הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

ויסות מסלול AKT/Wnt/β-קטנין והשראת קופרופטוזיס על ידי כורכומין בגליובלסטומה

655 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69663

⸱

27 בינואר 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

במאמר זה

סיכום

כורכומין (CUM) מעכב התקדמות גליובלסטומה (GBM) על ידי גרימת קופרופטוזיס באמצעות דיכוי ציר AKT/Wnt/β-קטנין. פרוטוקול זה בוחן את המנגנון המולקולרי שבו CUM מעכב התקדמות ממאירה ב-GBM ומתאר שיטות להערכת האופן שבו CUM משרה קופרופטוזיס על ידי ויסות מסלול זה.

תקציר

כורכומין (CUM) יכול לווסת את ההתנהגות הממאירה של גליובלסטומה (GBM). מחקר זה בוחן האם CUM מדכא התקדמות GBM על ידי גרימת קופרופטוזיס דרך מסלול האיתות AKT/Wnt/β-קטנין. ריכוזי כורכומין אופטימליים נקבעו באמצעות מבחן MTT. תאי A172 ו-U251 טופלו ב-CUM, מעכב AKT MK-2206, מעכב Wnt LGK974, ו-Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl2). התרבות תאים, נדידה, פלישה ואפופטוזיס הוערכו באמצעות צביעת קרבוקסיפלואורסאין סוקסינימידיל אמינו אסטר, בדיקות שריטות, בדיקות טרנסוול וציטומטריית זרימה, בהתאמה. מיטוSOX פלואורסצנציה, ניתוח מטבולי של סוסון ים, אימונופלואורסצנציה, זיהוי Cu2+ ו-Western bloting שימשו להערכת לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי וקופרופטוזיס. ציר AKT/Wnt/β-קטנין נותח באמצעות ערכת דיווח TCF/LEF1 ובלוט מערבי. הוקם מודל גזנוגרפט GBM, ו-CUM ניתנה באמצעות גאווג' במשך חמישה שבועות. הוערכו השפעות CUM על גדילת הגידול, קופרופטוזיס וביטוי חלבונים במסלול AKT/Wnt/β-catenin. תאים טופלו ב-10 מיקרומום ו-20 מיקרומום CUM במבחנה. טיפול ב-CUM הפחית התפשטות, נדידה ופלישה, תוך קידום לחץ חמצוני וקופרופטוזיס. CUM גם דיכאה את פעילות האיתות של Wnt/β-catenin. עיכוב המסלול הגביר את רמות מיני החמצן הריאקטיביים (פי 3.7) ו-Cu+ (פי 3.1), והפחית את ביטוי הדיהידרוליפואמיד אצטילטרנספראז, ובכך הגביל התנהגות ממאירות. בעכברים עירומים, CUM הפחית משמעותית את גדילת הגידול, קידם קופרופטוזיס ועיכב את הפעלת ציר AKT/Wnt/β-catenin. התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-CUM מדכא אותות AKT/Wnt/β-קטנין, מקדם קופרופטוזיס ומפריע להתקדמות ה-GBM.

מבוא

גליומה היא הגידול הממאיר התוך-גולגולתי הראשוני הנפוץ ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS)1. גליומה דרגה 4 מתייחסת בדרך כלל לגליובלסטומה (GBM), עם פרוגנוזהגרועה 2. GBM הוא גידול מוח פולשני מאוד, האחראי לכמעט 50% מהמאירויות של מערכת העצבים המרכזית, עם הישרדות חציונית של פחות משנהו-3. הוא ידוע בשל הממאירות הגבוהה שלו ובשיעור ההישנות הגבוה שלו. כיום, אסטרטגיות הטיפול ב-GBM מתבססות בעיקר על ניתוח, בתוספת רדיותרפיה, כימותרפיהושיטות טיפול מקיפות נוספות. למרות שאסטרטגיות טיפוליות מתקדמות כמו אימונותרפיה, ביותרפיה וננו-רפואה השיגו תוצאות מרשימות במחקרים פרה-קליניים 7,8, שיעור ההישרדות הכולל לחמש שנים נותר רק 4.3%9. משטר הכימותרפיה הנפוץ ביותר הוא משטר Stupp המוכר; עם זאת, אצל חולי GBM עם MGMT לא מתילציה, שיעור ההישרדות הכולל אינו ממושך באופן משמעותי10. לכן, חקר אסטרטגיות טיפול חדשות הוא בעל חשיבות מרכזית להארכת תקופת ההישרדות של המטופלים. מחקר זה מניח כי המנגנון האנטי-סרטני של כורכומין (CUM) על GBM קשור לקופרופטוזיס.

חילוף חומרים לא תקין של נחושת או נזק לתאים הנגרמים מנחושת יכולים להוביל לסדרת מחלות11. בתנאי חמצון רדוקס קונבנציונליים, ניתן לחמצון Cu+ המופחתל-Cu+ 2. צבטקוב ואח' מצאו מנגנון לא ידוע קודם של מוות תאי מונע מנחושת, הנקרא קופרופטוזיס. יוני Cu2+ נקשרים לתרכובות אצילטיות, ואז הביטוי של חלבוני אשכול Fe-S מופחת, מה שגורם למוות תאים12,13. מחקרים נרחבים אישרו כי קופרופטוסיס קשור קשר הדוק לתהליך הפתופיזיולוגי של הגידולים14,15. lncRNA וגנים הקשורים לקופרופטוזיס מהווים סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לתחזית וטיפול ב-GBM16. BCMD יכול לשחרר Cu2+, לגרום לקופרופטוזיס ולגרום למוות תאי אימונוגני לטיפול ב-GBM17. לכן, אנו מאמינים שקופרופטוזיס יכול לשמש כמטרה חדשה לטיפול ב-GBM. עם זאת, רוב השיטות הקיימות מסתמכות על נשאים סינתטיים כמו אלסקולוmol-Cu או השראה ישירה של יוני נחושת בריכוז גבוה. למרות שהתערבות דרסטית חיצונית זו יכולה להוכיח את מושג הקופרופטוזיס, סיכויי השינוי הקליני שלה מוגבלים בשל היעדר מתאם פיזיולוגי ומיקוד. לכן, החיפוש אחר תרכובות טבעיות או מולקולריות קטנות שיכולות לווסת באופן אנדוגני ומדויק את קופרופטוזיס GBM ולהבהיר את מנגנון האיתות במעלה הזרם הפך לגשר מרכזי בין מנגנון חדש זה לטיפול קליני.

הרפואה הסינית נחשבת באופן נרחב למשאב חשוב למחקר תרופות נגד גידולים. CUM הוא חומר פוליפנולי שמופק מכורכום מסורתי ברפואה הסינית. הפרמקולוגיה המודרנית אישרה שיש לו תפקידים אנטי-חמצניים, אנטי-דלקתיים ואנטי-גידולים. ל-CUM יש פעילויות אנטי-גידוליות רבות. הוא יכול להפחית את פעילות תאי GBM על ידי קידום אפופטוזיס, שיבוש מסלולים מולקולריים ומנגנונים נוספים18. ניסויים במבחנה הראו כי CUM במינון נמוך בשילוב עם הקרנה יכולים לשפר באופן סינרגטי את התרבות האנטי-GBM19. יתרה מזאת, CUM יכול לווסת מסלולים מרכזיים הקשורים ל-GBM, כולל MAPK20. בהשוואה לכימותרפיה מסורתית של טמוזולומיד (TMZ), CUM מראה יתרונות טיפוליים ייחודיים. היעילות של טמוזולומיד מוגבלת לעיתים קרובות על ידי מנגנוני תיקון DNA חזקים ב-GBM, מה שמוביל לעמידות לתרופות; המנגנון שבו CUM משרה קופרופטוזיס על ידי מיקוד במטבוליזם המיטוכונדריאלי21,22 אינו תלוי ב-TMZ. CUM יכול לא רק לווסת את התהליכים המטבוליים הקשורים לקופרופטוזיס, אלא גם להפריע בו זמנית למסלולי איתות מרכזיים רבים הקשורים להתקדמות GBM, ולספק דרכים פוטנציאליות להתגבר על מגבלות הטיפולים הבודדים ולפתח אסטרטגיות טיפול משולבות. טווח הריכוזים של CUM ששימש במחקר זה (10-20 מיקרומון) תואם לריכוזים אפקטיביים שדווחו במחקרי טיפול פרה-קליני23. למרות שהזמינות הביולוגית הנמוכה של CUM ויעילות האספקה שלה דרך מחסום הדם-מוח הן אתגרים מרכזיים ביישומים מעשיים, מערכות ננו-אספקה מתפתחות ואסטרטגיות שינוי ממוקדות סיפקו פתרונות מבטיחים להתגבר על צוואר הבקבוקהזה.

למרות שההשפעות הפרואפופטוטיות, האנטי-רבטיביות ומעכבות ההגירה של CUM ב-GBM דווחו על ידי מחקרים רבים25,26, רוב המחקרים הקיימים התמקדו בהשפעותיה על מסלולי אפופטוזיס או אוטופגיה מסורתיים. מחקר זה נועד להבהיר האם CUM מעכב את ההתקדמות הממאירה של GBM על ידי ויסות קופרופטוזיס. בדקנו האם CUM עשוי לגרום לקופרופטוזיס בין היתר על ידי דיכוי ציר AKT/Wnt/β-קטנין, ובכך דיכוי GBM. בהתבסס על כך, מחקר זה מספק בסיסים ניסיוניים ל-CUM לשיפור הטיפול ב-GBM ולפיתוח מטרות חדשות בטיפול ב-GBM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים מוסדיים שנקבעו לטיפול ושימוש הומאני בבעלי חיים במעבדה, ואושרו רשמית על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדית. ננקטו צעדים להפחתת אי הנוחות והמצוקה של בעלי החיים בכל הזדמנות אפשרית.

עבודות שכללו תרכובות כימיות, צבעים ודגימות ביולוגיות התבצעו לפי נהלי בטיחות ביולוגית מוכרים כדי לצמצם סיכונים פוטנציאליים. חומרים שעלולים להיות מסוכנים – כולל פאראפורמלדהיד, תגובות מבוססי נחושת ו-DHE – טופלו באמצעות ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מסכות פנים ומשקפי בטיחות. כל חומרי הפסולת, כגון חומרים משומשים ופריטים חד-פעמיים מזוהמים, הופרדו למכלי ביו-סיכון ייעודיים וטופלו לאחר מכן על ידי שירותי ניהול פסולת מסוכנת מורשים בהתאם לתקנות הבטיחות המוסדיות והסביבתיות. העיצוב הניסויי הכולל מתואר באיור 1.

איור 1
איור 1: תהליך העבודה של מחקר זה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תרבית תאים וקיבוץ
האסטרוציטים האנושיים (NHA) ותאי גליובלסטומה תקינים A172, U251, LN229 ו-SHG-44 (ראו טבלת חומרים) גודלו במדיום DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ונשמרו באינקובטור בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. המדיום הוחלף כל יומיים, והתאים עברו כאשר הגיעו לכ-80% מזל. המינון המתאים וזמן החשיפה ל-CUM נקבעו באמצעות מבחן MTT. תאי NHA, A172, U251, LN229 ו-SHG-44 טופלו בריכוזים שונים (0, 2.5, 5, 10, 20 ו-4 מיקרומון) של CUM במשך 24, 48 ו-7 שעות בהתאמה,23 בהתאמה. לאחר מכן נוספו 2 מיקרוליטר של תמיסת MTT. לאחר ה-H, נוספו 15 מיקרו-ליטר דימתיל סולפוקסיד לכל באר וערבבו בעדינות. צפיפות אופטית (OD) ב-45 ננומטר נמדדה באמצעות קורא מיקרופלט. תאים לא מטופלים (קבוצת הביקורת) שימשו כביקורת שלילית בכל הניסויים.

תאי A172 ו-U251 זרעו וחולקו לקבוצות: בקרה, CUM במינון נמוך (1 מיקרומון), CUM במינון גבוה (2 מיקרומון), מעכב AKT (MK-2206), מעכב AKT + מעכב Wnt (MK-2206 + LGK974), ו-Elsm-Cu (אלסקלומול + CuCl₂), בהתאם לתנאי הטיפול. תאים בקבוצות CUM טופלו ב-10 או 2 מיקרומום CUM למשך 4 שעות. תאים בקבוצת MK-2206 קיבלו 1 מיקרומום MK-2206 למשך 2 שעות. תאים בקבוצת MK-2206 + LGK974 טופלו ב-μM LGK974 עבור H לאחר חשיפה ל-MK-2206. תאי קבוצת Elsm-Cu טופלו ב-100 ננומולר אלסקלומול ו-μM CuCl₂ למשך 4 שעותו-14 שעות.

ציטומטריית זרימה
תאי A172 ו-U251 מתורבתים בכל קבוצה הוסטו עם תמיסת צביעת PBS המכילה 1 מיקרוגרם/מ"ל PI למשך דקה. תאים טופלו לאחר מכן ב-0.25% טריפסין ונאספו בצנטריפוגציה (20 × גרם, מינימום, בטמפרטורת החדר). תאים חיוביים ל-PI זוהו באמצעות ציטומטר זרימה עם ערוץ PE (עירור ב-488 ננומטר), ושיעור תמותת התאים חושב27.

בדיקת קרבוקסיפלואורסאין סוקסינימידיל אמינו אסטר (CFSE)
תאי A172 ו-U251 נדגרו עם צבע CellTrace CFSE מיקרומול/ליטר בטמפרטורה של 3°C למשך דקה אחת בחושך. המדיום נוטרל, והתאים צונטרו בטמפרטורה של 20 × גרם למינימום בטמפרטורת החדר. לאחר האיסוף, התאים תורבתו וטופלו בהתאם לקבוצות שלהם. עוצמת הפלואורסצנציה של CFSE נותחה באמצעות ציטומטריית זרימה (עירור ב-488 ננומטר)27.

מבחן יצירת שיבוט תאים
תאי A172 ו-U251 מתורבתים עוכלו, הושעו מחדש ונספרו. נוספו שני מיליליטר של מתלה תא מוכן. לאחר ערבוב עדין, התאים הועברו לדגירה למשך כ-14 ימים. התאים קיבעו לאחר מכן עם 4% פאראפורמלדהיד למשך 3 דקות, והקיבע הושלך. לאחר צביעה עם 0.1% קריסטל סגול. תמונות מהמושבות נלקחו, ושיעור היווצרות השיבוטים חושב14.

מבחן שריטה של תא
תאי A172 ו-U251 (1 ×10 6 תאים לבאר) תורבדו עד שהגיעו ל-90% קונפלינסי. שכבת התא נשרטה פעם אחת באמצעות קצה סטרילי בנפח 2 מיקרוליטר ליצירת פצע, ולאחר מכן טופלה בריכוזים שונים של CUM עבור H ו-48 שעים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ. קצב החלמת השריטות הוערך באמצעות תוכנת ImageJ. התמונות הומרו לפורמט של 8 ביט, נקבע סף מאוחד להבחנה בין אזור השריטה לאזור התא, ואזורי השריטה ב-0 ו-48 שעות חושבו באמצעות פונקציית ניתוח חלקיקים . קצב החלמה משריטה (%) = (מרחק 0 שעה − מרחק 48 שעות) / מרחק 0 שעה × 100%23.

ניסוי טרנסוול
תאי A172 ו-U251 נחשפו לטיפולים שנקבעו, ואז נותקו אנזימטית וצונטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. התאים הושעו מחדש במדיום ללא סרום. מטריג'ל דולל ביחס של 1:8 במדיום ללא סרום, מעורבב היטב, והוחל 5 מיקרוליטר על התא העליון של הכנסת טרנסוול, ואחריו דגירה של 4 שעות. בסך הכל נוספו 5 ×-10 תאים לכל באר לתא העליון, בעוד 60 מיקרוליטר מדיום עם 20% FBS הוכנסו לתא התחתון. לאחר 48 שעות של דגירה, התאים קיבעו באמצעות פאראפורמלדהיד וצבועו בסגול קריסטלי. חמישה שדות ראייה נבחרו ממרכז ופריפריה של כל באר. תאים נצפו וצולמו תחת מיקרוסקופ. תאים פולשים חושבו באמצעות ImageJ. התמונות הומרו לפורמט של 8 ביט, הוטלו ספים להבחנה בין תאים מוכתמים לרקע, ופונקציית ניתוח חלקיקים ספרה תאים שהיגרו דרך הממברנה23.

זיהוי פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית (MMP)
תאי A172 ו-U251 מתורבתים בכל קבוצה נדגרו עם מיליטר של תמיסת JC-1 למשך 30 דקות בחושך. התאים נשטפו בעדינות באמצעות בופר JC-1 מקורר מראש, נצפו וצולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות עירור של 488 ננומטר, נאספו אותות פולימר ומונומר JC-1 באמצעות מסנני פליטה של 590 ננומטר ו-530 ננומטר, בהתאמה. יחס הפלואורסצנציה האדום/ירוק (אגרגטים JC-1 למונומרים) נותח באמצעות תוכנת ImageJ להערכת שינויים ב-MMP28. תמונות של ערוצים אדומים וירוקים הופקו בנפרד, ועוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת באותו אזור נמדדה.

גילוי קצב צריכת חמצן (OCR)
תאי A172 ו-U251 שתרבתו. הפלטה הונחה באנלייזר מחומם מראש בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס לצורך התאמה. לאחר ההתאמה, נוסף מדיום ההגדרה. לאחר כיול אוטומטי, הפלטה התאזנה ל-15-2 דקות בטמפרטורה של 3°C ללאCO2. נמדד OCR בסיסי, ותוכנית הבדיקה הוגדרה לרשום את ה-OCR המיטוכונדריאלי במרווחים מוגדרים. הנתונים יוצאו לניתוח מאוחריותר 28.

זיהוי גלאי פלואורסצנטי של MitoSOX של מיני חמצן תגובתי (ROS)
תאי A172 ו-U251 הותאמו לצפיפות של 1 ×-104 תאים למ"ל, ו-1 מ"ל לכל באר נזרע בצלחת קונפוקלית, ולאחר מכן בוצעה התערבות תרופה. הסופרנטנט של התא נזרק, ונוסף 1 מ"ל של גלאי MitoSOX מדולל (1:1,000). התאים הוגדרו בחושך בטמפרטורה של 3°C למשך דקה. אות הפלואורסצנציה נלכד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה (עירור/פליטה: 510/580 ננומטר) להערכת רמות ROS29 במיטוכונדריה.

אימונופלואורסצנציה
כיסויי כיסוי נשטפו פעם אחת עם מדיום תרבית DMEM. לאחר מכן הונחו בלוחות של שישה בארות לזרעת תאים ולהתערבות תרופתית. לאחר 24 שעות, התאים הוקבעו ב-4% פאראפורמלדהיד וחסמו לאחר מכן באלבומין סרום בקר (BSA) של 5% למשך 30 דקות. תמיסת החסימה הוסרה, והוחלו נוגדנים ראשוניים מדוללים המיועדים לדיהידרוליפואמיד אצטילטרנספראז (DLAT) ו-β-קטנין, ואחריהם דגירה לילית בטמפרטורהשל °C 30. נוגדנים משניים מסומנים פלואורסצנטית הוכנסו ודגרו בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. גרעיני התאים צובעו נגד DAPI, והוסתפו עם מגיב אנטי-פייד. תמונות פלואורסצנציה צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ועוצמת האות נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ. התמונות הומרו לפורמט של 8 ביט, והוחל סף עקבי להבחנה בין אותות מטרה לרעש רקע. כלי המלבן שימש לבחירת אזורי התאים הרצויים, ועוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת נמדדה27. כדי להמחיש את המיטוכונדריה, התאים טופלו ב-20 ננומטר MitoTracker Red CMXRos למשך 30 דקות ואז תוקנו בפארפורמלדהיד30.

ערכת דיווח TCF/LEF1 לוסיפראז
הפעלת Wnt/β-catenin בתוך תאי A172 ו-U251 הוערכה באמצעות ערכת דיווח TCF/LEF1 לוסיפראז. וקטור המדווח TCF/LEF מכיל קופסת TATA ואלמנטים של תגובת פקטור תאי T/פקטור מגביר לימפה (TCF/LEF), המאפשרים זיהוי עקיף של פעילות שעתוק של β-קטנין באמצעות ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). תאי A172 ו-U251 שהתרבתו עברו העברה הפוכה עם וקטור דיווח TCF/LEF של 5 נ"גרם. שש עשרה שעות לאחר ההעברה, נרשמה עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרופלט עם הגדרות עירור ופליטה של 488 ו-51 ננומטר, בהתאמה31.

עכברים נושאי גידול
עשרה עכברים עירומים זכרים מסוג BALB/c (בני 7 שבועות, 2 ± 2 גרם) הוחזקו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים (2 מעלות צלזיוס, 65% לחות) עם גישה בלתי מוגבלת לאוכל ומים סטנדרטיים. כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הסקירה האתית של בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת היאנגצה (מס' 2023092; תאריך אישור: 18.10.2023).

כדי להקים מודל זנוגרפט GBM, תאי A172 (4 × 106 תאים למ"ל) הושמו במדיום ללא סרום, והוזרק 0.1 מ"ל תת-עורית לצד ימין של כל עכבר. בעלי החיים חולקו באקראי לקבוצת ביקורת או לקבוצת טיפול ב-CUM (n = 5 לכל קבוצה). קבוצת ה-CUM קיבלה 60 מ"ג/ק"ג כורכומין ביום באמצעות גאבאז' אוראלי, בעוד קבוצת הביקורת קיבלה נפח שווה של מי מלח. קוטר הגידול נרשם כל 7 ימים באמצעות קליפר ורנייה, ונפח הגידול חושב באמצעות הנוסחה 1/2 × אורך ×רוחב 2 (מ"מ 3). לאחר 5 שבועות, עכברים הושמתו עקב פריקת צוואר הרחם, והגידולים נקטפו בתנאים סטריליים למדידת משקל32.

בדיקת טונל
רקמות הגידול נקבעו ב-4% פאראפורמלדהיד במשך 24 שעות, יובשו באתנול, הוטבעו בפרפין, וחתכו בעובי מיקרון. החתכים עברו הסרת שעווה והודרציה מחדש, שטפו ב-PBS, טופלו בחראבונאז K במשך 50 דקות לשאיבת אנטיגן, ודגרו ב-3% מי חמצן. תערובת תגובת TUNEL הונחה במשך שעה, ולאחר מכן הורכבה עם מגיב אנטי-פייד. תמונות פלואורסצנציה נאספו במיקרוסקופיה, ותאי TUNEL חיוביים בשדה נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ.

אימונוהיסטוכימיה
מקטעי הגידול המוטמעים בפרפינים נאפו בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס, הוסרקו בשעווה בקסילן, והודרו מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת. שליפת אנטיגנים בוצעה באמצעות בופר מחומם של EDTA, ולאחר מכן כיבוי פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. המחסניות דגרו בנוגדן ראשוני נגד Ki-67 במהלך הלילה בטמפרטורה של °C. לאחר דגירה עם נוגדן משני למשך 20 דקות, החתכים צוברו בדיאמינובנזידין (DAB) למשך 5 דקות וצובעו נגד בהמטוקסילין. לאחר התייבשות והרכבה עם שרף ניטרלי, צולמו שקופיות תחת מיקרוסקופ. צביעה חיובית זוהתה על ידי משקע חום-צהבהב, ותאי Ki-67 חיוביים נמדדו באמצעות ImageJ27.

צביעת פלואורסצנציה של דיהידרואתידיום (DHE)
רמות ROS הוערכו באמצעות צביעת פלואורסצנציה של DHE. קטעי רקמת גידול קפואים נשטפו ב-PBS. פלואורסצנציה ברקע כובה, ו-μM DHE נוסף לכל חלק למשך 3 דקות. לאחר שטיפת PBS, החלקים נאטמו בחושך. פלואורסצנציה נצפתה באמצעות מיקרוסקופ (עירור/פליטה: 518/605 ננומטר), ונאספו חמש תמונות אקראיות בכל קבוצה. ImageJ שימש לכימות רמות ROS.

זיהוי תוכן Cu2+
ריכוז Cu2+ בתאי GBM ורקמות גידול הוערך באמצעות ערכת זיהוי קולורימטרית. תאי A172 ו-U251, לאחר הטיפול, נאספו וצונטריפוגה ב-1,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה מעלות צלזיוס. כדורי תאים הושעו מחדש ב-0. מ״ל מים מזוקקים, סוניקציה על קרח, ושוב בצנטריפוגה. רקמות הגידול עברו הומוגניזציה במים מזוקקים ובצנטריפוגה דומה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סופרנטנטים (1 מיקרוליטר) הועברו ללוח עם 96 בארות, מעורבבים עם 23 מיקרוליטר של תגובת כרומוגנית, נאטמו ודגרו במשך 5 דקות. צפיפות אופטית (OD) נמדדה ב-58 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט, ורמות Cu+ 2+ חושבול-14.

ווסטרן בלוט (WB)
חלבונים בודדו מתאים מתורבתים ורקמות גידול. סופרנטנטים הושגו באמצעות צנטריפוגציה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, וריכוזי החלבון נמדדו באמצעות בדיקת BCA. לאחר הדנאטורציה, הדגימות הופרדו על ידי SDS-PAGE, הועברו לממברנות PVDF ונחסמו עם חלב רזה של 5% למשך שעה. הממברנות נשטפו ב-TBST ודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של °C עם נוגדנים ראשוניים נגד FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-קטנין, p-β-קטנין ו-β-אקטין (ראו טבלת החומרים)14,33. לאחר שטיפות נוספות של TBST, הממברנות דוגרו בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP למשך שעה אחת, שפותחו באמצעות תגובת ECL, והוצגו באמצעות כימילומינסנציה. תוכנת ImageJ שימשה לכימות עוצמת האות באמצעות כלי בחירת מלבן ופונקציית ניתוח הג'לים. ביטוי חלבון יחסי חושב כיחס בין ערך אפור של פס המטרה לערך הבקרה הפנימית (GAPDH). תמציות גרעיניות מתאי A172 ו-U251 הוכנו באמצעות ערכת חילוץ חלבון גרעיני. ההבעה של β-קטנין ולמין B1 הוערכה, כאשר לאמין B1 שימש כבקר טעינה גרעינית34.

ניתוח סטטיסטי
תוצאות כמותיות משקפות את הממוצע של שלושה שכפולים עצמאיים. כל הנתונים הוערכו מבחינת התפלגות תקינה והומוגניות של שונות. ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי שימש להשוואות בין קבוצות שונות. הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ערך P של פחות מ-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. נהלים אלו שימשו להבטחת עמידות הנתונים ולתמיכה באמינות המסקנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עיכוב קיום תאי GBM ומוות תאי מושרה
ראשית, לא נרשמה שינוי משמעותי בחיוניות תאי ה-NHA לאחר 2 שעות, 48 שעות ו-72 שעות של התערבות CUM (איור 2A), מה שמעיד שריכוזי ה-CUM ששימשו לא השפיעו רעילה על תאים תקינים. לעומת זאת, הקיימות של קווי תאי GBM (A172, U251, LN229 ו-SHG-44) ירדה משמעותית בריכוזי CUM ≥ 1 מיקרומום (P < 0.05-0.001) (איור 2B-E). בהתבסס על תוצאות אלו, נבחרו 1 מיקרומום ו-2 מיקרומול CUM וזמן חשיפה של 4 ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיעור ההישנות של GBM קשור למאפיינים הביולוגיים הממאירים שלו36. CUM מפעיל השפעות אנטי-GBM על ידי ויסות לחץ חמצוני, אפופטוזיס, אוטופגיה, גרורות, פלישה ומטרות מולקולריות מרכזיות37. במחקר זה, ניסויים ברמת התא הראו כי CUM מעלה משמעותית את תמותת תאי GBM ומעכב התפשטות, יצירת מושבות, נדידה ופלישה – ממצאים התואמים לדיווחים קודמים20.

קופרופטוסיס קשור להתפתחות סוגי סרטן שונים, כולל GBM

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת צביעה קריסטלית בצבע סגול 0.1%סרוויסביוG1014תאי תיוג
4% פאראפורמלדהידביוטייםP0099תיקון תאים או רקמות
מעכב AKT (MK-2206)Selleck.cn, שנגחאי, סיןS1078מעכב AKT ספציפי
נוגדנים (נוגדנים ראשוניים ומשניים)ABclonal Technology, ווהאן, סין / abcam, קיימברידג', בריטניה / Servicebio, ווהאן, סין / Beyotime, שנחאי, סין / Cellular signaling, דנברס, MA, ארה"בA8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025זיהוי רמות ביטוי חלבונים
ערכת זיהוי אפופטוזיס תאיתסרוויסביו, ווהאן, סיןG1021זיהוי אפופטוזיס
צבע CFSE עקבות תאיםInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בC34570זיהוי התרבות תאים
מערכת הדמיה כימלומינסצנטיתביו-רד, הרקולס, קליפורניה, ארה"בChemi Doc XRS+זיהוי רגישות גבוהה במיוחד של חלבון
Cu2+ ערכת בדיקה צבעוניתElabscience, ווהאן, סיןE-BC-K300-Mזיהוי תכולת Cu2+ ברקמות גידול ותאי GBM
CuCl2סיגמא-אלדריך, דרמשטאדט, גרמניה751944משרה קופרופטוזיס
כורכומין (CUM)עלה מקור שנחאי, שנגחאי, סיןS19245תרכובת פוליפנולית
ערכת גילוי DHEביוטיים, שנגחאי, סיןS0063זיהוי רמות ROS
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סרוויסביוG4101-2ממס לבדיקת MTT
מפתח ECLסרוויסביוG2161שימש ל-Western Blot
אלסקולולSelleck.cnS1052משרה קופרופטוזיס
ציטומטריית זרימהBD Biosciences, ניו ג'רזי, ארה"בBD FACSAria IIIמשמש לבדיקות מוות תאים ו-CFSE
מיקרוסקופ פלואורסצנציהאולימפוס, טוקיו, יפןIX73משמש לבדיקות אימונופלואורסנציה, ROS, TUNEL, DHE ו-MMP
קווי תאי גליובלסטומה A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) ו-SHG-44 (RRID: CVCL_6902)חברת פונוסאי ביוטכנולוגיה בע"מ, ווהאן, סיןCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207קווי תאי גליובלסטומה אנושיים
תוכנת GraphPad Prism 9.0GraphPad Software, LLCגרסה 9.0ניתוח סטטיסטי
תוכנת ImageJ 1.53kהמכון הלאומי לבריאות הנפשגרסה 1.53kחישוב סטטיסטי
פתרון עבודה של JC-1סולארביו, בייג'ינג, סיןM8650זיהוי MMP
עכברים עירומים זכרים מסוג BALB/cמעבדת סלאק קינגדה לבעלי חיים בע"מ, חונאן, סיןניסוי עכבר
קורא מיקרופלטביו-טק, ורמונט, ארה"בELX-800למדידת ערך OD450 ננומטר
מיקרוסקופאולימפוסBX53משמש לבדיקות שריטה של תאים, ניסוי טרנסוול ובדיקות אימונוהיסטוכימיה
גשושית MitoSOXתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"בM36008משמש לזיהוי ROS
Mitotracker Red CMXRosתרמו פישר סיינטיפיקM7512סימון ספציפי של מיטוכונדריה בתאים חיים
ערכת זיהוי MTTסרוויסביוG4101-1זיהוי כחיות תאים
תאי NHA במוח האסטרוציטים האנושיים (RRID:CVCL_B0DK)חברת Huatuo Biotechnology בע"מ, שנזן, סיןHTX2408קו תאים לניסויי בקרה
ערכת חילוץ חלבון גרעיניביוטייםP0027הפקת חלבון גרעיני
מנתח מטבוליזם אנרגיה של תאי סוסון יםAgilent,  בייג'ינג, סיןסיהורס XFמשמש לזיהוי OCR
ערכת דיווח TCF/LEF1 לוסיפראזBiolab Technology Co., Ltd, בייג'ינג, סיןזיהוי פעילות מסלול האיתות Wnt/β-catenin
ערכת גילוי TUNELביוטייםC1088זיהוי אפופטוזיס ברקמות גידול
מעכב Wnt (LGK974)Selleck.cnS7143מעכב Wnt ספציפי

מקורות

  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
  3. Sahoo, O. S., Mitra, R., Nagaiah, N. K. H. The hidden architects of glioblastoma multiforme: glioma stem cells. 3 (1), 66(2024).
  4. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: a review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  5. Singh, D. Nanocage-tethered polymeric hybridome for pDNA delivery: a revolutionary approach for treatment of glioblastoma. J Can Biomol Therap. 2 (1), 133-144 (2025).
  6. van den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  7. Zhou, Y., Shi, F., Zhu, J., Yuan, Y. An update on the clinical trial research of immunotherapy for glioblastoma. Front Immunol. 16, 1582296(2025).
  8. Ravuluri, J. A. V., et al. Brain-targeted nano-architectures for efficient drug delivery and sensitization in glioblastoma. Curr Pharm Des. 29 (22), 1775-1790 (2023).
  9. LeBlanc, V. G., et al. Single-cell landscapes of primary glioblastomas and matched explants and cell lines show variable retention of inter- and intratumor heterogeneity. Cancer Cell. 40 (4), 379-392.e9 (2022).
  10. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing identifies critical transcription factors of tumor cell invasion induced by hypoxia microenvironment in glioblastoma. Theranostics. 13 (11), 3744-3760 (2023).
  11. Jiang, Y., Huo, Z., Qi, X., Zuo, T., Wu, Z. Copper-induced tumor cell death mechanisms and antitumor theragnostic applications of copper complexes. Nanomedicine (Lond). 17 (5), 303-324 (2022).
  12. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  13. Meena, R., Sahoo, S. S., Sunil, A., Manna, D. Cuproptosis: a copper-mediated programmed cell death. Chem Asian J. 20 (4), e202400934(2025).
  14. Jin, Y., et al. Baicalein enhances cisplatin sensitivity in cervical cancer cells by promoting cuproptosis through the Akt pathway. Biomed Pharmacother. 179, 117415(2024).
  15. Ning, S., et al. Type-I AIE photosensitizer loaded biomimetic system boosting cuproptosis to inhibit breast cancer metastasis and rechallenge. ACS Nano. 17 (11), 10206-10217 (2023).
  16. Chen, Y., Zhang, J., Zheng, W., Xu, H. Cuproptosis-related lncRNAs and genes: potential markers for glioblastoma prognosis and treatment. PLoS One. 20 (2), e0315927(2025).
  17. Huang, Q. -X., et al. Metal-organic framework nanoagent induces cuproptosis for effective immunotherapy of malignant glioblastoma. Nano Today. 51, 10911(2023).
  18. Mohamadian, M., Ahmadi, S. S., Bahrami, A., Ferns, G. A. Review on the therapeutic potential of curcumin and its derivatives on glioma biology. Neurochem Res. 47 (10), 2936-2953 (2022).
  19. Zoi, V., et al. Curcumin and radiotherapy exert synergistic anti-glioma effect in vitro. Biomedicines. 9 (11), 1562(2021).
  20. Wong, S. C., Kamarudin, M. N. A., Naidu, R. Anticancer mechanism of curcumin on human glioblastoma. Nutrients. 13 (3), 950(2021).
  21. Sun, X., et al. Protective effect of curcumin on hepatolenticular degeneration through copper excretion and inhibition of ferroptosis. Phytomedicine. 113, 154539(2023).
  22. Xiang, B., et al. Curcumin ameliorates copper-induced neurotoxicity through inhibiting oxidative stress and mitochondrial apoptosis in SH-SY5Y cells. Neurochem Res. 46 (2), 367-378 (2021).
  23. Wang, Z., et al. Curcumin suppresses glioblastoma cell proliferation by p-AKT/mTOR pathway and increases the PTEN expression. Arch Biochem Biophys. 689, 108412(2020).
  24. Jia, F., et al. Matrix metallopeptidase 2-responsive curcumin-loaded nanoparticles-induced signal transducer and activator of transcription 3 inhibition suppresses glioblastoma multiforme growth via enhancing nuclear factor erythroid 2-related factor 2 activity. Int J Biol Macromol. 307 (Pt 2), 141998(2025).
  25. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15, 2769-2781 (2021).
  26. Bhagat, N., et al. Self-assembled systems for nose-to-brain delivery of temozolomide in brain tumor therapy. Int J Pharm. 675, 125540(2025).
  27. Mohajerani, F., et al. CLEC19A overexpression inhibits tumor cell proliferation and migration and promotes apoptosis concomitant suppression of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in glioblastoma multiforme. BMC Cancer. 24 (1), 19(2024).
  28. Li, Z., et al. MELK promotes HCC carcinogenesis through modulating cuproptosis-related gene DLAT-mediated mitochondrial function. Cell Death Dis. 14 (11), 733(2023).
  29. Lin, S., Wu, B., Hu, X., Lu, H. Sirtuin 4 downregulation contributes to chondrocyte senescence and osteoarthritis via mediating mitochondrial dysfunction. Int J Biol Sci. 20 (4), 1256-1278 (2024).
  30. Wang, W., et al. Ferroptosis inducers enhanced cuproptosis induced by copper ionophores in primary liver cancer. J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 142(2023).
  31. Wagstaff, M., et al. β-Catenin interacts with canonical RBPs including MSI2 to associate with a Wnt signalling mRNA network in myeloid leukaemia cells. Oncogene. 44 (29), 2490-2503 (2025).
  32. Liao, C. L., et al. Tetrandrine suppresses human brain glioblastoma GBM 8401/luc2 cell-xenografted subcutaneous tumors in nude mice in vivo. Molecules. 26 (23), 7105(2021).
  33. Huo, S., et al. ATF3/SPI1/SLC31A1 signaling promotes cuproptosis induced by advanced glycosylation end products in diabetic myocardial injury. Int J Mol Sci. 24 (2), 1667(2023).
  34. Zhang, Z., et al. Maresin1 suppresses high-glucose-induced ferroptosis in osteoblasts via NRF2 activation in type 2 diabetic osteoporosis. Cells. 11 (16), 2560(2022).
  35. Wang, H., et al. Targeting Wnt/β-catenin signaling exacerbates ferroptosis and increases the efficacy of melanoma immunotherapy via the regulation of MITF. Cells. 11 (22), 3580(2022).
  36. Liu, Y., et al. DNA aptamer S11e recognizes fibrosarcoma and acts as a tumor suppressor. Bioact Mater. 12, 278-291 (2022).
  37. Walker, B. C., Mittal, S. Antitumor activity of curcumin in glioblastoma. Int J Mol Sci. 21 (24), 9435(2020).
  38. Zhang, B., Xie, L., Liu, J., Liu, A., He, M. Construction and validation of a cuproptosis-related prognostic model for glioblastoma. Front Immunol. 14, 1082974(2023).
  39. Liu, Z., Ma, H., Lai, Z. The role of ferroptosis and cuproptosis in curcumin against hepatocellular carcinoma. Molecules. 28 (4), 1623(2023).
  40. Tian, Z., Jiang, S., Zhou, J., Zhang, W. Copper homeostasis and cuproptosis in mitochondria. Life Sci. 334, 122223(2023).
  41. Prasad Panda, S., Kesharwani, A. Micronutrients/miRs/ATP networking in mitochondria: clinical intervention with ferroptosis, cuproptosis, and calcium burden. Mitochondrion. 71, 1-16 (2023).
  42. Peng, Y., Wang, Y., Zhou, C., Mei, W., Zeng, C. PI3K/Akt/mTOR pathway and its role in cancer therapeutics: are we making headway. Front Oncol. 12, 819128(2022).
  43. Precilla, D. S., et al. Wnt/β-catenin antagonists: exploring new avenues to trigger old drugs in alleviating glioblastoma multiforme. Curr Mol Pharmacol. 15 (2), 338-360 (2022).
  44. Li, C., Yang, J., Wang, W., Li, R. LHPP exerts a tumor-inhibiting role in glioblastoma via the downregulation of Akt and Wnt/β-catenin signaling. J Bioenerg Biomembr. 53 (1), 61-71 (2021).
  45. Liu, Y. T., et al. Dysregulated Wnt/β-catenin signaling confers resistance to cuproptosis in cancer cells. Cell Death Differ. 31 (11), 1452-1466 (2024).
  46. Yu, W., et al. Investigation of cuproptosis regulator-mediated modification patterns and SLC30A7 function in GBM. Aging (Albany NY). 16 (4), 3554-3582 (2024).
  47. Afshari, A. R., et al. Anti-tumor effects of curcuminoids in glioblastoma multiforme: an updated literature review. Curr Med Chem. 28 (39), 8116-8138 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AKTWnt Beta CateninWestern Blot

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.