הדמיית אלקטרוטאקסיס תלויה בגיל של תאי גזע שמקורם בשומן אנושיים תחת שדות חשמליים בזרם ישר

Summary

בקבוצה קטנה של תורמות, ההזדקנות הפחיתה את ההגירה האלקטרוטקטית של hADSCs. DCEF שינה את ביטוי הגנים (747 למעלה, 624 למטה), והעשיר את מונחי העברת נתרן/ערוץ GO ואת מסלולי PI3K-Akt KEGG, מה שמרמז על מעורבות באלקטרוטאקסיס הקשור לגיל, מבלי לקבוע סיבתיות.

Abstract

תאי גזע שמקורם בשומן אנושיים (hADSCs) הם חיוניים להתחדשות רקמות ולהחלמת פצעים, והנדידה המכוונת שלהם היא תנאי מוקדם להפעלת השפעות טיפוליות אלו. שדות חשמליים (EFs) מוכרים היטב כרמזים מרכזיים המנחים את נדידת התאים במהלך תיקון הפצע, אך ההתנהגות האלקטרוטקטית של hADSCs – במיוחד כיצד תכונות התורם (למשל, גיל) מווסתות התנהגות זו ואת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים שלה – נותרה מובנת היטב. פער ידע זה מגביל את היישום האופטימלי של hADSCs ברפואה רגנרטיבית. במחקר זה, אישרנו תחילה את קיומם של אלקטרוטקסיס ב-hADSCs ואישרנו את תלות המתח שלה: תחת שדות חשמליים בזרם ישר (DCEFs) של 100-200 mV/mm, hADSCs נדדו בכיוון לכיוון האנודה, עם עוצמות EF חזקות יותר ששיפרו הן את כיוון הנדידה והן את מהירות ההגירה (לעומת שליטה של 0 mV/mm). לאחר מכן השווינו hADSCs של תורמות צעירות (27.00 ± 4.58 שנים) ותורמות מבוגרות (62.33 ± 4.04 שנים) באמצעות ריצוף RNA (RNA-seq) לאחר גירוי DCEF של 200 mV/mm. ניתוח טרנסקריפטומי זיהה 747 גנים עם ויסות גבוה ו-624 גנים עם ויסות נמוך ב-hADSCs מבוגרים, עם גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) מועשרים בתהליכים/מסלולים ביולוגיים קריטיים לאלקטרוטקסיס – כולל הובלה טרנסממברנלית של יוני נתרן, פעילות תעלת נתרן עם שער מתח (מונחי GO), ומסלול האיתות PI3K-Akt (מסלול KEGG). פונקציונלית, hADSCs מבוגרים הראו ירידה משמעותית בנדידת האנודולים (ירידה במרחק מצטבר, מרחק אוקלידי וישירות) בהשוואה ל-hADSCs צעירים תחת גירוי DCEF. מחקר זה מספק את הראיה הראשונה לאלקטרוטאקסיס תלויה בגיל ב-hADSCs, ומראה כי גיל התורם קשור לפגיעה ביכולת האלקטרוטקטית. הוא גם מגלה כי פעילות תעלת נתרן לא מבוקרת ואיתות PI3K-Akt עשויים להיות הבסיס לירידה זו הקשורה לגיל. ממצאים אלו מצביעים על מנגנוני רגולציה פוטנציאליים של אלקטרוטקסיס hADSC ומציעים תובנות חדשות להתאמת טיפולים מבוססי hADSC (למשל, בחירת תורמים אופטימליים או מיקוד במסלולי נתרן/PI3K-Akt) לשיפור התחדשות הרקמות ותוצאות ריפוי הפצעים.

Introduction

תאי גזע שמקורם בשומן (ADSC) מחזיקים ביכולת התחדשות עצמית חזקה ופוטנציאל רגנרציה משמעותי. בתנאי השראה מתאימים, הם יכולים להתמיין לאוסטאובלסטים, כונדרוציטים ואודיפוציטים, בין היתר¹. באמצעות איתות פרקריני, ADSC יכול גם לתמוך ביצירת כלי דם וכלי לימפה ^2,3, לעכב יצירת צלקות⁴, ולהציג השפעות רגולטוריות חיסוניות⁵. לכן, ADSC נחשב לתא זרע אידיאלי לטיפולים מבוססי תאים ברפואה רגנרטיבית.

תפקיד ה-ADSC מושפע מתכונות שונות של התורם, שעשויים להשפיע על היעילות הפוטנציאלית שלהם בטיפולי תאים, כולל גיל התורם, מדד מסת הגוף, מגדר^{ואחרים.} ADSC שמקורו בתורמים מבוגרים מציגים תכונות הזדקנות בולטות יותר, עם פוטנציאל התמיינות אדיפוגני מופחת, פוטנציאל התמיינות אוסטאוגנית ויכולת נדידה ^7,8,9. יתרה מזאת, היכולת לקדם התרבות קרטינוציטים ולעורר את מנגנוני התיקון העצמי של הגוף פוחתת¹⁰.

הגירה מונחית תאים היא מנגנון פיזיולוגי מרכזי בריפוי פצעים והתחדשות רקמות, כאשר שדות חשמליים (EFs) ממלאים תפקיד חשוב בהכוונת נדידת התאים ובקידום תיקון פצעים¹¹. לדוגמה, כאשר מחסום האפיתל נפגע, נוצרים מיד שדות חשמליים אנדוגניים ונמשכים עד שהפצע מחלים ותפקיד המחסום האפיתל משוחזר 12,13,14. כאחד האותות המנחים את נדידת התאים המכוונת, הוכח כי לאותות חשמליים יש עדיפות גבוהה יותר מאשר אותות מקימים אחרים, כגון עיכוב מגע, כוחות מכניים וגורמים כימוטקטיים^15,16. פותחו מספר שיטות לקידום ריפוי פצעים והתחדשות רקמות, כגון באמצעות תרופות ומכשירי גירוי חשמלי חיצוניים שמגבירים או מחקים את השדות החשמליים האנדוגניים בגוף האדם^17,18. היכולת של התאים לנדוד לפי גרדיאנט שדה חשמלי נקראת אלקטרוטקסיס. מחקרים במבחנה הראו שסוגים רבים של תאים מסוגלים להגירה מכוונת בשדות חשמליים. חלק מהתאים נודדים לכיוון האנודה, כמו תאי עצב הגולגולת ביונקים, אסטרוציטים אנושיים ותאי סרטן השד 19,20,21. תאים אחרים נודדים לעבר הקתודה, כגון תאי אפיתל צינוריים של הכליה, פיברובלסטים דרמליים אנושיים, ונויטרופילים אנושיים 22,23,24. ניתן להנחות את ADSC לעבור לכיוון האנודה בשדות חשמליים בזרם ישר (DC), ובתנאי תרבית ממושכת, הוכח כי זרם חשמלי פולסי חיצוני מקדם ביעילות את ההגירה הכיוונית של ADSC לעבר האנודה תוך שמירה על חיוניות התא²⁵. עד כה, מחקרים על מאפייני האלקטרוטקסיס של תאי גזע שמקורם בשומן אנושיים נותרו נדירים, והמנגנונים הבסיסיים המווסתים את התנהגותם האלקטרוטקטית עדיין אינם מובנים במלואם.

אנו הראשונים לחקור באופן שיטתי הבדלים אלקטרוטקטיים תלויי גיל בין hADSCs בין תורמות צעירות לנשים מבוגרות תחת שדות חשמליים בזרם ישר (DCEF), ולחשוף עוד יותר את המנגנונים הבסיסיים (כולל פעילות תעלת נתרן ואיתות PI3K-Akt) באמצעות ניתוח טרנסקריפטומי. במחקר זה בדקנו את השפעות DCEF על hADSCs. באמצעות ריצוף RNA וניתוח העשרת גנים שונה, השווינו פרופילי ביטוי גנים בין שתי קבוצות hADSC – שמקורם בתורמות צעירות וקשישות – לאחר גירוי DCEF כדי לזהות הבדלים בתעתוק הקשורים לגיל. השענו כי הזדקנות התורם פוגעת ברגישות האלקטרוטקטית של hADSCs, וכי הירידה הקשורה לגיל זו קשורה לשינוי בפעילות תעלת הנתרן ולאיתות PI3K-Akt.

Protocol

התקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים לפני איסוף הרקמות. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת הרפואה הסינית (אישור מס': [2018]2018-110-2). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים לפני איסוף הרקמות

בידוד ותרבות hADSC
איסוף רקמות: דגימות רקמת שומן בבטן נאספו במהלך הליכי שאיבת שומן אלקטיביים שגרתיים שבוצעו במחלקה לכירורגיה פלסטית בבית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת הרפואה הסינית. כל התורמים היו מתנדבות בריאות שעברו שאיבת שומן בטן קוסמטית, ולא בוצעו התערבויות ניתוחיות נוספות למטרות מחקר. דגימות רקמה נאספו על ידי המנתח המנתח בתנאים סטריליים מיד לאחר השאיבה והועברו למעבדה במיכלים סטריליים על קרח בתוך 30 דקות.

גודל מדגם: בסך הכל 6 תורמים נכללו במחקר זה, שכללו 3 תורמים צעירים (גיל: 27.00 ± 4.58 שנים) ו-3 תורמים מבוגרים (גיל: 62.33 ± 4.04 שנים).

עיבוד רקמות: העבר שברי רקמת שומן לצינור קוני של 50 מ"ל, צנטריפוגה ב-1,800 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ושאיב בזהירות את שלב השמן העליון (כדי להסיר שומנים עודפים). הוסף 0.2% קולגנאז סוג IV (נפח סופי: 5-10 מ"ל ל-1 גרם רקמת שומן) לכדור הרקמה, ואז הניחו את הצינור באמבט מים או חממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. ערבבו בעדינות את הצינור כל 10-15 דקות במהלך העיכול כדי להבטיח מגע אחיד בין הקולגנאז לרקמה. לאחר העיכול, יש לסיים את התגובה על ידי הוספת DMEM דל סוכר בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (יחס נפח בין מדיום לנטרול לתמיסת קולגנאז = 1:1).

זהירות: בעת טיפול בקולגנאז, יש ללבוש כפפות חד-פעמיות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן כדי להימנע מעור ומגע עין, הכינו והשתמשו במגיב בארון בטיחות ביולוגי (BSC) למניעת זיהום באירוסולים, ובמקרה של דליפה, נגבו מיד עם 75% אתנול והשליכו חומרים מזוהמים כפסולת ביולוגית.

בידוד תאים: צנטריפוגה את תערובת העיכול המנוטרלת בעוצמה של 1,200 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשחק את התאים. השליכו את הסופרנאנט, ואז החזירו את הכדור לבופר פירוק האריתרוציטים (155 מ"מ NH₄Cl, 10 מ"מ KHCO₃, 0.1 מ"מ EDTA; pH 7.4; נפח: 2-3 מ"ל לכדור) ודגרו בטמפרטורת החדר (22-25 מעלות צלזיוס) למשך 5 דקות כדי לפרק תאי דם אדומים שנותרו. סיננו את תליית התא ברצף דרך מסננות של 200 מיקרון כדי להסיר פסולת רקמה לא מעוכלת ולקבל תלייה חד-תאית.

ספירת תאים: לפני הזרעה, מספר התאים נמדד באמצעות המוסיטומטר. בקצרה, hADSCs נותקו עם 0.25% טריפסין-EDTA, הושעו שוב במדיום הצמיחה, וערבבו 1:1 עם תמיסת טריפאן כחולה של 0.4%. תאים ברי חיים (לא מוצבעים) נספרו ידנית באמצעות המוסיטומומטר נויבאואר תחת מיקרוסקופ אור, ומספר התאים הבריים הכולל חושב כך: מספר התאים/מ"ל = (תאים ממוצעים שנספרו x מקדם דילול x 10⁴).

תרבית תאים: זרעו את התאים המסוננים בצפיפות של 5 על 10³ תאים/^{ס"מ 2} במדיום גדילה (DMEM נמוך גלוקוז + 10% FBS + 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. החלפת המדיום כל 2-3 ימים כדי להסיר תאים לא דביקים ולשמור על תנאי תרבית מיטביים. כל ה-hADSCs ששימשו לניסויים הבאים – כולל אפיון תאים (זיהוי סימני פני שטח, בדיקות התמיינות משולשת קווית), גירוי DCEF, ניתוח נדידה ומורפולוגיה, בדיקות הזדקנות/התרבות וריצוף RNA – היו במעבר 3 עד 5.

אפיון hADSC
ביטוי של סימני פני שטח התא: תרב תאים עד ל-70% קונפלינסיציה, ואז מפריד תאים דבקים עם 0.25% טריפסין-EDTA (דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות). צנטריפוגה את מתלי התא ב-300 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, זרקו את הסופרנטנט, והחזירו את כדור התא ל-1x PBS (נפח: 1-2 מ"ל). Aliquot 1 x 10⁵ תאים לכל דגימה (מוחזר ל-100 מיקרוליטר של 1x PBS) והוסיפו נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים בדילול שנקבעו: אנטי-CD44 (1:50), אנטי-CD90 (1:100), אנטי-CD29 (1:50), אנטי-CD73 (1:50), ואנטי-CD105 (1:20)^1,4,7. דגרו את תערובת הנוגדנים-תאי הנוגדנים בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות בחושך כדי למנוע הקפאת פלואורופור. לאחר הדגירה, צנטריפוגה בעוצמה של 1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושואפת את הסופרנטנט במלואו. תלה מחדש את הכדור ב-1-2 מ"ל של 1x PBS, צנטריפוגה שוב ב-1,000 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, זרוק את הסופרנטנט, וחזר על תהליך השטיפה פעמיים כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. לבסוף, להחזיר את כדור התא ל-200 מיקרולטר של 1x PBS טרי, לאסוף נתוני פלואורסצנציה באמצעות ציטומטר זרימה, ולבצע ניתוח כמותי עם תוכנת FlowJo (v10). תהליך השער התנהל לפי נהלי פנוטיפינג סטנדרטיים של MSC: שער FSC-SSC להוצאת פסולת ובחירת אוכלוסיית התאים הראשית לפי גודל וגרעיניות, ולאחר מכן הדרת כפולה באמצעות גרפים של FSC-A מול FSC-H וגרפים של SSC-A מול SSC-H כדי להבטיח אירועים חד-תאיים. לאחר מכן, בוצע גייטינג של תאים חיים כדי להוציא תאים מתים חיוביים בכחול טריפאן או PI. בוצעה חלוקת פלואורסצנציה לביקורת עם צביעה יחידה, ובקרות לא מוצבעות שימשו לקביעת ספים ל-CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (סמנים חיוביים) ו-CD34, CD45 (סמנים שליליים). חלקות שער מייצגות יוצאו ונותחו כדי לאשר את זהות ה-hADSCs.

פוטנציאל דיפרנציאציה
התמיינות אדיפוגנית: קציר hADSCs מדור P3 בנקודת מפגש של 85% באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA, ואז זרע אותם בלוחות של 24 בארות בצפיפות של 1 x 10⁵ תאים לכל באר (באמצעות מדיום DMEM מלא) ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 עד שהתאים מגיעים שוב ל-85% מפגש משותף. לאינדוקציה, השתמשו בערכת ההתמיינות של האדיפוגנזה, רכיב הערכת A (מעורר אדיפוגני) ורכיב B (שומר אדיפוגני) כפי שמופיע במדריך, והשתמשו ברכיב A בשלושת הימים הראשונים לפני המעבר לרכיב B ליום אחד. חזור על המחזור הזה במשך 3 שבועות. לצביעה, שאפו את מדיום ההשראה, שטפו בעדינות תאים עם 3 מ"ל של 1x PBS (להימנע מהפרעה לשכבות התא), קיבעו תאים עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ואז דגרו עם תמיסת שמן אדום 0.3% (מוכנה ב-60% איזופרופנול) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שטוף תאים 3 פעמים עם 1x PBS כדי להסיר כתמים עודפים, ואז צילם טיפות שומן באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך (20x).

התמיינות אוסטאוגנית: זרעו hADSCs בלוחות של 12 בארות בצפיפות של 1 על 10⁵ תאים לבאר, וכאשר התאים מגיעים ל-85% קונפלונסי, השתמשו בערכת ההתמיינות האוסטאוגנזה לאינדוקציה – רכיב הערכת A (משרה אוסטאוגנית) ורכיב B (תוסף אוסטאוגני) ב-DMEM דל גלוקוז (ריכוזים סופיים: 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.1 מיקרומום דקסמתזון, 10 מ"מ β-גליצרופוספט, 0.05 מ"מ חומצה אסקורבית-2-פוספט) ומרענן את המדיום כל 3 ימים במשך 3 שבועות. לצביעה, תקבע תאים עם 4% PFA בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, שטוף 3 פעמים עם 1x PBS, ואז דגר עם 2% תמיסת Alizarin Red S (pH 4.2, מוכנה במים דה-יוניים) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו תאים 3x עם 1x PBS להסרת כתם לא קשור, ואז צילמו גושים עם סידן תחת מיקרוסקופ פאזה-ניגודיות (20x) וכימות מינרליזציה על ידי מדידת שטח הגושים האדומים החיוביים של אליזרין באמצעות תוכנת ImageJ.

הבחנה כונדרוגנית: צנטריפוגות 250,000 hADSCs ב-500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצינור קוני של 15 מ"ל ליצירת כדור תא, הוסף 500 מיקרו ליטר של מדיום DMEM מלא לצינור, ודגירה לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 לייצוב הכדור. למחרת, השתמשו בערכת ההבדלה של כונדרוגנזיס לאינדוקציה – לשחזר את רכיב הערכה A (מעורר כונדרוגני) בתווך בלתי תלוי ב-CO₂ (ריכוזים סופיים: 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 10 ng/mL TGF-β3, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית-2-פוספט, 100 מיקרוגרם/מ"ל פירובאט נתרן לאחר 3 שבועות של אינדוקציה, מקבע את הכדור התא עם 4% PFA בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, שאיפת את הקיבסיבי, דגרה עם תמיסת טולואידין Blue O של 0.1% (מוכנה בבופר נתרן של 0.1 מ', pH 4.0) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, שאיפת הכתם, שטיפה של הכדור 3 פעמים במים דה-יוניים כדי להסיר צבע עודף, לאחר מכן צילומים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (20x) וכימות הצטברות פרוטאוגליקניות סולפטית על ידי מדידת צפיפות אופטית ממוצעת (OD) של צביעת טולואידין Blue O באמצעות תוכנת ImageJ.

זהירות: בעת טיפול ב-4% PFA (תגובת רעילה וקורוזיבית), עבוד אך ורק עם קפוצ'ון אדים תוך כדי לבישת כפפות חד-פעמיות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן כדי להימנע משאיפת אדים או מגע עם העור והעיניים – אם יש מגע, שטוף מיד במים זורמים למשך 15 דקות ופנה לטיפול רפואי. לצורך סילוק פסולת מסוכנת, יש לאסוף PFA משומש וחומרים מזוהמים ב-PFA (למשל, קצות פיפטה, צלחות) במיכל פסולת כימית ייעודית המסומן PFA Waste ולהשליך אותם באמצעות פרוטוקולי פסולת מסוכנת מוסדית, תוך הקפדה שלא להתערבב עם פסולת ביולוגית.

הרכבת תא אלקטרוטקסיס: קדחו שני חורים (בקוטר 0.75 ס"מ) בקצוות מנוגדים של קו המרכז על מכסה צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ, הממוקם במרחק של 1 ס"מ מקצה הצלחת (כדי לאפשר גשרים בין אגר למלח). מרחו שכבה דקה של גריז ואקום (≤ 2 ס"מ באורך, ≤ 1 ס"מ רוחב) בתחתית צלחת הפטרי לאורך קו המרכז, 4 ס"מ מכל קצה (איור 1A). באמצעות מלקחיים סטריליים עם קצה דק, הניחו כיסוי זכוכית סטרילי בגודל 1 ס"מ על 2 ס"מ על כל טלאי שומן, ולחצו בעדינות כדי להבטיח אטימה הדוקה (למנוע שבירת מכסה; איור 1B-C). מרחו שכבה דקה נוספת של גריז ואקום מעל כל כיסוי מחובר, ואז מניחים שכבת זכוכית סטרילית נוספת בגודל 1 ס"מ על 2 ס"מ ישירות על השומן ליצירת ערימת כיסוי כפולה. לחץ בעדינות כדי להבטיח אטימה הדוקה בין שני הכיסוי (למנוע דליפה בינונית; איור 1D). לאורך הקו האלכסוני שמחבר את הפינה העליונה-שמאלית של אחד מערימת הכיסוי לקצה הצלחות הקרוב ביותר, והפינה הימנית התחתונה של הערימה הנגדית לקצה הקרוב ביותר, מרחו גריז ואקום ליצירת קיר מחסום רציף. הקיר צריך להיות מודבק היטב לתחתית הצלחת (ללא רווחים) ולהיות בגובה של כ-2 ס"מ ורוחב של כ-0.5 ס"מ (איור 1E). חטא את התא המורכב תחת אור UV למשך 20 דקות (כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי), ואז אחסן בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים עד לשימוש (איור 1F).

גירוי DCEF: הנח מחסניות זכוכית סטריליות (לזריעת תאים) בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ ודגר לילה בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 כדי להכין מראש את השקופיות (לקדם הידבקות תאים). הכינו את תמיסת שטיינברג על ידי דילול 10 מ"ל של תמיסת מאגר פי 10 ב-90 מ"ל של ddH₂O (סטרילי; ריכוזים סופיים: 58 מ"מ NaCl, 0.67 מ"מ מ״ר KCl, 0.44 מ״מ מ׳ Ca(NO₃)₂4H₂O, 0.83מ״מ מ״מ מ״ג מ״ג מ״ג מ״ג HEPES; pH 7.4). הוסיפו 0.3 גרם אגר ל-20 מ"ל מהתמיסה המוכנה של שטיינברג, חממו במיקרוגל במשך 20 שניות עד שהאגר מומס לחלוטין והתמיסה נקייה, ואז ממלאים מיד גשרי מלח זכוכית מותאמים בתערובת החמה של אגר-שטיינברג ומאפשרים לה להתגבש בטמפרטורת החדר. לאחר ההתמצקות, סטריליזציה של גשרי המלח תחת אור UV למשך 15 דקות, ועקר שני בקבוקים (כל אחד מכיל 30 מ"ל תמיסת שטיינברג) באור UV למשך 15 דקות. hADSCs מדור P3 על הסלידים הסטריליים המותאמים מראש בצפיפות של 2 x 10⁴ תאים לסמ"ר, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_{CO 2 למשך} 24 שעות כדי לאפשר היצמדות תאים, לאחר מכן מעבירים את המגלשות עם זריעות תא למסלול של תא האלקטרוטאקסיס המורכב ומאובטחים אותן עם מחסניות צד סטריליות (כדי למנוע תנועה). אטום את המסלול על ידי הנחת כיסוי זכוכית בגודל 3 ס"מ על 2 ס"מ מעל שומן הוואקום, לחיצה עדינה כדי להבטיח אטימה הדוקה, ומריח שומן ואקום נוסף לאורך קצוות הכיסוי העליון ליצירת מחסום (למנוע אידוי בינוני). מלא את מאגרי התא במדיום בלתי תלוי ב-CO₂ (בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין; נפח: 5-8 מ"ל למאגר), הכנסת גשרי מלח אגר מחוטאים דרך החורים במכסה צלחת פטרי (כאשר קצה אחד שקוע במיכל התווך של התא והקצה השני טבול בבקבוקים המלאים בתמיסת שטיינברג), וחבר את הבקבוקים לאספקת כוח באמצעות אלקטרודות Ag/AgCl (כדי לספק זרם ישר יציב). הפעילו שדה חשמלי DC (DCEF) של 2 וולט/ס"מ למשך 4 שעות, מנטרים את המתח כל 15 דקות באמצעות מולטימטר דיגיטלי (כווננו במידת הצורך כדי לשמור על עוצמת שדה קבועה), וצילמו תמונות טיים-לאפס של נדידת תאים כל 5 דקות ב-4 שדות אקראיים באמצעות התוכנה (מצב מטרה 5x, שדה בהיר).

הערה: בעת שימוש בציוד חשמלי, ודא שספק הכוח והאלקטרודות יבשים וממוקמים על משטח לא מוליך כדי למנוע הלם חשמלי. לבש כפפות מבודדות בעת חיבור או ניתוק אלקטרודות, כבה את החשמל לפני כיוון ההתקנה, ובמקרה של דליפה בינונית לרכיבים חשמליים, כבה מיד את החשמל ונגב בנייר סופג טבול ב-75% אתנול. במחקר זה, על ידי מזעור עובי תא האלקטרופורזה ושמירה עליו בכ-1 מ"מ, יחד עם מדידות מתח רב-נקודתיות בשני קצות התא, השינוי בעוצמת השדה נשלט בטווח של 10%. בתנאים אלו, נחשב כי התפלגות השדה החשמלי באזור התרביות היא למעשה אחידה^{של 26}.

ניתוח הגירה ומורפולוגיה
הדמיה חיה: עבור hADSCs תחת גירוי DCEF, ייבא את רצפי התמונה ב-timelapse (מרווחי 5 דקות) לתוכנת ImageJ, עוקב ידנית אחרי 100 תאים ב-4 שדות עצמאיים מההתחלה (t=0) ועד סוף הגירוי (t=4 שעות) באמצעות תוסף Manual Tracking, וחשב את מהירות ההגירה הממוצעת (μm/דקה) ואת הכיוונים (יחס D/T, כאשר D = מרחק קו ישר מההתחלה ועד הסוף, T = אורך מסלול כולל) באמצעות תוסף Chemotaxis Tool (ImageJ).

מעקב: חשב את פרמטרי ההגירה הבאים לכימות התנהגות אלקטרוטקטית: כיוון (Σcosθi/n, כאשר θi הוא הזווית בין וקטור ההזזה של התא לכיוון השדה החשמלי (EF), ו-n הוא מספר התאים המעקבים הכולל, הנע בין -1 ל-1 עם ערכים קרובים ל-1 המצביעים על נדידה מכוונת אנודה חזקה יותר), מרחק מצטבר (אורך המסלול הכולל שכל תא עבר במהלך תקופת הגירוי, במיקרומטר), מהירות מסילה (מרחק מצטבר חלקי זמן גירוי, במיקרומטר/שעה), ומרחק אוקלידי (הזזת התחלה לקצה בקו ישר של כל תא, במימטר, המשקפת נדידה נטו).

מורפומטריה: לאחר גירוי DCEF, מקבע תאים עם 4% PFA בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, שטוף 3 פעמים עם 1x PBS, צביעת שלד התא ב-Phalloidin-TRITC (דילול של 1:500 ב-1x PBS; נפח: 200 מיקרוליטר לבאר עבור לוחות עם 24 בארים) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (לסימון F-actin), וצבע נגד גרעיני DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל ב-1x PBS; נפח: 100 מיקרוליטר לבאר) למשך 5 דקות. תאים צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בהגדלה של פי 20 (עם תמונות ברזולוציה גבוהה מייצגות שצולמו ב-40x). Phalloidin-TRITC הוצג באמצעות אורך גל עירור של 540-555 ננומטר ואורך גל פליטה של 565-580 ננומטר, בעוד ש-DAPI צולם באמצעות אורך גל עירור של 358-405 ננומטר ואורך גל פליטה של 420-480 ננומטר. לאחר מכן מודדים את הפרמטרים המורפולוגיים הבאים ב-ImageJ: ציר ארוך (קוטר פרט מקסימלי, המרחק הארוך ביותר בין כל שתי נקודות בהיקף התא), אורך אנכי (רוחב התא בניצב לציר הארוך), ואנכיות (sinα, כאשר α היא הזווית בין ציר התא הארוך לכיוון ה-EF, כאשר ערכים גבוהים יותר מצביעים על יישור גבוה יותר עם ה-EF).

מבחני הזדקנות והפצה
כתמי SA-β-Gal: השתמשו בערכת זיהוי הזדקנות לזיהוי תאים מזדקנים (תאים מוצבעים בכחול) תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (מטרת 20x). הטלת hADSCs מדור P3 בלוחות 6 בארות בצפיפות של 2 x 10⁵ תאים בכל באר, תרבית עד ל-80% קונפליקציה, שאיבת המדיום, שטיפת תאים בעדינות 3 פעמים עם 1x PBS, הוספת 1 מ"ל תמיסת קיבוע (שהגיעה בערכה) לכל באר ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, שטיפת תאים 3 פעמים עם 1x PBS כדי להסיר את הקיבוע שנותר לאחר הקיבועות, הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת צביעה SA-β גלון (מוכנה על ידי ערבוב של 50 מיקרו ליטר של מצע SA-β גלון עם 450 מיקרו-ליטר של בופר צביעה לפי מדריך הערכה) לכל באר, אוטם את הפלטה עם שכבת שכבה שקופה (למניעת אידוי), דגרה למשך הלילה (16-18 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (הימנעות מחשיפה ל-CO₂ , שכן הוא משנה את ה-pH ומעכב פעילות אנזימים), לצלם תמונות שדה בהיר של ≥10 שדות אקראיים בכל באר (10 פעמים אובייקטיביות) ביום הבא, לספור את מספר התאים המוצבעים בכחול (SA-β-gal⁺) ואת סך התאים, ולחשב את אחוז התאים המזדקנים כ-(מספר תאי SA-β-gal⁺ / מספר תאים כולל) כפול 100.

הצבעה חיסונית ב-Ki67
לאחר צביעת SA-β-גל, שאף את תמיסת הצביעה, שטוף תאים פעמיים עם 1x PBS, חדיר ממברנות תאים עם 0.1% Triton X-100 (מוכן ב-1x PBS; 1 מ"ל לבאר) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, וחסום קישור נוגדנים לא ספציפי עם 5% BSA (ב-1x PBS; 1 מ"ל לבאר) בטמפרטורת החדר למשך שעה. התאים נדגרו לאחר מכן בנוגדן ראשוני Anti-Ki67 (דילול של 1:200 ב-1% BSA/PBS; 500 מיקרוליטר לבאר) בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. למחרת, התאים נשטפו 3 פעמים עם 1 PBS (5 דקות כל אחד), הסרת נוגדן ראשוני לא קשור והודגרו עם נוגדן משני מצמיד Alexa Fluor 488 488 (דילול 1:500 ב-1% BSA/PBS; 500 מיקרוליטר לבאר) בטמפרטורת החדר למשך שעה בחושך. התאים נשטפו שוב 3 פעמים עם 1x PBS וצבועו ב-DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל ב-1x PBS; 200 מיקרו-ליטר לבאר) למשך 5 דקות. תמונות פלואורסצנציה צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בהגדלה של פי 20 (עם תמונות מייצגות ברזולוציה גבוהה שנרכשו ב-40x). תאי Ki67⁺ המסומנים ב-Alexa Fluor 488 הוצגו באמצעות אורך גל עירור של 485-495 ננומטר ואורך גל פליטה של 515-545 ננומטר, בעוד שגרעינים מוכתמים ב-DAPI צולמו באמצעות אורך גל עירור של 358-405 ננומטר ואורך גל פליטה של 420-480 ננומטר. אחוז התאים המתרבים חושב כך: (מספר תאי Ki67⁺ / מספר גרעיני DAPI⁺ ) x 100.

הערה: בעת טיפול בנוגדנים ראשוניים ומשניים, יש לעבוד ב-BSC למניעת זיהום, לחבר נוגדנים לנפחים חד-פעמיים כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה שוב, ולאסוף חומרים מזוהמים בנוגדנים (למשל, קצות פיפטה, צלחות) בשקית פסולת ביולוגית ייעודית לאוטוקלב לעיקור באמצעות אוטוקלב לפני ההשלכה.

ניתוח אלקטרוטאקסיס תלוי גיל של hADSCs: השתמשו בספק כוח פולס DC ליצירת DCEF בשלוש עוצמות: 0 mV/mm (בקרה), 100 mV/mm, ו-200 mV/mm, השתמשו בתחנת עבודה עם תאים חיים לצפייה ותיעוד נדידת תאים בזמן אמת, ועבור כל עוצמת EF השוו כמותית את קיבולת ההגירה האנודלית של hADSCs מתורמות צעירות וקשישות על ידי מדידת מרחק מצטבר, מרחק אוקלידי, מהירות מסלול וכיוון, עם שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים בכל קבוצה להבטחת אמינות התוצאה. פרמטרי ההגירה האלקטרוטקטית נמדדו באמצעות תוספי Manual Tracking and Chemotaxis Tool ב-ImageJ (NIH). תאים בודדים נעקבו ידנית לאורך כל תקופת הגירוי של 4 שעות, והפרמטרים הבאים חושבו לפי שיטות סטנדרטיות: מרחק מצטבר: אורך המסלול הכולל שכל תא עבר במהלך תקופת ההקלטה. מרחק אוקלידי: המרחק בקו ישר בין מיקום ההתחלה והסיום של התא. מהירות מסלול: מרחק מצטבר חלקי זמן המעקב הכולל (מיקרומטר/שעה). הכוונה: מחושבת כממוצע הקוסינוס של הזווית (θ) בין כל וקטור הזזה לווקטור השדה החשמלי (הערכים נעים בין -1 ל-1; ערכים קרובים יותר ל-1 מצביעים על נדידת אנודלית חזקה).

רצף RNA
חילוץ והכנת RNA: סטריליזציה של מיכל מלא קרח תחת אור UV למשך 15 דקות (לשמירה על יציבות ה-RNA) וביצוע כל השלבים הבאים על הקרח. העבר שקופיות זכוכית עם זרעי hADSC (1 ס"מ x 2 ס"מ) מתא האלקטרוטאקסיס לצלחת פטרי סטרילית, שטוף תאים 3 פעמים עם 3 מ"ל של 1x PBS קר (הוסף PBS בעדינות, ערבב מעט, ושאוף לחלוטין כדי להסיר את התווך ששארי), ואז הוסף 1 מ"ל של תגובת טריזול לכל שקופית ודגרה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לעבור את כל התאים (ודא שהליזאט מכסה את כל שכבת התא). העבר את הליזאט לצינור צנטריפוגה חופשי מ-RNase בנפח 1.5 מ"ל, הוסף 0.2 מ"ל כלורופורם, מערבולת בעוצמה במשך 15 שניות כדי לגרום להפרדת פאזה, לדוג את הצינור על קרח למשך 15 דקות, ואז צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זה מפריד את הליזאט לשלוש שכבות: שלב מימי עליון המכיל RNA, שכבת חלבון אמצעית, ופאזה אורגנית תחתונה. העבר בזהירות את הפאזה המימית העליונה (≈ 0.5 מ"ל) לצינור חדש ללא RNase (הימנע ממגע בשכבה האמצעית), הוסף 0.5 מ"ל איזופרופנול, מערבולת עדינה לשיקוע RNA, דגר על קרח למשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C; ה-RNA ייצור כדור לבן בתחתית הצינור. להשליך את הסופרנאנט, לחזור על ההשקעה של איזופרופנול פעם אחת לשיפור טוהר ה-RNA, לשאוב את הסופרנטנט לחלוטין, לייבש את כדור ה-RNA באוויר ב-BSC בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות (אין לייבש יותר מדי, כי זה מפחית את המסיסות), החזיר את כדור ה-RNA ל-30 מיקרוליטר של מים שטופלו ב-DEPC, דגר ב-55°C למשך 10 דקות כדי לסייע בהמיסה, לכמת את טוהר ה-RNA על ידי מדידת יחס A260/A280 (מטרה: 1.8-2.0) באמצעות ספקטרופוטומטר, הערכת שלמות ה-RNA באמצעות שבב ננו RNA; מטרה: מספר שלמות RNA [RIN] > 8.0, ואחסן דגימות RNA מאושרות בטמפרטורה של -80°C עד לריצוף.

זהירות: טריזול וכלורופורם הם רעילים, נדיפים ומסרטנים, לכן יש לטפל בהם אך ורק עם מכסה אדים תוך כדי חבישת כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות – הימנעו משאיפת אדים, נגבו עם מגבת נייר ושטפו בסבון ומים במשך 10 דקות אם נשפכו על העור, ואל תערבבו עם אקונומיקה או חומרים מחמצנים אחרים (שכן זה עלול לייצר גזים רעילים). לטיפול בפסולת מסוכנת הקשורה להפקת RNA, יש לאסוף תערובת, סופרנטנטים איזופרופנוליים וצינורות מזוהמים במיכל אטום ועמיד לכימיה, המסומן כפסולת RNA (אין לערבב עם פסולת מימית או ביולוגית) ולהשליך את הפרוטוקולים המוסדיים של פסולת מסוכנת, תוך הקפדה שלא לשפוך לניקוזים.

קדם-עיבוד נתונים ובקרת איכות: הכנת ספריות ריצוף באמצעות ערכת ההכנה לספריית mRNA-seq של VAHTS בהתאם לפרוטוקול היצרן – העשרת mRNA באמצעות חרוזי מגנטיים של אוליגו(dT), פירוק mRNA לשברים של 200-300 bp באמצעות קטיון דיוולנטי, סינתז cDNA של גדילי ראשון באמצעות הקסמרים אקראיים ואחריהם cDNA של גדיל שני, ביצוע תיקון קצה, הוספת זנבות A, קישור מתאמי ריצוף, הגברת ספריות באמצעות PCR, וטיהור באמצעות חרוזים. רצף את הספריות על פלטפורמת ריצוף (קריאות קצוות זווגות של 150 בסיסים), מייצר כ-50 מיליון קריאות גולמיות לכל דגימה, ואז השתמש בתוכנה לחיתוך קריאות באיכות נמוכה (הסרת קריאות עם בסיס של >50% עם ציון איכות Phred <20) ורצפי מתאמים, תוך שמירה על כ-48 מיליון קריאות נקיות לכל דגימה (Q30 > 90%) לניתוח בהמשך לאחר החיתוך.

ניתוח ביואינפורמטיקה: יישור הקריאות הנקיות לגנום הייחוס האנושי (GRCh38/hg38) באמצעות תוכנת Hisat2 v2.2.1 ושמור תוצאות יישור כקבצי BAM, השתמש בתוכנת htseq-count v0.13.5 לספירת מספר הקריאות הממופה לכל גן (בהתבסס על הערות גנים של Ensembl), נרמול נתוני ספירת גנים באמצעות פונקציית estimateSizeFactors מחבילת DESeq (2012) R כדי להסיר השפעות אצווה והבדלים בעומק הריצוף, ולבצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות פונקציית nbinomTest (חבילת DESeq), בבחירת גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) באמצעות ספי שינוי קיפול (FC) > 2 וערך p מותאם (PADj) < 0.05. ביצוע ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים (GO) (תהליך ביולוגי, תפקוד מולקולרי, רכיב תאי) וניתוח העשרת מסלולי אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) על DEGs באמצעות חבילת clusterProfiler v4.0 R, תוך התמקדות בהעשרות הקשורות להגדת תאים (למשל, היצמדות תאים, נדידת תאים), העברת יונים (למשל, העברת יוני נתרן טרנסממברנה), ומסלולי אותות (למשל, מסלול איתות PI3K-Akt). לבצע קיבוץ היררכי לא מפוקח על DEGs באמצעות חבילת pheatmap v1.0.12 R והמחשת דפוסי ביטוי גנים בין דגימות באמצעות מפת חום (ציוני z בקנה מידה שורה).

ניתוח סטטיסטי: כל הנתונים הניסיוניים מוצגים כממוצע ± שגיאת סטנדרטית של הממוצע (ממוצע ± SEM), עם לפחות 3 שכפולים ביולוגיים עצמאיים בכל קבוצה (n ≥ 3). השתמש במבחן t של סטודנט להשוואת הבדלים בין שתי קבוצות (למשל, תורמים צעירים מול מבוגרים) ובניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA), ואחריו מבחן הפוסט-הוק של טוקי להשוואת הבדלים בין שלוש קבוצות או יותר (למשל, עוצמות EF שונות), ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנת SPSS 23.0 והגדרת מובהקות סטטיסטית כך: *p < 0.05, **p < 0.01, עמוד < 0.001.

Results

יישום שדות חשמליים מנחה את הנדידה הכיוונית של hADSCs ומגביר את יכולת הנדידה שלהם
ה-hADSCs שהופקו הציגו סמנים טיפוסיים של פני תאי גזע מזנכימליים (למשל, CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) והחזיקו בפוטנציאל התמיינות תלת-קווית (אדיפוגני, אוסטאוגני, כונדרוגני; איור 2A), ועומד בקריטריונים הסטנדרטיים לזיהוי hADSC. השתמשנו בשדות חשמליים זרם ישר (DCEFs) בעוצמות של 0 mV/mm, 100 mV/mm, ו-200 mV/mm כדי לחקור את התגובה האלקטרוטקטית של hADSCs. בקבוצת הביקורת ללא גירוי חשמלי (0 mV/mm), hADS...

Discussion

בשלבים מוקדמים של תהליך תיקון והתחדשות פגיעות רקמה, שדות חשמליים מתגלים כאחד הרמזים הפיזיקליים הראשונים שנקבעו במיקרו-סביבה. התכונות הכיווניות שלהם קשורות מרחב-זמן לגיוס התאים לאתר הפציעה²⁷. שדות חשמליים אנדוגניים נובעים מהפוטנציאל הטרנסאפיתל הנוצר על ידי העברת יונים מקוטבת ברקמות אפיתליאליות. כאשר מחסום האפיתל מופרע או עובר הזדקנות, הפוטנציאל משתנה באופן משני, בעוד אזורים לא פגועים או שאינם זקנים שומרים על העברת יונים, מה שיוצר גרדיאנט מתח שמייצר DCEF במקביל למשט...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4&g; C/-20 ודרגה גבוהה; C/-80 ו°; מקרר C	חאייר, סין	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
אגר	הושי, סין	10000561
אנלייזר ביולוגי Agilent 2100	אג'ילנט טכנולוגיות, ארצות הברית	G2939BA
Alizarin Red S	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	A5533
ארון בטיחות ביולוגית	תרמו פישר סיינטיפיק, ארצות הברית	1300 A2 1.5 מ'
CaNO3· 4H2O	הושי, סין	10013960
צנטריפוגה	תרמו פישר סיינטיפיק, ארצות הברית	X4R Pro
חממת CO2	תרמו פישר סיינטיפיק, ארצות הברית	פורמה סטרי-מחזור 3307
קולגנאז סוג IV	ביושארפ, סין	BS076
מיקרוסקופ קונפוקלי	צייס, גרמניה	LSM 900
ספק כוח פולס DC	Daedo Powertronics, קוריאה	DDP-500
דקסמתזון	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	D4902
מולטימטר דיגיטלי	פלוק, ארצות הברית	פלוק-175
DMSO	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	D2650
מאזן אלקטרוני	סארטוריוס, גרמניה	BSA224S-CW
FBS	גיבקו, ארצות הברית	10270-106
ציטומטר זרימה	תרמו פישר סיינטיפיק, ארצות הברית	A24858
IBMX (1-מתיל-3-איזובוטילקסנתין)	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	I7018
אינדומטצין	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	I7378
אינסולין	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	I5500
מיקרוסקופ הפוך	צייס, גרמניה	אקסיו אובזרבר 7 / ACR
ITS-G	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	I3146
KCl	הושי, סין	10019318
KH2PO4	הושי, סין	10019320
חומצה לינולאית	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	L1376
תחנת סלולר חיה	לייב סל אינסטרומנט, קוריאה	Chamlide TC
DMEM עם רמות סוכר נמוכות	גיבקו, ארצות הברית	11885084
MgSO4· 7H2O	הושי, סין	10019322
Na2HPO4· 12H2O	הושי, סין	10019324
NaCl	הושי, סין	10019318
ספקטרופוטומטר NanoDrop 2000	תרמו פישר סיינטיפיק, ארצות הברית	ND-2000
שמן אדום O	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	O0625
פניצילין/סטרפטומיצין	גיבקו, ארצות הברית	15140122
פיפטות	אפנדורף, גרמניה	4920000061
SYBR Premix EX Taq	טקארה, סין	RR420A
טולואידין כחול O	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	T3260
טריס	הושי, סין	10019326
טריזול	ביוטיים, סין	R0016
טריפסין-אדטה	גיבקו, ארצות הברית	25200056
מיקרוסקופ זקוף	צייס, גרמניה	415200-0000-000
גריז ואקום	דאו קורנינג, ארצות הברית	1597418
ויטמין C	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	A4544
מערכת טיהור מים	תרמו פישר סיינטיפיק, ארצות הברית	GenPure xCAD Plus UF-TOC
β-גליצרופוספט	סיגמא-אלדריץ', ארצות הברית	G9422