם מניעים מרכזיים בביולוגיית הגידול⁶. בניגוד למוטציות גנטיות, שינויים אפיגנטיים, כולל מתילציה ב-DNA ושינויים בהיסטונים, מווסתים את ביטוי הגנים מבלי לשנות את רצף ה-DNA הבסיסי. שינויים אלו יכולים להשתיק גנים מדכאי גידול או להפעיל אונקוגנים ולהגביר את ההתנהגות האגרסיבית של SCLC. לדוגמה, ההיסטון מתילטרנספראז KMT2D עובר מוטציה תכופה עם תדירות שינוי של 12.9% בקבוצה⁷ גדולה של חולי SCLC בעולם האמיתי, ואחראי למונומתילציה של היסטון H3 ליזין 4 (H3K4me1), סימן הקשור לאזורי מגבירים פעילים בגנום. SCLC היא מחלה מולקולרית הטרוגנית. SCLC מסווגים לתת-סוגים מולקולריים בהתבסס על ביטוי שונה של ארבעה LDTFs: הומולוג אצ'אט-סקוטה 1 (ASCL1), גורם התמיינות נוירוגני 1 (NEUROD1), חלבון 1 עם קשור ל-yes (YAP1) והומיאובוקס 3 מסוג POU class 2 (POU2F3). תת-הסוגים הנוירואנדוקריניים (NE), כולל ASCL1 ו-NEUROD1, מהווים כ-70-80% ממקרי SCLC⁸. לכן, חקירת התפוצה והפרופילים של PTMs היסטונים שונים ואתרי קישור TF בתתי-הסוגים השונים של SCLC עשויה להבהיר תוכניות גנים ספציפיות לתת-סוגים הפגיעות להתערבות טיפולית.

השיטה המסורתית לזיהוי PTMs של היסטונים ואתרי קישור של חלבונים רגולטוריים ספציפיים לרצף ברמת הגנום היא ריצוף אימונופרציפיטציה כרומטיני (ChIP-seq)⁹. עם זאת, ChIP-seq דורש מספר רב של תאי קלט ולעיתים מספק רקע גבוה לאורך הגנום. כתוצאה מכך, ChIP-seq דורש רמת העשרה גבוהה של חלבון המטרה כדי להבחין בין אות אמיתי לרעש, ודורש ריצוף עמוק לניתוח נתונים יעיל. בנוסף, קישור צולב פורמלדהידי המשמש ב-ChIP-seq יכול להסתיר אפיטופים וליצור אתרי קישור חיוביים שגויים¹⁰. חיתוך תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז ואחריו ריצוף דור הבא (CUT&RUN-seq) הוא אלטרנטיבה ברזולוציה גבוהה למיפוי PTMs היסטונים ואתרי קישור TF במקום בתוך תאים שלמים. בשיטה זו, תאים חדירים מודגרים בנוגדן המיועד לחלבון המקושר לכרומטין, ולאחר מכן נקשרים לחלבון מיזוג של חלבון A(G)-מיקרוקוקלי נוקלאז (MNase). עיכול DNA ממוקד משני צידי החלבון המעניין מושרה בתנאים עם סידן גבוה ומלח נמוך, ומשחרר שברי DNA ספציפיים לטיהור. מקטעי ה-DNA המטוהרים משמשים לבניית ספריות ריצוף ברקודיות, שניתן לאגד לריצוף בתפוקה גבוהה ^11,12,13,14. בהשוואה ל-ChIP-seq, CUT&RUN דורש הרבה פחות תאים כקלט, מייצר רעש רקע נמוך יותר, נמנע מיצירת ארטיפקטים של קישור צולב ודורש פחות קריאות רצף – מה שהופך אותו למתאים במיוחד לחקר מצבי כרומטין דינמיים בסרטן בצורה חסכונית כלכלית.

טכנולוגיית CUT&RUN פותחה כדי לחקור את מיקומי הגנום של החלבונים האינטראקטיביים עם כרומטין, כולל שינויים בהיסטונים, אתרי קישור TF וקומפלקסים הקשורים לכרומטין, ובכך חושפת נופים רגולטוריים אפיגנטיים^11,12. טכניקה זו אפשרה ניתוחים מפורטים של ארכיטקטורת מגבירים-מקדמים, ויסות רשת שעתוק ודינמיקת מצב הכרומטין במהלך ההתפתחות והתקדמות המחלה^. במחקר סרטן, CUT&RUN מאפשרת מיפוי מדויק של סימני היסטון^16,17 ותפוסה של פקטור שעתוק אונקוגני, ומסייע בזיהוי תוכניות רגולטוריות ייחודיות לשושלת ויעדים טיפוליים פוטנציאליים^15,16. יתרה מזאת, ניתן לבצע CUT&RUN במקום בתאים, כולל CD8+ תאי T¹⁷, וכן לדגימות רקמה^18,19.

כדי לזהות את המיקום הגנומי של PTMs ואתרי קישור של פקטורי שעתוק E2F7 בתתי-סוגים של SCLC, יישמנו CUT&RUN-seq על ארבעה מודלים של קווי תאים NE של SCLC: H146 ו-DMS79 (תת-סוג ASCL1), וכן H446 ו-H82 (תת-סוג NEUROD1), עם או בלי מוטציות KMT2D. פרופילנו את סימן ההיסטון H3K4me1, שינוי הקשור למגבר שהונע בעיקר על ידי KMT2D, ואת E2F7, שהוכח כקופקטור של^{ASCL1 20}. סימן ההיסטון H3K4me3, המקושר למקדמים פעילים, שימש כבקרה חיובית, בעוד ש-IgG שימש כבקרה שלילית.

כאן אנו מציגים פרוטוקול CUT&RUN-seq מפורט לקווי תאים SCLC NE, המבוסס על הדברים הבאים: ערכת CUT&RUN הזמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים), העבודה המקורית של סקין והניקוף 11,12,13, ואופטימיזציות מעבדתינו שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה (איור 1) מספק הוראות שלב אחר שלב לביצוע CUT&RUN-seq בקווי תאים של SCLC NE, שלרוב גדלים כאגרגטים לא דבקים או אשכולות צפים.

1. תרבית תאים

לשמור על קווי תאים DMS79 (תת-סוג ASCL1), H146 (תת-סוג ASCL1), H82 (תת-סוג NEUROD1) ו-H446 (תת-סוג NEUROD1) ב-13 מ"ל של מדיום RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים) בבקבוקים בנפח 75 מ"ל. לטפח את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2.
הערה: כל התאים ששימשו במחקר זה נרכשו מ-ATCC ואומתו באמצעות פרופיל חוזר קצר בטנדם.

2. חדירות תאים

הערה: חדירות תאים נכונה חיונית כדי לאפשר לנוגדנים, pAG-MNase ולקטעי חלבון-DNA מעוכלים להתפזר בחופשיות פנימה והחוצה מהתאים. לפני תחילת פרוטוקול CUT&RUN על קו תאים חדש, יש לבצע אופטימיזציות כדי לקבוע את ריכוז הדיגטונין האידיאלי לחדירות אפקטיבית. הריכוז הנמוך ביותר להשגת חדירות מעל 95% (95% מהתאים "מתים") צריך לשמש עבור פרוטוקול CUT&RUN.

הנח את מלאי ה-5% דיגיטונין, מעכב הפרוטאז והספרמידין על הקרח ותן להם להפשיר לחלוטין.
הכינו את בופר השטיפה לפי טבלה 1 והשאירו את הבופר על קרח.
הכינו תמיסת עבודה של 0.05% דיגיטונין על ידי ערבוב 10 מיקרוליטר מהמלאי של 5% עם 990 מיקרוליטר של בופר שטיפה. ערבב היטב על ידי מערבולת ושמור על הקרח.
יצירת סדרת דילול של דיגיטונין (0.05%, 0.01%, 0.001%, ו-0.0001%)"על ידי דילול התמיסה הקודמת ברצף לנפח סופי של 1 מ"ל מכל צינור. הפעילו כל דלול לפני שממשיכים להבא. במקביל, יש להכין בקרת דימתיל סולפוקסיד (DMSO) של 0.05% בבופר שטיפה (100 מיקרו ליטר בסך הכל; ראו טבלה 2).
הערה: דיגיטונין ו-DMSO הם כימיקלים מסוכנים. יש לטפל בזהירות ולהשליך את כל הפסולת במיכל פסולת מסומנת כראוי עם מכסים מאובטחים.
השאירו את כל תמיסות הדילול של הדיגיטונין ואת בקרת ה-DMSO על הקרח עד שישתמשו בהם.
קבעו את מספר התאים הנדרשים על ידי הכפלת מספר תנאי החדירות במספר התאים הנדרשים לכל בדיקה. יש להוסיף 20% נוספים כדי לפצות על שונות בפיפטינג (למשל, בחמישה תנאים ב-5×10 תאים כל אחד, יש להכין בערך 1.2 x 5 x 5 x 10⁵ תאים).
אסוף את מספר התאים המותחים הנדרש באמצעות צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT). החזירו את הכדור ל-600 מיקרוליטר של 1× PBS (100 מיקרוליטר לכל תנאי ועוד 20% עודף).
Aliquot 100 מיקרולטר של תאים תלויים ב-PBS לחמישה צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל – צינור אחד לכל ריכוז דיגיטונין וצינור אחד לבקרת DMSO.
צנטריפוגה את הצינורות ב-600 × גרם למשך 3 דקות ב-RT.
הסר בזהירות את הסופרנטנט ותלווה מחדש כל כדור ב-50 מיקרוליטר של בופר הבקרה המתאים של הדיגיטונין או DMSO.
דגרו את הדגימות ב-RT למשך 10 דקות.
מערבבים 10 מיקרוליטר מהתאים המטופלים עם 10 מיקרוליטר של טרייפן בלו והעמיסו 10 מיקרוליטר מהתערובת על סלייד ספירת תאים.
השתמש במונה תאים כדי לכמת תאים בריאים (לא מוצבעים) ותאים חיוביים חדירים שאינם קיימים (צבועים בכחול).
זהה את ריכוז הדיג'טונין הנמוך ביותר שמייצר את האחוז הגבוה ביותר של תאי טרייפן כחולים חיוביים. השתמש בריכוז הזה בניסוי CUT&RUN במורד הזרם. ודאו שבקרת ה-DMSO שומרת על חיוניות טיפוסית לתרבית תאים בריאה תקינה.

3. חיתוך ורוץ

הערה: הריאגנטים בפרוטוקול זה מותאמים ל-5 תגובות, עם תוספת נוספת כדי להתחשב באובדן הפיפטינג. לרשימת חומרים וציוד, ראו טבלת חומרים. מומלץ לפחות שני שכפולים ביולוגיים עצמאיים לכל ניסוי CUT&RUN.

יום 1
1. הכנת בופר CUT&RUN
  1. הכינו את בופר השטיפה על ידי שילוב בופר קדם-שטיפה, מעכב פרוטאז 25x ו-1 מטר ספרמידין כפי שמתואר בטבלה 3.
  2. הכינו את בופר חדירות התאים על ידי הוספת 5% דיגיטונין למאגר השטיפה לפי טבלה 3.
  3. הכינו את בופר הנוגדנים על ידי הוספת 0.4 מיקרוליטר EDTA ל-100 מיקרוליטר של בופר חדירות התא בריכוז הדיגטונין המתאים, כפי שמתואר בטבלה 3. הנח את הבופר המוכן על הקרח.
  4. אחסן את שארית בופר חדירת התאים בטמפרטורה של 4°C לשימוש ביום השני.
2. הפעלת חרוזי קונקנאבלין A (ConA)
  1. תלה בעדינות את המתלה של חרוזי ConA כדי להבטיח את הפצתו השוויונית.
  2. העבר 55 מיקרוליטר מתליית החרוזים (11 מיקרוליטר לדגימה) לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  3. מניחים צינור על מתקן מגנטי בנפח 1.5 מ"ל עד שהחרוזים נפרדו לחלוטין, ואז הפיפטה להסרת סופרנטנט.
  4. שטוף מיד את החרוזים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של בופר הפעלה קר (100 מיקרוליטר לכל דגימה). החזירו את החרוזים על ידי פיפטינג עדין בכל שטיפה והשתמשו במתקן המגנטי כדי להשליך את הסופרנטנט בין השטיפות.
  5. לאחר השטיפה הסופית, הסר את הסופרנטנט ותלווה בעדינות את החרוזים המופעלים ב-55 מיקרוליטר (11 מיקרוליטר לדגימה) של בופר הפעלה קר של חרוזים.
  6. Aliquot 10 מיקרוליטר מהחרוזים מתלים לכל צינור במערכת צינורות בת 8 רצועות ושומרים על הצינורות על קרח.
3. קציר תאים וקשור תאים לחרוזים מופעלים
  הערה: עמידות התא חשובה ליחס האות לרקע. עם זאת, הקיימות של קווי תאים של SCLC NE יכולה להיות משתנה (70%-90%) בשל קצב מחזור תאים גבוה מטבעו והעדפה לגדול כאגרגטים בינוניים-גדולים בתלוי.
  1. הסר את התאים מהאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ובדקו אותם תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח איכות.
  2. העבר את מתלה התא לצינור חרוטי של 50 מ"ל וצנטריפוגה בעוצמה של 1,000-1,200 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  3. שאיפת המדיום מהצינור הקוני ושוטפת את כדור התא ב-20 מ"ל של 1× PBS.
  4. צנטריפוגה שוב, שאפו את ה-PBS, ועכבו את הכדור עם אקיוטאז למשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37°C, בהתאם לגודל הכדור.
  5. סיימו את העיכול על ידי הוספת 5 מ"ל PBS + 10% FBS. השגת תלייה חד-תאית על ידי פיפטה עדינה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית.
  6. צנטריפוגה את התאים בעוצמה של 1,000-1,200 × גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנאנט, והחזירו את הכדור לתא ב-5 מ"ל PBS.
  7. לספור תאים התחלתיים, לאשר את עמידות ושלמות התאים.
  8. חשב את מספר התאים הכולל הנדרש על ידי הכפלת מספר התגובות במספר התאים בכל תגובה (5×10,⁵). הוסיפו עודף של 20% כדי להתחשב בשגיאות בפיפטינג (למשל, 1.2 × 6 × 5 × 10⁵ עבור 6 תגובות). העבר את תליות התאים המחושבות לצינורות של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-600 x g, 3 דקות ב-RT.
    הערה: הכינו לפחות תגובה נוספת אחת כגיבוי.
  9. החזירו את התאים ל-RT Wash Buffer בצפיפות של 5×10-5 תאים בכל תגובה (שש תגובות בסך הכל), תוך שימוש ב-100 מיקרוליטר בכל תגובה, ופיפטציה עדינה אך יסודית להבטחת תלייה אחידה. צנטריפוגה ב-600 x g למשך 3 דקות ב-RT. פיפט להסרת סופרנאנט.
  10. חזור על שלב הכביסה (שלב 9) שוב.
  11. Aliquot 100 מיקרוליטר של תאים שטופים לכל צינור במערכת 8 רצועות המכילה 10 מיקרוליטר של חרוזי CoA מופעלים. בעדינות פיפטה לערבוב וסובב במהירות בצנטריפוגה קטנה כדי לאסוף את התערובת (החרוזים לא אמורים לשקוע).
  12. דגרו את תערובת תאי החרוזים למשך 10 דקות ב-RT כדי לאפשר לתאים להיקשר לחרוזים.
  13. הניחו צינורות על מתקן מגנט של צינורות בנפח 0.2 מ"ל, אפשרו לתערובת להתפזר, והפיפטה להסרת סופרנטנט. חסוך 10 מיקרו-ליטר של סופרנטנט כדי לוודא שתאים קשורים לחרוזים. זרוק את הסופרנטנט שנותר והתקדם במהירות לשלב הבא.
  14. הסר צינורות מהמגנט. מיד הוסיפו 50 מיקרוליטר של בופר נוגדנים קר לכל תגובה והפיפטה בעדינות כדי להחזיר את החרוזים.
  15. מערבבים 10 מיקרוליטר גם מהסופרנטנט וגם מ-10 מיקרוליטר של תליית התא/חרוזים (שהוחזרו בבופר נוגדנים) עם 10 מיקרוליטר של טרייפן בלו וטעיסו את התערובת על סלייד מונה התא.
  16. נתח עם מונה סלולרי. וודא שהסופרנטנט כמעט ואינו מכיל חרוזים או תאים, ותערובת החרוז/תא מכילה תאים חדירים מוקפים בחרוזים.
    הערה: חשוב לבדוק את תאימות חרוזי CoA של התאים.
4. חדירות וקישור נוגדנים
  הערה: ההצלחה של CUT&RUN תלויה באופן קריטי בזיקת הנוגדן למטרה ובספציפיות שלו בתנאים ניסיוניים מסוימים. אנו ממליצים על הדברים הבאים: 1. להשתמש בנוגדנים מסחריים שאומתו ל-CUT&RUN כאשר הם זמינים. 2. עבור מטרות ללא נוגדנים מאומתים על ידי CUT&RUN, יש לשקול נוגדנים מאומתים לאימונופלואורסצנציה (IF), שכן נוגדני IF מזהים אפיטופים בהקשר התאי הטבעי שלהם , בדומה לקישור מקומי של נוגדן למטרה בתוך תאים חדירים ב-CUT&RUN. 3. בדקו 3-5 נוגדנים במקביל כדי לזהות את היעיל ביותר ליישום הספציפי שלכם.
  1. סובב במהירות את הפאנל והפיפטה של K-MetStat כדי להחזיר את השעיה. הוסף 2 מיקרוליטר של פנל K-MetStat לתגובות המיועדות לנוגדנים בקרה חיוביים ל-H3K4me3 ו-IgG שליליים. פיפטה לערבוב וצינורות סיבוב מהיר (אופציונלי).
  2. הוסף 0.5 מיקרוגרם כל אחד מנוגדני H3K4me3, H3K4me1 ו-IgG, ו-0.6 מיקרוגרם של נוגדן פוליקלונלי E2F7 ממקורות שונים לכל תגובה (טבלה 4). תתייג את צינורות 8 הרצועות.
  3. בעדינות פיפטה כדי לערבב נכון כל צינור תגובה. דגרו לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על נוטאטור עם פקקי הצינור מורמים. אל תסובב או תהפוך את ^{הצינורות.}
יום 2
1. קישור pAG-MNase לנוגדן
  הערה: חרוזים שמתיישבים בלילה זה נורמלי ואינו משפיע על התוצאות. אם החרוזים הופכים לגושיים או דביקים לאחר דגירה לילית, החזירו את החרוזים לתלות אותם באמצעות פיפטינג עדין. כדי לשפר עקביות ותפוקה, מומלץ לבצע פיפטינג רב-ערוצי. בעת שימוש בצינורות 8 רצועות, יש להסיר ולהחליף את הבופרים רצועה אחת בכל פעם כדי למנוע התייבשות של חרוזי ConA.
  1. שים את מעמד המגנט על הקרח.
  2. הסר את צינורות 8 הפסים מדגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וסובב במהירות לאיסוף נוזלים.
  3. הנח צינורות על מעמד המגנט עד שהתערובת תתפזר. בזהירות פיפט והסר את הסופרנטנט.
  4. תשאיר את הצינורות על מעמד המגנט. שטוף את הצינורות פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר חדירות תא קר. פיפטה להסרת סופרנטנט.
  5. הסר צינורות מהמגנט והוסף מיד 50 מיקרוליטר של בופר חדירות תא קר לכל תגובה. פיפטינג עדין כדי להחזיר תאים/חרוזים.
  6. הוסיפו 2.5 מיקרוליטר pAG-MNase לכל תגובה וערבבו היטב על ידי פיפטינג עדין.
  7. תדגור תגובות במשך 10 דקות ב-RT.
  8. סובב במהירות את הצינורות, מניח אותם חזרה על מעמד המגנט, עד שהתערובת תתפזר. פיפטה להסרת סופרנטנט.
  9. החזקת הצינורות על מעמד מגנט, שטוף את הצינורות פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר חדירות תא קר. פיפטה להסרת סופרנטנט.
  10. הסר צינורות ממעמד המגנט, והחזיר בעדינות 50 מיקרוליטר של בופר חדירות תאים קר. שים את הצינורות על קרח.
2. עיכול ושחרור כרומטין ממוקד
  הערה: בצע עיכול תלוי Ca²⁺ בטמפרטורה של 0°C כדי למזער פיצול MNase לא מכוון של DNA¹² נגיש. כלול DNA עם ספייק-אין, כמו Escherichia coli (E. coli), כך שהוא מייצג בערך 0.5-5% (רצוי ~1%) מסך הריצוף¹³. DNA ספייק-אין משמש לנרמול עומק ריצוף וחשוב במיוחד בהשוואה בין דגימות לאורך סדרה, לדוגמה, בעת הערכת שינויים גלובליים בשינוי ההיסטונים לאחר עיכוב או מחיקה גנטית של אנזימי משנה היסטונים.
  1. הוסיפו 1 מיקרוליטר של 100 מ"מ סידן כלוריד לכל תגובה ברצועה בת 8 צינורות (מהשלב 3.2.1.10) בזמן הקרח. הפיפטה בעדינות כדי להחזיר את החרוזים לתלייה מלאה ולהבטיח עיכול יעיל.
  2. דגרו את הצינורות על נוטאטור בטמפרטורה של 4°C למשך 2 שעות, כאשר הקצוות המכוסים מורמים.
  3. בצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל, הכינו את תערובת Stop Buffer. לכל תגובה, שלבו 33 מיקרוליטר של בופר עצור עם 1 מיקרוליטר של DNA ספייק-אין של E. coli (0.5 ng). מערבובת עדינה לערבוב.
  4. יש להוסיף 33 מיקרו-ליטר של בופר עצור לכל תגובה בסוף הדגירה של שעתיים. ערבב על ידי פיפטינג עדין.
  5. דגרו את התגובות בתרמחזור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. צינורות סיבוב מהיר לאיסוף התוכן בתחתית, ואז מניחים אותם על מדף מגנט עד שהתמיסה מתבהרת.
  7. העבר בזהירות כ-84 מיקרוליטר סופרנטנט המכיל את ה-DNA המשוחרר מ-CUT&RUN לצינורות טריים בנפח 1.5 מ"ל.
3. טיהור DNA באמצעות ערכת טיהור DNA (ראו טבלת חומרים)
  הערה: לפני השימוש הראשון, הוסיפו 6.9 מ"ל איזופרופנול לבופר הקישור DNA והוסיפו 20 מ"ל ≥ 95% אתנול לבופר ה-DNA.
  1. הוסף 420 מיקרוליטר של בופר קישור DNA לכל סופרנטנט שנאסף. מערבולת לרגע כדי לערבב היטב.
  2. הניחו עמודת ניקוי DNA בצינורות האיסוף שלו.
  3. הטעין כל דגימה על העמודה המתאימה.
  4. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם ל-30 שניות ב-RT. השליכו את ה-Flow-Through והחזרו את העמודה לצינור האיסוף.
  5. הוסיפו 200 מיקרוליטר של בופר שטיפת DNA לכל עמודה ולצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות ב-RT. השליכו את ה-flow-through והחזירו את העמודה בצינור האיסוף.
  6. חזור על שלב הכביסה פעם אחת.
  7. צנטריפוגה שוב ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות ב-RT כדי להסיר לחלוטין את שאריות השטיפה.
  8. העברו עמודות לצינורות מסומנים בנפח 1.5 מ"ל.
  9. מרח 12 מיקרוליטר של בופר השטנה ישירות על הממברנה במרכז העמודה.
  10. דגרו 5 דקות ב-RT ואז צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך דקה אחת ב-RT כדי להוציא את ה-DNA.
    הערה: זהו נקודת עצירה בטוחה. אחסן DNA שנפלט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לעיבוד עתידי.
4. כימות DNA של CUT&RUN וניתוח התפלגות גודל מקטעים
  הערה: כמת DNA באמצעות פלואורומטר באמצעות ערכת הבדיקה של dsDNA High Sensitivity, המספקת מדידות מדויקות יותר של DNA דו-גדילי לעומת שיטות מבוססות ספיגה.
  1. השתמשו ב-1 מיקרוליטר מכל דגימה כדי לקבוע את ריכוז ה-DNA של CUT&RUN באמצעות ערכת בדיקת הרגישות הגבוהה dsDNA (ראו טבלת חומרים).
  2. השתמשו ב-1 מיקרוליטר DNA נוסף כדי להעריך את נוכחות והתפלגות הגודל של שברים חתוכים. בצע ניתוח שברים באמצעות ערכת DNA רגישות גבוהה (ראו טבלת חומרים) בהתאם להנחיות היצרן (אופציונלי).
    הערה: חלבוני קישור בשפע גבוה, כגון שינויים פוסט-תרגומיים של היסטונים (PTM), ניתנים לזיהוי בקלות בשלב זה. עם זאת, גורמי שעתוק בעלי שפע נמוך עשויים להיות קשים יותר לזיהוי.
5. בניית ספרייה, ניתוח קטעים וריצוף
  הערה: ≤5 ng DNA כולל של CUT&RUN, כפי שנקבע על ידי ערכת בדיקה ברגישות גבוהה של dsDNA, שימש לבניית ספריות רצף הדור הבא (NGS) של CUT&RUN. כדי למזער דימרים של מתאם, הקטן את המתאם מ-Illumina ל-1 מיקרוליטר עבור קישור המתאם. מספר מחזורי ה-PCR במהלך בניית הספרייה ניתן להתאמה בהתאם לכמות הקלט, תפוקת הספרייה ושיעור הכפילות. אסטרטגיות שונות לטיהור DNA חרוזי מגנטי (ראו טבלת חומרים) עשויות לשמש בהתאם ל-PTMs של היסטון המטרה או לגורמי השעתוק.
  1. בניית הספרייה נבנתה באמצעות ערכת ההכנה לספרייה CUT&RUN (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות יצרן הערכה, עם שינויים קטנים. בקיצור, 5 ng של DNA CUT &RUN שימש כקלט המומלץ להכנת הספרייה. ל-DNA פחות מ-5 ננוגרם, השתמש בכמה שיותר להכנת ספרייה. לכל דגימה נעשה שימוש בפריימרים כפולים של אינדקס i5 ו-i7 כדי להבטיח ריצוף מרובה מוצלח.
    הערה: זהו נקודת עצירה בטוחה. ניתן לאחסן את ה-DNA בטמפרטורה של -20°C להמשך העיבוד.
  2. מדוד את ריכוז ספריית CUT&RUN עם פלואורומטר וערכת הבדיקה הרגישות הגבוהה dsDNA. התפלגות הגודל של ספריות CUT&RUN NGS נקבעה באמצעות ערכת DNA רגישות גבוהה (ראו טבלת חומרים) בהתבסס על מדריך ערכת DNA רגישות גבוהה או מכשיר אלקטרופורזה קפילרי דומה TapeStation (ראו טבלת חומרים).
    הערה: דיללו את ספריית CUT&RUN כדי להביא את הריכוז לטווח הגילוי של ערכת הבדיקה הרגישות הגבוהה dsDNA וערכת ה-DNA הרגישות הגבוהה.
  3. ספריות בריכה (40-46) המבוססות על אינדקסים מולקולריים וייחודיים שווים. לאחר טיהור DNA בחירת גודל חרוזים מגנטיים, בוצע ריצוף זוגות (אורך קריאה של 100 bp) עבור הספריות המאוחדות על מערכת Illumina NovaSeq 6000 לחצי S-Prime (SP) בעומק קריאה מוערך של 10 מיליון קריאות לספרייה.
6. ניתוח נתונים ב-CUT&RUN
  1. נתח נתוני CUT&RUN באמצעות צינור מותאם אישית (איור 5A). הערך את איכות הקריאה עם FastQC. הסר רצפי מתאם מתחילת הקריאות באמצעות Cutadapt. יישר קריאות קצוות זוגיות לגנום האנושי (hg38) ולגנום ההתייחסות של E. coli עם Bowtie2. השתמש ב-Samtools כדי להסיר קריאות לא ממופות. הסר קריאות כפולות עם Picard, ויצר קבצי bedGraph באמצעות Bedtools. צור קבצי bigWig (שחור-לבן) עם DeepTools. הצג את הנתונים באמצעות IGV ו-DeepTools. נרמל את ספירת הקריאה הכוללת לספירת קריאות האי-קולי . בצע קריאת שיא באמצעות SEACR (ניתוח העשרה דליגה ל-CUT&RUN)¹⁹.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קווי תאים טיפוסיים או "קלאסיים" של SCLC NE מאופיינים בגרעינים גדולים, ציטופלזמה דלה, וצמיחה כאגרגטים לא דביקים או ספרואידים דחוסים בתלוי. קווי תאים גבוהים ב-ASCL1, כמו NCI-H146 ו-DMS79, וקווי תאים בגובה NEUROD1, כמו NCI-H82 ו-H446, מציגים את הפנוטיפ הקלאסי של SCLC: תאים קטנים עד בינוניים עם ציטופלזמה דלה, כרומטין גרגרי דק, ונטייה לגדול בעיקר כאגרגטים לא דביקים או ספרואידים דחוסים. למרות שמודלים בגובה NEUROD1 שומרים על ביטוי סמן NE, הם מועשרים לתוכניות שעתוק הקשורות להתמיינות נוירונים, עי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיסרגולציה אפיגנטית ו-LDTFs הם גורמים מרכזיים לביולוגיית הגידולים של SCLC⁶. קביעת התפוצה הגנומית של שינויים ספציפיים בהיסטונים וחלבונים הקשורים ל-DNA ב-SCLC יכולה לחשוף מנגנונים פוטנציאליים של עמידות טיפולית נרכשת ופלסטיות פנוטיפית. CUT&RUN-SEQ היא שיטה עוצמתית למיפוי אינטראקציות בין חלבון-DNA בין היסטונים ולא-היסטונים ברזולוציה גבוהה¹⁴ מתאים, רקמות. פרוטוקול זה מהווה חלופה יעילה וזולה לגישות המסורתיות של ChIP-seq בקווי תאים SCLC NE, במטרה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי NCI K08CA241309 (PI: Hui-Zi Chen), פרס ACS IRG (PI: Hui-Zi Chen), ופרס גילוי סרטן הריאות של האגודה האמריקאית לריאות (PI: Hui-Zi Chen). ריצוף בוצע במרכז לינדה טי. וג'ון א. מלוז למדעי הגנום והרפואה המדויקת. אנו מודים גם לכל חברי המעבדה על תובנותיהם ותמיכתם בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>מגיב חזק
RPMI-1640 media	גיבקו תרמופישר סיינטיפיק	11875093	מדיום תרבית תאים
סרום בקר עוברי (FBS)	נוירומיקה	FBS002-HI	רכיב במדיום תרבית התאים
1% פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו תרמופישר סיינטיפיק	15140122	אנטיביוטיקה, למניעת זיהום חיידקי בתרביות תאים
Trypan Blue Solution, 0.4%	גיבקו תרמופישר סיינטיפיק	15250061	Trypan Blue Staining שימש להערכת חדירות באמצעות מונה תאים אוטומטי.
Roche cOmplete, קוקטייל Proease Inhibitor ללא EDTA	רוש	11873580001	מעכב פרוטאז. רכיבים של בופר שטיפה
5% Digitonin	אפיסייפר	21-1004	רכיבי בופר ומתכון Buffer ניתן למצוא בגיליון ה-Buffer
בופר הפעלה של חרוזים	אפיסייפר	21-1001	רכיבי בופר ומתכון Buffer ניתן למצוא בגיליון ה-Buffer
חרוזי קונקנאבלין A (ConA)	אפיסייפר	21-1401	מיקרוספירות פרמגנטיות מצופות ConA הן חרוזים מגנטיים מצופים לקטין המאפשרים קישור לממברנה ליפידית
CUT & RUN Kit	CUTANA ChIC EpiCypher	14-1048	ריאגנטים ל-CUT & RUN יצירת DNA
ערכת טיהור DNA	קוטנה אפיסייפר	14-0050	להוציא DNA מחלקי ה-DNA הממוקדים ששוחררו בסופרננטנט שבתגובה
CUT & ערכת ההכנה לספריית RUN	קוטנה אפיסייפר	14-001	יצר את ה-CUT& RUN ספריות רצף מהדור הבא (NGS)
טיהור DNA חרוזים מגנטיים	אג'נקורט AMPure XP בקמן קולטר	A63880	ניקוי ייצור PCR ובחירת גודל (כלומר, הסרת דימר ופריימר במתאם)
E. coli Spike-in DNA	אפיסייפר	18-1401	משמש כקוץ חיצוני לכיול ריצוף קריאות על פני סדרת דגימות ו-mdash; לדוגמה, מצבים מטופלים לעומת לא מטופלים
pAG-MNase	אפיסייפר	15-1016	בעת הקישור לנוגדן הראשי, האנזים חותך את קטע ה-DNA הממוקד משני צידי החלבון הקשור כאשר הוא מופעל על ידי סידן
PBS PH7.4 1x	גיבקו (תרמו פישר סיינטיפיק)	10010-049	תאי שטיפה
בופר קדם-שטיפה	אפיסייפר	21-1002	רכיבי בופר ומתכון Buffer ניתן למצוא בגיליון ה-Buffer
dsDNA רגישות גבוהה ערכת בדיקה	קיוביטTM תרמו פישר סיינטיפיקל	Q32854	CUT & כימות DNA של RUN
בופר עצירה	אפיסייפר	21-1003	רכיבי בופר ומתכון Buffer ניתן למצוא בגיליון ה-Buffer
ערכת DNA ברגישות גבוהה	טכנולוגיות אגילנט	5067-4626	CUT & ניתוח ריבוע והתפלגות גודל מקטעים של ספריות RUN DNA ו-NGS
<חזק>חומרי
צינורות PCR של 8 רצועות בנפח 0.2 מ"ל	אפיסייפר	10-0009k	שפופרות ל-CUT& תגובות RUN, תואמות למתקן ההפרדה המגנטי של צינורות 0.2 מ"ל
שקופיות LUNA עם 8 ערוצים	לוגוס ביוסיסטמס INC	L72001	שקופיות לספירת תאים, בדיקת עמידות ושלמות תאים
מאגר תגובות רב-ערוציים	פישר סיינטיפיק	14-387-072	מיכל שטיפת בופר
DynaMagTM-2 (מתקן הפרדה מגנטית), צינורות 1.5 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	12321D	חרוזי ConA בודדו מבופר האחסון שלהם באמצעות מתקן הפרדה מגנטית ולאחר מכן הופעלו על ידי השעיה מחדש בבופר הפעלה בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
מתקן הפרדה מגנטית, צינורות של 0.2 מ"ל	אפיסייפר	10-0008	לעמוד להיפרד תאי קישור חרוזים, נוגדנים, pAG/MNase מתגובה ובופרים שטיפה
Eppendor Research Plus 8-Channel Pipette, 0.5-10 uL	אפנדורף	3125000010	דגימות של צינורות 8-רצועות שאיבה כדי להאיץ את זרימת העבודה, פיפטור רב-ערוצי דומה
רפנס אפנדורף 2 8-ערוצי פיפט, 30-300 uL	אפנדורף	4926000050	שלבי שאיפה ושטיפה להאצת זרימת העבודה, פיפטור רב-ערוצי דומה
<חזק>ציוד
מיקסר Scientific Industries Vortex-Genie 2, מהירות משתנה, 120V	פישר סיינטיפיק	50-728-002	מיני-צנטריפוגה וסיבוב
מונה תאים אוטומטי LUNA FX7	לוגוס ביוסיסטמס INC	L70001	מונה תאים
מערבל אגוזים	VWR	82007-202	שלבי דגירה של חרוזים (דגירה של נוגדנים בלילה, תגובת עיכול pAG-MNase).
Eppendorf 6331 Nexus Gradiant MasterCycler Thermal Cycler	אפנדורף	6331	CUT & בניית ספריית הדור הבא של RUN
פלואורומטר קיוביט 4	תרמו פישר סיינטיפיק	Q33226	כימות DNA.
אנלייזר ביולוגי Agilent 2100	אג'ילנט טכנולוגיות	G2939A	גודל קטעים, ניתוח ריכוז עבור CUT&. הרץ DNA וחתוך & RUN ספריות, מכשיר אלקטרופורזה קפילרי דומה (למשל Agilent TapeStation)
אג'ילנט טייפסטיישן	אג'ילנט טכנולוגיות	G2992AA	גודל קטעים, ניתוח ריכוז עבור CUT&. הרץ DNA וחתוך & ספריות RUN
מערכת Illumina NovaSeq 6000	אילומינה, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב		סידור ה-CUT& המאוחד RUN libraries

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. J Hum Genet. 58 (7), 439-445 (2013).
Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications-cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
Wang, Y., et al. STAT3 facilitates super enhancer formation to promote fibroblast-to-myofibroblast differentiation by the analysis of ATAC-seq, RNA-seq and ChIP-seq. J Cell Mol Med. 29 (11), e70639(2025).
Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biol. 20 (1), 245(2019).
Takumida, H., et al. Integrative epigenome and transcriptome analyses reveal transcriptional programs differentially regulated by ASCL1 and NEUROD1 in small cell lung cancer. Oncogene. 44 (34), 3113-3125 (2025).
Sivakumar, S., et al. Integrative analysis of a large real-world cohort of small cell lung cancer identifies distinct genetic subtypes and insights into histologic transformation. Cancer Discov. 13 (7), 1572-1591 (2023).
Rudin, C. M., et al. Author correction: Molecular subtypes of small cell lung cancer: A synthesis of human and mouse model data. Nat Rev Cancer. 19 (7), 415(2019).
Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 6, e21856(2017).
Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc. 13 (5), 1006-1019 (2018).
Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. Elife. 8, e46314(2019).
Custers, S., et al. Cleavage under targets & release using nuclease (CUT&RUN) protocols for the study of genetic and epigenetic regulation in cancer. Methods Mol Biol. 2944, 207-225 (2025).
Hainer, S. J., Boskovic, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329.e11 (2019).
Marroquin-Rivera, A., et al. Immune-related transcriptomic and epigenetic reconfiguration in BV2 cells after lipopolysaccharide exposure: An in vitro omics integrative study. Inflamm Res. 73 (2), 211-225 (2024).
Huang, H., et al. Deciphering the role of histone modifications in memory and exhausted CD8 T cells. Sci Rep. 15 (1), 17359(2025).
De Sarkar, N., et al. Nucleosome patterns in circulating tumor DNA reveal transcriptional regulation of advanced prostate cancer phenotypes. Cancer Discov. 13 (3), 632-653 (2023).
Roberti, A., Fraga, M. F. Epigenomic profiling of histone posttranslational modifications in frozen cancer tissue using CUT&RUN. Methods Mol Biol. 2930, 229-243 (2025).
Black, J. B., et al. Master regulators and cofactors of human neuronal cell fate specification identified by CRISPR gene activation screens. Cell Rep. 33 (9), 108460(2020).
Augert, A., et al. Small cell lung cancer exhibits frequent inactivating mutations in the histone methyltransferase KMT2D/MLL2: CALGB 151111 (Alliance). J Thorac Oncol. 12 (4), 704-713 (2017).
Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
Yang, Y., et al. H3K9me3 involved in FOXL2 regulation of SerpinE2 expression to affect steroid hormone synthesis in follicular granulosa cells. FASEB J. 39 (12), e70730(2025).
Panday, A., Elango, R., Willis, N. A., Scully, R. A modified CUT&RUN-seq technique for qPCR analysis of chromatin-protein interactions. STAR Protoc. 3 (3), 101529(2022).
Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease. J Vis Exp. (180), e63536(2022).
Hsieh, T. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Mol Cell. 78 (3), 539-553.e8 (2020).
Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nat Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CUT And RUN H3K4me3 H3K4me1 E2F7

מיפוי גנומי רחב של שינויים בהיסטונים ואתרי קישור לפקטורי שעתוק בקווי תאי סרטן ריאות נוירואנדוקריניים קטנים באמצעות CUT&RUN

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים